一種天然抗菌肽Alligatorin4及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種天然抗菌肽Alligatorin4及其在抗菌方面的應(yīng)用。本發(fā)明的抗菌肽Alligatorin4來(lái)源于揚(yáng)子鱷。通過(guò)檢索揚(yáng)子鱷基因數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選分析獲得抗菌肽成熟肽序列，其氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所示。通過(guò)對(duì)比分析，該天然抗菌肽Alligatorin4與目前已知所有抗菌肽的氨基酸序列存在明顯差異，屬于一種新型抗菌肽?？咕鷮?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的抗菌肽Alligatorin4對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌具有極強(qiáng)的抗菌活性，抗菌作用廣譜高效，此外具有溶血活性低、鹽耐受性、熱耐受性和熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，可應(yīng)用于制備抗菌、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物、防腐劑、獸藥、動(dòng)物飼料以及化妝品中。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種天然抗菌肽Al I igator in4及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種天然抗菌肽及其應(yīng)用，更具體的說(shuō)，涉及一種來(lái)源于揚(yáng)子鱷的天 然抗菌肽Alligatorin4及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 傳統(tǒng)抗生素在治療細(xì)菌性感染疾病方面取得了顯著效果，但是近年來(lái)，隨著傳統(tǒng) 抗生素在醫(yī)學(xué)和養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域的濫用，微生物對(duì)傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生了越來(lái)越強(qiáng)的耐受性，同 時(shí)也出現(xiàn)了一些耐藥性極強(qiáng)的超級(jí)細(xì)菌，微生物耐藥問(wèn)題已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的難 題。一直以來(lái)微生物耐藥性的應(yīng)對(duì)手段是使用對(duì)耐藥微生物尚未使用過(guò)的新的或者替代性 的抗微生物制劑，而這種新的抗生素使用一段時(shí)間后，微生物會(huì)進(jìn)一步對(duì)這種新的抗生素 產(chǎn)生耐藥性，因此這就需要持續(xù)開(kāi)發(fā)新的抗微生物制劑。開(kāi)發(fā)出一種新型抗菌機(jī)制藥物是 解決微生物耐受性問(wèn)題的一個(gè)新方向。
[0003] 抗菌肽是一種小分子多肽，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲(chóng)等均具有殺滅作用。抗菌肽 具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、殺菌活性強(qiáng)等特點(diǎn)。大多數(shù)抗菌肽的殺菌機(jī)制是通過(guò)作用于細(xì)菌 細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層，破壞細(xì)胞膜完整性并在細(xì)胞膜上形成跨膜通道，造成細(xì)胞內(nèi)容 物溶出而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這種獨(dú)特的殺菌機(jī)制一般不易引起微生物耐藥性。而且抗菌肽對(duì) 哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞和組織一般沒(méi)有毒害性，不存在殘留問(wèn)題，因此抗菌肽有望成為一種新 型的高效的抗菌藥物，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是為解決傳統(tǒng)抗生素的不足之處，提供了一種來(lái)源于揚(yáng)子鱷的天然抗 菌肽Alligatorin4,另外提供了該抗菌肽的氨基酸序列以及其在抗菌方面的應(yīng)用。揚(yáng)子鱷 抗菌肽Alligatorin4具有廣譜高效的抗菌作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和真 菌具有極強(qiáng)的抗菌活性，且具有分子量小、合成簡(jiǎn)單、溶血活性低、鹽耐受性、熱耐受性和熱 穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，可應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品保鮮和養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明中天然抗菌肽Alligatorin4來(lái)自于爬行動(dòng)物揚(yáng)子鱷體內(nèi)的一種抗菌肽， 抗菌肽Alligatorin4由38個(gè)氨基酸組成，分子量為4402. 5Da，等電點(diǎn)為12. 78。氨基酸序 列如序列表 SEQ ID N0:1 所不 Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Leu Arg Arg Lys lie Lys Lys Gly Phe Lys Lys lie Phe Lys Arg Leu Pro Pro Val Gly Val Gly Val Ser lie Pro Leu Ala Gly Arg Arg，所有氨基酸均為L(zhǎng)-型。
[0007] 本發(fā)明也提供了抗菌肽Alligatorin4的化學(xué)制備方法：
[0008] 根據(jù)獲得天然抗菌肽Alligatorin4成熟肽的氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成 儀（433A, Applied Biosystems)合其全序列，通過(guò)HPLC反相柱層析脫鹽純化；用高效 液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-T0F)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0009] 另外，本發(fā)明提供了抗菌肽Alligatorin4的應(yīng)用，在制備抗菌藥物或組合物、抑 制細(xì)菌生長(zhǎng)藥物或組合物、防腐劑、動(dòng)物飼料添加劑或化妝品添加劑中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供了一種來(lái)源于揚(yáng)子鱷的天然抗菌肽Alligatorin4以及其在 抗菌方面的應(yīng)用?？咕腁lligatorin4具有廣譜高效的抗菌作用，且具有分子量小、合成 簡(jiǎn)單、溶血活性低、鹽耐受性、熱耐受性和熱穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，可應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品 保鮮和養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 實(shí)施例1 :
[0012] 天然抗菌肽Alligatorin4的發(fā)現(xiàn)
[0013] 通過(guò)檢索，從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)網(wǎng)站的揚(yáng)子鱷基因組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)一條基因 序列（XP_006037273. 1)，長(zhǎng)度為519bp，編碼的多肽前體由172個(gè)氨基酸殘基組成。該基因 及其編碼的多肽前體分別如SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示：
[0014] atgcagacctgctgggtcatcctgctcctgcccctgctcggggcagccagcaccgagctg
[0015] MQTCWVILLLPLLGAASTEL
[0016] cccacccctggcaccgacccaccacagctcacgccgacctacgcccaggccctggccacg
[0017] PTPGTDPPQLTPTYAQALAT
[0018] gccgtcgacgtctacaaccaagggcccggcgtggacttcgccttccggctcctggaggca
[0019] AVDVYNQGPGVDFAFRLLEA
[0020] gagtcccgggacgactgggacgcgagcacggatcccctgcggcagctggagttcaccctg
[0021] ESRDDWDASTDPLRQLEFTL
[0022] aaggagaccgagtgccccgtgggcgaggaccagcccctggaccagtgcgacttcaaggat
[0023] KETECPVGEDQPLDQCDFKD
[0024] ggcggggcggtgctggactgcacagggaccttctcctgctccgaggcctcgctcatggtg
[0025] GGAVLDCTGTFSCSEASLMV
[0026] ctggtcacctgccaacccgccgagcccctgcctgaccgcgtccgcaggggtctattcaag
[0027] LVTCQPAEPLPDRVRRGLFK
[0028] aagctgaggaggaaaatcaagaagggctttaagaaaatcttcaagcgcctgcctcccgtc
[0029] KLRRKIKKGFKKIFKRLPPV
[0030] ggtgtcggtgtctccatcccactcgcaggaaggcggtga
[0031] GVGVSIPLAGRR-
[0032] 將該基因序列用 NCBI 網(wǎng)站的 blastX 軟件（http://blast. st_va. ncbi. nlm. nih. gov/Blast.cgi ? PROGRAM = blastx&PAGE-TYPE = BlastSearch&LINK-L0C = blasthome)進(jìn)行序列比對(duì)分析結(jié)果表明，該基因的編碼產(chǎn)物可能為揚(yáng)子鱷cathelicidins 家族抗菌肽前體。進(jìn)一步將該基因編碼的多肽前體序列用NCBI網(wǎng)站的protein blast 軟件（http://blast.st_va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ? PROGRAM = blastp&PAGE- TYPE = BlastSearch&LINK_L0C = blasthome)進(jìn)行序列比對(duì)，并與之前發(fā)現(xiàn)的其它動(dòng)物 來(lái)源cathelicidins家族抗菌肽序列進(jìn)行比較分析，確定該抗菌肽成熟過(guò)程中酶切位點(diǎn) 為-R133-v134-，從而獲得該抗菌肽成熟肽序列 RRGLFKKLRRKIKKGFKKIFKRLPPVGVGVSIPLAGRR( 氨基酸單字母簡(jiǎn)寫(xiě)序列），命名為Alligatorin4。Alligatorin4與目前已知所有抗菌肽的 氨基酸序列存在明顯差異。
[0033] 實(shí)施例2
[0034] 抗菌肽Alligatorin4的化學(xué)合成方法
[0035] (1)用自動(dòng)多肽合成儀（433A, Applied Biosystems)合成 Alligatorin4 的全序 列，通過(guò)HPLC (：18反相柱層析脫鹽純化。（2)分子量測(cè)定采用常規(guī)基質(zhì)輔助激光解析電離飛 行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-T0F)法。（3)純化的Alligatorin4用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純 度>95%，分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-T0F，4402. ?a)， 等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)為12. 78,用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀確定其氨基酸序列結(jié)構(gòu)與天然 Alligatorin4 一致。
[0036] 實(shí)施例3 :
[0037] 抗菌肽Alligatorin4抗菌活性檢測(cè)
[0038] (1)分別挑取保存于斜面上的試驗(yàn)菌株（大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌 ATCC27853購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，其它菌株從當(dāng)?shù)蒯t(yī)院收集）均勻涂布 于MH固體培養(yǎng)基（購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司）平板上，將經(jīng)過(guò)滅菌的0. 5cm直徑 的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加溶解于滅菌去離子水的2mg/ml的Alligatorin4樣品溶液 10 μ 1，于37°C倒置培養(yǎng)18-20小時(shí)，觀察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會(huì)在 濾紙片周?chē)纬汕逦该鞯囊志?，抑菌圈越大表明樣品抗菌活性越?qiáng)。結(jié)果表明，抗菌肽 Alligatorin4對(duì)表2中列出的菌株種類(lèi)均具有抗菌活性。
[0039] (2)采用 2 倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration): 選擇上述實(shí)驗(yàn)步驟（1)中具有抑菌圈的菌株進(jìn)行MIC測(cè)定實(shí)驗(yàn)。將試驗(yàn)菌株接種到ΜΗ液 體培養(yǎng)基（購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司）中，然后在培養(yǎng)箱中37°C振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期，而后用新鮮MH液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株培養(yǎng)液稀釋到2X 105cfu/ml 待用。
[0040] 在無(wú)菌96孔板各孔中預(yù)先加入100 μ 1 MH液體培養(yǎng)基，然后在第一孔中加入 100 μ 1用ΜΗ液體培養(yǎng)基稀釋到一定濃度的經(jīng)0. 22 μ m孔濾膜過(guò)濾的的Alligatorin4樣 品溶液，混勻后取100 μ 1加入第2孔，依次倍比稀釋?zhuān)▍⒁?jiàn)表1)，自第9孔吸出100 μ 1棄 去，第10孔為對(duì)照管。
[0041] 表1稀釋方法
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種天然抗菌肽Alligatorin4,其特征在于，所述抗菌肽來(lái)源于揚(yáng)子鱷，由38個(gè)氨 基酸組成，分子量為4402. ?a，等電點(diǎn)為12. 78,其氨基酸序列表如SEQ ID NO: 1所示：Arg Arg Gly Leu Phe Lys Lys Leu Arg Arg Lys lie Lys Lys Gly Phe Lys Lys lie Phe Lys Arg Leu Pro Pro Val Gly Val Gly Val Ser lie Pro Leu Ala Gly Arg Arg，所有氨基酸 均為L(zhǎng)-型。
2. -種如權(quán)利要求1所述的天然抗菌肽Alligatorin4在制備抗菌藥物或組合物、抑制 細(xì)菌生長(zhǎng)藥物或組合物、防腐劑、動(dòng)物飼料添加劑或化妝品添加劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K8/64GK104151415SQ201410315332
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】王義鵬, 于海寧, 高久香, 蔡莎莎 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)