細(xì)胞支架構(gòu)建體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用接種有獲自自體來源的細(xì)胞的支架而進(jìn)行的層狀結(jié)構(gòu)的體腔器官或組織結(jié)構(gòu)的再生、重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換。
【專利說明】細(xì)胞支架構(gòu)建體
[0001] 本申請(qǐng)是基于申請(qǐng)日為2009年11月4日， 優(yōu)先權(quán)日:為2008年11月4日，申請(qǐng)?zhí)?為200980153634. 8 (PCT/US2009/063306)，發(fā)明名稱為："細(xì)胞支架構(gòu)建體"的專利申請(qǐng)的 分案申請(qǐng)。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及使用接種有獲自自體來源的細(xì)胞的支架而進(jìn)行的層狀結(jié)構(gòu)的體腔器 官或組織結(jié)構(gòu)的再生、重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換。

【背景技術(shù)】
[0003] -些畸形可導(dǎo)致膀胱發(fā)育異常并需要進(jìn)行手術(shù)擴(kuò)張。例如后尿道瓣膜、雙側(cè)輸尿 管異位、膀胱外翻、生殖腔外翻和脊柱裂（即脊髓脊膜突出）的病癥會(huì)使膀胱變得順應(yīng)性 差，從而導(dǎo)致膀胱容量變小并產(chǎn)生較高的壓力。在臨床上，這會(huì)使患者發(fā)生失禁，并增加由 于泌尿系統(tǒng)壓力過高而導(dǎo)致的腎衰竭的風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)這些兒童患者的標(biāo)準(zhǔn)治療是通過腸膀 胱成形術(shù)進(jìn)行的膀胱擴(kuò)張（Lewis et al. Br. J. Urol. (1990) ;65:488-491)。膀胱擴(kuò)張包括 從患者的大腸上取一部分，并將該組織連接到已經(jīng)存在的膀胱上，以增加順應(yīng)性、降低壓力 和增加容量。這一手術(shù)相當(dāng)復(fù)雜和昂貴。即使手術(shù)在技術(shù)上很成功，在手術(shù)過程中也會(huì)伴隨 各種中間風(fēng)險(xiǎn)，患者還可能發(fā)生慢性并發(fā)癥。這些手術(shù)的侵入性、花費(fèi)和并發(fā)癥使得該手術(shù) 只能被限制用于最嚴(yán)重的膀胱缺陷患者。對(duì)成人進(jìn)行的類似手術(shù)過程是針對(duì)通常由于膀胱 癌而需要進(jìn)行膀胱替換的患者進(jìn)行。對(duì)成人而言，需要切除整個(gè)膀胱并用大腸來替換。盡 管具有不利影響的風(fēng)險(xiǎn)，每年在美國仍完成10, 〇〇〇例這樣的手術(shù)，其中約10%為患有先天 性畸形的兒童，90%為患有后天失調(diào)例如膀胱癌的成年人。在醫(yī)學(xué)上，顯然迫切地需要改進(jìn) 的方法來消除或至少大大減少由現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的護(hù)理引起的不利影響。
[0004] 在人類尿膀胱是一個(gè)肌性膜性的囊，位于盆腔前部并作為尿液的儲(chǔ)存裝置，它通 過輸尿管接收尿液并通過尿道排出尿液。在人類中，膀胱位于盆腔中的髖骨（恥骨聯(lián)合）的 后方，由膀胱向下和向后連接到被稱為尿道的引流管，尿道開口到體外。膀胱會(huì)發(fā)生多種疾 病和損傷，這引起了患者的膀胱惡化。例如，膀胱惡化可能由傳染性疾病、腫瘤和發(fā)育異常 導(dǎo)致。此外，膀胱惡化也可能由創(chuàng)傷（例如車禍和運(yùn)動(dòng)損傷）所導(dǎo)致。常常有必要對(duì)膀胱癌 患者實(shí)行尿流改道。在美國每年新增超過54, 000例的膀胱癌病例。大多數(shù)膀胱癌為上皮 細(xì)胞起源，全世界每年新增約336, 000例尿路上皮癌（移行細(xì)胞癌（TCC) MKakizoe (2006) Cancer Sci. 97(9)821)。
[0005] 當(dāng)個(gè)體由于泌尿系統(tǒng)損傷或功能喪失而不能排尿時(shí)，尿流改道是一種引導(dǎo)尿液從 體內(nèi)排出的方法。通常，任何阻礙尿液流動(dòng)并增加輸尿管和/或腎內(nèi)的壓力的病癥都可能 需要尿流改道。一些需要尿流改道的適應(yīng)癥包括需要進(jìn)行膀胱切除術(shù)的膀胱癌、損害腎 功能的神經(jīng)性膀胱功能障礙、膀胱的輻射損傷、女性的不可控性失禁以及慢性骨盆疼痛綜 合征。通常對(duì)于尿流改道有兩種主要的策略：尿道再造術(shù)（urostomy)和可控性尿流改道 (continent diversion)。尿道再造術(shù)包括在腹部制造一個(gè)與體內(nèi)管道相通的開孔，所述體 內(nèi)管道例如小腸粘膜下層（SI)的一小段，例如回腸、結(jié)腸或空腸。在這種方法中，所述短 SI的另一端與輸尿管相連接，輸尿管正常情況下是將尿液從腎運(yùn)輸至膀胱。尿液通過輸尿 管流入所述短SI，然后通過所述開孔流至體外的收集袋中。這種方法的另一種替代方案是 將輸尿管直接與所述開孔相連接，這也稱為輸尿管造瘺術(shù)（ureterostomy)?？煽匦阅蛄鞲?道包括在胃或小腸或大腸部位在體內(nèi)制造一個(gè)袋或儲(chǔ)存裝置，這樣可能需要或不需要再使 用開孔。例如，可以取一段腸子并將其改造為更接近球形的形狀，從而制造可控性皮膚儲(chǔ)存 裝置。所述經(jīng)過改形的區(qū)段的一端與輸尿管連接，另一端與開孔連接并通向體外的收集袋。 最后，將所述經(jīng)過改形的區(qū)段放置在原來膀胱的位置，將其一端與輸尿管連接，另一端與尿 道連接，這樣就完成了原位尿流改道，使得個(gè)體可以通過尿道排尿，而不必再通過所述開孔 排尿。
[0006] 雖然小腸粘膜下層（SI)可用于尿流改道，但據(jù)報(bào)道除去粘膜和粘膜下層會(huì)使腸 區(qū)段發(fā)生收縮（參見例如Atala，A.，J. Urol. 156:338 (1996))。其他已有報(bào)道的由于使用胃 腸區(qū)段進(jìn)行膀胱手術(shù)的問題包括：形成結(jié)石、粘液產(chǎn)生增多、腫瘤形成、感染、代謝紊亂、長 時(shí)間攣縮和吸收。已經(jīng)表明，使用天然材料進(jìn)行尿流改道時(shí)，由于膀胱組織具有其特殊的肌 肉彈性以及尿道上皮的不透性功能，使其并不容易被替換。此外，使用患者自身的腸區(qū)段進(jìn) 行尿流改道需要進(jìn)行至少兩個(gè)不同的手術(shù)過程，第一個(gè)手術(shù)是取出腸區(qū)段，第二個(gè)手術(shù)是 安裝尿流改道。由于需要多個(gè)手術(shù)，從而增加了手術(shù)的總成本、患者的風(fēng)險(xiǎn)以及患者的總體 不適程度。
[0007] 因此，鑒于與使用胃腸區(qū)段進(jìn)行尿道改道相關(guān)的多種并發(fā)癥以及需要多次手術(shù)過 程，仍然需要方法和裝置來為需要尿道改道系統(tǒng)的患者提供這類系統(tǒng)。
[0008] 尿失禁是一個(gè)普遍的問題，會(huì)發(fā)生于所有年齡和身體健康水平的人群，無論在 社區(qū)還是在醫(yī)療機(jī)構(gòu)中都會(huì)發(fā)生。醫(yī)學(xué)上，尿失禁容易使患者發(fā)生尿路感染，褥瘡，會(huì)陰 部紅疹和尿膿毒癥。在社會(huì)學(xué)和心理學(xué)層面，尿失禁會(huì)引起尷尬、社會(huì)歧視、抑郁癥，以 及尤其是對(duì)老年人而言會(huì)引起寄居機(jī)構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)增加（^^20 6丨31.，4]111.1^￥.661'0111：〇1· Geriatrics, 9:74 (1989))。在經(jīng)濟(jì)上，關(guān)于尿失禁的花費(fèi)也是驚人的，僅美國每年花在關(guān)于 失禁方面的費(fèi)用就超過百億美元。
[0009] 尿失禁可以歸因于真性的尿壓力（膀胱及尿道過度活動(dòng)）或固有的括約肌功能障 礙（"ISD"）或兩種原因均有。尿失禁在婦女中尤其常見，并在較少程度上存在于兒童（特 別是ISD)和接受了前列腺根除術(shù)的男性。
[0010] 應(yīng)激性尿失禁是不自主的尿液流失，發(fā)生于增加腹內(nèi)壓的物理活動(dòng)的過程中，例 如在咳嗽，打噴嚏，大笑或運(yùn)動(dòng)時(shí)。一個(gè)人可能患有上述兩種類型的尿失禁中的一種或兩種 均有，當(dāng)兩種均有時(shí)，就被稱為混合性尿失禁。雖然對(duì)尿失禁已有了一些認(rèn)識(shí)，但是在大多 數(shù)情況下的急迫性尿失禁是特發(fā)性的，這意味著具體原因無法確定。尿失禁可能發(fā)生在任 何年齡的任何人群，并且在女性和老年人群中更為常見。
[0011] 逼尿肌是膀胱壁肌肉，它的收縮使得尿液從膀胱排出。逼尿肌功能異常例如逼尿 肌反射亢進(jìn)的結(jié)果包括膀胱順應(yīng)性變差、膀胱內(nèi)壓力升高和膀胱容量減小，所有這些結(jié)果 都可能導(dǎo)致上尿路惡化。
[0012]目前治療急迫性尿失禁的一種方法是注射神經(jīng)毒素，例如肉毒桿菌毒素，例如 Botox敗據(jù)認(rèn)為，肉毒桿菌毒素通過麻痹膀胱壁上的逼尿肌或者可能影響膀胱傳入途徑 和減少膀胱上皮下神經(jīng)中感覺受體，從而發(fā)揮對(duì)膀胱活動(dòng)過度的效果。肉毒桿菌毒素分子 的大尺寸可以限制其擴(kuò)散能力，從而防止其達(dá)到傳入和傳出神經(jīng)纖維。因此，當(dāng)前治療膀胱 活動(dòng)過度癥（OAB)的方法例如需要許多次地（通常是20至50次）將肉毒桿菌毒素注射進(jìn) 膀胱壁肌肉，從而增加了就醫(yī)次數(shù)和相關(guān)的治療費(fèi)用。此外，慢性地和長期地抑制從膀胱釋 放的感覺神經(jīng)遞質(zhì)的安全性尚未確定。
[0013] 其他治療尿失禁的方法涉及給予具有膀胱松弛特性的藥物，抗膽堿能藥物是此類 藥物的主要代表。例如，抗膽堿藥例如普魯本辛（propantheline bromide),或者平滑肌松 弛劑/抗膽堿能藥物的組合例如消旋奧昔布寧和dicyclomin的組合，已被用來治療尿失禁 (參見例如，A. J. Wein，Urol. Clin. N. Am.，22:557 (1995))。然而，這種藥物治療經(jīng)常不能夠 對(duì)所有類型的尿失禁患者均獲得完全的成功，并且經(jīng)常導(dǎo)致患者出現(xiàn)明顯的副作用。
[0014] 除了藥物療法之外，在本發(fā)明出現(xiàn)之前，本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方法包 括人造括約?。↙ima S.V.C.et al.，J. Urology, 156:622_624 (1996) ;Levesque P.E.et al.，J. Urology, 156:625-628 (1996))、膀胱；頸支撐假體（Kondo A. et al.，J.Urology，157:824-827 (1996))、注射交聯(lián)的膠原?61'!11&11(：.16七&1.，工 Urology,157:122-124(1997) ；Perez L.M.et al. , J. Urology,156:633-636 (1996)； Leonard Μ· P. et al.，J. Urology, 156:637-640 (1996))以及注射聚四氟乙烯（Perez L. M. et al.，J. Urology, 156:633-636 (1996))。
[0015] 一種最近為人們所熟知的治療由ISD引起的尿失禁的方法是對(duì)患者實(shí)行尿道周 內(nèi)視鏡的膠原蛋白注射。這擴(kuò)張了膀胱肌肉，并致力于減少膀胱泄漏或應(yīng)激性尿失禁的可 能性。
[0016] 現(xiàn)有的治療尿失禁的技術(shù)方案有著眾所周知的缺點(diǎn)。雖然在內(nèi)視鏡指導(dǎo)下在膀胱 頸周圍注射膠原蛋白的方法對(duì)于括約肌缺陷獲得了相當(dāng)高的成功率，并且沒有顯著的發(fā)病 率，但是膠原蛋白的使用可能會(huì)導(dǎo)致平均在兩年之后發(fā)生的衰竭，并且還需要考慮到其成 本效益問題（（Khullar V.et al. ,British J.Obstetrics&Gynecology, 104:96-99(1996)) 。此外，對(duì)可能由于遷移現(xiàn)象而導(dǎo)致的患者控制力的惡化（Perez L. M. et al.)可能需要重 復(fù)注射，以恢復(fù)控制力（Herschorn S.et al.，J. Urology, 156:1305-1309 (1996))。
[0017] 在前列腺根除術(shù)之后使用膠原來治療應(yīng)激性尿失禁的結(jié)果也通常令人失望 (Klutke C. G. et al.，J. Urology, 156:1703-1706(1996))。而且，一個(gè)研究提供證據(jù)表明， 注射牛皮膠原會(huì)產(chǎn)生IgG和IgA類的特異性抗體（McCell and，M.and Delustro，F(xiàn).，J. Urologyl55, 2068-2073(1996))。因此，可以預(yù)計(jì)的是，隨著時(shí)間推移可能會(huì)出現(xiàn)患者對(duì)膠 原的過敏。
[0018] 雖然僅獲得了有限的成功，但是由于缺少其他合適的替代方法，經(jīng)尿道的膠原注 射仍然是一種可接受的固有括約肌缺陷的治療方法。
[0019] 目前，醫(yī)生們對(duì)于患有活動(dòng)過度性膀胱障礙或急性尿失禁的患者起初都先進(jìn)行非 侵入性的藥物治療。然而，如果藥物治療無效，醫(yī)生們都會(huì)推薦侵入性更強(qiáng)的治療方案。
[0020] 因此，需要侵入性最小的由于擴(kuò)張現(xiàn)有的層狀結(jié)構(gòu)的體腔器官或組織結(jié)構(gòu)（例如 膀胱）的方法。
[0021] 已經(jīng)成功地應(yīng)用組織工程學(xué)原理提供了可植入的細(xì)胞接種基質(zhì)，以用于層狀結(jié)構(gòu) 的體腔器官或組織結(jié)構(gòu)的重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換，所述體腔器官或組織結(jié)構(gòu)例如膀胱、膀 胱的一部分或膀胱組件。如Atala的美國專利No. 6, 576, 019所述，所述細(xì)胞可以來源于可 以患者自身的組織，包括膀胱、尿道、輸尿管和泌尿生殖組織。然而，作為使用最初的器官位 置作為發(fā)育新的和健康的工程組織的基本單元的方法而言，依賴于這樣的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的 開發(fā)和維持是有問題的。例如，在治療有缺陷的膀胱時(shí)，細(xì)胞來源就是具體的問題，因?yàn)橛?來源于有缺陷的膀胱的膀胱細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果可能培養(yǎng)出的細(xì)胞也是有缺陷的。使用這 樣的細(xì)胞并不是用于接種新的膀胱支架或基質(zhì)的明智選擇。因此，需要另外的適用于接種 可植入的新的器官/組織結(jié)構(gòu)支架或基質(zhì)的細(xì)胞來源。
[0022] 有大量文獻(xiàn)支持這一觀念：人類脂肪組織是成人干細(xì)胞的豐富來 源（Devlin et al. (2004)，Cytotherapy6:7_14 ;Awad，et al. (2003)，Tissue Engineering9:1301-12 ；Erickson et al. (2002), Biochemical and Biophysical Research Communications290:763-769 ；Gronthos et al. (2001), Journal of Cellular Physiologyl89:54-63 ；Halvorsen et al. (2001) ；Metabolism50:407-413 ； Halvorsen et al. (2001), Tissue Eng. 6:729-41 ；Harp et al. (2001), Biochemical and Biophysical Research Communication281:907-912 ;Hicok et al. (2004), Tissue EngineeringlO:371-380 ；Safford et al. (2002),Jun7,294 (2):371-9 ；Safford et al, (2004), Experimental Neurologyl87:319-28 ；Sen et al. (2004), Journal of Cellular Biochemistry81:312-319 ；Sigal et al. (1994),Hepatologyl9:999-1006 ； Wickham et al. (2003), Clinical Orthopedics and Related Research, 412:196-212 ； Ashijian et al. (2003),Plast Reconstr Surg. 111:1922-31 ；De Ugarte et al. (2003)，Cells Tissues Organs. 174:101-9 ;Mizumo et al. (2002)，Plast Reconstr Surg. 109:199-209 ；Morizono et al. (2003), Hum Gene Ther. 14:59-66 ； Winter et al. (2003), Arthritis Rheum. 48:418-29 ；Zuk et al. (2001), Tissue Eng7:2n-228;Zuk et al.(2002)，Mol Bioll3:4279 - 4295，綜述于 Gimble et al. (2003)，CytotherapyS: 362-369)。這些細(xì)胞被稱為脂肪來源的成人干（ADAS)細(xì) 胞，它們具有與MSC相似的免疫基因型和分化潛能（Gixmthos et al. (2001)，Joumal of Cellular Physiologyl89:54-63 ；Safford et al. (2002), Biochem Biophys Res Commun. 294(2):371-9 ;Zuk et al. (2002)，Mol Biol Celll3:4279-4295)。
[0023] 在公眾領(lǐng)域中已知能夠從人類吸脂手術(shù)樣本中分離成人干細(xì)胞的有 效的和可重復(fù)的方法（Aust et al. (2004)，Cytotherapy6:7-14 ;Halvorsen et al. (2001)，Metab〇liSm50:407-413)。所述方法包括將組織用膠原酶消化、差異離心和在培 養(yǎng)中擴(kuò)增。在經(jīng)過24小時(shí)的培養(yǎng)之后，一克組織能夠產(chǎn)生50, 000至100, 000個(gè)基質(zhì)細(xì)胞 (Sen et al. (2001)，J Cellular Biochemistry81:312-319)。對(duì)來源于 20 個(gè)獨(dú)立供體的 樣本的分析獲得了一致的結(jié)果：從Iml吸脂手術(shù)廢液中平均能夠收獲401，000個(gè)細(xì)胞，其存 活率為94% (Aust et al. (2004)，Cytotherapy6:7_14)。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，可以在兩 周時(shí)間內(nèi)從標(biāo)準(zhǔn)脂肪吸取物中獲得含有大于5億個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0024] 在存在地塞米松、胰島素、異丁基甲基黃嘌呤和噻唑烷二酮的條件下，ADAS細(xì)胞會(huì) 經(jīng)歷脂肪形成過程（Sen et al. (2001) Journal of Cellular Biochemistry81:312-319)。 ADAS細(xì)胞的分化潛能并不限于分化為脂肪細(xì)胞譜系。已經(jīng)報(bào)道了促使ADAS細(xì)胞向軟骨 細(xì)胞和成骨細(xì)胞途徑分化的條件（Awad，et al. (2003)，Tissue Engineering9:1301_12; Erickson e t a I. (2002), Biochemical and Biophysical Research Communications290:763-769 ；Halvorson et al. (2001),Metabolism50:407-413 ； Hicok et al. (2004), Tissue EngineeringlO:371-380 ；ffickham et al. (2003), Clinic Orthopedics and Related Research412:196-212)。在通過皮下植入被植入免疫缺 陷型小鼠體內(nèi)后，人類ADAS細(xì)胞與羥基磷灰石生物材料合成骨基質(zhì)相結(jié)合（Hikok et al. (2004)，Tissue Engineeringl0:371-380)。有大量數(shù)據(jù)能夠證明，在存在抗氧化劑 和其他培養(yǎng)基物的條件下培養(yǎng)的來源于鼠類或人類脂肪組織的成人干細(xì)胞（分別稱為 muADAS和huADAS)會(huì)發(fā)生與神經(jīng)分化相一致的形態(tài)學(xué)和基因型的變化（De Ugarte(2003) Cells Tissues Organs. 174:101-9 ；Safford et al. (2002),294(2):371-9 ；Safford et al. (2004), Experimental Neurologyl87:319-28) 〇
[0025] 如 Jayo et al. Regen. Med. (2008) 3 (5)，671-682 (下文中稱為 " Jayo I "）所述， 試圖修復(fù)器官或組織的方法的特征在于頻繁地通過膠原沉積或有時(shí)通過疤痕組織形成來 不完全地替換組織。Jayo等人還觀察到一個(gè)更有益的組織工程學(xué)結(jié)果，就是組織結(jié)構(gòu)或器 官的原始結(jié)構(gòu)和功能的再生。還可參見Jayo et al.，J. Urol. (2008) 180 ;392-397(下文中 稱為"Jayo II"）。已確信由某些分子與體內(nèi)的再生過程有關(guān)。例如，趨化因子MCP-I是其 中最熟悉的，它具有募集單核細(xì)胞的能力。然而，它似乎還是血管平滑肌細(xì)胞增殖的強(qiáng)有絲 分裂原。MCP-I將循環(huán)系統(tǒng)中的單核細(xì)胞募集至血管受損的區(qū)域，所述單核細(xì)胞通常轉(zhuǎn)化 為巨噬細(xì)胞并稱為細(xì)胞因子和生長因子的儲(chǔ)庫。巨噬細(xì)胞還攝取膽固醇并氧化脂肪。巨噬 細(xì)胞和肌肉前體細(xì)胞均被認(rèn)為是MCP-I信號(hào)傳導(dǎo)的靶標(biāo)。CCR-2受體是MCP-I (CCL2)的配 體，CCR-2缺陷型小鼠表現(xiàn)出再生缺陷和增強(qiáng)的脂肪生成/纖維化。CCR-2缺陷型小鼠的局 部受到骨骼肌再生刺激時(shí)與正常小鼠相比具有如下區(qū)別：細(xì)胞間隙增多、出現(xiàn)大量炎性細(xì) 胞、肌纖維腫腫大且變圓、細(xì)胞間隙中有更多的成纖維細(xì)胞積累、脂肪浸潤與脂肪堆積周圍 的膠原分布、伴有I丐沉積的纖維化（Warren et al.(2005), FASEB J. 19:413-415 ;Selzman et al. (2002), Am J Physiol Heart Circ Physiol.283 (4) ；H1455-H1461 ；Shannon et al. (2007), Am. J. Cell Physiol. 292:C953-C967 ；Shireman et al. (2006), J. Surg. Res. 134(I):145-57. Epub2006Feb20 ；Amann et al. (1998), Brit.J.Urol.82:118-121 ； Schecter et al. (2004),J.Leukocyte Biol.75:1079-1085 ；Deonarine et al. ,(2007) ,Transl Med. 5:11 ;Lumeng et al. (2007)，J Clin. Invest. 117(1) :175 - 184)。
[0026] 本發(fā)明涉及來源于自體來源的細(xì)胞群，所述自體來源與將如本文所述被再生、重 建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的器官或組織結(jié)構(gòu)不同；本發(fā)明還涉及分離這類細(xì)胞的方法、接種有 這類細(xì)胞的新的器官/組織結(jié)構(gòu)支架或基質(zhì)（構(gòu)建體）和制備它們的方法，以及使用這類 新的器官/組織結(jié)構(gòu)構(gòu)建體治療有需要的患者的方法。
[0027] 發(fā)明概述
[0028] 本發(fā)明涉及使用接種有來自受試者的自體細(xì)胞的支架，在受試者體內(nèi)進(jìn)行層狀結(jié) 構(gòu)的體腔器官或組織結(jié)構(gòu)的再生、重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換。
[0029] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了尿流改道構(gòu)建體和制備和使用所述構(gòu)建體的方法。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述尿流改道針對(duì)受試者的有缺陷的膀胱，且包括：(a)第一可植入的、 生物相容性構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括管狀支架，所述管狀支架具有被構(gòu)造為與腹腔壁區(qū)域 相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個(gè)被構(gòu)造為與第一輸尿管相連接的第一側(cè)部 開口；以及（b)并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細(xì)胞群，所述自體細(xì)胞群沉積在所述 支架的表面上或其中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述尿流改道針對(duì)受試者的有缺陷的膀胱，且 包括：一個(gè)第一可植入的、生物相容性的管狀支架，所述支架適于尿液的臨時(shí)儲(chǔ)存和通過， 所述支架包括一個(gè)被構(gòu)造為與所述受試者的腹腔壁上的開口相連接的第一末端，和至少一 個(gè)適于與一個(gè)第一輸尿管相連接的第一側(cè)部開口，從而使得來自所述第一輸尿管的尿液能 夠通過所述開口流至所述管狀支架的內(nèi)部；和（b)并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細(xì) 胞群，所述自體細(xì)胞群沉積在所述支架的表面上或其中。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備用于有需要的受試者體內(nèi)的有缺陷的膀胱 的尿流改道構(gòu)建體的方法，所述方法包括下述步驟：a)提供一個(gè)第一可植入的生物相容性 支架，所述支架包括一個(gè)管狀支架，所述管狀支架具有一個(gè)被構(gòu)造為與腹腔壁區(qū)域相連接 的第一末端和一個(gè)第二封閉末端，和至少一個(gè)被構(gòu)造為與一個(gè)第一輸尿管相連接的第一側(cè) 部開口；以及（b)將并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細(xì)胞群沉積在所述支架的一個(gè)第 一區(qū)域上或其中，以形成尿流改道構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟： a)提供一個(gè)可植入的、生物相容性的管狀支架，所述支架適于尿液的臨時(shí)儲(chǔ)存和通過，所述 支架包括一個(gè)被構(gòu)造為與所述受試者的腹腔壁上的開口相連接的第一末端和一個(gè)第二封 閉末端，和至少一個(gè)適于與一個(gè)第一輸尿管相連接的第一側(cè)部開口，從而使得來自所述第 一輸尿管的尿液能夠通過所述開口流至所述管狀支架的內(nèi)部；以及（b)將并非來源于所述 有缺陷的膀胱的自體細(xì)胞群沉積在所述支架的一個(gè)第一區(qū)域上或其中，以形成尿流改道構(gòu) 建體。
[0031] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備用于有需要的受試者體內(nèi)的有缺陷的膀 胱的尿流改道構(gòu)建體的方法，所述方法包括下述步驟：a)提供一個(gè)第一可植入的生物相容 性支架，所述支架包括一個(gè)管狀支架，所述管狀支架具有一個(gè)被構(gòu)造為與腹腔壁區(qū)域相連 接的第一末端和一個(gè)第二封閉末端，和至少一個(gè)被構(gòu)造為與一個(gè)第一輸尿管相連接的第一 側(cè)部開口；以及（b)將并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細(xì)胞群沉積在所述支架的一個(gè) 第一區(qū)域上或其中，以形成尿流改道構(gòu)建體；以及c)將所述構(gòu)建體植入所述受試者體內(nèi)以 形成尿流改道。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟：a)提供一個(gè)可植入的、生物 相容性的管狀支架，所述支架適于尿液的臨時(shí)儲(chǔ)存和通過，所述支架包括一個(gè)被構(gòu)造為與 所述受試者的腹腔壁上的開口相連接的第一末端和一個(gè)第二封閉末端，和至少一個(gè)適于與 一個(gè)第一輸尿管相連接的第一側(cè)部開口，從而使得來自所述第一輸尿管的尿液能夠通過所 述開口流至所述管狀支架的內(nèi)部；以及（b)將并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細(xì)胞群 沉積在所述支架的一個(gè)第一區(qū)域上或其中，以形成尿流改道構(gòu)建體；以及c)將所述構(gòu)建體 植入所述受試者體內(nèi)以形成尿流改道。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括將一個(gè)尿流改 道構(gòu)建體植入所述受試者體內(nèi)的步驟，所述尿流改道構(gòu)建體包括：(a) -個(gè)管狀支架，所述 管狀支架具有一個(gè)被構(gòu)造為與腹腔壁區(qū)域相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個(gè) 被構(gòu)造為與一個(gè)第一輸尿管相連接的第一側(cè)部開口；以及（b)并非來源于所述有缺陷的膀 胱的自體細(xì)胞群，所述自體細(xì)胞群沉積在所述支架的表面上或其中，以形成所述尿流改道。
[0032] 在所有實(shí)施方案中，所述尿流改道支架還可包括一個(gè)被構(gòu)造為與第二輸尿管相連 接的第二側(cè)部開口。在所有實(shí)施方案中，所述第一末端可被構(gòu)造為與所述腹腔壁的位置平 齊。在所有實(shí)施方案中，所述第一末端可被構(gòu)造為縫合在所述受試者的皮膚上。在所有實(shí) 施方案中，所述第一末端可被構(gòu)造為形成開孔。在所有實(shí)施方案中，所述開孔還可包括開孔 扣。在所有實(shí)施方案中，所述支架還包括被構(gòu)造為形成開孔的墊圈環(huán)。在所有實(shí)施方案中， 所述生物相容性支架為可生物降解的。在所有實(shí)施方案中，所述支架可包括選自下列的材 料：聚乙醇酸，聚乳酸，以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。在所有實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群為 平滑肌細(xì)胞群。在所有實(shí)施方案中，所述改道可以替換所述有缺陷的膀胱。在所有實(shí)施方 案中，所述改道可為臨時(shí)性的。在所有實(shí)施方案中，所述改道可為永久性的。在所有實(shí)施方 案中，所述管狀支架可具有矩形或三角形或圓形的截面形狀。在所有實(shí)施方案中，所述改道 可不含有尿道上皮細(xì)胞。在所有實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可提供一種新的尿路管道，其特 征在于能夠再生類似尿道的組織。在所有實(shí)施方案中，所述再生的組織的特征可為具有下 列一種或多種結(jié)構(gòu)：尿道上皮、固有層和平滑肌束。在所有實(shí)施方案中，在所述再生的組織 中可觀察到下列一種或多種結(jié)構(gòu)：輸尿管-膀胱連接（UCJ)、所述導(dǎo)管的頭區(qū)和所述導(dǎo)管的 圍腔區(qū)。在所有實(shí)施方案中，所述再生的組織的特征可為具有下列一種或多種結(jié)構(gòu)：粘膜、 粘膜下層和具有維管基質(zhì)的平滑肌。在所有實(shí)施方案中，所述再生的組織為覆蓋平滑肌的 連續(xù)尿道上皮。在所有實(shí)施方案中，所述尿路管道在被植入后形成上皮化的粘膜。
[0033] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的平滑肌細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群來 源于外周血，并包含具有收縮功能的一種或多種細(xì)胞，并且對(duì)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物呈陽性。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群來源于脂肪組織，并包含具有收縮功能的一種或多種細(xì)胞， 并且對(duì)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物呈陽性。
[0034] 在所有實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群的特征可為具有選自下列的一種或多種平滑肌細(xì) 胞標(biāo)記物：心肌蛋白（myocardin)、a-平滑肌肌動(dòng)蛋白、I丐結(jié)合蛋白（calponin)、肌球蛋白 重鏈、BAALC、結(jié)蛋白（desmin)、成肌纖維細(xì)胞抗原和SM22。在所有實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群 可表達(dá)心肌蛋白（ΜΥ0⑶）。在所有實(shí)施方案中，術(shù)語"ΜΥ0⑶"包括編碼MYO⑶多肽的核酸和 MYO⑶多肽。
[0035] 在所有實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群的收縮功能可為鈣依賴性的。
[0036] 在另一方面，本發(fā)明提供了直接來源于人類脂肪組織的平滑肌細(xì)胞（SMC)群。在 一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種生物標(biāo)記物在所述SMC群中的表達(dá)相對(duì)于其在人類骨髓來源 的MSC中的表達(dá)有差異，所述至少一種生物標(biāo)記物選自：0ct4B、骨橋蛋白、BMP6、⑶44,和 IL-lB、⑶F5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAMl、PECAM、vWF和Flk-l。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至 少一種生物標(biāo)記物在所述SMC群中的表達(dá)比其在人類骨髓來源的MSC中的表達(dá)水平要低， 所述至少一種生物標(biāo)記物選自：⑶F5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAMl、PECAM、vWF 和 Flk-I。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種生物標(biāo)記物在所述SMC群中的表達(dá) 比其在人類骨髓來源的MSC中的表達(dá)水平要高，所述至少一種生物標(biāo)記物選自：0ct4B、骨 橋蛋白、BMP6、CD44 和 IL-1B。
[0037] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了直接來源于人類脂肪組織的平滑肌細(xì)胞群， 所述平滑肌細(xì)胞群的特征在于與人類骨髓來源的MSC中相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平相比：（a) ⑶F5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAM1、PECAM、vWF 和 Flk-I 中的至少一種的表達(dá)水平降低； 和（b)0ct4B、骨橋蛋白、BMP6、⑶44和IL-IB中的至少一種的表達(dá)水平升高。在又另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述平滑肌細(xì)胞群的特征在于與人類骨髓來源的MSC中相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平相 t匕：（a)GDF5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAM1、PECAM、vWF 和 Flk-I 的表達(dá)水平全部降低；和 (b)0ct4B、骨橋蛋白、BMP6、⑶44和IL-IB的表達(dá)水平全部升高。
[0038] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了直接來源于脂肪組織的平滑肌細(xì)胞群，所述 平滑肌細(xì)胞群包括⑶45+的一種或多種細(xì)胞和/或⑶117+的一種或多種細(xì)胞。
[0039] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了直接來源于人類脂肪組織的平滑肌細(xì)胞群， 所述平滑肌細(xì)胞群的增殖周期比人類骨髓來源的MSC短。
[0040] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了直接來源于脂肪組織的平滑肌細(xì)胞群，所述 平滑肌細(xì)胞群在培養(yǎng)物中表現(xiàn)出增殖的接觸依賴性抑制。
[0041] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了直接來源于脂肪組織的平滑肌細(xì)胞群，所 述平滑肌細(xì)胞群的特征在于至少一種平滑肌細(xì)胞（SMC)標(biāo)記物響應(yīng)于凝血噁烷A2模擬物 而下調(diào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述SMC標(biāo)記物選自心肌蛋白和肌球蛋白重鏈-平滑肌同種 型（SMMHC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述心肌蛋白和SMMHC響應(yīng)于凝血噁烷A2模擬物而下 調(diào)。
[0042] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的平滑肌細(xì)胞群為純化的細(xì)胞群。
[0043] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞來源于脂肪組織的細(xì)胞制品或細(xì)胞群。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群來源于脂肪組織的SVF。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述SVF包括異源 的細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群包括完全分化的平滑肌細(xì)胞。在又另一個(gè)實(shí) 施方案中，本發(fā)明提供了與人類骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)群有區(qū)別的人類脂肪來源 的平滑肌細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述區(qū)別指的是所述人類脂肪來源的SMC群與人類 骨髓來源的MSC群相比，在轉(zhuǎn)錄物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和功能屬性方面有所不同。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述來源于脂肪組織的細(xì)胞群從自體來源獲得。
[0044] 在另一方面，本發(fā)明提供了從自體外周血或脂肪來源分離平滑肌細(xì)胞群的方法。
[0045] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟：(a)將所述外周血樣本與密度梯度 材料相接觸；(b)離心所述樣本以確定包括單核細(xì)胞級(jí)分的密度梯度；(c)從所述密度梯度 中提取所述單核細(xì)胞級(jí)分，其中所述級(jí)分包括含有一種或多種平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞群，所述 一種或多種平滑肌細(xì)胞具有收縮功能并對(duì)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物呈陽性。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述方法還包括（d)培養(yǎng)所述細(xì)胞群的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述被培養(yǎng)的細(xì)胞群 在培養(yǎng)物中形成平滑肌細(xì)胞集落。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述集落在培養(yǎng)約5天至約10 天后形成。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群不形成內(nèi)皮集落。在其他實(shí)施方案中，所述 方法還包括擴(kuò)增步驟（d)中的細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述被擴(kuò)增的細(xì)胞群為純化 的細(xì)胞群。
[0046] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟：(a)用膠原酶消化脂肪組織樣本； (b)離心所述樣本以確定基質(zhì)血管級(jí)分（SVF);和（c)從所述樣本中提取SVF，其中所述級(jí) 分包括含有一種或多種平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞群，所述一種或多種平滑肌細(xì)胞具有收縮功能并 對(duì)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物呈陽性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括（d)培養(yǎng)所述細(xì)胞群 的步驟。在其他實(shí)施方案中，所述方法還包括擴(kuò)增步驟（d)中的細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，所述被擴(kuò)增的細(xì)胞群為純化的細(xì)胞群。
[0047] 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了提供分離的平滑肌細(xì)胞群的方法，所述方 法包括下述步驟：a)在不使用平滑肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)來源于人類脂肪 SVF的平滑肌細(xì)胞制品；和b)從所述培養(yǎng)的細(xì)胞制品中分離完全分化的平滑肌細(xì)胞群。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述培養(yǎng)步驟之前先進(jìn)行酶促消化脂肪組織的步驟。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，在所述培養(yǎng)步驟之前先進(jìn)行離心所述被消化的脂肪組織以提供SVF的步驟。在其 他實(shí)施方案中，在所述培養(yǎng)步驟之前先進(jìn)行洗滌和平板接種所述SVF的步驟。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述培養(yǎng)步驟包括篩選與粘附至細(xì)胞培養(yǎng)載體的細(xì)胞。在又另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述培養(yǎng)步驟不包括使用含有誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞分化的組分的培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述培養(yǎng)步驟包括使用含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，所述血清例如胎牛血清（FBS)，它包括 幾種內(nèi)源性生長因子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟不包括選擇并向所述細(xì)胞培養(yǎng) 基中加入特異性和外源性生長因子。通常，"外源性"生長因子為除了內(nèi)源性生長因子之外 的選擇并加入至細(xì)胞培養(yǎng)基中的生長因子，內(nèi)源性生長因子通常已由培養(yǎng)基中的血清組分 (例如FBS)來提供。外源性生長因子可為重組生長因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步 驟不包括使用含有外源性生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟不 包括使用含有重組生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0048] 在所有實(shí)施方案中，所述平滑肌細(xì)胞群不是脂肪來源的干細(xì)胞群，和/或所述平 滑肌細(xì)胞群不是間充質(zhì)干細(xì)胞群。
[0049] 在另一方面，本發(fā)明提供了用于為有需要的受試者提供新的層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官 或組織結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包括：(a)包括聚合物基質(zhì)或支架的 可植入的構(gòu)建體；和（b)沉積在所述聚合物基質(zhì)的表面上或其中的自體細(xì)胞群，所述自體 細(xì)胞群不來源于與新的器官或組織結(jié)構(gòu)相應(yīng)的天然器官或組織。
[0050] 在另一方面，本發(fā)明提供了為有需要的受試者提供新的膀胱或其部分的構(gòu)建體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包括：(a)包括聚合物基質(zhì)或支架的可植入的構(gòu)建體；和 (b)沉積在所述聚合物基質(zhì)的表面上或其中的且不來源于所述受試者的膀胱的自體細(xì)胞 群。
[0051] 在某些實(shí)施方案中，所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體具有橢圓形的形狀。在一些實(shí) 施方案中，所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體在被植入時(shí)形成折疊構(gòu)型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體在被植入前經(jīng)過處理，以使得所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體在 被植入時(shí)更為柔軟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體的最大長度為約 10cm。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體的最大長度為約4cm。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體的最大長度為約3cm。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體的最大寬度為約4cm。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述成形的聚合物基 質(zhì)構(gòu)建體具有的二維表面積為約30cm 2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建 體具有的二維表面積為約25cm2。
[0052] 在其他實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體含有包括一種或多種外周血來源或脂肪組織來源 的平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞群，所述一種或多種外周血來源或脂肪組織來源的平滑肌細(xì)胞具有收 縮功能，并且對(duì)于平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物呈陽性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體的所述細(xì)胞群 具有鈣依賴性收縮功能。
[0053] 在所有實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體中不含有其他細(xì)胞群。在所有實(shí)施方案中，所述構(gòu) 建體可不含有尿道上皮細(xì)胞。在所有實(shí)施方案中，沉積在所述基質(zhì)上的所述自體細(xì)胞群為 本文所述的人類脂肪來源的平滑肌細(xì)胞群。在所有實(shí)施方案中，所述人類脂肪來源的SMC 細(xì)胞群可為直接來源于SVF和完全分化的細(xì)胞群。在所有實(shí)施方案中，被接種在所述基質(zhì) 上的人類脂肪來源的SMC細(xì)胞群在所述構(gòu)建體被植入至所述受試者的所需部位后，具有產(chǎn) 生MCP-I的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述MCP-I誘導(dǎo)天然間充質(zhì)干細(xì)胞趨向于所植入的 位置。
[0054] 在另一方面，本發(fā)明提供了適于被植入有需要的受試者體內(nèi)的新的器官或組織結(jié) 構(gòu)構(gòu)建體的制備方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟：a)獲得人類脂肪組織 樣本；b)從所述樣本中分離完全分化的平滑肌細(xì)胞群；c)培養(yǎng)所述細(xì)胞群；和d)將所述細(xì) 胞群與成型的聚合物基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建體相接觸，其中所述步驟a)、b)、c)和d)進(jìn)行約45天或 更短時(shí)間。在所有實(shí)施方案中，所述人類脂肪組織樣本從自體來源獲得。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，所述方法還包括檢測平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表 達(dá)為mRNA表達(dá)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)為多肽表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過 細(xì)胞內(nèi)免疫熒光方法檢測所述多肽表達(dá)。
[0055] 在另一方面，本發(fā)明提供了為有需要的受試者提供層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié) 構(gòu)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟：a)提供生物相容性的、合成的或天 然的聚合物基質(zhì)，所述聚合物基質(zhì)的形狀與需要治療的器官或組織結(jié)構(gòu)的至少一部分相適 應(yīng)；b)在所述聚合物基質(zhì)的一個(gè)第一區(qū)域上或其中沉積自體細(xì)胞群，所述自體細(xì)胞群不來 源于與所述新的器官或組織結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的天然器官或組織；和c)將所述成形的聚合物基 質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建體植入至所述受試者體內(nèi)，以用于形成層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)。在另 一方面，本發(fā)明提供了為有需要的受試者提供新的膀胱或其部分的方法。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述方法包括：a)提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基質(zhì)，所述聚合物基質(zhì)的 形狀與膀胱或其部分相適應(yīng)；b)在所述聚合物基質(zhì)的一個(gè)第一區(qū)域上或其中沉積自體細(xì) 胞群，所述自體細(xì)胞群不來源于所述受試者的膀胱；和c)將所述成形的聚合物基質(zhì)細(xì)胞構(gòu) 建體植入至所述受試者體內(nèi)，以用于形成新的膀胱或其部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所 述方法的步驟b)中的所述細(xì)胞群含有一種或多種外周血來源的平滑肌細(xì)胞，所述平滑肌 細(xì)胞具有收縮功能且對(duì)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物呈陽性；或者，步驟b)中的所述細(xì)胞群含有一種 或多種脂肪組織來源的平滑肌細(xì)胞，所述平滑肌細(xì)胞具有收縮功能且對(duì)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物 呈陽性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群的收縮功能為鈣依賴性的。在所有實(shí)施方案中， 沉積在所述基質(zhì)上的自體細(xì)胞群為本文所述的人類脂肪來源的平滑肌細(xì)胞群。在所有實(shí)施 方案中，被接種在所述基質(zhì)上的人類脂肪來源的SMC細(xì)胞群在所述構(gòu)建體被植入至所述受 試者的所需部位后，具有產(chǎn)生MCP-I的能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述MCP-I誘導(dǎo)天然間充 質(zhì)干細(xì)胞趨向于所植入的位置。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括對(duì)被植入的管道構(gòu)建體用所述受試者的 網(wǎng)膜、腸系膜、肌肉筋膜和/或腹膜進(jìn)行包裹以使其能夠血管化的步驟。
[0057] 本發(fā)明還涉及使用接種有來源于有需要的受試者的自體細(xì)胞的支架來擴(kuò)張所述 受試者的層狀結(jié)構(gòu)的體腔器官或組織結(jié)構(gòu)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在需要這種治療的 受試者體內(nèi)擴(kuò)張已有的層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)的方法，所述方法通過下述步驟實(shí) 現(xiàn)：提供聚合物基質(zhì)或支架，所述聚合物基質(zhì)或支架的形狀與需要治療的器官或組織結(jié)構(gòu) 的至少一部分相適應(yīng)，且所述聚合物基質(zhì)或支架的大小足以使其通過腹腔鏡方法而被植 入；將不是來源于所述器官或組織結(jié)構(gòu)的自體細(xì)胞群沉積在所述聚合物基質(zhì)的一個(gè)第一區(qū) 域上或其中；以及通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體植入至所述受試者體內(nèi) 的治療位置，以使得所述已有的層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)被擴(kuò)張。在某些實(shí)施方案 中，所述腔體器官或組織結(jié)構(gòu)為膀胱或膀胱的一部分。
[0058] 在另一方面，本發(fā)明提供了用于增加需要此治療的受試者的膀胱容積的方法，所 述方法通過下述步驟實(shí)現(xiàn)：提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基質(zhì)或支架，所述聚 合物基質(zhì)或支架的形狀與膀胱的至少一部分相適應(yīng)，且所述聚合物基質(zhì)或支架的大小足以 使其通過腹腔鏡方法而被植入；將不是來源于所述受試者的膀胱的自體細(xì)胞群沉積在所述 聚合物基質(zhì)的一個(gè)第一區(qū)域上或其中；以及通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建 體植入至所述受試者體內(nèi)的治療位置，由此增加膀胱容積。在一個(gè)實(shí)施方案中，膀胱容積的 增加量為約50mL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，膀胱容積的增加量為約100mL。
[0059] 在又另一方面，本發(fā)明提供了用于擴(kuò)張需要此治療的受試者的膀胱中的膀胱切口 位置的方法，所述方法通過下述步驟實(shí)現(xiàn)：提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基質(zhì) 或支架，所述聚合物基質(zhì)或支架的形狀與膀胱的至少一部分相適應(yīng)，且所述聚合物基質(zhì)或 支架的大小足以使其通過腹腔鏡方法而被植入；將不是來源于所述受試者的膀胱的自體細(xì) 胞群沉積在所述聚合物基質(zhì)的一個(gè)第一區(qū)域上或其中；以及通過腹腔鏡方法將所述成形的 聚合物基質(zhì)構(gòu)建體植入至所述受試者體內(nèi)的治療位置，由此擴(kuò)張膀胱切口位置。
[0060] 在又另一方面，本發(fā)明提供了治療需要此治療的受試者的尿失禁的方法，所述方 法通過下述步驟實(shí)現(xiàn)：提供生物相容性的、合成的或天然的聚合物基質(zhì)或支架，所述聚合物 基質(zhì)或支架的形狀與膀胱的至少一部分相適應(yīng)，且所述聚合物基質(zhì)或支架的大小足以使其 通過腹腔鏡方法而被植入；將不是來源于所述受試者的膀胱的自體細(xì)胞群沉積在所述聚合 物基質(zhì)的一個(gè)第一區(qū)域上或其中；以及通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體植 入至所述受試者體內(nèi)的治療位置，由此增加膀胱容積。
[0061] 本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明的聚合物基質(zhì)或支架的成套工具及其使用說明書。 [0062] 在另一方面，本發(fā)明提供了用于在植入后監(jiān)測受試者體內(nèi)的新的器官或組織結(jié)構(gòu) 再生的預(yù)后方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括檢測獲自所述受試者的測試樣本和對(duì) 照樣本中的MCP-I表達(dá)水平，其中所述測試樣本中的MCP-I表達(dá)水平高于對(duì)照樣本則表明 了受試者體內(nèi)的再生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述新的器官或組織結(jié)構(gòu)來源于本文所 述的自體平滑肌細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測MCP-I多肽表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，使用抗MCP-I試劑來檢測MCP-I多肽表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗MCP-I試劑為 抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用免疫組化方法檢測MCP-I多肽表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 在所述檢測步驟之前先進(jìn)行從受試者獲取所述測試樣本的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述測試樣本為血液。
[0063] 附圖簡述
[0064] 圖1顯示了膀胱擴(kuò)張支架的一個(gè)實(shí)例。
[0065] 圖2顯示了膀胱替換支架的一個(gè)實(shí)例。
[0066] 圖3顯示了尿流改道或管道支架的一個(gè)實(shí)例。
[0067] 圖3A顯示了具有不同類型截面的尿流改道構(gòu)建體的一個(gè)實(shí)例，還顯示了被設(shè)計(jì) 為與輸尿管相連接的開口的可能位置。
[0068] 圖3B顯示了尿流改道構(gòu)建體的幾種變化方案（A-開口呈卵形；B-開口呈卵形 的容器；C -封閉的卵形容器和三個(gè)管）。
[0069] 圖4顯示了尿流改道或管道構(gòu)建體的不同應(yīng)用。
[0070] 圖5A-B顯示了肌肉等效物支架的實(shí)例。
[0071] 圖6顯示了呈片狀或帶狀形式的各種肌肉等效物支架的圖。
[0072] 圖7顯示了不同的肌肉等效物支架及其分別的植入方法。圖7a顯示了平面片狀 支架的形成。圖7b顯示了適于通過腹腔鏡方法植入的支架，所述支架可在植入時(shí)被卷起并 送入腹腔鏡管中，然后在腹腔中展開。圖7c顯示了適于通過腹腔鏡方法植入的支架片，所 述支架片形成卷曲構(gòu)型以便于通過腹腔鏡管被插入，然后它將在腹腔中展開。圖7d顯示了 適于通過腹腔鏡方法植入的支架片，所述支架片形成卷曲構(gòu)型或手風(fēng)琴形的構(gòu)型以便于通 過腹腔鏡管被插入，然后它將在腹腔中展開。圖7e顯示了用于植入肌肉等效物支架的可能 的手術(shù)方法。圖7f顯示了在空膀胱和充盈的膀胱中的植入位置。圖7g顯示了帶有手術(shù)切 口的膀胱模型，顯示了在表面上切割是產(chǎn)生的橢圓形切口。
[0073] 圖8顯示了預(yù)折疊的手風(fēng)琴形構(gòu)型的支架片，以便于被插入通過腹腔鏡管口。
[0074] 圖9A顯示了被預(yù)先切為帶狀然后縫合在一起的支架，從而使其能夠堆積和被插 入腹腔鏡管口中，并保證了在腹腔中的定位。
[0075] 圖9B顯示了一個(gè)長18. 7cm、寬2. Ocm的具有兩折的支架。
[0076] 圖9C顯示了一個(gè)長13. 3cm、寬2. 8cm的具有三折的支架。
[0077] 圖9D顯示了一個(gè)長9. 7cm、寬4. Ocm的具有四折的支架。
[0078] 圖9E顯示了一個(gè)包括兩片的支架，其中每一片長9. 7cm、寬2. Ocm并具有兩折。
[0079] 圖10顯示了被植入的管道構(gòu)建體的構(gòu)型的實(shí)例。
[0080] 圖11顯示了臨時(shí)性尿流改道構(gòu)建體的植入組件的實(shí)例。
[0081] 圖12顯示了永久性尿流改道構(gòu)建體的植入組件的實(shí)例。
[0082] 圖13顯示了尿流改道構(gòu)建體的其他應(yīng)用。
[0083] 圖14顯示了犬外周血單核細(xì)胞級(jí)分（血塊黃層）的培養(yǎng)物。
[0084] 圖15顯示了犬外周血生長出的細(xì)胞。
[0085] 圖16顯示了犬平滑肌細(xì)胞在傳代幾次之后的形態(tài)。
[0086] 圖17顯示了從豬和人類的脂肪分離的平滑肌細(xì)胞。
[0087] 圖18顯示了對(duì)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的基因表達(dá)的RT-PCR分析。
[0088] 圖19顯示了平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的免疫熒光蛋白表達(dá)。
[0089] 圖20顯示了從人類外周血分離的平滑肌細(xì)胞的免疫染色。
[0090] 圖21顯示了從血液（A)、脂肪組織⑶和膀胱組織（C)分離的豬平滑肌細(xì)胞的收 縮力測定結(jié)果。
[0091] 圖22顯示了從人類脂肪組織分離的平滑肌細(xì)胞的生長與每單位面積回收的細(xì)胞 數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系。
[0092] 圖23顯示了從豬的脂肪（A)、外周血（B)和膀胱平滑?。–)分離的平滑肌細(xì)胞生 長與每代回收的細(xì)胞數(shù)之間的函數(shù)關(guān)系。
[0093] 圖24顯示了從人類膀胱平滑肌、脂肪、外周血和膀胱尿道上皮分離的細(xì)胞中細(xì)胞 因子MCP-I的表達(dá)。
[0094] 圖25顯示了 MCP-I的產(chǎn)生和接種細(xì)胞的密度之間的相關(guān)性。
[0095] 圖26顯示了輸尿管支架。
[0096] 圖27顯示了一種新的管道構(gòu)建體。
[0097] 圖28顯示了一種與輸尿管（實(shí)線箭頭）相連接的新的管道構(gòu)建體（虛線箭頭）。
[0098] 圖29顯示了與輸尿管（實(shí)線箭頭）相連接的構(gòu)建體的內(nèi)流端和朝向手術(shù)產(chǎn)生的 開口（虛線箭頭）的外流端。
[0099] 圖30顯示了所述開孔和用于尿液引流的導(dǎo)管。
[0100] 圖31-32顯示了植入有不含細(xì)胞的支架的動(dòng)物的細(xì)胞檢查圖。
[0101] 圖33顯示了植入有用血液來源的SMC接種的支架的動(dòng)物的細(xì)胞檢查圖。
[0102] 圖34-36植入有用血液來源的SMC接種的支架的動(dòng)物的細(xì)胞檢查圖。
[0103] 圖37顯示了植入有用血液來源的SMC接種的支架的動(dòng)物的細(xì)胞檢查圖。
[0104] 圖38-39顯示了植入有用脂肪來源的SMC接種的支架的動(dòng)物的細(xì)胞檢查圖。
[0105] 圖40-42顯示了植入有用脂肪來源的SMC接種的支架的動(dòng)物的細(xì)胞檢查圖。
[0106] 圖43顯示了植入有用脂肪來源的SMC接種的支架的動(dòng)物的細(xì)胞檢查圖。
[0107] 圖44顯示了尿路管道的修整示意圖。
[0108] 圖45顯示了植入有新的尿路管道構(gòu)建體的動(dòng)物的亞肉眼照片。
[0109] 圖46顯示了植入有新的尿路管道構(gòu)建體的動(dòng)物在輸尿管-管道連接處附近的新 的尿路管道的顯微照片。
[0110] 圖47顯示了植入有新的尿路管道構(gòu)建體的動(dòng)物在輸尿管-管道連接處附近的新 的尿路管道的顯微照片。
[0111] 圖48顯示了植入有新的尿路管道構(gòu)建體的動(dòng)物的管道中壁的顯微照片。
[0112] 圖49顯示了植入有新的尿路管道（膀胱SMC支架）的動(dòng)物的腎盂造影照片。
[0113] 圖50顯示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的動(dòng)物的腎盂造影照片。
[0114] 圖51顯示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的動(dòng)物的腎盂造影照片。
[0115] 圖52顯示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的動(dòng)物的腎盂造影照片。
[0116] 圖53顯示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的動(dòng)物的腎盂造影照片。
[0117] 圖54顯示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的動(dòng)物的腎盂造影照片。
[0118] 圖55顯示了植入有新的尿路管道（血液SMC支架）的動(dòng)物的腎盂造影照片。
[0119] 圖56顯示了植入有新的尿路管道（僅有支架）的動(dòng)物的腎盂造影照片。
[0120] 圖57顯示了有新的尿路管道（僅有支架）的動(dòng)物的腎盂造影照片。
[0121] 圖58顯示了有新的尿路管道（僅有支架）的動(dòng)物的腎盂造影照片。
[0122] 圖59顯示了后固定的管道（A)和修整示意圖（B)。圖59C表明了管道的各區(qū)域。
[0123] 圖60顯示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的動(dòng)物的顯微照片。
[0124] 圖61顯示了植入有新的尿路管道（膀胱SMC支架）的動(dòng)物的顯微照片。
[0125] 圖62顯示了植入有新的尿路管道（脂肪SMC支架）的動(dòng)物的顯微照片。
[0126] 圖63顯示了植入有新的尿路管道（膀胱SMC支架）的動(dòng)物的顯微照片。
[0127] 圖64顯示了由再生的泌尿組織形成的新的膀胱管道的組織學(xué)特征。
[0128] 圖65顯示了天然輸尿管-膀胱連接處的三種肌肉組分。
[0129] 圖66顯示了管道構(gòu)建體受體的子宮-管道（utero-conduit)連接處。
[0130] 圖67顯示了植入的管道構(gòu)建體的組織學(xué)。
[0131] 圖68顯示了豬的㈧膀胱來源、（B)脂肪來源和（C)外周血來源的平滑肌細(xì)胞的 形態(tài)學(xué)特征。
[0132] 圖69顯示了豬的膀胱來源、脂肪來源和外周血來源的平滑肌細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞 相關(guān)標(biāo)記物的RT-PCR分析。
[0133] 圖70顯示了豬的膀胱來源、脂肪來源和外周血來源的平滑肌細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞 相關(guān)標(biāo)記物的免疫熒光分析。
[0134] 圖71顯示了豬的㈧膀胱來源、（B)脂肪來源和（C)外周血來源的平滑肌細(xì)胞的 收縮力。
[0135] 圖72顯示了（A)膀胱來源、（B)脂肪來源和（C)外周血來源的外周血來源的平滑 肌細(xì)胞的生長動(dòng)力學(xué)。
[0136] 圖73顯示了從新的尿路管道構(gòu)建體形成的再生的泌尿組織的組織學(xué)特征。
[0137] 圖74顯示了植入有尿流改道構(gòu)建體的動(dòng)物體內(nèi)上皮化粘膜的存在。
[0138] 圖75顯示了植入的新的膀胱構(gòu)建體在4個(gè)月時(shí)的膀胱造影照片。A-膀胱來源的 SMC ;B -血液來源的SMC ;C -脂肪組織來源的SMC ;D -天然膀胱對(duì)照。
[0139] 圖76顯示了植入的新的膀胱構(gòu)建體隨時(shí)間變化的㈧容積和⑶順應(yīng)性。
[0140] 圖77顯示了 4個(gè)月以后的動(dòng)物的平均體重。
[0141] 圖78顯示了 4個(gè)月以后的動(dòng)物的平均血清肌酸酐水平。
[0142] 圖79顯示了 4個(gè)月以后的動(dòng)物的平均BUN。
[0143] 圖80顯示了 4個(gè)月以后的動(dòng)物的平均堿性磷酸酶（ALP)。
[0144] 圖81顯示了 4個(gè)月以后的動(dòng)物的平均總蛋白水平。
[0145] 圖82顯示了 4個(gè)月以后的動(dòng)物的平均白細(xì)胞（WBC)水平。
[0146] 圖83顯示了植入的構(gòu)建體在4個(gè)月以后的膀胱造影照片（血液來源的SMC)。
[0147] 圖84顯示了植入的構(gòu)建體在4個(gè)月以后的膀胱造影照片（脂肪來源的SMCs)。
[0148] 圖85顯示了人類膀胱發(fā)育的周期。
[0149] 圖86顯示了隨著年齡的膀胱容積增加和尿液輸出量。
[0150] 圖87A-C顯示了循環(huán)影響再生的結(jié)果。
[0151] 圖88顯示循環(huán)對(duì)臨床結(jié)果的再生-增強(qiáng)效果的轉(zhuǎn)換。
[0152] 圖89顯示了肌肉等效物支架的植入。
[0153] 圖90顯示了動(dòng)物在植入肌肉等效物支架后4周時(shí)的膀胱造影照片。
[0154] 圖91顯示了表達(dá)在脂肪來源的細(xì)胞群中各種標(biāo)記物的水平：㈧脂連素 (adiponection)和 FABP-4 ; (B)SMa A、SM22、心肌蛋白、SMMHC ; (C)鈣結(jié)合蛋白；（D)VECAD、 vWF、PECAM、FLTl ;和（E) FLK 和 TEK。
[0155] 圖92顯示了平滑肌標(biāo)記物對(duì)培養(yǎng)基類型的依賴性：(A) SMa A、SM22、心肌蛋白、 SMMHC ;和⑶鈣結(jié)合蛋白。
[0156] 圖93顯示了在脂肪來源的細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中，平滑肌標(biāo)記物鈣結(jié)合蛋白、心 肌蛋白和SMMHC的表達(dá)的比較。
[0157] 圖94顯示了在釋放來源的細(xì)胞中SMa A、SM22、心肌蛋白和鈣結(jié)合蛋白隨時(shí)間的 表達(dá)。
[0158] 圖95顯示了在脂肪來源的細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中內(nèi)皮標(biāo)記物的表達(dá)。
[0159] 圖96顯示了脂肪來源的細(xì)胞中細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。
[0160] 圖97顯示了間充質(zhì)干細(xì)胞中細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。
[0161] 圖98顯示了 MSC、膀胱來源的SMC、Ad-SMC和人類主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)組 學(xué)標(biāo)記的比較性分析。
[0162] 圖99顯示了脂肪來源的細(xì)胞在培養(yǎng)物中隨時(shí)間的增殖能力。
[0163] 圖100顯示了脂肪來源的細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)U46619的響應(yīng)。
[0164] 圖101顯示了中胚層分化標(biāo)記物的RT-PCR分析結(jié)果。
[0165] 圖102顯示了在MSC/AdSMC中的0ct4A/0ct4B表達(dá)的RT-PCR分析結(jié)果。
[0166] 發(fā)明詳述
[0167] 本發(fā)明涉及的細(xì)胞群來源于與將進(jìn)行本文所述的重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的器官 或組織結(jié)構(gòu)不同的器官或組織結(jié)構(gòu)來源，本發(fā)明還涉及分離這類細(xì)胞的方法、用這類細(xì)胞 接種的新的器官/組織結(jié)構(gòu)支架或基質(zhì)（構(gòu)建體）及其制備方法，以及使用這類新的器官 /組織結(jié)構(gòu)構(gòu)建體治療有需要的患者的方法。
[0168] 1.定義
[0169] 除非另有定義，都在本文所使用的技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語的含義均與本發(fā) 明所述【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同。Principles of Tissue Engineering, 3rdEd. (Edited by R Lanza, R Langer, &J Vacanti)，2007 為本領(lǐng)域技術(shù)人員 提供了本申請(qǐng)所使用的許多術(shù)語的一般性指導(dǎo)。
[0170] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，許多與本文所述的方法和材料類似或等同的方法和 材料都可用于實(shí)施本發(fā)明。實(shí)際上，本發(fā)明并不局限于本文所述的方法和材料。為了本發(fā) 明的目的定義以下術(shù)語。
[0171] 本文所使用的術(shù)語"平滑肌細(xì)胞"或"SMC"指的是有收縮力的細(xì)胞，它們來源于與 本文所述的重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換構(gòu)建體和方法所應(yīng)用的目標(biāo)器官或組織不同的天然器 官或組織。所述SMC可來源于外周血或脂肪組織。對(duì)于脂肪組織而言，所述SMC可來源于 含有血管組織的SVF。因此，所述SMCs可來源于脂肪來源的血管床的毛細(xì)血管、動(dòng)脈和小靜 脈，或所述SMC可來源于含有周細(xì)胞的血管周圍環(huán)境。本發(fā)明提供的平滑肌細(xì)胞在被接種 至本文所述的支架或基質(zhì)上并在其上被培養(yǎng)后，能夠形成常見于中空器官（例如膀胱、腹 腔、胃腸道等等）壁上的非橫紋肌，并具有能夠收縮和舒張的特征。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能 夠知曉平滑肌細(xì)胞的其他特性。
[0172] 本文所使用的術(shù)語"細(xì)胞群"指的是直接從合適的哺乳動(dòng)物組織來源分離并經(jīng)過 隨后的體外培養(yǎng)而獲得的多個(gè)細(xì)胞。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠知曉適用于本發(fā)明的分離和 培養(yǎng)細(xì)胞群的各種方法，以及適用于本發(fā)明的細(xì)胞群中的各種細(xì)胞數(shù)量。所述細(xì)胞群可為 脂肪來源的、但其中基本不含脂肪細(xì)胞或非粘附性脂肪細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞群（SMC)。所述 SMC細(xì)胞群的特征可為與平滑肌細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物的表達(dá)。所述SMC細(xì)胞群也可為純化的 細(xì)胞群。所述SMC細(xì)胞群可來源于自體來源。
[0173] 本文所使用的術(shù)語"自體"指的是由同一個(gè)體衍生或轉(zhuǎn)移而來。自體平滑肌細(xì)胞 群來源于將作為本文所述可植入構(gòu)建體的受體的受試者。
[0174] 術(shù)語"標(biāo)記物"或"生物標(biāo)記物"通常指的是DNA、RNA、蛋白、碳水化合物或基于糖 脂的分子標(biāo)記物，它們?cè)谂囵B(yǎng)的細(xì)胞群中的表達(dá)或存在可通過標(biāo)準(zhǔn)方法（或本文所述的方 法）進(jìn)行檢測，并且與培養(yǎng)的細(xì)胞群中一種或多種細(xì)胞為特定細(xì)胞類型的事實(shí)相一致。通 常，術(shù)語細(xì)胞"標(biāo)記物"或"生物標(biāo)記物"指的是在本文所述的細(xì)胞群中表達(dá)并通常由天然細(xì) 胞表達(dá)的分子。所述標(biāo)記物可為由細(xì)胞表達(dá)的多肽，或?yàn)樵谌旧w上的可識(shí)別的位置，例如 由天然細(xì)胞表達(dá)的基因、限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)或編碼多肽的核酸（例如mRNA)。所述標(biāo)記 物可為被稱為"基因表達(dá)標(biāo)記物"的基因的表達(dá)區(qū)域，或?yàn)椴痪哂幸阎幋a功能的一些DNA 區(qū)段。
[0175] 術(shù)語"平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物"通常指的是DNA、RNA、蛋白、碳水化合物或基于糖脂的分 子標(biāo)記物，它們?cè)谂囵B(yǎng)的細(xì)胞群中的表達(dá)或存在可通過標(biāo)準(zhǔn)方法（或本文所述的方法）進(jìn) 行檢測，并且與培養(yǎng)的細(xì)胞群中一種或多種細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞的事實(shí)相一致。通常，術(shù)語平 滑肌細(xì)胞（SMC) "標(biāo)記物"或"生物標(biāo)記物"指的是通常由天然平滑肌細(xì)胞表達(dá)的分子。所 述標(biāo)記物可為由細(xì)胞表達(dá)的多肽，或?yàn)樵谌旧w上的可識(shí)別的位置，例如由SMC細(xì)胞表達(dá) 的基因、限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)或編碼多肽的核酸。所述標(biāo)記物可為被稱為"基因表達(dá)標(biāo)記 物"的基因的表達(dá)區(qū)域，或?yàn)椴痪哂幸阎幋a功能的一些DNA區(qū)段。本發(fā)明考慮到的這類標(biāo) 記物包括但不限于下述標(biāo)記物中的一種或多種：心肌蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、鈣結(jié)合蛋 白、肌球蛋白重鏈、BAALC、結(jié)蛋白、成肌纖維細(xì)抗原、SM22,以及上述標(biāo)記物的任何組合。
[0176] 術(shù)語"差異表達(dá)的基因"、"有差異的基因表達(dá)"以及它們的同義詞在本文中可以互 換使用，指的是一種基因在第一種細(xì)胞或細(xì)胞群中被激活的表達(dá)水平高于或低于其在第二 種細(xì)胞或細(xì)胞群表達(dá)的水平。這一術(shù)語還包括這樣的基因，其表達(dá)在所述第一或第二種細(xì) 胞在培養(yǎng)傳代過程中的不同階段被激活的表達(dá)水平有高低的區(qū)別。還應(yīng)當(dāng)理解的是，差異 表達(dá)的基因可在核酸水平或蛋白水平上被激活或被抑制，或可能經(jīng)歷改變的天然剪接而生 成不同的多肽產(chǎn)物。這種不同可能表現(xiàn)為例如多肽在mRNA水平、表面表達(dá)、多肽的分泌或 其他分區(qū)方面的改變。差異的基因表達(dá)可包括兩種或多種基因或其基因產(chǎn)物之間的表達(dá)的 比較，或兩種或多種基因或其基因產(chǎn)物之間的表達(dá)比例的比較，或甚至為同一基因的兩種 不同的加工產(chǎn)物之間的比較，上述比較是在所述第一種細(xì)胞和所述第二種細(xì)胞之間進(jìn)行， 并且兩種細(xì)胞之間應(yīng)存在差異。差異的表達(dá)包括例如所述第一種細(xì)胞和所述第二種細(xì)胞之 間的基因或其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)時(shí)序或細(xì)胞表達(dá)類型的定量和定性的差異。出于本發(fā)明的目 的，認(rèn)為"有差異的基因表達(dá)"指的是在所述第一和第二種細(xì)胞或在培養(yǎng)傳代過程的不同階 段中，給定基因的表達(dá)差異為至少約1倍、至少約1. 5倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少 約3倍、至少約3. 5倍、至少約4倍、至少約4. 5倍、至少約5倍、至少約5. 5倍、至少約6倍、 至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約10. 5倍、至少約11倍、至少約 11. 5倍、至少約12倍、至少約12. 5倍、至少約13倍、至少約13. 5倍、至少約14倍、至少約 14. 5倍或至少約15倍。標(biāo)記物的差異表達(dá)可為在脂肪來源的細(xì)胞（所述第一種細(xì)胞）中 相對(duì)于在間充質(zhì)干細(xì)胞或MSC (所述第二種細(xì)胞）中的差異表達(dá)。
[0177] 術(shù)語"抑制"、"下調(diào)"、"低表達(dá)"和"降低"在本文中可以互換使用，意為基因的表 達(dá)、或編碼一種或多種蛋白或蛋白亞基的RNA分子或RNA等價(jià)物分子的水平、或一種或多種 蛋白或蛋白亞基的活性相對(duì)于一種或多種對(duì)照（例如一種或多種陽性和/或陰性對(duì)照）而 言有所下降。所述低表達(dá)可為在脂肪來源的細(xì)胞中相對(duì)于MSC中的表達(dá)降低。
[0178] 本文所使用的術(shù)語"上調(diào)"或"過表達(dá)"為意為基因的表達(dá)、或編碼一種或多種蛋 白或蛋白亞基的RNA分子或RNA等價(jià)物分子的水平、或一種或多種蛋白或蛋白亞基的活性 相對(duì)于一種或多種對(duì)照（例如一種或多種陽性和/或陰性對(duì)照）而言有所上升。所述過表 達(dá)可為在脂肪來源的細(xì)胞中相對(duì)于MSC中的表達(dá)上升。
[0179] 術(shù)語"收縮功能"指的是平滑肌收縮功能，包括滑動(dòng)的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白纖維之 間的相互作用，該相互作用由鈣激活的肌球蛋白的磷酸化啟動(dòng)，并產(chǎn)生依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣水 平的收縮。
[0180] 術(shù)語"接觸依賴性抑制"指的是當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞彼此接觸時(shí)細(xì)胞生長的停止。如 果在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到細(xì)胞彼此堆積，或類似地觀察到轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物中的集落形成， 則認(rèn)為細(xì)胞生長沒有被接觸抑制，也就是說細(xì)胞缺乏接觸依賴性抑制的屬性。間充質(zhì)干細(xì) 胞不具有這一屬性。相反地，具有接觸依賴性抑制屬性的細(xì)胞不會(huì)被觀察到在培養(yǎng)物中彼 此堆積。
[0181] 術(shù)語"外周血"通常意為在全身循環(huán)的血液。
[0182] 術(shù)語"脂肪組織"或"脂肪"通常意為基本由脂肪細(xì)胞形成的松散的結(jié)締組織。脂 肪組織可從身體的各個(gè)部位獲得，收縮部位包括但不限于皮下（皮下脂肪）和內(nèi)部器官周 圍（內(nèi)臟脂肪）。
[0183] 術(shù)語"構(gòu)建體"指的是沉積在由一種或多種合成的或天然存在的生物相容性材料 形成的支架或基質(zhì)上的至少一種細(xì)胞群。所述細(xì)胞群可在體外或體內(nèi)與支架或基質(zhì)相結(jié) 合。
[0184] 術(shù)語"樣本"或"患者樣本"或"生物學(xué)樣本"通常意為獲自個(gè)體、體液、身體組織、細(xì) 胞系、組織培養(yǎng)物或其他來源的任何生物學(xué)樣本。這一術(shù)語包括體液，例如，血液例如外周 血或靜脈血，尿液，以及其他生物學(xué)來源的樣本，例如脂肪吸取物和固體組織活檢樣本，例 如活檢標(biāo)本（例如脂肪組織活檢標(biāo)本），或組織培養(yǎng)物或來源于組織培養(yǎng)物的細(xì)胞以及其 后代。這一定義還包括從來源獲得后經(jīng)過任何方式處理之后的樣本，例如通過試劑處理、溶 解或?qū)δ撤N組分（例如蛋白或多核苷酸）的富集。這一定義還涵蓋臨床樣本，還包括培養(yǎng)物 中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、生物學(xué)液體和組織樣本。樣本的來源可為 實(shí)體組織，例如來源于新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣本或活檢樣本或吸取物； 血液或任何血液成分；體液例如腦脊液、羊水、腹水或細(xì)胞間液；來源于受試者任何發(fā)育階 段的細(xì)胞。所述生物學(xué)樣本可含有并不天然存在于天然組織中的化合物，例如防腐劑、抗凝 齊IJ、緩沖劑、固定劑、營養(yǎng)劑、抗生素等等。所述樣本可用于診斷測定或監(jiān)測測定。從哺乳動(dòng) 物獲取樣本的方法是本領(lǐng)域公知的。如果術(shù)語"樣本"單獨(dú)使用，它仍舊表示所述"樣本"為 "生物學(xué)樣本"或"患者樣本"，即所述術(shù)語可以互換使用。樣本也可為測試樣本。
[0185] 本文所使用的術(shù)語"測試樣本"指的是來源于已被植入本文所述的構(gòu)建體的受試 者的樣本。所述測試樣本可來源于哺乳動(dòng)物受試者的各種來源，包括但不限于血液、血清、 尿液、精液、骨髓、粘膜、組織等等。
[0186] 本文所使用的術(shù)語"對(duì)照"或"對(duì)照樣本"指的是陰性對(duì)照，其中預(yù)期獲得陰性結(jié) 果以幫助與測試樣本中的陽性結(jié)果相關(guān)聯(lián)?；蛘撸鰧?duì)照可為陽性對(duì)照，其中預(yù)期獲得陽 性結(jié)果以幫助與測試樣本中的陰性結(jié)果相關(guān)聯(lián)。適用于本發(fā)明的對(duì)照包括但不限于：已知 具有正常的細(xì)胞因子水平的樣本、從已知沒有被植入本文所述的構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物受試者 獲得的樣本，和從已知為正常的哺乳動(dòng)物受試者獲得的樣本。對(duì)照也可為在受試者被植入 本文所述的構(gòu)建體之前從所述受試者獲得的樣本。此外，所述對(duì)照可為含有與測試樣本所 含細(xì)胞具有相同起源的正常細(xì)胞的樣本。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉適用于本發(fā)明的其他對(duì) 照。
[0187] 本文所使用的術(shù)語"患者"指的是需要治療的任何個(gè)體動(dòng)物，更優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物 (包括人類動(dòng)物，例如，狗、貓、馬、兔、動(dòng)物園動(dòng)物、牛、豬、羊以及非非人類靈長動(dòng)物）。最優(yōu) 選地，本文所述的患者為人類。
[0188] 本文所使用的術(shù)語"受試者"意為應(yīng)接受治療的任何個(gè)體人類受試者，包括患者， 它正具有或曾經(jīng)具有一種或多種器官功能缺陷或衰竭的征兆、癥狀或指征，包括泌尿系統(tǒng) 的缺陷、受損或功能不全。這樣的受試者包括但不限于新近或之前被確診的受試者和表現(xiàn) 疾病復(fù)發(fā)的受試者，或者出于任何原因而具有器官功能缺陷或衰竭風(fēng)險(xiǎn)的受試者。所述受 試者可能之前已經(jīng)接受過與器官功能缺陷或衰竭相關(guān)的治療或者未經(jīng)治療。受試者可為尿 流改道治療的候選者，包括但不限于患有膀胱癌而需要切除膀胱的受試者、患有神經(jīng)性膀 胱功能障礙而影響腎功能的受試者、患有膀胱放射性損傷的受試者和患有不自主性尿失禁 的受試者。所述受試者可為新近或之前被確診需要進(jìn)行尿流改道的受試者和經(jīng)歷并發(fā)癥的 受試者，或者出于任何原因而具有泌尿系統(tǒng)功能缺陷、受損或功能不全風(fēng)險(xiǎn)的受試者。所述 受試者可能之前已經(jīng)接受過與泌尿系統(tǒng)功能缺陷、受損、或功能不全相關(guān)的治療或者未經(jīng) 這樣的治療。
[0189] 本文所使用的術(shù)語"尿流改道"或"管道"指的是所述受試者與所植入的尿流改 道構(gòu)建體、愈合的輸尿管和鄰近的圍腔經(jīng)過一段時(shí)間相互作用之后所形成的器官或組織結(jié) 構(gòu)。圍腔與允許尿液通過腹腔壁的區(qū)室前部相連接，可由連接所述構(gòu)建體的尾端（位于腹 腔內(nèi)）和皮膚的腹腔包膜的最前管狀部分形成。
[0190] 術(shù)語"尾"和"頭"是相對(duì)于尿液產(chǎn)生和流動(dòng)的描述性術(shù)語。術(shù)語"尾"指的是所述 尿流改道構(gòu)建體在植入后最接近所述開孔處的一端，而術(shù)語"頭"指的是所述尿流改道構(gòu)建 體在植入后最接近腎臟和輸尿管的一端。
[0191] 術(shù)語"碎屑"指的是在植入尿流改道構(gòu)建體之后在愈合和再生過程中形成的碎片。 碎屑可由脫落的組織細(xì)胞、炎性滲出物和支架生物降解產(chǎn)物形成。如果所述管道被這類碎 片堵塞（外流不正常），那么停滯的碎片會(huì)在所述管道的腔中形成碎屑或半固體塊。
[0192] 術(shù)語"清創(chuàng)術(shù)"指的是通過手術(shù)或非手術(shù)方法從管道中去除外來物質(zhì)或被撕裂的、 無生命力的、被污染的或死亡的組織，以防止感染、防止堵塞和促進(jìn)愈合過程。所述清創(chuàng)術(shù) 可包括去除碎屑。
[0193] 術(shù)語"開孔"指的是通過手術(shù)生成的用于使尿液從尿流改道構(gòu)建體的引流管外流 端流出體外的開口。尿液通常由體外的尿袋收集。
[0194] 術(shù)語"開孔端"或"開孔扣"指的是用于保持所述開孔的開口處完整的手段例如裝 置。
[0195] 本文所使用的術(shù)語"擴(kuò)張"或"擴(kuò)大"指的是增加已有的層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組 織結(jié)構(gòu)的大小。例如，在本發(fā)明的一個(gè)方面，已有的層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)可被擴(kuò) 大 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或 29 個(gè)百分點(diǎn)。在本 發(fā)明的另一方面，已有的層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)可被擴(kuò)大例如以增加已有的層狀 結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)的已有的容積。
[0196] 本文所使用的術(shù)語"容積"指的是在確定的區(qū)域內(nèi)能夠含有的液體的量。
[0197] "再生預(yù)后"或"再生性預(yù)后"通常指的是對(duì)植入本文所述的構(gòu)建體后的可能過程 或結(jié)果的預(yù)報(bào)或預(yù)計(jì)。如本文所述，再生預(yù)后包括對(duì)下述一種或多種情況的預(yù)報(bào)或預(yù)計(jì)：在 膀胱替換或擴(kuò)張后膀胱功能的發(fā)展或改善、在管道植入后尿流改道功能的發(fā)展，改善的膀 胱容積的發(fā)展和改善的膀胱順應(yīng)性的發(fā)展。如本文所述，"對(duì)再生的預(yù)后"意為對(duì)對(duì)植入新 的器官或組織結(jié)構(gòu)后的可能過程或結(jié)果提供預(yù)報(bào)或預(yù)計(jì)。在一些實(shí)施方案中，"對(duì)再生的預(yù) 后"包括對(duì)下述一種或多種情況提供預(yù)報(bào)或預(yù)計(jì)：在膀胱替換或擴(kuò)張后膀胱功能的發(fā)展或 改善、在管道植入后尿流改道功能的發(fā)展，膀胱容積的發(fā)展或改善的膀胱容積，以及膀胱順 應(yīng)性的發(fā)展或改善的膀胱順應(yīng)性。
[0198] "再生的組織"指的是在植入本文所述的構(gòu)建體后發(fā)展出的器官或組織結(jié)構(gòu)的組 織。所述器官或組織結(jié)構(gòu)可為膀胱或膀胱的一部分。所述再生的組織可包括襯有平滑肌的 連續(xù)的尿道上皮。
[0199] 2.細(xì)朐群
[0200] 本發(fā)明提供了用于層狀結(jié)構(gòu)的體腔器官或組織結(jié)構(gòu)的重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的 平滑肌細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群包括具有收縮功能并對(duì)一種或多種平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物呈陽 性的至少一種細(xì)胞。
[0201] 如本文所述，已經(jīng)應(yīng)用組織工程學(xué)原理成功地提供了用于層狀結(jié)構(gòu)的體腔器 官和組織結(jié)構(gòu)的重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的可植入的細(xì)胞接種基質(zhì)，所述體腔器官和組 織結(jié)構(gòu)例如膀胱或通常由尿道上皮和平滑肌層構(gòu)成的膀胱組件。（Becker et al. Eur. Urol. 51, 1217-1228 (2007) ；Frimberger et al. Regen. Med. I, 425-435 (2006) ；Roth et al. Curr. Urol. R印· 10, 119-125(2009) ;Wood et al. Curr. Opin. Urol. 18, 564-569)。平滑 肌細(xì)胞可來源于患者自身的組織，包括膀胱、尿道、輸尿管和其他泌尿生殖組織。然而，作為 使用最初的器官位置作為發(fā)育新的和健康的工程組織的基本單元的方法而言，依賴于這樣 的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)和維持是有問題的（例如在膀胱癌的治療過程中）。顯然這樣的癌 細(xì)胞不適于接種在可植入的新的膀胱支架或基質(zhì)上。
[0202] 本發(fā)明提供了來源于與將進(jìn)行重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的器官或組織結(jié)構(gòu)不同的 器官或組織結(jié)構(gòu)來源的細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述來源為自體來源。
[0203] 在另一方面，所述細(xì)胞群表達(dá)與平滑肌細(xì)胞群一致的標(biāo)記物或平滑肌細(xì)胞群典型 的標(biāo)記物。
[0204] 在另一方面，本發(fā)明提供了從與將進(jìn)行重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的腔體器官或組織 結(jié)構(gòu)不同的器官或組織結(jié)構(gòu)來源分離的平滑肌細(xì)胞群。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述腔體 器官或組織結(jié)構(gòu)為膀胱或膀胱的一部分。
[0205] 在一個(gè)方面，所述來源為外周血。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述外周血來源的平滑肌細(xì) 胞群來源于患者樣本。所述患者樣本可為靜脈血。
[0206] 在一個(gè)方面，所述來源為脂肪組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂肪組織來源的平滑 肌細(xì)胞群來源于患者樣本。所述患者樣本可為在吸脂手術(shù)過程中取出的脂肪組織或脂肪吸 取物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，患者樣本
[0207] 在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的細(xì)胞群在被培養(yǎng)后可發(fā)展出多種平滑肌 細(xì)胞特征，所述特征包括但不限于："峰-谷"狀形態(tài)學(xué)，一種或多種平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的表 達(dá)，收縮功能，纖維形成和細(xì)胞因子合成。
[0208] 在一個(gè)方面，被培養(yǎng)的細(xì)胞群的特征在于其具有"峰-谷"狀形態(tài)學(xué)。具有"峰-谷" 狀形態(tài)學(xué)的細(xì)胞可具有多種特征，包括但不限于：紡錘形狀、在傳代時(shí)具有平坦和纖維狀、 呈平行列狀地延伸和排列、"漩渦"狀的生長外觀，以及上述任意特征的組合。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述細(xì)胞群在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)發(fā)展出平滑肌細(xì)胞典型的"峰-谷"狀形態(tài)學(xué)。
[0209] 在另一方面，被培養(yǎng)的細(xì)胞群的特征在于存在一種或多種平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)表達(dá)可檢測的平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物， 所述標(biāo)記物包括但不限于一種或多種下列蛋白：心肌蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、鈣結(jié)合蛋 白、肌球蛋白重鏈、BAALC、結(jié)蛋白、成肌纖維細(xì)胞抗原、SM22,以及它們的任意組合。
[0210] 在另一方面，被培養(yǎng)的細(xì)胞群的特征在于存在表達(dá)一種或多種細(xì)胞表面標(biāo)記物的 一種或多種細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)含有對(duì)細(xì)胞表 面標(biāo)記物呈陽性的一種或多種細(xì)胞，所述細(xì)胞表面標(biāo)記物包括但不限于下列一種或多種標(biāo) 記物：⑶73、⑶90、⑶105、⑶166、⑶31、⑶54、⑶56、⑶117,以及它們的任意組合。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)含有⑶45+、⑶31+、⑶54+、⑶56+、⑶90+ 和⑶105+的一種或多種細(xì)胞。
[0211] 在另一方面，被培養(yǎng)的細(xì)胞群的特征在于存在具有收縮功能的一種或多種細(xì)胞。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)發(fā)展出收縮功能。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述收縮功能為鈣依賴性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鈣依賴性的收縮功能可通 過與鈣螯合劑相接觸的抑制而得到證實(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鈣螯合劑為EDTA。本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠知曉其他本領(lǐng)域已知的合適的螯合劑。
[0212] 在又另一方面，被培養(yǎng)的細(xì)胞群的特征在于纖維形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì) 胞群在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)經(jīng)歷纖維形成。
[0213] 在一個(gè)方面，所述細(xì)胞群包括表達(dá)一種或多種細(xì)胞因子的至少一種細(xì)胞。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子選自=MCP-U制瘤素 M、IL-8和GR0。
[0214] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的細(xì)胞群在分離后的培養(yǎng)過程中具有有限的增殖壽命。在其 他實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群的增殖壽命為約1代、約2代、約3代、約4代、約5代、約6代、 約7代、約8代、約9代、約10代、約11代、約12代、約13代、約14代、約15代、約16代、 約17代或約18代。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群在培養(yǎng)中的增殖壽命不超過5代。 脂肪來源的SMC通常在培養(yǎng)中3-5天傳一代，血液來源的SMC通常在培養(yǎng)中14天開始產(chǎn)生 第一代，然后每3-5天傳一代（詳見實(shí)施例1)。
[0215] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有至少一種再生性細(xì)胞的再生性細(xì)胞群，所述再生 性細(xì)胞當(dāng)沉積在本文所述的支架或基質(zhì)上并被植入至有需要的受試者體內(nèi)時(shí)，能夠使得按 本文所述進(jìn)行重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的器官或組織結(jié)構(gòu)發(fā)生再生。再生性細(xì)胞群在被植入 有需要的患者體內(nèi)后能夠刺激或起動(dòng)層狀結(jié)構(gòu)的體腔器官或組織結(jié)構(gòu)的再生。通常，器官 或組織結(jié)構(gòu)的再生的特征為細(xì)胞組件、組織結(jié)構(gòu)和架構(gòu)、功能以及調(diào)節(jié)性發(fā)育的重建。此 夕卜，再生性細(xì)胞群最大程度上消除了在細(xì)胞接種腔體器官或組織結(jié)構(gòu)構(gòu)建體植入位置上可 能發(fā)生的不完整性或障礙。在植入職位處的組織破壞的表現(xiàn)為膠原沉積增加和/或疤痕組 織形成，這兩者中的每一個(gè)都可以通過使用再生性細(xì)胞群而被最大程度地消除。此外，某些 細(xì)胞事件是再生性過程的指征。對(duì)于通過本文所述的細(xì)胞群和支架再生的膀胱或膀胱的一 部分而言，再生的器官或組織結(jié)構(gòu)包括從朝向腔體表面延伸的多個(gè)微脈管放射性發(fā)散的具 有維管組織的平滑肌薄壁組織，以及具有對(duì)齊粘膜表面的完全發(fā)育血管的基質(zhì)元件（見上 文Jayo II)。再生的膀胱或膀胱的一部分的特征還有存在紡錘樣/間充質(zhì)細(xì)胞和ciSMAW 性的肌肉前體細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述a SM陽性的紡錘樣細(xì)胞可在新生基質(zhì)組織 中和多個(gè)新生血管（小動(dòng)脈）周圍觀察到。
[0216] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的細(xì)胞群當(dāng)沉積在本文所述的支架或基質(zhì)上并被 植入至有需要的受試者體內(nèi)時(shí)，能夠使得按本文所述進(jìn)行重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的器官或 組織結(jié)構(gòu)發(fā)生修復(fù)。在其他實(shí)施方案中，修復(fù)效果的特征為疤痕組織形成和/或膠原沉積。 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉本領(lǐng)域已知的修復(fù)的其他特征。
[0217] 在另一方面，所述再生性細(xì)胞群提供了再生性效果，其特征在于對(duì)重建的層狀結(jié) 構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)的大小的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述再生性細(xì)胞群的 再生性效果通過特異性針對(duì)接受了接種有所述再生性細(xì)胞群的支架或基質(zhì)的受試者的適 應(yīng)性調(diào)節(jié)而得到確認(rèn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述適應(yīng)性調(diào)節(jié)為使用本文所述的構(gòu)建體的受 試者的膀胱的替換或擴(kuò)張，從而使得新的膀胱生長并發(fā)育為與所述受試者身體成比例的大 小。
[0218] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述能夠刺激再生的細(xì)胞群為產(chǎn)生MCP-I的細(xì)胞群，所述細(xì) 胞群含有至少一種表達(dá)趨化因子產(chǎn)物MCP-I的細(xì)胞。MCP-I再生性刺激的特征為某種細(xì)胞 類型向植入位置的募集。在一個(gè)實(shí)施方案中，MCP-I將肌肉祖細(xì)胞募集至植入位置以在新的 膀胱中增殖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MCP-I將單核細(xì)胞募集至植入位置，所述單核細(xì)胞又可 以產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和/或趨化因子以促進(jìn)再生性過程。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MCP-I誘 導(dǎo)網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)育為肌細(xì)胞。
[0219] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了特異性細(xì)胞因子例如MCP-I作為組織再生的替代性標(biāo) 記物的用途。這類標(biāo)記物可以與基于功能是否重建的再生評(píng)估組合使用。隨著再生過程的 時(shí)程對(duì)替代性標(biāo)記物的監(jiān)測可以作為再生的預(yù)后指征。
[0220] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群為純化的細(xì)胞群。本文所述的純化的細(xì)胞群的 特征在于基于形態(tài)學(xué)、標(biāo)記物表達(dá)和功能中的一種或多種的表型。所述表型包括但不限于 下列的一種或多種：峰-谷形態(tài)學(xué)、一種或多種平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)、細(xì)胞因子的表 達(dá)、在培養(yǎng)中有限的增殖壽命、收縮功能以及誘導(dǎo)纖維形成的能力。所述表型可包括本文所 述的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他特征。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述純化的細(xì)胞群基本上 與本文所述的平滑肌細(xì)胞群相同?；鞠嗤募兓募?xì)胞群通常具有至少約90%的均一 性，這可通過形態(tài)學(xué)、標(biāo)記物表達(dá)和功能中的一種或多種來判斷。在其他實(shí)施方案中，所述 純化的細(xì)胞群具有至少約95%的均一性、至少約98%的均一性或至少約99. 5%的均一性。
[0221] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述平滑肌細(xì)胞群直接來源于人類脂肪組織，并且其特征 在于下列一種或多種蛋白的表達(dá)水平與其在人類骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)中的表 達(dá)水平有差異：骨橋蛋白、0ct4B、生長分化因子5(⑶F5)、肝細(xì)胞生長因子（HGF)、白血病 抑制因子（LIF)、黑素瘤細(xì)胞粘附分子（MCAM)、脈管細(xì)胞粘附分子I (VCAMl)、PECAM、vWF、 Flk-1、發(fā)育不良相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白6(BMP6)、CD44和IL-1B。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述SMC細(xì)胞群與人類骨髓來源的MSC相比：(a)⑶F5、HGF、LIF、MCAM、 RUNX2、VCAM1、PECAM、vWF和Flk-I中的一種或多種的表達(dá)水平下降；和/或（b)0ct4B、骨 橋蛋白、BMP6、⑶44和IL-IB中的一種或多種的表達(dá)水平上升。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述 SMC 細(xì)胞群與人類骨髓來源的 MSC 相比：（a) GDF5、HGF、LIF、MCAM、RUNX2、VCAMl、PECAM、vWF 和Flk-I的表達(dá)水平全部下降；和/或（b)0ct4B、骨橋蛋白、BMP6、CD44和IL-IB的表達(dá)水 平全部上升。
[0222] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述平滑肌細(xì)胞群直接來源于脂肪組織，所述脂肪組織包 括一種或多種⑶45+細(xì)胞和/或一種或多種⑶117+細(xì)胞。
[0223] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了直接來源于人類脂肪組織的平滑肌細(xì)胞群，所 述平滑肌細(xì)胞群與人類骨髓來源的MSC相比具有較短的增殖壽命。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述SMC細(xì)胞群在培養(yǎng)物中表現(xiàn)出增殖的接觸依賴性抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述直 接來源于脂肪組織的SMC細(xì)胞群的特征在于至少一種平滑肌細(xì)胞（SMC)標(biāo)記物響應(yīng)于凝血 噁烷A2模擬物而下調(diào)。在其他實(shí)施方案中，所述SMC標(biāo)記物選自心肌蛋白和肌球蛋白重 鏈-平滑肌同種型（SMMHC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述心肌蛋白和SMMHC響應(yīng)于凝血噁 烷A2模擬物而下調(diào)。
[0224] 在所有實(shí)施方案中，所述SMC細(xì)胞群來源于自體來源。
[0225] 在一個(gè)方面，本發(fā)明考慮了本文所述的平滑肌細(xì)胞群用于呼吸疾病的應(yīng)用。氣道 平滑肌存在于大多數(shù)脊椎動(dòng)物的氣管系統(tǒng)中。呼吸系統(tǒng)眼部疾病指的是所述受試者由于肺 部肌肉的功能不正常而具有有缺陷的呼吸系統(tǒng)。據(jù)報(bào)道，某些細(xì)胞群在被給予至肺部時(shí)可 提供有益的效果（例如Ohnishi et al. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2008December; 3(4) :509 - 514)。這些SMC細(xì)胞群可對(duì)患有呼吸系統(tǒng)疾?。ɡ缦⒎螝饽[或慢性阻塞 性肺?。–OPD))的個(gè)體有益處。對(duì)于患有肺癌的個(gè)體也可能有益處。在一個(gè)實(shí)施方案中， 自體SMC細(xì)胞群可從有需要的受試者的脂肪組織或外周血分離?？蓪⑺黾?xì)胞群接種于適 于植入至所述受試者肺部位置的支架上。本發(fā)明的細(xì)胞群的一個(gè)優(yōu)勢為：如果受試者的呼 吸系統(tǒng)有缺陷（例如患有肺癌）時(shí)，可能不能從所述受試者的肺部獲得合適的SMC。所述細(xì) 胞群可用于受試者的肺的全部或部分被切除的情況（例如肺癌的情況）。在受試者的肺的 全部或部分被切除后，可以從活檢樣本中分離自體SMC細(xì)胞群，經(jīng)過培養(yǎng)后接種于合適的 支架上并植入所述受試者體內(nèi)，以提供新的肺或新的肺部組織結(jié)構(gòu)。
[0226] 在另一方面，本發(fā)明考慮了本文所述的SMC細(xì)胞群用于眼部疾病的應(yīng)用。眼部疾 病指的是所述受試者由于眼部肌肉的功能不正常而具有眼部缺陷。平滑肌存在于眼內(nèi)的睫 狀肌并控制眼的容積，以用于觀察不同距離的物體并調(diào)節(jié)房水通過Schlemm氏管的外流。 平滑肌還存在于眼部的虹膜。這些SMC細(xì)胞群可對(duì)患有眼部疾?。ɡ缋匣ㄑ酆瓦h(yuǎn)視眼） 的患者有一處。對(duì)于患有肺癌的個(gè)體也可能有益處。在一個(gè)實(shí)施方案中，自體SMC細(xì)胞群 可從有需要的受試者的脂肪組織或外周血分離。可將所述細(xì)胞群接種于適于植入至所述受 試者眼部位置的支架上。本發(fā)明的細(xì)胞群的一個(gè)優(yōu)勢為：如果受試者的眼部有缺陷或由于 眼部組織的可用性受到限制時(shí)，可能不能從所述受試者的眼部獲得合適的SMC?？梢詮幕顧z 樣本中分離自體SMC細(xì)胞群，經(jīng)過培養(yǎng)后接種于合適的支架上并植入所述受試者體內(nèi)，以 提供新的眼部組織。
[0227] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以不使用支架（例如通過植入）而將本發(fā)明的平滑肌細(xì) 胞群給予患有呼吸系統(tǒng)疾病或眼部疾病的受試者。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠知曉合適的植 入方法。
[0228] 在一個(gè)實(shí)施方案中，自體SMC細(xì)胞群可從有需要的受試者的脂肪組織或外周血分 離。可將所述細(xì)胞群接種于適于植入至所述受試者肺部位置的支架上。本發(fā)明的細(xì)胞群的 一個(gè)優(yōu)勢為：如果受試者的呼吸系統(tǒng)有缺陷（例如患有肺癌）時(shí)，可能不能從所述受試者的 肺部獲得合適的SMC。所述細(xì)胞群可用于受試者的肺的全部或部分被切除的情況（例如肺 癌的情況）。在受試者的肺的全部或部分被切除后，可以從活檢樣本中分離自體SMC細(xì)胞 群，經(jīng)過培養(yǎng)后接種于合適的支架上并植入所述受試者體內(nèi)，以提供新的肺或新的肺部組 織結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以不使用支架（例如通過植入）而將本發(fā)明的平滑肌細(xì) 胞群給予患有呼吸系統(tǒng)疾病的受試者。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠知曉合適的植入方法。
[0229] 3.分離細(xì)朐群的方法
[0230] 自體細(xì)胞群直接來源于需要治療的受試者。所述受試者提供來源的組織通常與需 要治療的器官或組織結(jié)構(gòu)不同。自體細(xì)胞群可以來源于患者的自身組織，例如來源于脂肪 組織或外周血。所述自體細(xì)胞可以從活檢樣本中分離。此外，所述細(xì)胞在使用前可被冷凍 或擴(kuò)增。
[0231] 為了準(zhǔn)備構(gòu)建細(xì)胞接種的支架，獲自受試者的含有平滑肌細(xì)胞的樣本被解離形成 合適的細(xì)胞懸液。分離和培養(yǎng)細(xì)胞的方法在已授權(quán)的美國專利No. 5, 567, 612中有述，該專 利文獻(xiàn)通過援引的方式明確地納入本文。將細(xì)胞解離為單細(xì)胞狀態(tài)的過程并不是開始原代 培養(yǎng)所必需的，因?yàn)樵隗w外培養(yǎng)一段時(shí)間（例如一周）后就可以形成單細(xì)胞懸液?？梢酝?過機(jī)械方法和酶學(xué)方法破壞連結(jié)細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)和胞間連接，從而進(jìn)行組織解離。如果 需要，可以在體外培養(yǎng)自體細(xì)胞，以增加可用于接種支架的細(xì)胞的數(shù)量。
[0232] 在接種前，可以使用遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在聚合物接種之前，可以用特異性基因轉(zhuǎn) 染平滑肌細(xì)胞。細(xì)胞-聚合物構(gòu)建體可以攜帶能使宿主長期存活或使組織形成新的器官所 需要的遺傳信息。
[0233] 可以使用或不使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的細(xì)胞分級(jí)步驟來制備細(xì)胞培養(yǎng)物?？梢?基于細(xì)胞大小、DNA含量、細(xì)胞表面抗原和存活力來進(jìn)行細(xì)胞分級(jí)。例如，可以從脂肪組織 中富集平滑肌細(xì)胞，并同時(shí)減少內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞以收集平滑肌細(xì)胞。雖然可以使用細(xì) 胞分級(jí)，但是它并不是實(shí)施本發(fā)明所必需的。
[0234] 在本文所述的方法中，另一種任選的過程為冷凍保存?？梢允褂美鋬霰４鎭砝?降低對(duì)多次侵入性手術(shù)過程的需要。可以擴(kuò)增取自活檢樣本或取自受試者的細(xì)胞，可以使 用一部分?jǐn)U增的細(xì)胞并將另一部分細(xì)胞冷凍保存。能夠擴(kuò)增和保存細(xì)胞就減少了必需的手 術(shù)過程的次數(shù)。冷凍保存用途的另一實(shí)例是在組織庫中的應(yīng)用。自體細(xì)胞可在例如供體組 織庫中儲(chǔ)存。當(dāng)新的器官或組織結(jié)構(gòu)需要細(xì)胞時(shí)，可以按照需要由冷凍保存的細(xì)胞提供?；?病的或正接受可能危害其已有的器官或組織結(jié)構(gòu)的治療的患者可以冷凍保存一種或多種 活檢樣本。然后，如果患者自身的器官或組織結(jié)構(gòu)發(fā)生衰竭，就可以融化冷凍保存的自體細(xì) 胞并用于治療。例如，如果在經(jīng)過治療后的新的器官或組織結(jié)構(gòu)中復(fù)發(fā)癌癥，可以使用冷凍 保存的細(xì)胞來重建器官或組織結(jié)構(gòu)，就不再需要另外的活檢樣本。
[0235] 可以按照下述總體方法來從脂肪或外周血中分離平滑肌細(xì)胞。可以獲得合適重量 (例如以克為單位）和/或面積（例如以cm 2為單位）的脂肪活檢標(biāo)本。可以在在計(jì)劃植 入新的器官或組織結(jié)構(gòu)構(gòu)建體之前獲得合適體積（例如以ml為單位）的外周血。
[0236] 下面描述一種適用于從脂肪的基質(zhì)血管級(jí)分（SVF)中分離平滑肌細(xì)胞的代 表性實(shí)例方法，所述脂肪的基質(zhì)血管級(jí)分（SVF)代表了由多種細(xì)胞類型組成的不均 一的細(xì)胞群，包括內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，以及由國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（International Society for Cellular Therapy(ISCT))標(biāo)準(zhǔn)定義的 MSC 樣細(xì)胞（Domini et al.2006Cytotherapy8:4, 315-317)?？梢詮幕顧z樣本中獲得合適重量的（以克為單位）的 脂肪組織（例如7-25g)，用PBS洗滌（例如3次），用手術(shù)刀和剪將組織剪碎，轉(zhuǎn)移至50mL 錐形瓶中并在含膠原酶（例如〇· 1至〇· 3% ) (Worthington)和1 % BSA的DMEM-HG溶液中 在37°C培養(yǎng)60分鐘?？梢猿掷m(xù)振蕩或間歇性振蕩所述錐形瓶以促進(jìn)消化。可以以600g離 心10分鐘以沉淀SVF并在添加10% FBS的DMEM-HG中重懸。然后使用基質(zhì)-脈管級(jí)分來 進(jìn)行第〇代細(xì)胞的接種。
[0237] 下面描述一種適用于從外周血中分離平滑肌細(xì)胞的代表性實(shí)例方法?？蓪⒑线m的 體積（例如25ml)的外周血以1:1稀釋于PBS中，加入25ml Histopaque_1077(Sigma)并 置于50mL錐形瓶中以分層。在離心（例如800g，30min)后，可以收集單核細(xì)胞級(jí)分，用PBS 洗滌一次并重懸于α-ΜΕΜ/10% FBS(Invitrogen)中以進(jìn)行第0代細(xì)胞的接種。
[0238] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠知曉其他用于分離平滑肌細(xì)胞的方法。
[0239] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了無需使用誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞的條件而從SVF中分 離出分離的平滑肌細(xì)胞群的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括a)獲得脂肪組織，b) 消化所述脂肪組織，c)離心所述被消化的脂肪組織以提供基質(zhì)血管級(jí)分（SVF)，d)無需使 用誘導(dǎo)分化為平滑肌細(xì)胞的條件而培養(yǎng)所述SVF，和e)從脂肪組織來源的SVF中分離平滑 肌細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟包括洗滌所述SVF，在細(xì)胞培養(yǎng)基重懸所述 SVF，以及將所述重懸的SVF鋪板。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟包括提供貼靠細(xì)胞 培養(yǎng)載體（例如培養(yǎng)板或容器）的細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括擴(kuò)增所 述培養(yǎng)的細(xì)胞群。在其他實(shí)施方案中，所述方法還包括分析所述平滑肌細(xì)胞群是否具有平 滑肌細(xì)胞的特征。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述脂肪組織來源于自體來源。
[0240] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)條件不需要使用能夠誘導(dǎo)脂肪組 織SVF來源的細(xì)胞群分化為平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)組分。據(jù)Jack et al.，J Biomaterials30 (2009) 3529-3270報(bào)道，在含有肝素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)來源于SVF的未 分化的脂肪干細(xì)胞6周，以使得干細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞（還可參見Rodriguez的美國專 利No. 7, 531，355)。Jack et al.報(bào)道的干細(xì)胞不需要在培養(yǎng)期間內(nèi)被分份。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述培養(yǎng)條件不需要使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括含有肝素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，本發(fā)明的方法包括使用不含有能夠使細(xì)胞群分化為平滑肌細(xì)胞或培養(yǎng)和擴(kuò)張細(xì) 胞群所需的外源性生長因子的培養(yǎng)條件。
[0241] 本發(fā)明的方法與其他報(bào)道過的方法相比的優(yōu)勢包括省略了使脂肪來源的干細(xì)胞 分化為平滑肌細(xì)胞的步驟，這就減少了獲得脂肪活檢樣本和從中分離平滑肌細(xì)胞群之間的 時(shí)間。此外，由于不再需要誘導(dǎo)分化的其他細(xì)胞培養(yǎng)基組分（例如外源性生長因子），也就 具有了降低成本的優(yōu)勢。
[0242] 在另一方面，本發(fā)明提供了分離和培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞群的方法，所述平滑肌細(xì)胞群 含有至少一種具有收縮功能和對(duì)一種或多種平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物呈陽性的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述方法包括從需要重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)的患 者獲得樣本的步驟，其中所述樣本不是從需要被重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的腔體器官或組織 結(jié)構(gòu)獲得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述平滑肌細(xì)胞來源于患者樣本。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述腔體器官或組織結(jié)構(gòu)為膀胱或膀胱的一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣本為自體 樣本。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣本為外周血樣本。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣本為 脂肪組織樣本。所述脂肪組織可為通過腹部吸脂手術(shù)而取出的所述受試者的組織。
[0243] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，在所述獲得步驟之后還進(jìn)行分離步驟。
[0244] 對(duì)外周血樣本而言，所述分離步驟包括使樣本與密度梯度材料相接觸，離心所述 樣本以確定含有單核細(xì)胞級(jí)分的密度梯度，以及從所述密度梯度中提取所述單核細(xì)胞級(jí) 分。在所述分離步驟之后還可以進(jìn)行培養(yǎng)步驟，即培養(yǎng)來自所提取的級(jí)分的細(xì)胞。
[0245] 對(duì)于脂肪組織樣本而言，所述純化步驟包括用膠原酶消化所述樣本，離心經(jīng)過消 化的樣本，將離心的樣本混合以從原代脂肪細(xì)胞中分離基質(zhì)細(xì)，離心混合的樣本以獲得基 質(zhì)-脈管級(jí)分，該級(jí)分可被重懸以進(jìn)行隨后的培養(yǎng)。
[0246] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了不使用誘導(dǎo)分化的細(xì)胞培養(yǎng)基而提供分離的平滑肌細(xì) 胞（SMC)群的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟：a)獲得脂肪組織活檢樣 本，b)酶促消化所述脂肪組織，c)離心經(jīng)消化的脂肪組織以提供含有不均一細(xì)胞群的基質(zhì) 血管級(jí)分（SVF)，d)洗滌和鋪板所述不均一的細(xì)胞群；e)在不使用平滑肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)培 養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞群，f)從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離完全分化的SMC細(xì)胞群。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟e)包括篩選貼靠細(xì)胞培養(yǎng)載體的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述培養(yǎng)步驟e)不包括使用含有外源性生長因子的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述培養(yǎng)方法包括使用含有最少必須培養(yǎng)基（例如DMEM或α-MEM)和胎牛血清（例如10% FBS)的細(xì)胞培養(yǎng)基，并通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行培養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述平滑肌細(xì)胞群不是脂肪來源的干細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述平滑肌細(xì) 胞群不是間充質(zhì)干細(xì)胞群。
[0247] 4.支架（Scaffolds)
[0248] 如Atala的美國專利No. 6576019(其全部內(nèi)容通過援引的方式納入本文）所述， 支架或聚合物基質(zhì)可由各種不同的材料構(gòu)成。通常，生物相容性材料特別是可生物降解材 料是用于構(gòu)建本文所述的支架的優(yōu)選材料。所述支架為具有至少兩個(gè)分離表面的可植入 的、生物相容性的、合成的或天然的聚合物基質(zhì)。所述支架的形狀與需要治療的所述腔體器 官或組織結(jié)構(gòu)的至少一部分相適應(yīng)。所述生物相容性材料是可生物降解的。生物相容性指 的是所述材料沒有毒性或?qū)τ谏飳W(xué)功能沒有損害性效果?？缮锝到庵傅氖撬霾牧峡?以在患者體內(nèi)被吸收或降解?？缮锝到獠牧系膶?shí)例包括例如可吸收的縫線。用于形成 支架的代表性材料包括天然的或合成的聚合物，例如膠原，聚（α酯）例如聚（乳酸）、聚 (乙醇酸）、聚原酸酯和聚酸酐以及它們的共聚物，它們可以通過水解以受控的速度降解并 被吸收。這些材料可以實(shí)現(xiàn)對(duì)降解性、可操作性、大小和構(gòu)型的最大程度的控制。優(yōu)選的可 生物降解聚合物材料包括以可吸收的合成縫線材料的形式開發(fā)的聚乙醇酸和聚羥基乳酸 (polyglactin)。聚乙醇酸和聚輕基乳酸纖維可以以廠商提供的形式使用。其他支架材料包 括纖維素醚、纖維素、纖維素酯、氟化聚乙烯、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰 亞胺、聚丙烯酸酯、聚苯并惡唑、聚碳酸酯，聚醚腈（polycyanoarylether)、聚酯、聚酯碳酸 酯、聚醚、聚醚醚酮，聚醚酰亞胺、聚醚酮、聚醚砜、聚乙烯、聚氟烯烴、聚酰亞胺、聚烯烴、聚 惡二唑、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚硫、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚 氨酯、聚乙烯，聚偏氟乙烯、再生的纖維素、硅酮、脲醛，或這些材料的共聚物或物理混合物。 可用合適的抗微生物劑浸漬所述材料或者用有色添加劑對(duì)所述材料著色，以改善其視覺效 果和有助于手術(shù)過程。
[0249] 其他可生物降解的支架材料包括由Ethicon公司（Ethicon Co.，Somerville, N. J.)生產(chǎn)的合成縫線材料，例如M0N0CRYL?(乙醇酸和ε-己內(nèi)酯的共聚物）、VICRYL? 或Polyglactin910(乳酸和乙醇酸的共聚物，涂覆有Polyglactin370和硬脂酸 鈣）和PANACRYL? (乳酸和乙醇酸的共聚物，涂覆有己內(nèi)酯和乙醇酸的共聚物）。 (Craig P.H. , WiIliams J.A. , Davis K.ff. , et al. :A Biological Comparison of Polyglactin910and Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Sutures. Surg. 141 ； 1010,（1975))和聚乙醇酸。這些材料可以以廠商提供的形式使用。
[0250] 在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述基質(zhì)或支架可以使用天然的去細(xì)胞化器官的一部分 來產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^從器官中去除全部細(xì)胞和組織內(nèi)容而對(duì)生物結(jié)構(gòu)或器官部分去細(xì)胞化。 去細(xì)胞化過程包括一系列的連續(xù)提取。這種提取過程的一個(gè)關(guān)鍵特征是避免了可能打亂或 破壞生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的劇烈提取過程。第一步包括除去細(xì)胞碎片和細(xì)胞膜的溶 解。然后再溶解核胞質(zhì)組分和核組分。
[0251] 優(yōu)選地，通過使用溫和的機(jī)械破壞方法除去包圍器官部分的細(xì)胞膜和細(xì)胞碎片， 從而使所述生物結(jié)構(gòu)例如器官部分被去細(xì)胞化。所述溫和的機(jī)械破壞方法必須足以破壞細(xì) 胞膜。然而，所述去細(xì)胞化過程應(yīng)避免損傷或打亂所述生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜內(nèi)部結(jié)構(gòu)。溫和的 機(jī)械破壞方法包括刮去器官部分的表面、在合適體積的液體（例如蒸餾水）中攪拌器官部 分或攪拌器官。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述溫和的機(jī)械破壞方法包括在合適體積的蒸饋 水中攪拌器官部分，直至細(xì)胞膜被破壞且細(xì)胞碎片被從所述器官移除。
[0252] 在除去細(xì)胞膜后，再除去所述生物結(jié)構(gòu)的核和胞質(zhì)組分。這可以通過溶解細(xì)胞和 核組分但不破壞其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的方式來進(jìn)行。為了溶解核組分，可以使用非離子型去污劑或 表面活性劑。非離子型去污劑或表面活性劑包括但不限于：可以獲自Rohm and Haas of Philadelphia、Pa.的 Triton 系列產(chǎn)品，包括 Triton X-100、Triton N-101、Triton X-114、 Triton X-405、Triton X-705和Triton DF-16,它們可從多個(gè)供貨商處購得；Tween系列 產(chǎn)品，例如單月桂酸酯（Tween20)、單棕櫚酸酯（Tween40)、單油酸酯（Tween80)和聚氧乙 烯-23-月桂醚（Brij. 35)、聚氧乙烯醚W-I (Polyox)等等，膽酸鈉、去氧膽酸鹽、CHAPS、阜 角苷、正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-D-吡喃葡萄糖苷和 Nonidet P-40。
[0253] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉屬于上述類別的化合物的描述和可商購的供貨 商，這些也可見于〃Chemical Classification, Emulsifiers and Detergents"，McCut cheon's, Emulsifiers and Detergents, 1986, North American and International Editions, McCutcheon Division, MC Publishing Co. , Glen Rock, N. J. , U. S. A. and Judith Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry, Calbiochem. R. , Hoechst Celanese Corp. , 1987。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中， 上述非離子型表面活性劑為Triton序列產(chǎn)品，優(yōu)選地為Triton X-100。
[0254] 可以根據(jù)被去細(xì)胞化的生物結(jié)構(gòu)的類型來改變上述非離子型去污劑的濃度。例 如，對(duì)于精細(xì)組織例如血管，應(yīng)降低去污劑的濃度。非離子型去污劑的優(yōu)選濃度可為約 0. 001至約2. 0% (w/v)。更優(yōu)選地為約0. 05至約I. 0% (w/v)。再更優(yōu)選地為約0. 1% (w/ v)至約0. 8% (w/v)。優(yōu)選的濃度范圍為約0. 001至約0. 2% (w/v)，特別優(yōu)選的范圍為約 0· 05 至約 0· 1% (w/v)。
[0255] 對(duì)于包括致密的胞質(zhì)纖維網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞間復(fù)合物和頂端微細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞骨架組 分，可以使用堿性溶液例如氨水進(jìn)行溶解。包括銨鹽及其衍生物的其他堿性溶液也可用于 溶解細(xì)胞骨架組分。合適的銨鹽溶液的實(shí)例包括硫酸銨、乙酸銨和氨水。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施 方案中，使用了氨水。
[0256] 可以根據(jù)被去細(xì)胞化的生物結(jié)構(gòu)的類型來改變所述堿性溶液例如氨水的濃度。 例如，對(duì)于精細(xì)組織例如血管，應(yīng)降低去污劑的濃度。優(yōu)選的濃度范圍可為約0.001至約 2. 0% (w/v)。更優(yōu)選地為約0. 005至約0. 1% (w/v)。再更優(yōu)選地為約0. 01% (w/v)至約 0. 08% (w/v) 〇
[0257] 去細(xì)胞化的凍干的結(jié)構(gòu)可儲(chǔ)存于合適的溫度下直至需要使用時(shí)。在使用前，可以 將所述去細(xì)胞化的結(jié)構(gòu)在合適的等滲緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行平衡。合適的緩沖劑包 括但不限于磷酸鹽緩沖溶液（PBS)、鹽水、MOPS，HEPES，Hank's平衡鹽溶液等等。合適的細(xì) 胞培養(yǎng)基包括但不限于RPMI1640、Fisher's培養(yǎng)基、Iscove' s培養(yǎng)基、McCoy's培養(yǎng)基、 Dulbecco' s培養(yǎng)基等等。
[0258] 其他可用的生物相容性材料包括不銹鋼、鈦、硅酮、金和硅橡膠。
[0259] 可以加固所述聚合物基質(zhì)或支架。例如，可以在合成基質(zhì)或支架形成的過程中加 入加固材料，或者在植入之前將加固材料貼附在天然或合成的基質(zhì)上。用于形成加固的代 表性材料包括天然或合成的聚合物，例如膠原，聚（α酯），例如聚（乳酸），聚（乙醇酸）， 聚原酸酯和聚酸酐，以及它們的共聚物，它們都可以以受控的速度通過水解降解并被吸收。 這些材料可以實(shí)現(xiàn)對(duì)可降解性、可操作性、大小和構(gòu)型的最大程度的控制。
[0260] 可以根據(jù)機(jī)械性質(zhì)來表征所述可生物降解聚合物，例如使用Instron測試儀來測 量拉伸強(qiáng)度，通過凝膠滲透色譜（GPC)來測量聚合物的分子量，通過差示掃描量熱法（DSC) 來測量轉(zhuǎn)變溫度，以及通過紅外（IR)光譜來測量鍵結(jié)構(gòu)；或者可以通過毒理學(xué)來表征所述 可生物降解聚合物，初始的篩選測試包括Ames測定和體外致畸性測定和動(dòng)物體內(nèi)植入研 究，以研究其免疫原性、炎性、釋放和降解性質(zhì)等?？梢允褂脪呙桦婄R來測定體外細(xì)胞貼附 和存活力，使用放射性同位素來進(jìn)行組織學(xué)和定量測定。還可以根據(jù)被植入患者體內(nèi)后材 料降解所需的時(shí)間來表征可生物降解材料。通過變化所述構(gòu)建方式，例如厚度和網(wǎng)篩大小， 所述可生物降解材料基本上能夠在約2年至約2個(gè)月之間、優(yōu)選地在約18個(gè)月和約4個(gè)月 之間、最優(yōu)選地在約15個(gè)月和約8個(gè)月之間、最優(yōu)選地在約12個(gè)月和約10個(gè)月之間發(fā)生 生物降解。如果必要的話，可以構(gòu)建所述可生物降解材料以使其在約3年或約4年或約5 年更長時(shí)間內(nèi)不發(fā)生降解。
[0261] 可以如上所述地使用可控的有孔結(jié)構(gòu)編織所述聚合物基質(zhì)或支架?？梢允褂每椎?大小來確定細(xì)胞分布。例如，聚合物基質(zhì)或支架上的孔的大小可以大到使得細(xì)胞能夠從一 個(gè)表面遷移至相對(duì)的表面。或者，所述孔可以小到僅能允許聚合物基質(zhì)或支架的兩側(cè)進(jìn)行 液體流通但不允許細(xì)胞通過。為實(shí)現(xiàn)這一目的，合適的孔直徑可為約0. 04微米至約10微 米、優(yōu)選地為約0. 4微米至約4微米。在一些實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架的表面可具有 足夠大的孔，以使得細(xì)胞群可以貼附和遷移至孔中。孔在聚合物基質(zhì)或支架的底部可以變 得比較小，以防止細(xì)胞從所述聚合物基質(zhì)或支架的一側(cè)遷移至相對(duì)側(cè)。具有較小孔直徑的 聚合物基質(zhì)或支架的一個(gè)實(shí)施方案為層狀結(jié)構(gòu)，其中在兩層大孔材料之間夾有小孔材料。 聚碳酸酯膜是特別合適的，因?yàn)樗鼈冊(cè)诰幙棔r(shí)可以精細(xì)控制孔的大小，例如孔的大小可為 約0. Ol微米、約0. 05微米、約0. 1微米、約0. 2微米、約0. 45微米、約0. 6微米、約I. O微 米、約2. 0微米和約4. 0微米。在亞微米水平上，所述聚合物基質(zhì)或支架使得細(xì)菌、病毒和 其他微生物可以透過。
[0262] 在設(shè)計(jì)每一種具體基質(zhì)或其部分的時(shí)候要考慮以下特征或標(biāo)準(zhǔn)：（i)形狀、 (ii)強(qiáng)度、（iii)硬度和剛性，和（iv)可縫合性（所述基質(zhì)或其部分易于被縫合或以其 他方式貼附至鄰近組織的程度）。如本文所述，給定基質(zhì)或支架的硬度透過彈性模量來 定義，彈性模量是表示使支架變形的每單位面積上的壓力與導(dǎo)致的變形程度之間比例的 系數(shù)。（參見例如 Handbook of Biomaterials evaluation, Scientific, Technical, an d Clinical Testing of Implant Materials, 2nd edition, edited by Andreas F.von Recum, (1999) ；Ratner, et al., Biomaterials Science:An Introduction to Materials in Medicine,Academic Press (1996))。支架的剛性指的是給定支架具有的彈性（或缺乏 彈性）的程度。
[0263] 上述標(biāo)準(zhǔn)的每一個(gè)都是變量，例如可以通過材料和制造工藝的選擇而被改變，以 使得所述基質(zhì)或其部分能夠最好地被放置和修飾，以治療醫(yī)學(xué)指征和實(shí)現(xiàn)其目的功能。例 如，包括用于膀胱替換、重建和/或擴(kuò)張的基質(zhì)或支架的材料必須足夠結(jié)實(shí)，以支持縫合不 會(huì)破裂，同時(shí)還要有足夠的順應(yīng)性以容納變化的尿液體積。
[0264] 最佳地，所述基質(zhì)或支架的形狀應(yīng)使得：在其生物降解后，所得的重建的膀胱與天 然膀胱一樣在空的時(shí)候可以收縮，且在從新的器官或組織結(jié)構(gòu)中取出尿路導(dǎo)管后輸尿管不 會(huì)被堵塞也不會(huì)留下漏孔。生物工程膀胱構(gòu)建體可以以整體方式生產(chǎn)，也可以各個(gè)部分獨(dú) 立生產(chǎn)，或者以特殊部分的方式生產(chǎn)再進(jìn)行組合。生產(chǎn)的每一個(gè)特殊基質(zhì)或支架部分可具 有特殊功能?；蛘呤菫榱吮阌谥苽涠a(chǎn)特殊部分。特殊部分可由特殊材料構(gòu)建，并可被 設(shè)計(jì)為具有特殊性質(zhì)。特殊部分的性質(zhì)可包括與天然組織（例如輸尿管）相似的拉伸強(qiáng)度 (0. 5至I. 5MPa2)和30至100%的最終延展性，或者收縮拉伸強(qiáng)度為0. 5至28MPa2,最終延 展性為10_200*%，壓縮強(qiáng)度可為〈12。
[0265] 優(yōu)選的是由纖維形成的網(wǎng)篩狀結(jié)構(gòu)，所述纖維可為圓形、扇形、扁平型、星型，可以 孤立或與其他纖維交織在一起。分支纖維的使用所基于的原理，與通常用于解決表面面積 對(duì)體積的比例增加的問題的原理相同。所有的多細(xì)胞生物體均利用這種重復(fù)分支結(jié)構(gòu)。分 支系統(tǒng)形成器官之間以及各器官的功能單位之間的通訊網(wǎng)絡(luò)。使用細(xì)胞接種和植入這種構(gòu) 型使得可以植入大量細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞均與宿主的環(huán)境相接觸，使得養(yǎng)分和廢物能夠自由交 換，同時(shí)實(shí)現(xiàn)血管新生化。所述聚合物基質(zhì)或支架可根據(jù)所需的最終形式、結(jié)構(gòu)和功能制成 彈性或剛性。
[0266] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述聚合物基質(zhì)或支架由具有15 μ m的平均纖維直徑的 聚乙醇酸纖維形成，并使用4-0Polyglactin910縫線形成膀胱形狀的模型。將所得的結(jié)構(gòu) 用液化共聚物涂覆，所述液化共聚物例如聚-DL-丙交酯-共-乙交酯50:50,80mg/ml亞甲 基氯，以獲得合適的機(jī)械形式并固定其形狀。
[0267] 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，用生物相容性和可生物降解形凝材料涂覆本發(fā)明的支 架。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述形凝材料包括聚丙交酯-共-乙交酯共聚物。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述形凝材料為液化的。
[0268] 在另一方面，可以在植入前（在用細(xì)胞接種聚合物基質(zhì)或支架之前或之后）用 添加劑或藥物處理本發(fā)明的支架，從而例如在植入后促進(jìn)新組織的再生。因此，例如可以 在所述聚合物基質(zhì)或支架中加入生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)或支架組分以及其他生 物活性材料，從而促進(jìn)植入物愈合和新組織的再生。通常應(yīng)根據(jù)待被重建、替換或擴(kuò)張 的組織或器官來選擇這樣的添加劑，以保證在植入的器官或組織中能夠形成合適的新組 織（對(duì)于用于促進(jìn)骨愈合的這類添加劑的實(shí)例而言，可參見例如Kirker-Head，C. A. Vet. Surg. 24(5) :408-19(1995))。例如，當(dāng)使用聚合物基質(zhì)（任選地接種有內(nèi)皮細(xì)胞）來擴(kuò)張血 管組織時(shí)，可以使用血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)(參見例如美國專利No. 5, 654, 273)來促進(jìn) 新的血管組織的再生。如果使用加入的細(xì)胞，那么可以加入的生長因子和其他添加劑（例 如表皮生長因子（EGF)、肝素結(jié)合表皮樣生長因子（HBGF)、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)、細(xì) 胞因子、基因、蛋白等等）的量可超過在聚合物基質(zhì)上接種的細(xì)胞所產(chǎn)生的任何這類生長 因子的量（如果確實(shí)產(chǎn)生的話）。優(yōu)選地，提供的這類添加劑的量足以促進(jìn)新組織類型的再 生，所述組織類型適合于將要被修復(fù)、替換或擴(kuò)張的組織或器官（例如通過引起或加速宿 主細(xì)胞向植入物中的滲透）。其他可用的添加劑包括抗細(xì)菌藥劑抗生素。
[0269] 一種優(yōu)選的支撐基質(zhì)或支架含有交叉的細(xì)絲，在所述細(xì)胞支撐物被植入后，它們 可以使得營養(yǎng)物通過很短的距離擴(kuò)散至細(xì)胞而使得細(xì)胞能夠存活。在植入后，隨著細(xì)胞團(tuán) 的擴(kuò)增，所述細(xì)胞支撐基質(zhì)或支架能夠同步地被血管化。
[0270] 在植入前在體外進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建體的構(gòu)建，可以促進(jìn)細(xì)胞在植入后在體內(nèi)的最 終分化，并且盡可能地降低對(duì)所述基質(zhì)的炎性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，由此避免了植入物的攣縮和收 縮。
[0271] 在使用前，可以使用任何已知的方法對(duì)所述聚合物基質(zhì)或支架進(jìn)行滅菌。所使用 的方法取決于在聚合物基質(zhì)中所使用的材料。滅菌方法的實(shí)例包括蒸汽滅菌、干熱滅菌、放 射滅菌、用例如環(huán)氧乙烷的氣體滅菌，以及氣體和煮沸滅菌。
[0272] 組成支架的合成材料可使用例如溶劑澆鑄、模壓、拉細(xì)絲、結(jié)網(wǎng)、浸析、編織和涂覆 等方法來成型。在溶劑澆鑄方法中，將一種或多種聚合物溶于適當(dāng)?shù)娜軇├缍燃淄橹?形成溶液，將所述溶液澆鑄在分枝形狀的浮雕結(jié)構(gòu)上。在溶劑蒸發(fā)后獲得薄膜。在模壓方 法中，將聚合物在最高達(dá)30, 000磅/平方英寸的壓力下壓成適當(dāng)?shù)男螤睢＠?xì)絲包括從熔 融聚合物中拉絲，結(jié)網(wǎng)包括通過將纖維壓制成毛氈狀的材料而形成網(wǎng)篩。在浸析方法中，將 含有兩種物質(zhì)的溶液噴灑為接近所述構(gòu)建體的最終形式的形狀。然后用溶劑溶解掉其中一 種組分，導(dǎo)致孔隙的形成（參見Mikos,美國專利No. 5, 514, 378,通過援引的方式納入本 文）。在成核方法中，將支架形狀的薄膜暴露于放射性裂變產(chǎn)物以產(chǎn)生放射性損壞材料的 痕跡。然后用酸或堿蝕刻聚碳酸酯層，將放射性損壞材料的痕跡翻印成孔。最后可以使用 激光成型和在許多材料中燒穿成孔，以形成具有均勻孔徑的結(jié)構(gòu)。涂覆指的是用例如液化 共聚物（聚-DL-丙交酯-共-乙交酯50:5080mg/ml亞甲基氯）的材料涂覆或浸透聚合物 結(jié)構(gòu)，從而改變其機(jī)械性質(zhì)。可以進(jìn)行一層涂覆，也可以進(jìn)行多層涂覆，直至獲得所需的機(jī) 械性質(zhì)。上述成型技術(shù)可以組合使用，例如，聚合物基質(zhì)或支架可被編織、模壓和膠粘在一 起。而且，通過不同工藝成型的不同聚合物材料可以連接在一起形成組合形狀。所述組合 形狀可為層狀結(jié)構(gòu)。例如，可以將一種聚合物基質(zhì)或支架貼附在一種或多種聚合物基質(zhì)上 以形成多層聚合物基質(zhì)或支架結(jié)構(gòu)。這種貼附可以通過使用液體聚合物膠粘或通過縫合來 進(jìn)行。此外，所述聚合物基質(zhì)或支架可以以固體塊的形式形成，并通過激光或其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 來成型至其所需的最終形式。激光成型指的是使用激光去除材料的過程。
[0273] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述支架由無紡聚乙醇酸（PGA)毛氈和聚（乳酸-共-乙 醇酸）聚合物（PLGA)形成。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述支架為尿流改道支架。
[0274] 如Bertram等人的美國專利公布20070276507(其全部內(nèi)容通過援引的方式納入 本文），本發(fā)明的聚合物基質(zhì)或支架可成型為任意數(shù)量的所需構(gòu)型，以滿足其任意數(shù)量的總 體系統(tǒng)、幾何學(xué)或空間的限制。所述基質(zhì)可為三維基質(zhì)，并且經(jīng)過成型以符合層狀結(jié)構(gòu)的腔 體器官或組織結(jié)構(gòu)的尺寸和形狀.例如，當(dāng)使用聚合物基質(zhì)進(jìn)行膀胱重建時(shí)，可以使用經(jīng) 過成型而符合整個(gè)膀胱或其一部分的三維基質(zhì)。天然地，所述聚合物基質(zhì)可成型為不同的 大小和形狀，以符合不同體型的患者的膀胱。任選地，所述聚合物基質(zhì)在成型后應(yīng)使得在其 生物降解后，所得的重建的膀胱在排空時(shí)能夠像天然的膀胱一樣地可收縮。所述聚合物基 質(zhì)也可成型為其他形式，以適應(yīng)患者的特殊需要。例如，先前具有損傷或功能障礙的患者可 能具有改變的腹腔，因此可能需要特殊的膀胱替換支架、膀胱擴(kuò)張支架、膀胱管道支架和逼 尿肌肌肉等效物支架來配合。
[0275] 在一個(gè)方面，本發(fā)明考慮了適于與本文所述的平滑肌細(xì)胞群一起使用的其他支 架。例如，可以提供適于植入至肺部的支架。
[0276] A.擴(kuò)張或替換令·架
[0277] 在另一方面，所述聚合物基質(zhì)或支架的形狀符合膀胱的一部分。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述成型的基質(zhì)為適于替換所述受體已有膀胱的至少約50%、至少約60%、至少約 70 %、至少約80 %、至少約90 %或至少約95 %。在另一方面，所述成型的聚合物基質(zhì)或支架 與膀胱的100%或全部膀胱相符合。
[0278] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合物基質(zhì)包括一個(gè)第一可植入的、生物相容性的、合成 的或天然的、具有兩個(gè)分離表面的聚合物基質(zhì)或支架；和一個(gè)第二可植入的、生物相容性 的、合成的或天然的、具有兩個(gè)分離表面的聚合物基質(zhì)或支架，它們適合于彼此接合，并且 其在接合時(shí)的形狀符合需要治療的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)至少一部分。所述第一和第二聚合 物基質(zhì)可由一個(gè)整體單元形成并被分為兩個(gè)或多個(gè)不同部分，或者由兩個(gè)或多個(gè)不同部分 形成并適于接合。在一些實(shí)施方案中，所述第一和第二聚合物基質(zhì)在接合后可用于腔體器 官或組織結(jié)構(gòu)的重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換。
[0279] 在一些實(shí)施方案中，所述第一和第二聚合物基質(zhì)是對(duì)稱的，而在其他實(shí)施方案中， 所述第一和第二聚合物基質(zhì)是不對(duì)稱的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一聚合物基質(zhì)或支架 具有半球形或準(zhǔn)半球形的形狀，有一個(gè)封閉的圓頂末端和一個(gè)開放的赤道狀邊緣；所述第 二聚合物基質(zhì)或支架具有適于與所述第一聚合物基質(zhì)的赤道狀邊緣結(jié)合的卡圈。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述第一和第二聚合物基質(zhì)均為半球或準(zhǔn)半球狀，有一個(gè)封閉的圓頂末端和 一個(gè)開放的赤道狀邊緣。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二聚合物基質(zhì)各具有一個(gè) 圓形或半圓形的底座和至少2個(gè)從所述底座呈放射狀延伸的花瓣形部分。在這一實(shí)施方案 中，所述第一和所述第二聚合物基質(zhì)的底座和花瓣形部分彼此接合產(chǎn)生一個(gè)空心球狀或準(zhǔn) 球狀的基質(zhì)或支架，從而使得在所述接合的聚合物基質(zhì)的一側(cè)形成一個(gè)縱向凸出的橢圓形 開口，而在所述縱向開口的對(duì)側(cè)形成一個(gè)圓形開口。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一和第二 聚合物基質(zhì)由三部分組成，包括適于接合的頂片、前片和側(cè)片。在這一實(shí)施方案中，所述三 個(gè)不同的部分通過至少三個(gè)、優(yōu)選為四個(gè)垂直接縫而接合，從而形成冠狀的新的膀胱構(gòu)建 體。優(yōu)選地，冠狀構(gòu)建體單獨(dú)用作用于腔體器官的重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的裝置。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體為膀胱擴(kuò)張支架。膀胱擴(kuò)張支架的一個(gè)實(shí)例示于圖1。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述構(gòu)建體為膀胱替換支架。膀胱替換支架的一個(gè)實(shí)例示于圖2。
[0280] 此外，當(dāng)所述構(gòu)建體必須與天然脈管或管道相連接時(shí)，所述第一聚合物基質(zhì)和/ 或所述第二聚合物基質(zhì)可包括至少一個(gè)適于接受管狀脈管或插入物的容器或端口。所述脈 管或插入物本身為例如圓柱狀或管狀的成型聚合物基質(zhì)，各自具有至少一個(gè)位于所述圓柱 狀聚合物的第一末端的凸緣。優(yōu)選地，所述所述脈管或插入物由與上述第一或第二聚合物 基質(zhì)相同的生物相容性材料構(gòu)成。在一些實(shí)施方案中，所述脈管或插入物還包括適于包圍 所述圓柱狀或管狀脈管或插入物聚合物基質(zhì)的墊片。例如，所述墊片為水凝膠。任選地，所 述所述圓柱狀或管狀脈管或插入物包括墊片。所述墊片可為水凝膠。此外，所述圓柱狀或 管狀插入物可為自我穩(wěn)定的。
[0281] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述支架或基質(zhì)（在用細(xì)胞接種后）必需與天然脈管或 管道相連接時(shí)，所述適于接受管狀脈管或插入物的容器或端口也應(yīng)用于下文所述的其他基 質(zhì)。
[0282] B.尿流改道
[0283] 本發(fā)明提供了可被細(xì)胞接種并用作在受試者的尿流改道的構(gòu)建中替換胃腸道組 織的新的尿流改道或管道支架。例如，本文所述的新的尿流改道可用于接受了膀胱根除術(shù) 治療的患者，否則所述患者可能需要使用回腸回路改道。
[0284] 在一個(gè)方面，本發(fā)明考慮了適于用作有需要的受試者的尿流改道的管道支架或基 質(zhì)，所述管道支架或基質(zhì)由本文所述的方法形成。所述管道支架的一端可以與一條或多條 輸尿管相連接，另一端可以與受試者體外的尿液儲(chǔ)庫相連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述管道 可以通過開孔而通向受試者的體外。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合物基質(zhì)包括一個(gè)以管 狀形式提供的第一可植入的、生物相容性的、合成聚合物基質(zhì)或支架。在一些實(shí)施方案中， 所述管狀支架包括一個(gè)被設(shè)計(jì)為與受試者的輸尿管相連接的第一末端。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述第一支架還包括一個(gè)被設(shè)計(jì)為在受試者體內(nèi)形成開孔或括約肌的第二末端。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一支架還包括至少一個(gè)被設(shè)計(jì)為與至少一條輸尿管相連接的側(cè)部 開孔。在一些實(shí)施方案中，所述第一支架包括被設(shè)計(jì)為與第一輸尿管相連接的第一側(cè)部開 孔和被設(shè)計(jì)為與第二輸尿管相連接的第二側(cè)部開孔。
[0285] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述管狀結(jié)構(gòu)包括一個(gè)具有平滑邊緣的第一末端和具有不 均一或不不平滑邊緣的第二末端。所述不均一邊緣可包括一個(gè)圓形的底座和從該底座呈放 射狀延伸的幾個(gè)花瓣形部分。所述花瓣形部分的數(shù)目可為1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)。 所述不平滑邊緣可包括例如圖3所示的一系列花瓣形部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述管狀 結(jié)構(gòu)具有適于用作有需要的患者的尿流改道系統(tǒng)或管道的形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，例 如在輸尿管切除術(shù)的情況下，所述系統(tǒng)使尿液從一條或多條輸尿管改道至腹腔壁區(qū)域。在 其他實(shí)施方案中，例如在膀胱切除術(shù)的情況下，所述系統(tǒng)使尿液從膀胱改道至腹腔壁區(qū)域。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)使膀胱和尿道相連接。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用一個(gè) 第一系統(tǒng)使尿液從一條或多條輸尿管改道至腹腔壁區(qū)域，并使用一個(gè)第二系統(tǒng)使尿液從膀 胱改道至腹腔壁區(qū)域。在所有實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)可使尿液從一條或多條輸尿管改道至 腹腔壁區(qū)域，例如形成開孔。
[0286] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述管狀基質(zhì)或支架為尿流改道或管道支架。
[0287] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述尿流改道系統(tǒng)的管狀結(jié)構(gòu)的截面形狀為矩形、圓形或三 角形。圖3A顯示了本文所考慮的一些不同的截面形狀。
[0288] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，管狀結(jié)構(gòu)保留足夠的剛性，以在植入后保持暢通。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，通過或不通過在上述管狀結(jié)構(gòu)的腔中使用導(dǎo)管來保持其剛性。當(dāng)使用導(dǎo)管時(shí)， 可將其置于所述管狀結(jié)構(gòu)的腔空間內(nèi)以提供額外的通透性。
[0289] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述管道支架還可包括一個(gè)圓形或卵形的第二支架，其被 設(shè)計(jì)為將所述第一支架的第一末端與輸尿管相連接。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述管道支 架還可包括一個(gè)墊圈形的第三支架，其被設(shè)計(jì)為開孔或括約肌的形式并與所述第一管狀支 架的第二末端一起形成受試者身體的開孔。圖3B顯示了尿流改道構(gòu)建體的變化方案（A-開口呈卵形；B-開口呈卵形的容器；C-封閉的卵形容器和三個(gè)管）。
[0290] 在一些實(shí)施方案中，所述管狀結(jié)構(gòu)可包括墊片結(jié)構(gòu)，以用于連接至組織、器官或身 體部分，以實(shí)現(xiàn)吻合從而形成可控的開孔或括約肌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所提供的墊片的 厚度小于約lmm、小于約I. 5mm、小于約2mm、小于約2. 5mm、小于約3mm、小于約3. 5mm、小于 約4mm、小于約4. 5mm或小于約5mm。
[0291] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述尿流改道或管道支架被成型為圖3所示的構(gòu)型。
[0292] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述管狀結(jié)構(gòu)包括一個(gè)具有平滑邊緣的第一末端和一個(gè)具 有不均一或不平滑邊緣的第二末端。所示不均一邊緣可包括一個(gè)或多個(gè)緊固件，被設(shè)計(jì)為 與受試者的外部區(qū)域相連接，例如以開孔至受試者體外的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述管 狀結(jié)構(gòu)的第一和第二末端可為圖3所示的形式。所示緊固件的數(shù)量可為1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4 個(gè)、5個(gè)或6個(gè)。
[0293] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述管狀支架具有如圖27所示的形式。
[0294] 圖4A顯示了正常人類泌尿系統(tǒng)的一部分解剖結(jié)構(gòu)。
[0295] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述管狀結(jié)構(gòu)的形式適于用作有需要的患者體內(nèi)的尿流改道 或管道。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如在輸尿管切除術(shù)的情況下，所述 管道使尿液從一條或多條輸尿管改道至腹腔壁區(qū)域（圖4D)。在其他實(shí)施方案中，例如在膀 胱切除術(shù)的情況下，所述管道使尿液從膀胱改道至腹腔壁區(qū)域（圖4B)。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述管道使膀胱和尿道相連接（圖4D)。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用一個(gè)第一管道 使尿液從一條或多條輸尿管改道至腹腔壁區(qū)域，并使用一個(gè)第二管道使尿液從膀胱改道至 腹腔壁區(qū)域。在所有實(shí)施方案中，所述管道可使尿液從一條或多條輸尿管改道至腹腔壁區(qū) 域（圖4B)。在所有實(shí)施方案中，所述管道均可被設(shè)計(jì)為形成開孔。
[0296] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述尿流改道或管道支架的管狀結(jié)構(gòu)的截面形狀為矩形、圓 形或三角形。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述管狀結(jié)構(gòu)保留足夠的剛性，以在植入后保持暢通。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過或不通過在上述管狀結(jié)構(gòu)的腔中使用導(dǎo)管來保持其剛性。在一 些實(shí)施方案中，尿流改道支架還包括被設(shè)計(jì)為在植入后置于所述管狀結(jié)構(gòu)的腔空間內(nèi)的導(dǎo) 管。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述導(dǎo)管為類似Foley氏管的球囊導(dǎo)管。當(dāng)使用導(dǎo)管時(shí)，可將其置 于所述管狀結(jié)構(gòu)的腔空間內(nèi)以提供額外的通透性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠知曉可適用于 本發(fā)明的本領(lǐng)域中已知的其他導(dǎo)管。
[0297] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述支架的管狀壁厚度應(yīng)為小于約2mm、小于約2. 5mm、小 于約3. 5mm、小于約4mm、小于約4. 5mm、小于約5mm、小于約5. 5mm或小于約6mm。
[0298] 在一些實(shí)施方案中，所述支架可具有可變的外徑和內(nèi)徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 支架的末端可為喇叭口形、非喇叭口形、封口形或圓形。
[0299] 在其他實(shí)施方案中，所述支架可允許尿液透過。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述支架的孔 徑大于約〇微米至約500微米。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔徑為約100微米至約200微 米。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述孔徑為約150微米至約200微米。在其他實(shí)施方案中，所述 孔徑為約100微米、約110微米、約120微米、約130微米、約140微米、約150微米、約160 微米、約170微米、約180微米、約190微米或約200微米。在一些實(shí)施方案中，所述孔徑為 約100微米、約200微米、約300微米、約400微米、約500微米或約600微米。在其他實(shí)施 方案中，所述支架的孔徑構(gòu)型包括單孔徑分布、多孔徑分布或梯度孔徑分布。
[0300] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述支架材料可縫合的，并且可以與組織形成不滲漏的連 接。
[0301] 在其他實(shí)施方案中，選擇所述管狀支架的材料，以保證在為在植入應(yīng)用的過程中 保持通暢、支持細(xì)胞貼附和與宿主組織一起生長并保持柔性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述材 料的爆裂強(qiáng)度應(yīng)超過其在與體內(nèi)的正常體液循環(huán)接觸時(shí)所承受的壓力。在其他實(shí)施方案 中，所述材料應(yīng)具有與宿主組織生長相適應(yīng)的降解時(shí)間。
[0302] C.肌肉等效物
[0303] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的聚合物基質(zhì)或支架為肌肉等效物支架。在一個(gè)實(shí)施方案中， 肌肉等效物支架為逼尿肌肌肉等效物支架。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述支架適用于通過腹 腔鏡手術(shù)植入。
[0304] 在一個(gè)方面，聚合物基質(zhì)包括其形狀適合于至少一部分需要所述治療的器官或組 織結(jié)構(gòu)和其大小是足夠通過腹腔鏡方法植入的聚合物基質(zhì)或支架。在某些實(shí)施方案中，本 發(fā)明的聚合物基質(zhì)或支架長度約為3至20cm之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架 的最大長度約20cm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架的最大長度約15cm。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架的最大長度約l〇cm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或 支架的最大長度約8cm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架的最大長度約4cm。在又 另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架的最大長度約3cm。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的聚 合物基質(zhì)或支架的寬度約為1至8cm之間。在一些實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架的最大 寬度約4cm。在其他實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架的最大寬度約3cm。在另外的實(shí)施方式 中，聚合物基質(zhì)或支架的最大寬度約5cm。
[0305] 在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架具有三維（3-D)形狀。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，聚合物基質(zhì)或支架具有扁平形狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述扁平形狀的聚合物基質(zhì)或 支架包括預(yù)處理區(qū)域以允許更大的靈活性。在某些實(shí)施方案中，該預(yù)處理區(qū)域在將要褶皺 的區(qū)域中具有涂層。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架具有足夠的延展性以便進(jìn)行卷 曲、折疊或成型以用于通過腹腔鏡管和/或端口進(jìn)行植入。在這種實(shí)施方式中，聚合物基質(zhì) 或支架具有足夠的延展性以便展開、鋪開或恢復(fù)到穿過腹腔鏡管和/或端口插入之后的形 狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架在通過腹腔鏡管和/或端口植入之前被切割成 2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)條帶。在某些實(shí)施方案中，該2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)條帶在通 過腹腔鏡管和/或端口植入之前彼此接合。該2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)條帶可通過膠水、 訂書釘、縫線或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的其他技術(shù)方式接合在一起。在這種實(shí)施方式中， 該2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)條帶為折疊的和/或堆疊的以穿過腹腔鏡管和/或端口。在 這種實(shí)施方式中，該2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)條帶在穿過腹腔鏡管和/或端口插入之后為 展開的和/或鋪開的。在一些實(shí)施方案中，在正確地穿過腹腔鏡管和/或端口插入之后，先 前放置的接合裝置被收緊。
[0306] 在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)包括一個(gè)第一可植入的、生物相容性、合成的或天 然的聚合物基質(zhì)或支架，其具有補(bǔ)片或條帶樣式。在一個(gè)實(shí)施方案中，該補(bǔ)片具有適合于用 作患者所需的膀胱中逼尿肌肌肉等效物的樣式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該補(bǔ)片具有適合于 用作患者所需的增大已有膀胱容積的樣式。在某些實(shí)施方案中，該補(bǔ)片將膀胱的大小增大 了約50mL至約500mL。在一些實(shí)施方案中，該補(bǔ)片增大了膀胱大小50mL。在一些實(shí)施方案 中，該補(bǔ)片增大了膀胱大小約450mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，表面面積增大了 30cm2使得200mL 的膀胱容積增大到250mL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表面面積增大了 25cm2使得350mL的膀胱 容積增大到400mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述支架具有約30cm 2的二維表面積。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述支架具有約25cm2的二維表面積。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述補(bǔ)片為條帶、圓 盤、方形、橢圓或其他任意合適的樣式。在其他實(shí)施方案中，所述補(bǔ)片具有預(yù)折疊的樣式，例 如風(fēng)琴狀。
[0307] 圖5A-B示出了肌肉等效物支架或聚合物基質(zhì)的示例。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物 基質(zhì)或支架為雙楔形狀，例如圖5A所示的形狀。在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)成型為 圖6-9所示出的其中一種結(jié)構(gòu)。
[0308] 在所有實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架成型為以使得膀胱和基質(zhì)或支架上的應(yīng)變 最小化。
[0309] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)包括一個(gè)第一可植入的、生物相容性、合成的或 天然的聚合物基質(zhì)或支架，其具有補(bǔ)片或條帶樣式。在一個(gè)實(shí)施方案中，該補(bǔ)片具有適合于 用作患者所需的膀胱中逼尿肌肌肉等效物的樣式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該補(bǔ)片具有適合 于用作患者所需的增大已有膀胱容積的樣式。在一些實(shí)施方案中，該補(bǔ)片增大了膀胱大小 50mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述補(bǔ)片為條帶、圓盤、方形、橢圓或其他任意合適的樣式。在其 他實(shí)施方案中，所述補(bǔ)片具有預(yù)折疊的樣式，例如風(fēng)琴狀。
[0310] 在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)成型為圖1-9或27所示出的其中一種結(jié)構(gòu)。
[0311] 在所有實(shí)施方案中，所述用于這些基質(zhì)或支架生物相容性材料例如是可生物降解 的。在全部這些實(shí)施方案中，所述生物相容性材料可為聚乙醇酸。
[0312] 在所有實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)或支架涂覆有生物相容性和可生物降解的形凝材 料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述形凝材料可以包括液化共聚物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述液 化共聚物可以包括液化乳酸/乙醇酸共聚物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述液化共聚物可包括 聚-DL-丙交酯-共-乙交酯。
[0313] 5.構(gòu)律體
[0314] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種或多種至少接種了一種細(xì)胞群的聚合物支架或基 質(zhì)。這些支架已經(jīng)接種了一種細(xì)胞群，在本文中可被稱為"構(gòu)建體"。在一個(gè)實(shí)施方案中， 該細(xì)胞接種的聚合物基質(zhì)或基質(zhì)形成新的膀胱構(gòu)建體，該新膀胱構(gòu)建體選自膀胱替代構(gòu)建 體、膀胱擴(kuò)張構(gòu)建體、膀胱管道構(gòu)建體和逼尿肌肌肉等效物構(gòu)建體。
[0315] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉本文描述的一種或多種細(xì)胞群的接種或沉積可以通過 現(xiàn)有技術(shù)中各種已知的方法來實(shí)現(xiàn)。例如，生物反應(yīng)器孵化和培養(yǎng)（美國公布的Bertram 等人的專利申請(qǐng)20070276507 ;McAllister等人的美國專利7, 112, 218 ;Auger等人的 美國專利5, 618, 71 ;Niklason等人的美國專利6, 537, 567)、壓力引誘接種（Torigoe et al. (2007)Cell Transplant. , 16(7):729-39 ；ffang et al. (2006)Biomaterials. May ； 27(13) :2738-46)和靜電接種（Bowlin等人的美國專利5, 723, 324)可以使用。此外，最新的 同時(shí)在電紡纖維外上細(xì)胞氣溶膠衣的技術(shù)對(duì)接種或者沉積來說也可以是合適的（Stankus et al. (2007)Biomaterials, 28:2738-2746)〇
[0316] 在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞的沉積包括將支架和增強(qiáng)細(xì)胞附著的蛋白質(zhì)接觸的步 驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該增強(qiáng)蛋白為纖維連接蛋白、膠原質(zhì)和MATRIGEL?的一種或多 種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該支架不包含增強(qiáng)細(xì)胞附著的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì) 胞的沉積包括在將支架與細(xì)胞群接觸后的培養(yǎng)步驟。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，該培養(yǎng)可能 包括一個(gè)生物反應(yīng)器中脈動(dòng)的和/或穩(wěn)定的流動(dòng)。
[0317] 從本文描述的脂肪或外周血分離的平滑肌細(xì)胞群可以在本文所述的支架上接種。
[0318] 以下為在支架上接種細(xì)胞的方法的代表性實(shí)例。脂肪的或外周血來源的平滑肌細(xì) 胞可以擴(kuò)增最長達(dá)7周，以產(chǎn)生在支架上接種所需的細(xì)胞數(shù)量。適于在支架上接種的細(xì)胞 的密度如下所述。脂肪來源的平滑肌細(xì)胞可在細(xì)胞收獲前擴(kuò)增2代，以在支架上接種產(chǎn)生 構(gòu)建體。外周血來源的平滑肌細(xì)胞為在支架上接種的培養(yǎng)可在收獲之前擴(kuò)增3-4代。為提 供細(xì)胞接種的支架，合適的材料（例如PGA毛氈）可以切成一定大小，縫合成合適的形狀， 并涂覆材料（例如PLGA)。該支架然后可以用合適的方法滅菌（例如環(huán)氧乙烷）。在細(xì)胞 接種的前一天，該滅菌的支架可以通過60 %乙醇/40 % D-PBS、100 % D-PBS、D-MEM/10 % FBS 或α -MEM/10% FBS預(yù)濕而飽和，接著室溫下在D-MEM/10% FBS或α -MEM/10% FBS里培養(yǎng) 過夜。支架可以接種脂肪來源的或外周血來源的平滑肌細(xì)胞，在濕潤的、37°C含5%的CO2 的培養(yǎng)器中使構(gòu)建體成熟，直至植入受試者體內(nèi)（例如7天）。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠知 曉為制備用于細(xì)胞接種的支架和在支架上接種細(xì)胞的其他方法。
[0319] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在減少的時(shí)間框架下制備構(gòu)建體的方法，這對(duì)等待植 入構(gòu)建體的所述受試者有益。據(jù)報(bào)道，來源于SVF的未分化的脂肪干細(xì)胞在分化成平滑肌 細(xì)胞之前必須在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6星期（Jack et al. 2009,見上文）。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述方法包括下述步驟：a)獲得人類脂肪組織樣本；b)從樣本中分離完全分化的平滑 肌細(xì)胞群；c)培養(yǎng)所述細(xì)胞群；和d)將所述細(xì)胞群與聚合物基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建體接觸，其中步 驟a)、b)、c)和d)需要實(shí)施約45天或少于45天的時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該分離步 驟是在沒有細(xì)胞篩選的情況下實(shí)施的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該分離步驟b)是在完成步驟 a)后實(shí)施約72小時(shí)或少于72小時(shí)的時(shí)間。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟c)實(shí)施 約4周或少于4周的時(shí)間。在其他實(shí)施方案中，該接觸步驟d)實(shí)施約10天或少于10天的 時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)、b)、c)和d)實(shí)施28天或少于28天的時(shí)間。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，該分離步驟b)在完成a)步驟后實(shí)施約48小時(shí)或少于48小時(shí)的時(shí)間。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)步驟c)實(shí)施約2周或少于2周的時(shí)間。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 該接觸步驟d)實(shí)施約5天或少于5天的時(shí)間。在所有實(shí)施方案中，該人類脂肪組織樣本均 從自體來源獲得。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括檢測平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)的 步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)為mRNA表達(dá)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)為 多肽表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽表達(dá)由細(xì)胞內(nèi)免疫熒光檢測。
[0320] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該支架包括本文所述的細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該支架 基本上由本文所述的細(xì)胞群構(gòu)成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該支架由本文所述的細(xì)胞群組成。
[0321] 所述第一聚合物基質(zhì)或第二聚合物基質(zhì)，如果有的話，或兩者都有，包含至少一種 細(xì)胞群，該細(xì)胞群沉積在所述第一聚合物基質(zhì)的一個(gè)第一表面、所述第二聚合物基質(zhì)的一 個(gè)第一表面的表面上或表面中，或兩者都有，以形成基質(zhì)或支架加細(xì)胞的構(gòu)建體，其中至少 一種細(xì)胞群基本上包括一個(gè)肌細(xì)胞群。該肌細(xì)胞群例如為平滑肌細(xì)胞群。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施 方案中，所述第一表面和所述第二表面為所述第一和第二聚合物基質(zhì)的每個(gè)外部表面。
[0322] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含基質(zhì)和細(xì)胞的構(gòu)建體不含任何其他細(xì)胞群。在一 個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體不含有尿道上皮細(xì)胞。
[0323] 這些構(gòu)建體是用于向有需要的受試者提供腔體器官或組織結(jié)構(gòu)，如泌尿生殖器器 官，包括例如膀胱、輸尿管和尿道。所述受試者可能需要重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換這些器官或 組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，該腔體器官或組織結(jié)構(gòu)為膀胱或其部分，該聚合物基質(zhì)或支架在 該基質(zhì)表面沉積有平滑肌細(xì)胞。該構(gòu)建體也可能用于提供尿流改道或管道、或逼尿肌肌肉 等效物。
[0324] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供尿流改道或管道支架或接種本文所述的細(xì)胞群的基質(zhì)。 該支架已接種細(xì)胞群，在本文中可被稱為"構(gòu)建體"。在一個(gè)實(shí)施方案中，該尿流改道或膀胱 管道構(gòu)建體由本文所述的一種或多種支架和沉積于本文所述的一種或多種支架的一個(gè)或 多個(gè)表面上的細(xì)胞群組成。
[0325] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了肌肉等效物構(gòu)建體，其可用于為有需要的受試者增強(qiáng) 已有的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)如泌尿生殖器器官，包括例如膀胱。所述受試者可能會(huì)需要這 些器官或組織的擴(kuò)張或治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，該腔體器官或組織結(jié)構(gòu)為膀胱或其部分， 該聚合物基質(zhì)或支架在基質(zhì)表面沉積有平滑肌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，該構(gòu)建體用于提 供逼尿肌肌肉等效物.。
[0326] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠知曉在基質(zhì)或支架上沉積細(xì)胞群有數(shù)種合適的方法。
[0327] 在一個(gè)方面，構(gòu)建體適合于植入需要新器官或組織結(jié)構(gòu)的受試者體內(nèi)。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述構(gòu)建體包括產(chǎn)生細(xì)胞因子MCP-I的細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該MCP-I 引起受試者或受體的天然間充質(zhì)干細(xì)胞向植入位置遷移。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受體的 遷移的天然間充質(zhì)干細(xì)胞幫助新器官或組織結(jié)構(gòu)的再生。
[0328] 在另一方面，本發(fā)明提供特定密度的細(xì)胞接種的支架。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè) 支架由細(xì)胞密度約20 X IO6至約30 X IO6個(gè)細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞群接種。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，該細(xì)胞密度為約IX IO6至約40 X 106、約IX IO6至約30 X 106、約IX IO6至約20 X 106、 約IX IO6至約IOX 106,或約IX IO6至約5X IO6個(gè)細(xì)胞。
[0329] 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，該密度為約20X IO6至約98X IO6個(gè)細(xì)胞。在再另一個(gè) 實(shí)施方案中，該密度為約21 X IO6至約97X 106、約22X IO6至約95X 106、約23X IO6至約 93 X 106、約 24 X IO6 至約 91 X 106、約 25 X IO6 至約 89 X 106、約 26 X IO6 至約 87 X 106、約 28 X IO6 至約 85 X 106、約 29 X IO6 至約 83 X 106、約 30 X IO6 至約 80 X 106、約 35 X IO6 至約 75 X 106、約 40 X IO6 至約 70 X 106、約 45 X IO6 至約 65 X 106,或約 50 X IO6 至約 60 X IO6 個(gè)細(xì) 胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該密度為約24X IO6至約91 X IO6個(gè)細(xì)胞。
[0330] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該密度為約2. 5 X IO6至約40 X 106、約5 X IO6至約40 X 106、 約 7. 5 X IO6 至約 35 X 106、約 10 X IO6 至約 30 X 106、約 15 X IO6 至約 25 X IO6 和約 17. 5 X IO6 至約22. 5X IO6個(gè)細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞密度為約IX 106、約2X106、約 3 X 106、約 4 X 106、約 5 X 106、約 6 X 106、約 7 X 106、約 8 X 106、約 9 X 106、約 10 X 106、約 11\106、約12\106、約13\10 6、約14\106、約15\106、約16\106、約17\10 6、約18父106、 約 19X106、約 20X 106、約 21X106、約 22X 106、約 23X 106、約 24X 106、約 25X 106、約 26X 106、約 27X 106、約 28X 106、約 29X 106、約 30X 106、約 31X 106、約 32X 106、約 33X 106、 約 34X 106、約 35X 106、約 36X 106、約 37X 106、約 38X 106、約 39X 106、約 40X 106、約 41X 106、約 42X 106、約 43X 106、約 44X 106、約 45X 106、約 46X 106、約 47X 106、約 48X 106、 約 49X 106、約 50X 106、約 51X106、約 52X 106、約 53X 106、約 54X 106、約 55X 106、約 56X 106、約 57X 106、約 58X 106、約 59X 106、約 60X 106、約 61X 106、約 62X 106、約 63X 106、 約 64X 106、約 65X 106、約 66X 106、約 67X 106、約 68X 106、約 69X 106、約 70X 106、約 71X 106、約 72X 106、約 73X 106、約 74X 106、約 75X 106、約 76X 106、約 77X 106、約 78X 106、 約 79X 106、約 80X 106、約 81X106、約 82X 106、約 83X 106、約 84X 106、約 85X 106、約 86X 106、約 87X 106、約 88X 106、約 89X 106、約 90X 106、約 91X 106、約 92X 106,約 93X 106、 約 94X 106、約 95X 106、約 96X 106、約 97X 106、約 98X IO6 或約 99X IO6 個(gè)細(xì)胞。
[0331] 在又另一方面，本發(fā)明提供接種細(xì)胞的支架，該細(xì)胞在一支架的每cm2有特定的細(xì) 胞密度。在一個(gè)實(shí)施方案中，該密度為約3, 000細(xì)胞/cm2至約15, 000細(xì)胞/cm2、約3, 500 細(xì)胞/cm2至約14, 500細(xì)胞/cm2、約4, 000細(xì)胞/cm2至約14, 000細(xì)胞/cm2、約4, 500細(xì)胞 /cm2 至約 13, 500 細(xì)胞 /cm2、約 5, 000 細(xì)胞 /cm2 至約 13, 000 細(xì)胞 /cm2、約 4, 500 細(xì)胞 /cm2 至約13, 500細(xì)胞/cm2、約5, 000細(xì)胞/cm2至約13, 000細(xì)胞/cm2、約5, 500細(xì)胞/cm2至約 12, 500 細(xì)胞/cm2、約 6, 000 細(xì)胞/cm2 至約 12, 000 細(xì)胞/cm2、約 6, 500 細(xì)胞/cm2 至約 11，500 細(xì)胞/cm2、約7, 000細(xì)胞/cm2至約11，000細(xì)胞/cm2、約7, 500細(xì)胞/cm2至約10, 500細(xì)胞 /cm2、約 8, 000 細(xì)胞 /cm2 至約 10, 000 細(xì)胞 /cm2、約 7, 500 細(xì)胞 /cm2 至約 9, 500 細(xì)胞 /cm2， 或約8, 000細(xì)胞/cm2至約9, 000細(xì)胞/cm2。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該密度為約3, 000細(xì) 胞/cm2至約7, 000細(xì)胞/cm2,或約9, 000細(xì)胞/cm2至約15, 000細(xì)胞/cm2。
[0332] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的構(gòu)建體適于在植入后為所述受試者提供特定的特征。在一 個(gè)實(shí)施方案中，該構(gòu)建體適于在植入后為所述受試者提供再生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該構(gòu) 建體適于促進(jìn)受試者在植入位置的再生。例如，在植入之后，再生的組織可以在植入位置從 所述構(gòu)建體自身中形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體可以在植入之后賦予所述受試 者功能性的特征。例如，尿流改道構(gòu)建體可適于賦予受試者的尿液從一個(gè)第一輸尿管（例 如第一側(cè)部開孔）到管狀支架的內(nèi)部的通路，和/或適于在受試者外部提供臨時(shí)性尿液儲(chǔ) 存和通路（例如管狀支架）。在一個(gè)實(shí)施方案中，尿流改道構(gòu)建體可適于在植入后提供上皮 化的粘膜。在另一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建體可適于提供受試者體內(nèi)的新器官或組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn) 態(tài)調(diào)節(jié)的發(fā)育。
[0333] 6.俥用方法
[0334] 在一個(gè)方面，本發(fā)明考慮了為需要這類治療的受試者提供層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或 組織結(jié)構(gòu)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該受試者可能需要重建、修復(fù)、擴(kuò)張、或替換器官或組 織。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基質(zhì)的步 驟，這些基質(zhì)成形，以根據(jù)器官或組織結(jié)構(gòu)的需要符合至少器官或組織結(jié)構(gòu)的部分。該提供 步驟之后，可以沉積本文所述的至少一種非來源于需重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的所述受試者 的該器官的組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群。該沉積步驟可以包括在聚合物基質(zhì)上培養(yǎng)所述細(xì)胞群。在 基質(zhì)上沉積所述細(xì)胞群以提供構(gòu)建體之后，可以將其植入患者體內(nèi)的治療位置以形成所需 的層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié) 構(gòu)為膀胱或膀胱的一部分。
[0335] 在另一方面，本發(fā)明提供了為有需要的受試者提供層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié) 構(gòu)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟：a)提供生物相容性的合成的或天 然的聚合物基質(zhì)，該基質(zhì)的形狀符合需要所述治療的該器官或組織結(jié)構(gòu)的至少一部分；b) 在聚合物基質(zhì)的第一區(qū)域上或其中沉積并非來源于與新器官或組織結(jié)構(gòu)相應(yīng)的天然器官 或組織的自體細(xì)胞群；和c)將所述成型的聚合物基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建體植入所述受試者，以形成 層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)。在另一方面，本發(fā)明提供了向有需要的受試者提供新的 膀胱或其部分的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括a)提供生物相容性的合成的或天 然的聚合物基質(zhì)，該基質(zhì)的形狀符合膀胱或其部分；b)在聚合物基質(zhì)的第一區(qū)域上或其中 沉積并非來源于受試者膀胱的自體細(xì)胞群；和c)將所述成形的聚合物基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建體植 入所述受試者以形成新的膀胱或其部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述方法的所述步驟 b)的細(xì)胞群中包含一種或多種外周血來源的平滑肌細(xì)胞，它們對(duì)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物呈陽性 并具有收縮功能，或步驟b)所述細(xì)胞群包含一種或多種脂肪組織來源的平滑肌細(xì)胞，它們 對(duì)平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物呈陽性并具有收縮功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞群的收縮功 能是鈣依賴性的。
[0336] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括用受試者的網(wǎng)膜、腸系膜、肌肉筋膜、和/ 或腹膜包裹管道構(gòu)建體以使其血管化的步驟。
[0337] 在另一方面，本發(fā)明提供了為有需要的受試者的有缺陷的膀胱提供尿流改道或管 道的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述給有需要的受試者提供尿流改道的方法包括下述步驟： (a)提供生物相容性管道支架；(b)在所述支架的第一區(qū)域上或其中沉積第一細(xì)胞群，所述 第一細(xì)胞群實(shí)質(zhì)上為肌肉細(xì)胞群；和（C)將步驟（b)的支架植入所述受試者以形成允許尿 液流出所述受試者體外的管道。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該生物相容性材料為可生物降解的。 在其他實(shí)施方案中，該生物相容性材料為聚乙醇酸。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一細(xì)胞 群實(shí)質(zhì)上為平滑肌細(xì)胞群。
[0338] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括提供本文所述的尿流改道或管道支架的方法。 在其它另一個(gè)實(shí)施方案中，該尿流改道或管道支架以多部分的形式提供，如第一個(gè)支架、第 二個(gè)支架和第三個(gè)本文所述的支架。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括沉積并非來源 于該有缺陷的膀胱的細(xì)胞群以形成尿流改道或管道構(gòu)建體的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 該沉積步驟可以包括在所述支架上培養(yǎng)所述細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括 將尿流改道構(gòu)建體植入有需要的患者的步驟。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該植入是在有缺陷的 膀胱的位置。
[0339] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體的開口末端（例如，一個(gè)被設(shè)計(jì)為與腹腔壁相連 接的第一末端）匯聚于貫穿腹部或恥骨弓壁的皮膚（造瘺術(shù)），以形成開孔或括約肌。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，將導(dǎo)管穿過開放的開孔插入所述構(gòu)建體的空腔，以提供尿液外流。
[0340] 圖10顯示了植入管道構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)。
[0341] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括監(jiān)測在尿流改道構(gòu)建體植入后的堵塞 的步驟。所述堵塞可以是碎屑堆積引起的。如果檢測到堵塞，所述方法還可以包括從管道 腔內(nèi)清除碎屑的步驟。
[0342] 在一個(gè)方面，本發(fā)明臨時(shí)性地為有需要的受試者提供尿流改道。在一個(gè)實(shí)施方案 中，臨時(shí)性尿流改道或管道構(gòu)建體被植入受試者以形成一個(gè)開放的開孔，導(dǎo)管或其它設(shè)備 被臨時(shí)性地穿過開孔插入至管道構(gòu)建體內(nèi)的內(nèi)腔。在想要尋求有缺陷的膀胱的永久性解決 方案時(shí)，臨時(shí)性管道提供了允許尿液從所述受試者排出的優(yōu)勢。例如，所述管道構(gòu)建體的植 入可以在接種細(xì)胞群的新膀胱植入之前、之后或同時(shí)實(shí)施（參見例如Bertram et al，見上 文）。圖11顯示了一個(gè)臨時(shí)性尿流改道構(gòu)建體的植入組件的實(shí)例。
[0343] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括用受試者的網(wǎng)膜、腸系膜、肌肉筋膜和/ 或腹膜包裹尿流改道或管道構(gòu)建體以使其血管化的步驟。
[0344] 在一個(gè)方面，本發(fā)明永久性地為有需要的受試者提供尿流改道。圖12顯示了永久 性尿流改道構(gòu)建體的植入組件的實(shí)例。
[0345] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的構(gòu)建體可以用于前列腺尿道替換和尿流改道。這 些步驟對(duì)于需要前列腺根除術(shù)來切除前列腺尿道的受試者來說是必須的。其他實(shí)施方案 中，該構(gòu)建體可以用于經(jīng)皮膚的改道管道，以形成帶有類閥門扭結(jié)的可控管道。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，該構(gòu)建體可用作膀胱頸手術(shù)中的膀胱頸吊索和包覆材料以及帶有可控通道的尿 液排出口或可導(dǎo)尿開口。這些實(shí)施方案的實(shí)例如圖13所示。
[0346] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的尿流改道構(gòu)建體提供上皮化的粘膜。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述構(gòu)建體適于在植入上形成上皮化粘膜。在一個(gè)實(shí)施方案中，上皮化粘膜包括前庭部分和 粘膜皮膚部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，前庭部分鄰近于粘膜皮膚部分。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，粘膜皮膚部分位于所述連接到受試者的腹腔壁和皮膚的構(gòu)建體的開孔末端。通常，天然 存在的粘膜皮膚部分以存在粘膜和皮膚外皮為特征，并且典型地存在于鄰近于身體的外部 皮膚末端和覆蓋身體內(nèi)部的粘膜開始的開口。所述由本發(fā)明的方法和構(gòu)建體提供的上皮化 粘膜在植入受試者體內(nèi)后在該尿流改道構(gòu)建體的所述第一末端發(fā)育。在另外一個(gè)實(shí)施方案 中，所述上皮化粘膜的特征是存在上皮細(xì)胞，其首先出現(xiàn)在前庭部分并逐漸擴(kuò)張或從粘膜 皮膚部分向所述構(gòu)建體的開口部繁殖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞的特征為上皮細(xì)胞 標(biāo)記物的表達(dá)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞標(biāo)記物為細(xì)胞角蛋白。所述細(xì)胞角蛋白 可以是現(xiàn)有技術(shù)已知的角蛋白的一種或多種，包括但不限于細(xì)胞角蛋白1至19。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，該角蛋白可以用AE-1/AE3抗體檢測出。
[0347] 向待被擴(kuò)張的器官或組織中植入支架可以根據(jù)實(shí)施例中所描述的方法或根據(jù)現(xiàn) 有技術(shù)已知的方法來實(shí)施。通過把植入材料縫合于目標(biāo)器官，可以將該基質(zhì)或支架植入到 所述受試者的器官或組織。
[0348] 所述技術(shù)可以用于在需要此類治療的患者體內(nèi)，以使已有的層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官 或組織結(jié)構(gòu)擴(kuò)張。例如，已有的層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)可以通過下述步驟被擴(kuò)張： 提供聚合物基質(zhì)或支架，該基質(zhì)或支架的形狀符合需要所述治療的器官或組織的至少一部 分，并且其大小足以通過腹腔鏡方法被植入；在所述聚合物基質(zhì)的一個(gè)第一區(qū)域上或其中 沉積非來源于該器官或組織結(jié)構(gòu)的自體細(xì)胞群；以及，通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合 物基質(zhì)構(gòu)建體植入所述患者體內(nèi)的所述治療位置，從而使得已有的層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或 組織結(jié)構(gòu)被擴(kuò)張。
[0349] 圖7e顯示了用于植入本文所述的肌肉等效物支架的可能的手術(shù)方法。圖7f顯示 了在空的和充盈的膀胱上的植入位置。圖7g顯示了帶有手術(shù)切口的膀胱模型，顯示了在表 面切片上產(chǎn)生的橢圓體。塑料管可用作有限可用空間的模型，以穿過本發(fā)明折疊的或卷曲 的聚合物基質(zhì)或支架。
[0350] 所述技術(shù)也可以用于增加需要該治療的患者的膀胱容積。例如，膀胱容積可以通 過下述步驟而得到增加：提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基質(zhì)，該基質(zhì)或支架的 形狀符合需要所述治療的器官或組織的至少一部分，并且其大小足以通過腹腔鏡方法被植 入；在所述聚合物基質(zhì)的一個(gè)第一區(qū)域上或其中沉積非來源于該器官或組織結(jié)構(gòu)的自體細(xì) 胞群；以及，通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體植入所述患者體內(nèi)的所述治 療位置，從而使得膀胱容積增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述基質(zhì)或支架適合于增 加膀胱容積約50mL。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述基質(zhì)或支架適合于增加膀胱容積約 100mL。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的基質(zhì)或支架適合于增加膀胱容積約60、約70、約80或 約 9OmL。
[0351] 所述技術(shù)可以更進(jìn)一步用于擴(kuò)張需要該治療的患者的膀胱切口位置。例如，膀胱 切口位置可以通過下述步驟而被擴(kuò)張：提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基質(zhì)，該 基質(zhì)或支架的形狀符合需要所述治療的器官或組織的至少一部分，并且其大小足以通過腹 腔鏡方法被植入；在所述聚合物基質(zhì)的一個(gè)第一區(qū)域上或其中沉積非來源于該器官或組織 結(jié)構(gòu)的自體細(xì)胞群；以及，通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體植入所述患者 體內(nèi)的所述治療位置，從而使得膀胱切口位置被擴(kuò)張。
[0352] 本發(fā)明的另一個(gè)非限制性應(yīng)用包括對(duì)相應(yīng)治療有需求的患者的尿失禁的治療方 法。例如，尿失禁可以通過下述步驟得到治療：提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基 質(zhì)，該基質(zhì)或支架的形狀符合需要所述治療的器官或組織的至少一部分，并且其大小足以 通過腹腔鏡方法被植入；在所述聚合物基質(zhì)的一個(gè)第一區(qū)域上或其中沉積非來源于該器官 或組織結(jié)構(gòu)的自體細(xì)胞群；以及，通過腹腔鏡方法將所述成形的聚合物基質(zhì)構(gòu)建體植入所 述患者體內(nèi)的所述治療位置，從而使得膀胱容積增加。
[0353] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的支架、細(xì)胞群和方法還可被用于制備治療本文所 述的障礙的藥物。所述障礙包括需要再生、重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換層狀結(jié)構(gòu)的體腔器官或 組織結(jié)構(gòu)的受試者的任何病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述器官或組織結(jié)構(gòu)為膀胱或膀胱 的部分。
[0354] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，沉積在植入的構(gòu)建體上的細(xì)胞產(chǎn)生MCP-I并在植入位置釋 放，它會(huì)刺激天然間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)向植入位置遷移。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述天然 MSC促進(jìn)和/或加強(qiáng)植入構(gòu)建體在植入位置的再生。
[0355] 在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述，沉積的細(xì)胞群來源于外周血或脂肪組織平滑肌 細(xì)胞（SMC)群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述SMC細(xì)胞群包括至少一種有收縮功能并對(duì)平滑肌 細(xì)胞標(biāo)記物呈陽性的細(xì)胞，所述平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物例如心肌蛋白、α -平滑肌肌動(dòng)蛋白、鈣 結(jié)合蛋白、肌球蛋白重鏈、BAALC、結(jié)蛋白、成肌纖維細(xì)胞抗原、SM22,以及它們的任意組合。 在其他實(shí)施方案中，所述SMC細(xì)胞群包括至少一種表現(xiàn)心肌蛋白（MYO⑶）表達(dá)的細(xì)胞。該 MYO⑶表達(dá)可以為MYCOD多肽或編碼MYO⑶多肽的核酸的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述SMC的收縮功能是鈣依賴性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，需要重建、修復(fù)、擴(kuò)張或替換的受試 者所需的所述該層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)是膀胱或膀胱的一部分。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，所述聚合物基質(zhì)不含有尿道上皮細(xì)胞。
[0356] 在所有實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法利用植入一種支架，該支架以接種有本文所述 的細(xì)胞群的膀胱替換支架、膀胱擴(kuò)張支架、膀胱管道支架或逼尿肌肌肉等效物支架為基礎(chǔ)。
[0357] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的層狀結(jié)構(gòu)的體腔器官或組織結(jié)構(gòu)的再生、重建、 修復(fù)、擴(kuò)張或替換的方法包括以下步驟：a)提供生物相容性的合成的或天然的聚合物基 質(zhì)，該基質(zhì)的形狀符合需要所述治療的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)的至少一部分；b)在所述聚合 物基質(zhì)的第一區(qū)域上或其中以本文所述的細(xì)胞密度沉積一個(gè)第一細(xì)胞群，所述細(xì)胞群實(shí)質(zhì) 上為肌肉細(xì)胞群；和c)將所述成形的聚合物基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建體植入所述患者的所述治療位 置，以形成層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在體內(nèi)形成的所述層狀 結(jié)構(gòu)的腔體器官或組織結(jié)構(gòu)具有天然膀胱組織的順應(yīng)性。
[0358] 在另一方面，本發(fā)明提供了在植入有此需要的受試者后、基于生物力學(xué)刺激或循 環(huán)而再生新的膀胱的方法。在一個(gè)方面，所述方法適用于促進(jìn)已經(jīng)為膀胱或其一部分的擴(kuò) 張或替換而植入的新的膀胱構(gòu)建體的再生。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述新的膀胱構(gòu)建體由接 種在新的膀胱基質(zhì)或支架上的細(xì)胞形成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述新的膀胱支架是膀胱 替換支架、膀胱擴(kuò)張支架、膀胱管道支架或逼尿肌肌肉等效物支架。
[0359] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的所述方法可用于由接種在新的膀胱支架上的至少一種細(xì)胞 群形成的植入的新的膀胱構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞接種聚合物基質(zhì)（或基質(zhì)） 為膀胱替換支架、膀胱擴(kuò)張支架、膀胱管道支架或逼尿肌肌肉等效物支架。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述至少一種細(xì)胞群實(shí)質(zhì)上包括肌肉細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肌肉細(xì)胞群可 為平滑肌細(xì)胞群。如本文所述，可用使用不同的細(xì)胞接種密度。
[0360] 在一個(gè)方面，在新的膀胱植入后以不同的次數(shù)和不同的持續(xù)時(shí)間來實(shí)施本發(fā)明的 方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該循環(huán)在一段時(shí)間內(nèi)以日為基準(zhǔn)，在一段時(shí)間以周為基準(zhǔn)或者每 隔一周實(shí)施。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每日循環(huán)方案的持續(xù)時(shí)間為約2周、約3周、約4周、約 5周、約6周、約7周、約8周、約9周、約10周、約11周、約12周、約13周、約14周或多于 14周。
[0361] 在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者的每日循環(huán)方法可以包括下述步驟：用約1小時(shí)填充 該新的膀胱，用約1小時(shí)將該充滿的新的膀胱排水，和通常允許新的膀胱自由排水過夜。該 方法可以在受試者的每日循環(huán)方案的第一天實(shí)施。這種每日循環(huán)的操作可用在第一天之后 連續(xù)實(shí)施幾天。在一個(gè)實(shí)施方案中，該循環(huán)方案可以在第一天之后的某天實(shí)施，在這段時(shí)間 內(nèi)，該填充的步驟可以增加到約2小時(shí)、約3小時(shí)、約4小時(shí)或比4小時(shí)更多。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，在允許新的膀胱自由排水之前，所述填充和排水的時(shí)間可以在一天之內(nèi)重復(fù)多 于一次。
[0362] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者在植入后再植入導(dǎo)管，該循環(huán)時(shí)間由夾住或者 松開受試者的導(dǎo)管來進(jìn)行控制。
[0363] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠理解，本文也考慮了其他的循環(huán)方案。
[0364] 一個(gè)循環(huán)方案的實(shí)例如下所述。在如本文所述地將由接種在新的膀胱基質(zhì)或支 架上的細(xì)胞而形成的新的膀胱構(gòu)建體植入后，循環(huán)將會(huì)在每2周（14±2天的間隔）實(shí)施， 從植入后的1個(gè)月后開始持續(xù)到約第90日。循環(huán)將在某些類型的評(píng)估（例如植入的新膀 胱順應(yīng)性測量）之后但是在其它類型評(píng)估（例如熒光成像）之前完成。在順應(yīng)性測量完成 后，可通過用消毒鹽水以10_25mL/min的速率再充盈膀胱（通過保溫箱預(yù)熱）的方式實(shí)施 循環(huán)。該循環(huán)將至少重復(fù)5-10次。剛開始將會(huì)達(dá)到0-10毫米貢柱的壓力，并且從開始時(shí) 就進(jìn)行記錄。針對(duì)每個(gè)循環(huán)在每個(gè)在導(dǎo)管周圍觀察到的時(shí)間逝去點(diǎn)（leakage)(又名逝去 點(diǎn)），或者在輸入的量與剛實(shí)施的順應(yīng)性測量相等的時(shí)候（以兩者最先發(fā)生的時(shí)間為準(zhǔn)）， 記錄時(shí)間、輸入的等滲溶液的體積和產(chǎn)生的壓力。
[0365] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了促進(jìn)植入受試者體內(nèi)的新的膀胱再生的方法， 所述方法包括下述步驟：(a)用液體填充植入的新的膀胱；(b)排空步驟（a)中填充的新的 膀胱。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括步驟（c)重復(fù)步驟（a)和（b)。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，所述方法在植入后兩周內(nèi)開始。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟（a)和（b)每天進(jìn)行一 次、每周進(jìn)行一次或每兩周進(jìn)行一次。在其他一些實(shí)施方案中，所述填充步驟（a)進(jìn)行約1 小時(shí)，所述排空步驟（b)進(jìn)行約一小時(shí)。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟（a)和（b) -直持續(xù) 進(jìn)行至植入后至少六周。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟（a)和（b) -直持續(xù)進(jìn)行至植入后不 超過十周。在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟（a)和（b) -直持續(xù)進(jìn)行至植入后超過十周。在其 他實(shí)施方案中，所述填充步驟包括擴(kuò)張所述新的膀胱。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述再生包括 使受試者體內(nèi)的新的膀胱的容量相對(duì)于未經(jīng)過循環(huán)的新的膀胱而言有所增加。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，所述再生包括使受試者體內(nèi)的新的膀胱的順應(yīng)性相對(duì)于未經(jīng)過循環(huán)的新的膀胱 而言有所增加。在其他實(shí)施方案中，所述再生包括使受試者體內(nèi)的新的膀胱的細(xì)胞外基質(zhì) 發(fā)育相對(duì)于未經(jīng)過循環(huán)的新的膀胱而言有所增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)育的 增加包括彈性蛋白纖維的發(fā)育。
[0366] 在另一方面，本發(fā)明涉及為哺乳動(dòng)物提供新的膀胱的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)發(fā)育、從而使得植 入的新的膀胱能夠適應(yīng)受體的需要的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，植入的新的膀胱生長至與 所述受體成比例的大小。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述為受試者提供新的膀胱的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)發(fā) 育的方法包括下述步驟：(a)提供生物相容性聚合物支架；(b)在所述支架的一個(gè)第一區(qū)域 上或其中沉積一個(gè)第一細(xì)胞群，所述第一細(xì)胞群實(shí)質(zhì)上為肌肉細(xì)胞群；和（c)將步驟（b)的 支架植入所述受試者體內(nèi)，以建立穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)發(fā)育。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)發(fā)育 包括器官大小和結(jié)構(gòu)的重建。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)發(fā)育包括與體重成比例 的新的膀胱容量。在一個(gè)實(shí)施方案中，在植入后約四個(gè)月獲得成比例的新的膀胱容量。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述為受試者提供新的膀胱的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)發(fā)育的方法包括監(jiān)測穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié) 發(fā)育的階段或植入的新的膀胱的進(jìn)展。所述監(jiān)測可包括膀胱造影過程以顯示植入的新的膀 胱的位置和形狀，和/或測量尿動(dòng)力順應(yīng)性和容量。
[0367] 在另一方面，本發(fā)明提供了在患者體內(nèi)植入新的器官或組織結(jié)構(gòu)后對(duì)患者的預(yù)后 進(jìn)行評(píng)估的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟：檢測獲自所述受試者的測試 樣本中的MCP-I表達(dá)水平；(b)確定測試樣本中的MCP-I表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照樣本（或?qū)?照參照值）的水平；和（c)基于MCP-I表達(dá)水平的測定來預(yù)測所述患者的再生性預(yù)后，其中 如果測試樣本中的MCP-I表達(dá)水平高于對(duì)照樣本（或?qū)φ諈⒄罩担┘礊閷?duì)所述受試者再生 的預(yù)后。
[0368] 在另一方面，本發(fā)明提供了在患者體內(nèi)植入新的器官或組織結(jié)構(gòu)后對(duì)患者的預(yù)后 進(jìn)行評(píng)估的方法，所述方法包括：(a)獲得患者的生物學(xué)樣本；和（b)監(jiān)測所述生物學(xué)樣本 中的MCP-I表達(dá)，其中MCP-I的表達(dá)即為對(duì)患者的再生預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，患者生物 學(xué)樣中的MCP-I表達(dá)比對(duì)照樣本（或?qū)φ諈⒄罩担└呒礊槭茉囌叩脑偕A(yù)后。在一些實(shí)施 方案中，患者生物學(xué)樣中的MCP-I表達(dá)比對(duì)照樣本（或?qū)φ諈⒄罩担┑图礊槭茉囌叩奈丛?生預(yù)后。所述患者樣本可為測試樣本，包括體液例如血液或尿液。
[0369] 在一些實(shí)施方案中，所述測定步驟包括使用有合適的處理器執(zhí)行的軟件程序，并 實(shí)現(xiàn)下述目的（i)測量測試樣本和對(duì)照樣本中的差異的MCP-I表達(dá)水平；和/或（ii)對(duì)測 量測試樣本和對(duì)照樣本中的差異的MCP-I表達(dá)水平所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。合適的軟件和處 理器都是本領(lǐng)域公知的，并且可以商購獲得。所述程序可被固化在軟件中并存儲(chǔ)與可讀介 質(zhì)上，所述介質(zhì)例如CD-ROM、軟盤、硬盤、DVD或與處理器相關(guān)的內(nèi)存，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員 容易理解的是，整個(gè)程序或其部分都可以以公知的方式在處理器以外的裝置中運(yùn)行和/或 固化在固件中和/或?qū)Ｓ糜布K中。
[0370] 例如，在測定步驟之后，測量結(jié)果、發(fā)現(xiàn)、診斷、預(yù)測和/或治療建議通常被記錄并 傳送至技術(shù)員、醫(yī)生和/或患者。在某些實(shí)施方案中，將使用計(jì)算機(jī)來將這類信息傳送給相 關(guān)人員，例如患者和/或主治醫(yī)生。在一些實(shí)施方案中，可以進(jìn)行測定或?qū)⑺鼋Y(jié)果或診斷 傳送至另一個(gè)國家或地區(qū)來進(jìn)行分析。
[0371] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，以對(duì)具有差異水平的MCP-I表達(dá)的受試者測得的MCP-I 表達(dá)水平為基礎(chǔ)，在測定完成和預(yù)后/預(yù)測產(chǎn)生以后將得到的預(yù)后、預(yù)測和/或治療建議盡 快與受試者溝通?？梢酝ㄟ^受試者的主治醫(yī)生與所述受試者進(jìn)行所述結(jié)果和/或相關(guān)信息 的溝通?；蛘?，可以通過任何溝通手段直接與測試受試者進(jìn)行結(jié)果的溝通，所述手段包括書 寫和電子溝通形式，例如電話或電子郵件的溝通。在使用電子郵件溝通的情況下，使用計(jì)算 機(jī)可以促進(jìn)溝通。在某些實(shí)施方案中，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的計(jì)算機(jī)硬件和軟件 的組合，自動(dòng)地產(chǎn)生和傳送基于測試的含有預(yù)后測試結(jié)果和/或所得結(jié)論和/或治療建議 的溝通信息。美國專利No. 6, 283, 761記載了健康護(hù)理定位溝通系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例；但是本發(fā) 明并不限于使用這種特定溝通系統(tǒng)的方法。在本發(fā)明方法的某些實(shí)施方案中，所述方法的 全部或部分步驟，包括樣本的測定、預(yù)后和/或再生的預(yù)測、以及測定結(jié)果或預(yù)后的溝通， 都可以在另外的環(huán)境（例如外部環(huán)境）中進(jìn)行。
[0372] 在另一方面，本文所述的預(yù)后方法為評(píng)估植入的成功程度以及再生的康復(fù)/治療 方法提供了有用的信息。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括下述步驟：檢測獲自所述受試者 的測試樣本中的MCP-I表達(dá)水平；(b)確定測試樣本中的MCP-I表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照樣本 (或?qū)φ諈⒄罩担┑乃?；和（c)基于MCP-I表達(dá)水平的測定來預(yù)測所述患者的再生性預(yù) 后，其中如果測試樣本中的MCP-I表達(dá)水平高于對(duì)照樣本（或?qū)φ諈⒄罩担﹦t表明新的器 官或組織結(jié)構(gòu)出于再生階段。
[0373] 總體而言，本文所使用的術(shù)語"再生預(yù)后"包括對(duì)下述任意一種或多種情況的預(yù)報(bào) 和預(yù)測：通過植入本文所述的構(gòu)建體進(jìn)行膀胱替換或擴(kuò)張后功能性膀胱的發(fā)展和改善；在 植入本文所述的構(gòu)建體后功能性尿流改道的發(fā)展；在植入本文所述的構(gòu)建體后膀胱容量的 發(fā)展或改進(jìn)的膀胱容量；或者在植入本文所述的構(gòu)建體后膀胱順應(yīng)性的發(fā)展或改進(jìn)的膀胱 順應(yīng)性。
[0374] 在所有實(shí)施方案中，為需要本文所述的治療的患者提供層狀結(jié)構(gòu)的腔體器官或組 織結(jié)構(gòu)的方法可包括在植入后如本文所述地評(píng)估再生的步驟。
[0375] 在所有實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及為有需要的受試者提供新的器官或組織結(jié)構(gòu)的方 法，所述方法包括某些植入后的監(jiān)測步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，監(jiān)測植入的構(gòu)建體的效果和 表現(xiàn)，例如在植入后的不同時(shí)間點(diǎn)通過超聲成像、腎盂造影照片以及尿液和血液分析進(jìn)行。 這些監(jiān)測步驟在實(shí)施例3-6中有更詳細(xì)的描述。
[0376] 7.試劑盒
[0377] 本發(fā)明還包括試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明的聚合物基質(zhì)和支架以及相關(guān)材料 和/或細(xì)胞培養(yǎng)基和使用說明書。使用說明書可包括例如培養(yǎng)細(xì)胞或給予所述細(xì)胞和/或 細(xì)胞產(chǎn)物的說明。所述使用說明書還可包括為了通過腹腔鏡植入而對(duì)本發(fā)明的聚合物基質(zhì) 和支架進(jìn)行預(yù)處理、折疊或制備的說明。
[0378] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有本文所述的支架和使用說明書的試劑盒。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒中的支架為下述一種或多種支架：膀胱擴(kuò)張支架、膀胱替 換支架、尿路管道支架或肌肉等效物支架。
[0379] 8.報(bào)告
[0380] 當(dāng)為了商業(yè)目的實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，通常會(huì)產(chǎn)生報(bào)告或再生性預(yù)后的總結(jié)。本 發(fā)明的方法所產(chǎn)生的報(bào)告應(yīng)包括在提供本文所述構(gòu)建體的手術(shù)之前和之后對(duì)再生的可能 過程和結(jié)果的預(yù)測。所述報(bào)告可包括對(duì)于預(yù)后任何指征的信息。本發(fā)明的方法和報(bào)告還可 包括在數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)所述報(bào)告。或者，所述方法還可針對(duì)受試者從數(shù)據(jù)庫中產(chǎn)生報(bào)告并在 報(bào)告中記載數(shù)據(jù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述報(bào)告為紙質(zhì)報(bào)告，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述報(bào) 告為聲音報(bào)告，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述報(bào)告為電子報(bào)告。已經(jīng)考慮了將所述報(bào)告提供給 醫(yī)生和/或患者。所述報(bào)告的接收還可包括與含有數(shù)據(jù)和報(bào)告的服務(wù)器計(jì)算機(jī)建立網(wǎng)絡(luò)連 接，并從所述服務(wù)器計(jì)算機(jī)請(qǐng)求數(shù)據(jù)和報(bào)告。本發(fā)明提供的方法的全部或部分都可以自動(dòng) 進(jìn)行。
[0381] 提供下述實(shí)施例僅是出于說明的目的，并不意欲以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0382] 本申請(qǐng)中引用的所有專利、專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容均通過援引的方式納 入本文。 實(shí)施例
[0383] 實(shí)施例1作為SMCs源的外周血和脂肪組織
[0384] 血液源細(xì)胞
[0385] 成功分離犬，豬，和人類外周血平滑肌細(xì)胞。概括地說，制備50毫升含有1:1外 周血與磷酸鹽緩沖液的稀釋液且在中性粒細(xì)胞分離液中、一種密度梯度材料上分層，并且 在室溫下在1，354xg離心20分鐘。離心作用后，密度梯度（從上到下）清楚地顯示為4層： 血清，血沉棕黃層，中性粒細(xì)胞分離液，紅細(xì)胞。單核細(xì)胞位于血沉棕黃層，其以乳白/灰色 的帶形式存在。血沉棕黃層被收回并且轉(zhuǎn)移進(jìn)一根單獨(dú)的50ml圓錐試管。用PBS稀釋到 50ml。將樣品在室溫下711xg離心10分鐘至球團(tuán)細(xì)胞?；鞈仪驁F(tuán)且培養(yǎng)細(xì)胞。通過細(xì)胞 傳代、當(dāng)達(dá)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)量時(shí)，部分被固定進(jìn)行終點(diǎn)分析，包括免疫檢測平滑肌細(xì)胞蛋白 質(zhì)表達(dá)，平滑肌細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酸檢測，細(xì)胞收縮，細(xì)胞因子和酶合成。
[0386] 結(jié)果
[0387] 培養(yǎng)基選擇。單獨(dú)的40_40ml單核部分犬外周血樣混懸在6種不同介質(zhì)配方內(nèi)， 接種于6孔Primaria細(xì)胞培養(yǎng)板或膠原層板中。
[0388] 如圖14A-E中所示，在一周的培養(yǎng)后，在全部條件下觀察到小的粘性的菌落和小 細(xì)胞團(tuán)塊（DMEM介質(zhì)離析沒被顯示）但是細(xì)胞的種類難以識(shí)別。在α-ΜΕΜ+10% FBS中生 長時(shí)，在Primaria培養(yǎng)皿上觀察到小串葡萄狀和細(xì)胞團(tuán)塊，EGM-2培養(yǎng)基和伴隨添加物，和 EGM-2培養(yǎng)基和伴隨添加物（減去VEGF和FGF2) (A，C，Ε)和膠原蛋白I型，在組織培養(yǎng)上 涂上在相同的介質(zhì)（B，D，F(xiàn))里生長的塑料板。看到與生長在DMEM配方中（數(shù)據(jù)未顯示） 外周血培養(yǎng)相似的結(jié)果。
[0389] 如圖15中所示，在兩周的培養(yǎng)后，在Primaria(左平板）和膠原層板（中間平板） 上、a-MEM中觀察到生長暈菌落和小單層。形態(tài)學(xué)上，這些菌落似乎是平滑肌（圖15,頂 板）或者內(nèi)皮（圖15,中間平板）。平滑?。▓D15,頂板）或者內(nèi)皮（圖15,中間平板）形 態(tài)的生長暈菌落也在其他介質(zhì)/底材狀態(tài)（合適的平板）下形成。一些巨噬細(xì)胞最初被保 存在a -MEM中（圖15,底部左和中間平板），但是沒帶進(jìn)隨后的傳代。隔離在10% FBS的 a MEM中的Primaria盤上的細(xì)胞具有平滑?。ㄗ笊掀桨澹┗蛘呔奘杉?xì)胞（底部左平板）形 態(tài)。沒有內(nèi)皮細(xì)胞在這些條件（中間左平板）下被隔離。隔離在10% FBS的a -MEM中、膠 原層板上的細(xì)胞具有平滑?。ㄗ罡叩闹虚g平板），內(nèi)皮（中間中間平板）和巨噬細(xì)胞（底 部中間平板）形態(tài)。其他介質(zhì)/基質(zhì)配方例如EGM-2 (最高位置平板）和20% FBS的DMEM 補(bǔ)充劑（中間正確平板）也允許間充質(zhì)和類內(nèi)皮細(xì)胞的生長。
[0390] 12種培養(yǎng)基/底材狀態(tài)，α -ΜΕΜ/10% FBS的Primaria中包含大部分沒有內(nèi)皮細(xì) 胞的均勻隔離的平滑肌細(xì)胞（圖15,左上平板）菌落。細(xì)胞在Primaria板上隔離，平鋪在 Nunclon表面（在α -ΜΕΜ/10% FBS中）顯示典型的"峰谷"形態(tài)的是平滑肌細(xì)胞（SMC)， 與在其他研究中的描述一致（Kassis et al. (2006) ;Koerner et al. (2006) ;Simper et al. (2002)，上文）。
[0391] 如圖16中所示，這些細(xì)胞經(jīng)過數(shù)次傳代后仍然保持其形態(tài)（圖16A-G)。豬頸動(dòng)脈 SMC(圖16H)和狗膀胱SMC(圖161)的圖像比較顯示。在更晚傳代（圖16F，G)的平滑肌 細(xì)胞變得更大，更多展開。早期的傳代（A-E)像平滑肌細(xì)胞（SMC)隔離自豬頸動(dòng)脈（H)和 狗膀胱（I)。過后平滑肌細(xì)胞（F，G)的傳代更大，更多展開，產(chǎn)生一個(gè)平滑肌表現(xiàn)型。
[0392] 脂肪衍生細(xì)胞
[0393] 平滑肌細(xì)胞與豬脂肪組織隔離依照下列程序。全部程序在生物安全罩里進(jìn)行。
[0394] 獲取脂肪樣品。在用于生物安全容器之前，在室溫或者4°C下儲(chǔ)存不超過24小時(shí)。
[0395] 每IOOmlPBS中加入1克BSA和0. 1到0. 3克的膠原酶制備膠原酶溶液。通過 0. 2μπι過濾裝置過濾溶液。加熱至37°C。
[0396] 每脂肪體積加入等效體積的膠原酶溶液到每個(gè)離心瓶。需要組織體積的膠原酶溶 液（例如，每IOml脂肪組織膠原酶溶液IOml)。
[0397] 用消毒劑擦拭，蓋上蓋子，用石蠟?zāi)ぐ?，并且放?7°C培養(yǎng)箱里振蕩60分鐘?；?者，試試管放在37°C水浴器中，以每20分鐘手動(dòng)振蕩一次。
[0398] 室溫下300xg離心5分鐘。
[0399] 從離心機(jī)中取出試管，積極地振動(dòng)10秒，使細(xì)胞完全混合。這是完成基質(zhì)細(xì)胞與 主要脂肪細(xì)胞的分離。
[0400] 300xg離心5分鐘。小心吸出頂層的油，主要脂肪細(xì)胞（黃的層浮動(dòng)的細(xì)胞），以 及膠原酶溶液。在球團(tuán)上留下大約IOml的棕色的膠原酶溶液，以便基質(zhì)血試管的餾分（在 底部的深色的紅細(xì)胞）不被擾亂。
[0401] 混懸細(xì)胞團(tuán)塊于1% BSA的PBS中，用Steri-Flip過濾。
[0402] 300xg離心細(xì)胞5分鐘、吸出剩余的膠原酶溶液。吸出時(shí)，吸管的端從頂那里吸出， 以便油被盡可能完全清除。細(xì)胞團(tuán)應(yīng)該密封在底部。
[0403] 每個(gè)離管中加入組織培養(yǎng)液10ml，混懸細(xì)胞。把細(xì)胞集合到一根離心管中，離心。
[0404] 吸出上清液。用10毫升培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞。
[0405] 平分細(xì)胞至對(duì)等數(shù)目的燒瓶的中。平板接種24-72個(gè)小時(shí)后，從燒瓶吸出培養(yǎng)基。 以PBS洗滌并且吸出。
[0406] 每瓶加原始體積的新鮮培養(yǎng)基。
[0407] 細(xì)胞長到80-90%合流，然后傳代或者保存。
[0408] 通過細(xì)胞傳代、當(dāng)達(dá)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)量時(shí)，部分被固定進(jìn)行免疫檢測平滑肌細(xì)胞 蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0409] 圖17是關(guān)于培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。在培養(yǎng)3到5天后，評(píng)價(jià)形態(tài)學(xué)。從人和豬細(xì)胞 脂肪組織分離得到的細(xì)胞顯示平滑肌細(xì)胞形態(tài)特征（圖17)。那些細(xì)胞呈現(xiàn)峰-谷形態(tài)，并 且顯示另外特性例如細(xì)長形，在傳代上變平和成纖維細(xì)胞樣，拉長并且在平行排列，和一個(gè) "旋渦"形狀，所有這些均是培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞的特點(diǎn)。
[0410] 平滑肌標(biāo)志。增加收縮基因的表達(dá)（以及他們編碼的蛋白質(zhì)） 與 SMC 成熟一致（Jeon et al. J Cell Scill9, 4994-5005 (2006) ;Ross et al.J Clin Inves. 116,3139-3149 (2006) ；Sinha et al.Am J Physiol Cell Physiol287, 1560-1568(2004))。心肌是對(duì)平滑肌收縮蛋白進(jìn)行編碼的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，其 中包括SM22, α平滑肌肌動(dòng)蛋白，平滑肌肌漿球蛋白重鏈和鈣調(diào)理蛋白（Qiu et al. (2005) Circ Res983-991 ；ffang et al. (2003)Proc Natl Acad Scil00:7129-7134；Yoshida et al. (2003)Circ Res92:856-864)。心肌是平滑肌分化所必需的，并且足以驅(qū)動(dòng)某些細(xì)胞平 滑肌基因表達(dá)（Milyavsky et al. (2007)Cancer Cellll:133_146;van Tuyn et al. (2005) 上文；Wang et al. (2003)，上文；Yoshida et al. (2003)，上文）。我們確定是否從血或者 脂肪組織中隔離的平滑肌細(xì)胞通過隔離總RNA并且進(jìn)行半定量的RT-PCR表達(dá)平滑肌細(xì)胞 標(biāo)記心肌，平滑肌α肌動(dòng)蛋白，SM22,肌漿球蛋白重鏈，和鈣調(diào)理蛋白。
[0411] 如圖18中所示，結(jié)果表明，在基因水平這些細(xì)胞表達(dá)所有這些平滑肌細(xì)胞標(biāo)記， 和在膀胱平滑肌細(xì)胞里發(fā)現(xiàn)的平滑肌細(xì)胞標(biāo)記一致。這些數(shù)據(jù)支持外周血或者脂肪組織隔 離的這些平滑肌細(xì)胞具有平滑肌細(xì)胞性質(zhì)的觀點(diǎn)。
[0412] 表型特征。我們已經(jīng)表明這些外周血隔離平滑肌細(xì)胞與平滑肌收縮蛋白（圖18) 一樣表達(dá)為平滑肌基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器。圖18顯示SMC標(biāo)志心肌，平滑肌α肌動(dòng)蛋白， SM22,平滑肌肌漿球蛋白重鏈和鈣調(diào)理蛋白的RT-PCR分析。樣品來自于豬脂肪，外周血和 膀胱（傳代4)隔離的平滑肌細(xì)胞。從脂肪組織隔離的SMCs可以在每次傳代之間培養(yǎng)3-5 天，從血隔離的SMCs可以頭次傳代之前培養(yǎng)14天，3-5天后進(jìn)行再次傳代培養(yǎng)。β肌動(dòng)蛋 白的基因表達(dá)當(dāng)作凝膠用于內(nèi)部的加載控制。從動(dòng)物脂肪和外周血細(xì)胞隔離的細(xì)胞表達(dá)型 與膀胱SMC的相符合。
[0413] 圖19顯示免疫熒光法染色，將多種抗體直接用于平滑肌細(xì)胞表達(dá)蛋白染色。標(biāo)記 α肌動(dòng)蛋白，SM22,鈣調(diào)理蛋白和平滑肌肌漿球蛋白重鏈在從豬脂肪，外周血和膀胱隔離的 平滑肌細(xì)胞里檢測。這些蛋白質(zhì)全部涉及平滑肌細(xì)胞的收縮的功能。平滑肌α肌動(dòng)蛋白， SM22,鈣調(diào)理蛋白和平滑肌肌漿球蛋白重鏈在多次傳代的平滑肌細(xì)胞中染色。這些蛋白質(zhì) 的亞細(xì)胞定位與膀胱SMC相比在平滑肌細(xì)胞里實(shí)際上相同。在細(xì)胞的應(yīng)力纖維里的這些蛋 白質(zhì)的詳細(xì)的染色被注意到。這是期望的典型的平滑肌細(xì)胞染色模型。
[0414] 圖20顯示的是從人外周血（傳代5)隔離的平滑肌細(xì)胞的免疫染色。使用平滑肌 α肌動(dòng)蛋白，SM22,鈣調(diào)理蛋白的探針。同種細(xì)胞中兩種蛋白質(zhì)平滑肌的α肌動(dòng)蛋白和鈣 調(diào)理蛋白（右平板頂部）雙重染色法共同顯示。在單個(gè)細(xì)胞中不止1個(gè)的平滑肌細(xì)胞標(biāo)記 同時(shí)表達(dá)更進(jìn)一步支持這些是平滑肌細(xì)胞的觀點(diǎn)。
[0415] 收縮性。由于外周血得到平滑肌細(xì)胞表達(dá)平滑肌收縮蛋白，我們進(jìn)行一次三維的 凝膠收縮測定評(píng)價(jià)他們的收縮性能。當(dāng)被嵌入在三維的凝膠（Travis et al. (2001)Circ Res88:77-83)內(nèi)時(shí)，SMC已經(jīng)顯示自發(fā)引起膠原基質(zhì)的收縮。脂肪組織得到的平滑肌細(xì)胞 也被進(jìn)行收縮性測試。
[0416] 圖21顯示與膀胱平滑肌細(xì)胞（C)的相比較豬血得到的（A)細(xì)胞和豬脂肪組織得 到的（B)細(xì)胞收縮性更強(qiáng)。把EDTA加到混合物中抑制收縮，支持了收縮是依賴鈣的想法， 也是平滑肌細(xì)胞的另一種特性。數(shù)據(jù)表明直徑較小依賴細(xì)胞的收縮，并且是在細(xì)胞容量內(nèi) 的功能。細(xì)胞種子為500, 000細(xì)胞/毫升，通過在兩天后減少膠原質(zhì)凝膠直徑證明其能進(jìn) 行收縮。豬膀胱平滑肌細(xì)胞作為陽性對(duì)照。證明收縮的鈣依賴性，鈣螯合劑EDTA加入到分 開的樣品中抑制收縮。結(jié)果確認(rèn)細(xì)胞的收縮能力以鈣依賴的的方式類似于膀胱得到的平滑 肌細(xì)胞。
[0417] 發(fā)展動(dòng)力學(xué)。為了在細(xì)胞治療應(yīng)用里利用平滑肌細(xì)胞，確定是否在一個(gè)可接受的 時(shí)間段內(nèi)達(dá)到需要的細(xì)胞量是重要的。結(jié)果從對(duì)犬和豬研究表明，平滑肌菌落（從40ml外 周血樣品中）被觀察到在早于7天后接種，并且能在不到14天（圖14和15)內(nèi)通過。在 研究中，在培養(yǎng)（傳代2的端）的18天后獲得120萬細(xì)胞，在它們冷凍保藏期間。50天后 這些特別的細(xì)胞被融化，通常在約80%融合時(shí)通過確定發(fā)展動(dòng)力學(xué)。在融化后6天，細(xì)胞群 體擴(kuò)大到1670萬個(gè)細(xì)胞（傳代3的末期）。再培養(yǎng)7天后，細(xì)胞群體達(dá)到3170萬個(gè)細(xì)胞 (傳代4的末期）。這項(xiàng)初始研究表明30天的培養(yǎng)可取得約3000萬細(xì)胞。
[0418] 圖22涉及到細(xì)胞有限的增殖潛能。圖22顯示每單位面積從人體脂組織隔離的平 滑肌細(xì)胞作為功能性細(xì)胞恢復(fù)的數(shù)量變化的函數(shù)。這些數(shù)據(jù)表明在4和5傳代之間，恢復(fù) 的細(xì)胞數(shù)量開始下降，支持這些細(xì)胞是有限和有限增生的能力的論點(diǎn)，為祖細(xì)胞所獨(dú)有的 特征，但不是真實(shí)的干細(xì)胞。
[0419] 圖23顯示從豬脂肪，外周血和膀胱平滑肌隔離的平滑肌細(xì)胞的發(fā)展，作為每條傳 代恢復(fù)的細(xì)胞數(shù)量的函數(shù)。如圖所示，在2和3傳代之間，在超過2-4周的時(shí)間段，細(xì)胞數(shù) 量方面取得巨大的擴(kuò)大，使數(shù)十個(gè)數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞的恢復(fù)成為可能。這證明脂肪衍生細(xì)胞的 有限或者有限的增殖潛能。
[0420] 增殖的接觸抑制。從外周血和脂肪組織隔離的平滑肌細(xì)胞顯示增殖的接觸抑制。 例如，在圖14-17提供的這些細(xì)胞的形態(tài)學(xué)上的評(píng)價(jià)證明超過幾條傳代的增殖的接觸抑制 的存在。當(dāng)細(xì)胞彼此接觸時(shí)增殖停止。相反，MSCs不顯示增殖的接觸抑制，在轉(zhuǎn)換細(xì)胞培 養(yǎng)過程中，觀察到他們可以相互堆積，類似于焦點(diǎn)形成。例如，Zhou et al.報(bào)道有關(guān)離析 的情況，以及來自老鼠骨髓的單核細(xì)胞餾分的MSCs培養(yǎng)，并且觀察到，以在3詞傳代之后， 培養(yǎng) MSCs 存在接觸抑制（見 10850 頁和圖 1A) (Cancer Res. 2006 ;66 (22) : 10849-10854)。
[0421] 細(xì)胞因子MCP-I的制備。MCP-I是一種膀胱迫肌細(xì)胞產(chǎn)品。在主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 里，MCP-I在再生中起作用。MCP-I以具有吸收單核細(xì)胞的能力而眾所周知。類似于趨化因 子；這也是血管損傷區(qū)域血管平滑肌細(xì)胞增生和循環(huán)吸收單核細(xì)胞的一種有效的促細(xì)胞分 裂劑。單核細(xì)胞轉(zhuǎn)換的巨噬細(xì)胞通常被用作細(xì)胞因子類和增長系數(shù)的存儲(chǔ)器。巨噬細(xì)胞和 肌前體細(xì)胞兩個(gè)都是MCP-I信號(hào)目標(biāo)。這和細(xì)胞因子在體內(nèi)吸收干細(xì)胞和祖細(xì)胞相關(guān)，潛 在的有助于再生過程。
[0422] 為測定人周血平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生的MCP-I數(shù)量，來自R&D系統(tǒng)的一個(gè)基于酶聯(lián)免疫 吸附測定的測定系統(tǒng)被使用。培養(yǎng)基樣品被一式兩份、與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，分析得到的MCP-I 水平，結(jié)果為ug/24hr/百萬個(gè)細(xì)胞。確定了從人膀胱平滑肌隔離的細(xì)胞，脂肪，外周血以及 膀胱尿道上皮（陰性對(duì)照）細(xì)胞因子MCP-I的表達(dá)。
[0423] 圖24顯示，來自上述分析的結(jié)果表明人周血得到和人體脂組織得到的平滑肌細(xì) 胞與人膀胱平滑肌細(xì)胞相比產(chǎn)生相當(dāng)水平的MCP-I。這些數(shù)據(jù)支持這一結(jié)論，正如膀胱SMC 一樣，從脂肪和外周血隔離的平滑肌細(xì)胞表達(dá)MCP-1。另外，這些數(shù)據(jù)使我們假設(shè)MCP-I在 再生中起關(guān)鍵作用，通過直接或者間接的引起肌祖細(xì)胞吸收/遷移，或者在構(gòu)建體內(nèi)擴(kuò)散。
[0424] 討論。從動(dòng)物脂肪隔離的平滑肌細(xì)胞證明了平滑肌細(xì)胞的幾種特征。我們的研究 已經(jīng)表明，使用標(biāo)準(zhǔn)酶消化和低速的離心作用可以輕易使細(xì)胞容從動(dòng)物脂肪中隔離。細(xì)胞 可以迅速擴(kuò)大，在不到一個(gè)月時(shí)間內(nèi)或許達(dá)到3000萬細(xì)胞。我們的研究進(jìn)一步證明這些細(xì) 胞可以，實(shí)際上，描述一個(gè)平滑肌細(xì)胞群體而不是一個(gè)真實(shí)的干細(xì)胞數(shù)量，如同平滑肌標(biāo)記 早在傳代3時(shí)存在。SMC標(biāo)記mRNA的表達(dá)在早于PO時(shí)就可被觀察到，像被RTPCR證明的那 樣。而且，隔離的平滑肌細(xì)胞具有收縮功能如同按標(biāo)準(zhǔn)膠原質(zhì)凝膠收縮測定證明的那樣。
[0425] 平滑肌細(xì)胞的特性。我們已經(jīng)顯示在隨后的傳代期間，平滑肌細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)被保 留。在基因和蛋白質(zhì)水平平滑肌標(biāo)記具有良好的相關(guān)性。
[0426] 細(xì)胞因子誘導(dǎo)。脂肪的平滑肌細(xì)胞對(duì)MCP-I的表達(dá)引導(dǎo)我們假設(shè)，MCP-I在新器 官或者組織結(jié)構(gòu)再生中起關(guān)鍵作用，通過直接或者間接的引起肌祖細(xì)胞吸收/遷移，或者 在構(gòu)建體內(nèi)擴(kuò)散。
[0427] 實(shí)施例2 MCP-I的制備和細(xì)胞密度
[0428] 使用商業(yè)上可用的工具檢測和測定來自膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)條件的培養(yǎng)基的 MCP-1。測試來自9個(gè)構(gòu)建體（3種，每種分別3種接種水平）的條件培養(yǎng)基樣品和用于接 種構(gòu)建體的配對(duì)的SMC細(xì)胞的MCP-I水平。結(jié)果如表2. 1所示。
[0429] 表 2. 1
[0430]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于受試者中的有缺陷的膀胱的尿流改道，包括： a) 第一可植入的、生物相容性構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括管狀支架，所述管狀支架具有被 構(gòu)造為與腹腔壁截面相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個(gè)被構(gòu)造為與第一輸尿 管相連接的第一側(cè)部開口；以及 b) 并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細(xì)胞群，所述自體細(xì)胞群沉積在所述支架的表 面上或其中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述支架還包括被構(gòu)造為與第二輸尿管相連 接的第二側(cè)部開口。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述第一末端被構(gòu)造為與所述腹腔壁的位置 平齊。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的尿流改道，其中所述第一末端被構(gòu)造為縫合在所述受試者的 皮膚上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的尿流改道，其中所述第一末端被構(gòu)造為形成開孔。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的尿流改道，其中所述開孔還包括開孔扣。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的尿流改道，其中所述支架還包括被構(gòu)造為形成開孔的墊 圈環(huán)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述生物相容性支架為可生物降解的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述支架包括選自下列的材料：聚乙醇酸、聚 乳酸、以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述細(xì)胞群為平滑肌細(xì)胞群。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述改道替換所述有缺陷的膀胱。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述改道為臨時(shí)性的。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述改道為永久性的。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述管狀支架具有矩形截面構(gòu)造。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述管狀支架具有三角形截面構(gòu)造。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述管狀支架具有圓形截面構(gòu)造。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尿流改道，其中所述改道不含有尿道上皮細(xì)胞。
18. -種用于需要的受試者中的有缺陷的膀胱的尿流改道構(gòu)建體的制造方法，包括： a) 提供第一可植入的生物相容性支架，所述支架包括管狀支架，所述管狀支架具有被 構(gòu)造為與腹腔壁區(qū)域相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個(gè)被構(gòu)造為與第一輸尿 管相連接的第一側(cè)部開口；以及 b) 將并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細(xì)胞群沉積在所述支架的第一區(qū)域上或其 中，以形成尿流改道構(gòu)建體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述支架還包括被構(gòu)造為與第二輸尿管相連接 的第二側(cè)部開口。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述第一末端被構(gòu)造為與所述腹腔壁的位置平 齊。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一末端被構(gòu)造為縫合在所述受試者的皮 膚上。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述第一末端被構(gòu)造為形成開孔。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述開孔還包括開孔扣。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述支架還包括被構(gòu)造為形成開孔的墊圈 環(huán)。
25. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述生物相容性支架為可生物降解的。
26. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述支架包括選自下列的材料：聚乙醇酸、聚乳 酸、以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。
27. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細(xì)胞群為平滑肌細(xì)胞群。
28. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述改道替換所述有缺陷的膀胱。
29. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述改道為臨時(shí)性的。
30. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述改道為永久性的。
31. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述管狀支架具有矩形截面構(gòu)造。
32. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述管狀支架具有三角形截面構(gòu)造。
33. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述管狀支架具有圓形截面構(gòu)造。
34. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述改道不含有尿道上皮細(xì)胞。
35. -種提供用于需要的受試者中的有缺陷的膀胱的尿流改道的方法，包括： a) 提供第一可植入的生物相容性支架，所述支架包括管狀支架，所述管狀支架具有被 構(gòu)造為與腹腔壁截面相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個(gè)被構(gòu)造為與第一輸尿 管相連接的第一側(cè)部開口；以及 b) 將并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細(xì)胞群沉積在所述支架的一個(gè)第一區(qū)域上 或其中，以形成尿流改道構(gòu)建體；以及 c) 將所述構(gòu)建體植入所述受試者中以形成所述尿流改道。
36. -種提供用于需要的受試者中的有缺陷的膀胱的尿流改道的方法，包括向所述受 試者中植入尿流改道構(gòu)建體，所述尿流改道構(gòu)建體包括：(a)管狀支架，所述管狀支架具有 被構(gòu)造為與腹腔壁截面相連接的第一末端和第二封閉末端，和至少一個(gè)被構(gòu)造為與第一輸 尿管相連接的第一側(cè)部開口；以及（b)并非來源于所述有缺陷的膀胱的自體細(xì)胞群，所述 自體細(xì)胞群沉積在所述支架的表面上或其中，以形成所述尿流改道。
37. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述支架還包括被構(gòu)造為與第二輸尿管相 連接的第二側(cè)部開口。
38. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述第一末端被構(gòu)造為與所述腹腔壁的位 置平齊。
39. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述第一末端被構(gòu)造為縫合在所述受試者 的皮膚上。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述第一末端被構(gòu)造為形成開孔。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述開孔還包括開孔扣。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40或41所述的方法，其中所述支架還包括被構(gòu)造為形成開孔的墊圈 環(huán)。
43. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述生物相容性支架為可生物降解的。
44. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述支架包括選自下列的材料：聚乙醇 酸、聚乳酸、以及聚乙醇酸和聚乳酸的共聚物。
45. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述細(xì)胞群為平滑肌細(xì)胞群。
46. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中其中所述改道替換所述有缺陷的膀胱。
47. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述改道為臨時(shí)性的。
48. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述改道為永久性的。
49. 根根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述管狀支架具有矩形截面構(gòu)造。
50. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述管狀支架具有三角形截面構(gòu)造。
51. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述管狀支架具有圓形截面構(gòu)造。
52. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述改道不含有尿道上皮細(xì)胞。
53. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述尿路管道構(gòu)建體在植入后形成再生的 組織。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述再生的組織包括覆蓋平滑肌的連續(xù)尿道上 皮。
55. 根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述尿路管道構(gòu)建體在植入后形成上皮化 的粘膜。
【文檔編號(hào)】A61F2/04GK104274256SQ201410270167
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2009年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2008年11月4日
【發(fā)明者】約翰.W.盧德洛, 曼紐爾.J.杰約, 喬迪普.巴蘇, 蒂莫西.A.伯特拉姆, 克里斯托弗.金海默, 凱利.I.格思里, 羅杰.拉甘, 迪帕克.賈因, 奧盧瓦托因.奈特, 理查德.佩因, 薩拉.F.昆蘭, H.S.拉波波特, 納姆拉塔.桑加 申請(qǐng)人:坦吉恩股份有限公司