S100鈣結(jié)合蛋白a8制備舒張氣道平滑肌藥物的新用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及蛋白藥物領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種S100鈣結(jié)合蛋白A8在制備舒張氣道平滑肌藥物的用途及含有該蛋白的藥物制劑。本發(fā)明揭示了S100鈣結(jié)合蛋白A8舒張氣道平滑肌的新功能，S100A8能明顯舒張氣道平滑肌，降低哮喘模型大鼠的氣道阻力，起到治療哮喘的作用，可用于哮喘疾病的治療以及哮喘治療藥物的制備；以針劑或噴霧劑的形式應(yīng)用于哮喘疾病的質(zhì)量，具有使用安全、有效、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】S100鈣結(jié)合蛋白A8制備舒張氣道平滑肌藥物的新用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白藥物領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種S100鈣結(jié)合蛋白A8制備哮喘治療藥 物的用途及含有該重組蛋白的哮喘治療藥物。

【背景技術(shù)】
[0002] S100A8蛋白是S100蛋白家族的重要成員，又被稱(chēng)作|丐粒蛋白A(Calgranulin-A)、 遷移抑制因子相關(guān)蛋白 8 (Migration inhibitory factor-related protein8)、囊性纖維 化抗原（Cystic fibrosis antigen)、白細(xì)胞 L1 輕鏈蛋白（Leukocyte LI complex light chain)、泌尿系結(jié)石蛋白A(Urinary stone protein band A)等。該蛋白在骨髓中細(xì)胞分 化早期階段和處于循環(huán)狀態(tài)的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化巨噬細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在非髓系細(xì)胞 如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中也有表達(dá)。研究顯示在細(xì)胞外液中也可檢測(cè)到不同表達(dá)水平的 S100A8蛋白，表明S100A8同時(shí)具有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的功能。當(dāng)S100A8蛋白與Ca2+結(jié)合， 在EF-2的HIII位置構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，從而暴露出HIV上的疏水殘基，使其可以與靶蛋白結(jié) 合，進(jìn)而通過(guò)與相應(yīng)靶蛋白作用產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明S100A8蛋白與腫瘤和炎 癥等病理過(guò)程密切相，S100A8蛋白主要通過(guò)對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用激活炎癥細(xì)胞和炎性 因子、結(jié)合并活化膜受體RAGE和TLR4,介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑，在炎癥中發(fā)揮 重要的調(diào)節(jié)作用。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)了 S100A8蛋白的抗炎癥活性，說(shuō)明S100A8在不同的 病理生理?xiàng)l件下可能發(fā)揮更為復(fù)雜的生物學(xué)調(diào)節(jié)功能。我們研究發(fā)現(xiàn)S100A8具有舒張氣 道平滑肌，降低氣道阻力的功能，而目前國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有關(guān)于此功能的報(bào)道，這一新的功能可 能為哮喘防治提供新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種具有舒張氣道平滑肌功能，并 能治療哮喘的蛋白S100A8(S100鈣結(jié)合蛋白A8 :NP_446274)，并將其應(yīng)用于哮喘治療藥物 的制備。
[0004] 本發(fā)明的第一方面公開(kāi)了一種S100鈣結(jié)合蛋白A8(S100A8)在制備舒張氣道平滑 肌藥物中的應(yīng)用。
[0005] 進(jìn)一步的，所述舒張氣道平滑肌藥物為哮喘治療藥物。
[0006] 所述S100鈣結(jié)合蛋白A8既可以為分離純化獲得的天然蛋白，也可以為通過(guò)基因 技術(shù)生產(chǎn)的重組蛋白。
[0007] 本發(fā)明經(jīng)大量的體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重組蛋白S100 A8具有舒張氣道平滑 肌的功能，并應(yīng)用于哮喘病的治療，具有較好的臨床應(yīng)用前景。
[0008] 本發(fā)明第二方面公開(kāi)了一種舒張氣道平滑肌的藥物組合物，包含S100鈣結(jié)合蛋 白A8。
[0009] 較佳的，所述S100鈣結(jié)合蛋白A8為該藥物組合物的唯一有效成分。
[0010] 更進(jìn)一步的，所述舒張氣道平滑肌的藥物組合物為哮喘治療藥物。
[0011] 本發(fā)明第三方面公開(kāi)了一種舒張氣道平滑肌的藥物制劑，含有安全有效量的Sioo 鈣結(jié)合蛋白A8,余量為藥學(xué)上可接受的載體。
[0012] 藥學(xué)上可接受的載體為各種藥學(xué)上常用的輔料和/或賦形劑，包括（但不限于） 糖類(lèi)（如乳糖、葡萄糖和蔗糖），淀粉（如玉米淀粉和土豆淀粉），纖維素及其衍生物（如羧 甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素），黃蓍膠粉末，麥芽，明膠，滑石，固體潤(rùn)滑劑（如 硬脂酸和硬脂酸鎂），硫酸鈣，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油， 多元醇（如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇），海藻酸，乳化劑（如Tween、聚 氧乙烯蓖麻油），潤(rùn)濕劑（如月桂基硫酸鈉），著色劑，調(diào)味劑，壓片劑、穩(wěn)定劑，抗氧化劑，防 腐劑，無(wú)熱原水，等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等；該載體可根據(jù)需要提高配方的穩(wěn)定性、活 性及生物有效性等。
[0013] 較優(yōu)的，所述S100鈣結(jié)合蛋白A8占所述藥物制劑總質(zhì)量的0. 0004%?99%。
[0014] 本發(fā)明的藥物制劑可以按照藥劑學(xué)上的通用方法制成任何常規(guī)的制劑形式。
[0015] 較優(yōu)的，本發(fā)明所述藥物制劑為針劑或噴霧劑。
[0016] 更優(yōu)的，所述針劑中藥學(xué)上可接受的載體選自磷酸鹽緩沖溶液或生理鹽水。
[0017] 最優(yōu)的，所述磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7. 2?7. 4。
[0018] 進(jìn)一步的，所述舒張氣道平滑肌藥物制劑為治療哮喘的藥物制劑。
[0019] 本發(fā)明揭示了 S100鈣結(jié)合蛋白A8舒張氣道平滑肌的新功能，S100A8能明顯舒張 氣道平滑肌，降低哮喘模型大鼠的氣道阻力，起到治療哮喘的作用，可用于哮喘疾病的治療 以及哮喘治療藥物的制備；具有使用安全、有效、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖 1 :pET_22b(+)載體圖譜
[0021] 圖2 :SDS-PAGE檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)菌株經(jīng)0. ImM IPTG 16°C誘導(dǎo) 16h 后，檢測(cè) Calgranulin A(Calculated Mw:11.3KD)有過(guò)量表達(dá)。
[0022] 圖3 :菌體超聲破碎后上清可溶部分含有Calgranulin A。
[0023] 圖4 :經(jīng)Chelating SFF(Ni) column分離純化，蛋白主要集中在D、E中。
[0024] 圖 5 :S100A8 純化蛋白，純度達(dá)到 90%，Buffer :20mM Tris，20%glycerol，pH8.0。
[0025] 圖 6 :用大鼠 S100A8 蛋白特異性抗體（Santa Cruz sc-8113, 1:2000)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明該純化蛋白為大鼠 S100A8蛋白。
[0026] 圖7 :S100A8蛋白降低哮喘大鼠氣道阻力。
[0027] 圖8 :S100A8蛋白降低Mch誘導(dǎo)的氣道平滑肌收縮張力。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本【技術(shù)領(lǐng)域】技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0030] 除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York,1987 and periodic updates； the series METHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304, Chromatin(P. M. ffassarman and A.P. ffolffe, eds.), Academic Press, San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P. B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0031] 實(shí)施例1 S100A8蛋白重組表達(dá)純化
[0032] 1· 1 擴(kuò)增 S100A8DNA
[0033] 按照NCBI組織分布信息，選擇正常大鼠肺組織，異硫氰酸胍一步法抽提總RNA， AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，作為S100A8基因 PCR擴(kuò)增模板，在DNA taq酶的作用下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的引物為：
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種S100鈣結(jié)合蛋白A8在制備舒張氣道平滑肌藥物中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述舒張氣道平滑肌藥物為哮喘治療藥物。
3. -種舒張氣道平滑肌的藥物組合物，包含S100鈣結(jié)合蛋白A8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于，所述S100鈣結(jié)合蛋白A8為該藥物 組合物的唯一有效成分。
5. -種舒張氣道平滑肌的藥物制劑，含有安全有效量的S100鈣結(jié)合蛋白A8,余量為藥 學(xué)上可接受的載體。
6. 如權(quán)利要求5所述的藥物制劑，其特征在于，所述S100鈣結(jié)合蛋白A8占所述藥物制 劑總質(zhì)量的〇· 0004%?99%。
7. 如權(quán)利要求5所述的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑為針劑或噴霧劑。
8. 如權(quán)利要求7所述的藥物制劑，其特征在于，所述針劑中藥學(xué)上可接受的載體選自 磷酸緩沖溶液或生理鹽水。
9. 如權(quán)利要求8所述的藥物制劑，其特征在于，所述磷酸緩沖溶液pH值為7. 2?7. 4。
10. 權(quán)利要求5-9任一權(quán)利要求所述的藥物制劑，其特征在于，所述舒張氣道平滑肌藥 物制劑為治療哮喘的藥物制劑。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK104056253SQ201410270113
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月17日
【發(fā)明者】楊永清, 徐玉東, 王宇, 尹磊淼 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué), 上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所