一種對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，包括如下步驟：(1)混合血漿；(2)加入CaCl2溶液攪拌后使用濾芯過(guò)濾澄清，得到過(guò)濾液；(3)加入吐溫-80和磷酸三丁酯混合液，使得過(guò)濾液中tween-80和TNBP的最終體積百分比分別為(1±0.3)％和(0.3±0.1)％，保持反應(yīng)液的溫度在24±2℃，恒溫4-6小時(shí)；(4)加入植物油，使得最終植物油的體積百分比為(5±2)％，降低反應(yīng)液溫度至16±2℃；(5)攪拌、靜置；(6)抽提，棄除油相，得到的液相。本發(fā)明的方法極大提高原料血漿的安全性，降低二次污染的幾率。
【專利說(shuō)明】一種對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種病毒滅活處理的方法，特別是涉及一種對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn) 行病毒滅活處理的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 血液制品是一門新興的生物醫(yī)藥行業(yè)，它的起始原料單一，為多人份健康人血漿 混合而成，在我國(guó)原料血漿的采集國(guó)家有非常嚴(yán)格的管理規(guī)定，要求對(duì)每一份采集的血漿 必須進(jìn)行多種病毒篩查檢測(cè)，合格后方能作為原料進(jìn)行生產(chǎn)。但是人類對(duì)于很多病毒的未 知性和檢測(cè)手段的第一，加上病毒檢測(cè)方法本身的局限性，因此不能完全保證原料的絕對(duì) 安全。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局在2002年出臺(tái)的[血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及 驗(yàn)證指導(dǎo)原則]規(guī)定：為了提高血液制品安全性，生產(chǎn)工藝要具有一定的去除/滅活部分病 毒能力，生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)有特定的去除/滅活病毒方法，且生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)有特定的能去除/滅 活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一種或多種方法聯(lián)合去除/滅活病毒。
[0003] 人類已知的通過(guò)人血液進(jìn)行傳播的病毒一般有三類，S卩脂包膜病毒（如乙肝病毒 HBV)、非脂包膜病毒（如甲肝病毒HAV)和細(xì)小病毒（如B19)，目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的人 血白蛋白等主要血液制品，多采用的是半成品后病毒處理且多是采用一次病毒滅活處理工 藝，如巴斯德法（60°C，72小時(shí)處理）和低pH法（pH 4.0, 21天放置處理）。因此如果對(duì)原 料血漿直接進(jìn)行病毒處理，將使得血液制品二次污染的幾率大大降低，同時(shí)結(jié)合對(duì)半成品 進(jìn)行后病毒處理方式，將極大的提高血液制品應(yīng)用安全性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種極大提高原料血漿的安全性，降低二次污染 的幾率，同時(shí)結(jié)合現(xiàn)有產(chǎn)品原有的病毒滅活工藝（如巴斯德法和低PH法），能極大的保障血 液制品病毒安全性的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法。
[0005] -種對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，包括如下步驟：
[0006] (1)將多人份血漿在常溫下混合；
[0007] (2)混合后的血漿精確計(jì)量體積，溫度控制在24±2°C，加入CaCl2溶液使得混合 后的血漿中最終CaCl 2為（2±0. 5)mmol/L，攪拌10分鐘后使用孔徑1 μ m的濾芯過(guò)濾澄清， 得到過(guò)濾液；
[0008] (3)根據(jù)過(guò)濾液的體積量，加入30 %的吐溫-80 (tween-80)和磷酸三丁酯 (TNBP)混合液，使得過(guò)濾液中tween-80和TNBP的最終體積百分比分別為（1±0. 3) %和 (0. 3±0. 1) %，保持混合液的溫度，控制在24±2°C，恒溫4-6小時(shí)；
[0009] (4)恒溫結(jié)束后，根據(jù)混合液體積，加入藥用級(jí)的植物油，使得最終植物油的體積 百分比為（5±2)%，降低反應(yīng)液溫度至16±2°C ;
[0010] (5)快速攪拌15分鐘，靜止放置30分鐘，使得油液相完全分層，得到混合液；
[0011] (6)使用隔離泵從混合液底部進(jìn)行抽提，棄除油相，得到的液相作為血液制品的原 料進(jìn)行人血白蛋白及靜注人免疫球蛋白制品的制備。
[0012] 本發(fā)明所述的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其中所述混合后 的血漿中最終CaCl 2為2mmol/L。
[0013] 本發(fā)明所述的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其中所述過(guò)濾液 中tween-80和TNBP的最終體積百分比分別為1 %和0. 3%，
[0014] 本發(fā)明所述的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其中所述植物油 的體積百分比為5%。
[0015] 本發(fā)明所述的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其中所述血液制 品的原料中凝血因子II、W、VDI、IX、X均不低于0. 7IU/ml。
[0016] 本發(fā)明所述的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其中采用所述液 相作為血液制品的原料制備得到的人血白蛋白及靜注人免疫球蛋白制品中，tween-80殘留 量為不高于l〇〇ug/ml，TNBP殘留量為不高于10ug/ml。
[0017] 本發(fā)明對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在 于：
[0018] 血液制品是一種采用多人份健康人血漿或經(jīng)特異性免疫的人血漿，混合后經(jīng)低溫 乙醇或其他批準(zhǔn)的工藝進(jìn)行分級(jí)分離、提純等技術(shù)制成的蛋白組分，用于治療和被動(dòng)免疫 防治。作為新興行業(yè)，因采用的是多人份混合血漿作為起始原料，雖然采用多種檢測(cè)手段去 最大限度避免病毒的污染，但因檢測(cè)本身存在誤差和檢測(cè)手段的限制以及存在未知病毒等 因素，所以血液制劑的使用存在被感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此國(guó)家也強(qiáng)制要求各生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)工 藝的應(yīng)用病毒滅活處理方式已降低風(fēng)險(xiǎn)。
[0019] 本發(fā)明涉及一種對(duì)原料混合血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其目的是為了提供一 種成本低、操作簡(jiǎn)便的病毒滅活處理方式，從源頭上把控，極大的降低藥品病毒感染風(fēng)險(xiǎn)， 同時(shí)使用該種病毒滅活后的血漿，仍能保持各種蛋白、因子及酶的活性。本發(fā)明包括：血漿 合并后，加入保護(hù)劑和病毒滅活劑，經(jīng)病毒滅活處理后，去除滅活劑，得到符合《中華人民共 和國(guó)藥典》2010年版三部規(guī)定的原料血漿。
[0020] 本發(fā)明對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法采用有機(jī)溶劑和去污劑 聯(lián)合應(yīng)用，能有效去除脂包膜病毒，該病毒處理方式使用方便，簡(jiǎn)單易操作，采用有機(jī)溶劑 和去污劑對(duì)原料混合血漿進(jìn)行的初步病毒滅活處理，不僅降低血液制品二次污染的幾率， 同時(shí)能有效保持各種蛋白、凝血因子及酶的活性。
[0021] 本發(fā)明還具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0022] 1、有機(jī)溶劑和去污劑聯(lián)合應(yīng)用，能快速有效去除部分病毒，且該病毒處理方式使 用方便，簡(jiǎn)單易操作；
[0023] 2、本工藝中通過(guò)藥用級(jí)植物油的萃取方法能簡(jiǎn)便而有效的對(duì)有機(jī)溶劑和去污劑 殘留進(jìn)行除去處理，達(dá)到《中國(guó)藥典》2010版對(duì)這兩種試劑殘留量的要求；
[0024] 3、使用該方式處理后的原料血漿，不僅降低血液制品二次污染的幾率，提高安全 性，同時(shí)能有效保持各種蛋白、凝血因子及酶的活性，不影響后續(xù)生產(chǎn)工藝提取各種蛋白及 酶類制品。
[0025] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法作進(jìn) 一步說(shuō)明。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明方法中原料血漿經(jīng)有機(jī)溶劑和去污劑混勻液處理后的中間品滅活 PRV效果動(dòng)力學(xué)曲線圖；
[0027] 圖2為本發(fā)明方法中原料血漿經(jīng)有機(jī)溶劑和去污劑混勻液處理后的中間品滅活 Sindbis病毒效果動(dòng)力學(xué)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1
[0029] 采用有機(jī)溶劑和去污劑混勻液對(duì)多人份混合人血漿進(jìn)行病毒處理。
[0030] (1)血漿融化
[0031] 從冷庫(kù)領(lǐng)取符合《中國(guó)藥典》2010版三部中"血液制品生產(chǎn)用人血漿"規(guī)定、并經(jīng) 復(fù)檢合格且符合檢疫期的血漿1668人份（凈重：1002. 34公斤），血漿融化在D級(jí)潔凈區(qū)內(nèi) 進(jìn)行。采用自然融化法或者水浴融化法。水浴融化法的水溫應(yīng)控制在37°C以下。
[0032] (2)血漿合并
[0033] 合并血漿，血漿合并在D級(jí)潔凈區(qū)內(nèi)進(jìn)行，合并之前，應(yīng)對(duì)血漿袋進(jìn)行消毒處理， 即用75%酒精浸泡三分鐘以上，用干凈紗布將血漿袋外部酒精擦凈后才能合并。合并血漿 時(shí),應(yīng)注意點(diǎn)滴回收,合并后混合血漿體積為965. 5升。
[0034] ⑶將混合血漿溫度控制在24±2°C，加入250mmol/L的CaCl2溶液7. 8毫升，攪 拌10分鐘后使用孔徑Ium的濾芯過(guò)濾澄清；
[0035] (4)收集濾液963升，按體積比30:1加入濃度為30%的吐溫-80(tween-80)和9% 磷酸三丁酯（TNBP)混合液32. 1升。保持反應(yīng)液的溫度，控制在24±2°C，恒溫4-6小時(shí)。
[0036] (5)恒溫時(shí)間結(jié)束后，根據(jù)反應(yīng)液體積，加入藥用級(jí)的植物油49. 8升，降低反應(yīng)液 溫度至16 ±2 °C。
[0037] (6)快速攪拌15分鐘，靜止放置30分鐘，使得油液相完全分層；
[0038] (7)使用隔離泵從混合液底部進(jìn)行抽提，棄除油相。得到經(jīng)病毒處理后的原料血漿 990 升。
[0039] 病毒處理后的血漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
[0040] 1、所用血漿原料應(yīng)符合《中國(guó)藥典》2010版三部中"血液制品生產(chǎn)用人血漿"規(guī) 定；
[0041] 2、蛋白含量
[0042] 可采用雙縮脲法（《中國(guó)藥典附錄》附錄VIB第三法）測(cè)定，應(yīng)不低于5.0%。
[0043] 3、因子效價(jià)測(cè)定
[0044] 3. 1人凝血因子IX效價(jià)測(cè)定
[0045] 依法測(cè)定（2010年版《中國(guó)藥典》三部附錄X L)，每Iml人凝血因子IX效價(jià)不低 于 0. 7IU。
[0046] 3. 2人凝血因子II效價(jià)測(cè)定
[0047] 依法測(cè)定（2010年版《中國(guó)藥典》三部附錄X J)，每Iml人凝血因子IX效價(jià)不低 于 0. 5IU。
[0048] 3· 3人凝血因子W效價(jià)測(cè)定
[0049] 依法測(cè)定（2010年版《中國(guó)藥典》三部附錄X Κ)，每Iml人凝血因子IX效價(jià)不低于 0· 5IU。
[0050] 3. 4人凝血因子X效價(jià)測(cè)定
[0051] 依法測(cè)定（2010年版《中國(guó)藥典》三部附錄X Μ)，每Iml人凝血因子IX效價(jià)不低于 0· 7IU。
[0052] 3. 5人凝血因子VDI效價(jià)測(cè)定
[0053] 依法測(cè)定（(2010年版《中國(guó)藥典》三部附錄X Ν)，每Iml人凝血因子IX效價(jià)不低 于 0. 7IU。
[0054] 4、HBsAg
[0055] 用經(jīng)批準(zhǔn)的試劑盒檢測(cè)，應(yīng)為陰性。
[0056] 5、HIV-1/HIV_2 抗體
[0057] 用經(jīng)批準(zhǔn)的試劑盒檢測(cè)，應(yīng)為陰性。
[0058] 6、HCV 抗體
[0059] 用經(jīng)批準(zhǔn)的試劑盒檢測(cè)，應(yīng)為陰性。
[0060] 7、無(wú)菌試驗(yàn)
[0061] 依法測(cè)定（2010年版《中國(guó)藥典》三部附錄XII A)檢定，應(yīng)符合規(guī)定。
[0062] 8、磷酸三丁酯殘留量
[0063] 依法測(cè)定（2010年版《中國(guó)藥典》三部附錄VI J)，應(yīng)不高于10 μ g/ml。
[0064] 9、聚山梨酯80殘留量
[0065] 依法測(cè)定（2010年版《中國(guó)藥典》三部附錄VI H)應(yīng)不高于100 μ g/ml。
[0066] 一、有機(jī)溶劑和去污劑混勻液對(duì)多人份混合人血漿病毒處理效果驗(yàn)證
[0067] 根據(jù)《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》（國(guó)藥監(jiān)注〔2002〕160 號(hào)）文件的精神，我公司對(duì)三批人原料血漿的病毒滅活處理工藝進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證的結(jié)果 如下：
[0068] 1、有機(jī)溶劑和去污劑混勻液對(duì)多人份混合人血漿滅活PRV(偽狂犬病毒） 驗(yàn)證結(jié)果見表1及圖1，由表1可以看出，三批中間品，經(jīng)過(guò)該滅活處理方法（0.3% TNBP+1. 0 % Tween-80, 25± I °C，6小時(shí)）病毒滅活后，殘余PRV滴度均低于本試驗(yàn) 最低檢測(cè)限（_〇. 5LgTCID50/0. Iml) ·可滅活所加指示病毒PRV分別為：20140301 批 > 4.87LgTCID50/0.1ml，20140302 批 > 4.75LgTCID50/0.1ml，20140303 批 彡4. 81LgTCID50/0. lml。取4小時(shí)、6小時(shí)最低稀釋度孔中的上清用于PK - 15細(xì)胞盲傳 三代，未見特異性細(xì)胞病變（CPE)。
[0069] 2、有機(jī)溶劑和去污劑混勻液對(duì)多人份混合人血漿滅活Sindbis (辛巴氏病 毒）驗(yàn)證結(jié)果見表2及圖2,由表2可以看出，三批中間品，經(jīng)過(guò)該滅活處理方法（0.3% TNBP+1.0% Tween-80, 25土 1°C，6小時(shí)）病毒滅活后，對(duì)Sindbis病毒發(fā)生了顯著滅活作 用·可滅活所加指示病毒Sindbis病毒分別為：20140301批彡4. 95LgPFU/ml，20140302 批彡4. 81LgPFU/ml，20140303批彡4. 87LgPFU/ml。取4小時(shí)、6小時(shí)最低稀釋度樣品用于 BHK - 21細(xì)胞盲傳三代，未見特異性細(xì)胞病變（CPE)。
[0070] 二、有機(jī)溶劑和去污劑混勻液對(duì)多人份混合人血漿滅活PRV病毒效果驗(yàn)證報(bào)告
[0071] 制品名稱：多人份混合原料人血漿
[0072] 驗(yàn)證用樣品：原料血楽病毒處理后的中間品
[0073] 樣品批號(hào)：20140301 ;20140302 ;20140303。
[0074] 生產(chǎn)單位：同路生物制藥有限公司
[0075] 驗(yàn)證依據(jù)：《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》
[0076] (國(guó)藥監(jiān)注〔2002〕160 號(hào)）
[0077] (一）、PRV病毒滅活效果驗(yàn)證試驗(yàn)方案
[0078] 1、驗(yàn)證目的：
[0079] 驗(yàn)證有機(jī)溶劑和去污劑混勻液（0· 3% TNBP+1. 0% Tween_80,25±l°C，6小時(shí)）對(duì) 多人份混合原料人血漿中指示病毒PRV病毒的滅活效果。
[0080] 2、驗(yàn)證樣品
[0081] 病毒處理后的中間品取自生產(chǎn)過(guò)程中有機(jī)溶劑和去污劑混勻液處理之前一步， 于-20°C保存。樣品的主要質(zhì)量參數(shù)見表3。
[0082] 表3.樣品的主要參數(shù)

【權(quán)利要求】
1. 一種對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其特征在于：包括如下步 驟： (1) 將多人份血漿在常溫下混合； (2) 混合后的血漿精確計(jì)量體積，溫度控制在24±2°C，加入CaCl2溶液使得混合后的 血漿中最終CaCl2為（2±0. 5)mmol/L，攪拌10分鐘后使用孔徑1 y m的濾芯過(guò)濾澄清，得到 過(guò)濾液； (3) 根據(jù)過(guò)濾液的體積量，加入30 %的吐溫-80 (tween-80)和磷酸三丁酯（TNBP) 混合液，使得過(guò)濾液中tween-80和TNBP的最終體積百分比分別為（1 ±0. 3) %和 (0. 3±0. 1) %，保持混合液的溫度，控制在24±2°C，恒溫4-6小時(shí)； (4) 恒溫結(jié)束后，根據(jù)混合液體積，加入藥用級(jí)的植物油，使得最終植物油的體積百分 比為（5±2)%，降低反應(yīng)液溫度至16±2°C ; (5) 快速攪拌15分鐘，靜止放置30分鐘，使得油液相完全分層，得到混合液； (6) 使用隔離泵從混合液底部進(jìn)行抽提，棄除油相，得到的液相作為血液制品的原料進(jìn) 行人血白蛋白及靜注人免疫球蛋白制品的制備。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其特征在 于：所述混合后的血楽中最終CaCl2為2mmol/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其特征在 于：所述過(guò)濾液中tween-80和TNBP的最終體積百分比分別為1 %和0. 3%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其特征在 于：所述植物油的體積百分比為5%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其特征在 于：所述血液制品的原料中凝血因子II、Vn、W、IX、X均不低于0. 7IU/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的對(duì)血液制品的原料血漿進(jìn)行病毒滅活處理的方法，其特征 在于：采用所述液相作為血液制品的原料制備得到的人血白蛋白及靜注人免疫球蛋白制品 中，tween-80殘留量為不高于100ug/ml，TNBP殘留量為不高于10ug/ml。
【文檔編號(hào)】A61K47/34GK104367591SQ201410553174
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】胡輝恒, 鄧?yán)? 董海軍 申請(qǐng)人:同路生物制藥有限公司