一種前列腺癌超聲診斷靶向試劑及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種前列腺癌超聲診斷靶向試劑及制備方法。所述的靶向試劑為EpDT3適體修飾的全氟溴辛烷納米粒，所述的EpDT3適體選自：a）EpDT3-SH：5'-GCGACUGGUUACCCGGUCG-?(CH2)6-SH-3'，且具有2'-氟代嘧啶修飾，或b）EpDT3-NH2：5’-NH2-spacer-GCGACUGGUUACCCGGUCGinvertedT-3’，具有2'-氟代嘧啶，3’-倒置T帽，并且5’-氨基通過六乙二醇連接。本發(fā)明制備的EpDT3適體修飾的靶向試劑能更多的滯留于腫瘤血管床，具備優(yōu)異的靶向性，顯影效果顯著增強。
【專利說明】一種前列腺癌超聲診斷靶向試劑及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及超聲診斷所用的靶向試劑，具體地說，涉及一種前列腺癌超聲診斷靶向試劑及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]超聲檢查是前列腺疾病的首選而重要的影像學檢查手段，但是目前所有的影像學檢查都不能敏感地區(qū)分慢性前列腺炎、前列腺肥大與早期前列腺癌，其鑒別診斷仍依賴于有創(chuàng)的經(jīng)直腸超聲引導下前列腺多點穿刺活檢。近年來，超聲儀器性能改進，新一代聲學造影劑的出現(xiàn)為超聲診斷開創(chuàng)了新的應(yīng)用領(lǐng)域。同時，超聲造影增強技術(shù)(ContrastEnhanced Ultrasound, CEUS)在診斷領(lǐng)域得到進一步發(fā)展，已成為診斷前列腺癌的無創(chuàng)性影像學手段之一。研究證明，二者結(jié)合可有效增強實質(zhì)性器官的二維超聲影像和血流多普勒信號，明顯提高超聲診斷的敏感性和特異性。
[0003]隨著各種新型超聲造影劑的出現(xiàn)和超聲顯像技術(shù)的不斷發(fā)展，微泡造影劑(如國內(nèi)臨床采用Braco公司生產(chǎn)的Sonovue造影劑)開始應(yīng)用于前列腺病變的檢查，但其敏感性較低，特異性不高，是一種無定向選擇作用的全身性造影劑。此外，尚有采用全氟溴辛烷等氟碳制備納米造影劑的報道(張華娟等.一種全氟碳化合物脂質(zhì)體納米球及其制備方法.中國專利，申請?zhí)? 01210549252.0)，從而克服微泡造影劑無法達到血管外腫瘤組織成像的目的。但是，前列腺癌病人的臨床癥狀相對隱蔽，這為前列腺癌的診斷帶來了很大的困難。國內(nèi)外近幾年已經(jīng)開始了靶向超聲造影劑的相關(guān)研究(李浪，等.攜載PSMA單抗靶向前列腺癌的納米級脂質(zhì)微泡的制備及體外尋靶能力.中國醫(yī)學影像技術(shù)，2012 ;28 (8):1449-1453)，通過靶向超聲造影劑，使其聚集于靶組織，達到特異性增強顯影效果。
[0004]近年研究發(fā)現(xiàn)上皮細胞黏附分子(epithelial cellular adhesion molecule,EpCAM，又稱CD326)是一種高表達于大多數(shù)惡性上皮腫瘤細胞表面的糖蛋白，具有加快細胞周期、促進細胞增殖、分化、遷移以及免疫逃逸、腫瘤干細胞特性等多種生物學功能，是目前表達最強的腫瘤表面抗原之一。EpCAM在激素非依賴性前列腺癌細胞株(如PC3、DU145等)、激素依賴性前列腺癌細胞株(如LNCaP、DuCaP)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移前列腺癌細胞中均高表達，轉(zhuǎn)移性難治性前列腺癌病人的血循環(huán)前列腺癌細胞80%以上高表達EpCAM，因此EpCAM適合作為前列腺癌診斷和治療的靶點。
[0005]適體(aptamer)是一類相對較短的單鏈DNA或RNA寡聚核苷酸,在體內(nèi)以特定的三維結(jié)構(gòu)存在，并與靶蛋白通過高親和力結(jié)合，從而發(fā)揮生理作用。適體與靶細胞結(jié)合的特異性與單克隆抗體相似，甚至更高。適體沒有明顯的免疫原性，其介導的靶向藥物注入人體內(nèi)不會引發(fā)免疫反應(yīng)。適體分子體積較小，當適體連接到藥物載體表面時，系統(tǒng)的體積不會有很大的增加，使藥物載體體積更容易控制。更重要的是適體制備方便，且比單克隆抗體有更高的穩(wěn)定性，可以在許多緩沖溶液中保存。
[0006]Shigdar等設(shè)計了多種祀向EpCAM的核酸酶抵抗適體(Shigdar S，Lin J, YuY, Pastuovic M, Wei M, Duan ff.RNA aptamer against a cancer stem cell markerepithelial cell adhesion molecule.Cancer Sci, 2011; 102 (5): 991-8)，發(fā)現(xiàn)僅有19nt的EpDT3適體與EpCAM結(jié)合后能夠以能量依賴方式通過受體介導的內(nèi)吞機制進入腫瘤細胞內(nèi)，因此EpDT3適體有望用于前列腺癌的靶向診斷。
[0007]基于上述認知，理論上可以制備EpDT3修飾的靶向超聲造影劑，運用于CEUS中，以實現(xiàn)前列腺癌的特異性顯影。但是目前關(guān)于此類靶向超聲造影劑還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種前列腺癌超聲診斷靶向試劑。
[0009]本發(fā)明的再一的目的是，提供上述前列腺癌超聲診斷靶向試劑的制備方法。
[0010]本發(fā)明的另一的目的是，提供上述前列腺癌超聲診斷靶向試劑的用途。
[0011]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
一種前列腺癌超聲診斷靶向試劑，所述的靶向試劑含有全氟溴辛烷納米粒，所述的全氟溴辛烷納米粒被EpDT3適體所修飾，所述的EpDT3適體選自:
a)EpDT3-SH:5’ - GCGACUGGUUACCCGGUCG- (CH2) 6- SH- 3’，且具有 2’-氟代嘧啶修飾，或
b)EpDT3-NH2:5’-NH2-spacer_GCGACUGGUUACCCGGUCG inverted T_3’，具有 2’-氟代嘧啶，3’ -倒置T帽，并且5’ -氨基通過六乙二醇連接。 [0012]作為本發(fā)明的一個實施例，所述的EpDT3適體為EpDT3_SH，所述的靶向試劑是通過以下方法制備的:按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的馬來酰亞胺基與EpDT3-SH的疏基反應(yīng)摩爾比為(1-3):1，將全氟溴辛烷納米乳劑與EpDT3-SH溶液混合，室溫條件下緩慢攪拌反應(yīng)6-10小時即得。
[0013]所述的全氟溴辛烷納米粒是通過以下方法制備的:
a)將PLGA-C00H溶解于二氯甲烷中，然后加入縮合劑、催化劑和N-羥基丁二酰亞胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEG-MAL和縛酸劑，得到PEG修飾的共聚物PLGA-PEG-MAL ；
b)將PLGA-PEG-MAL、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化劑及水，超聲或均質(zhì)化制得所述的全氟溴辛烷納米粒的乳劑，再攪拌令二氯甲烷或氯仿?lián)]發(fā)。
[0014]作為本發(fā)明的另一實施例，所述的EpDT3適體為氨基修飾的EpDT3適體，所述的靶向試劑是通過以下方法制備的:在室溫下向全氟溴辛烷納米?；鞈乙褐屑尤隕DC、NHS和TEA，溫和攪拌活化10-30min，再加入EpDT3_NH2混勻，室溫攪拌反應(yīng)2_4h，超濾分離即得。
[0015]所述的全氟溴辛烷納米粒是通過以下方法制備的:
a)將PLGA-C00H溶解于二氯甲烷中，然后加入縮合劑、催化劑和N-羥基丁二酰亞胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEg-COOH和縛酸劑，得到PEG修飾的共聚物PLGA-PEG-COOH ；
b)將PLGA-PEG-COOH、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化劑及水，超聲或均質(zhì)化制得所述的全氟溴辛烷納米粒的乳劑，再攪拌令二氯甲烷或氯仿?lián)]發(fā)。
[0016]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
如上所述的前列腺癌超聲診斷靶向試劑的制備方法，包括以下步驟:
a)將PLGA-C00H溶解于二氯甲烷中，然后加入縮合劑、催化劑和N-羥基丁二酰亞胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEG-MAL/NH2-PEG-COOH和縛酸劑，得到PEG修飾的共聚物 PLGA-PEG-MAL/PLGA-PEG-COOH ；
b)將PLGA-PEG-MAL/PLGA-PEG-COOH、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化劑及水，超聲或均質(zhì)化制得所述的全氟溴辛烷納米粒的乳劑，再攪拌令二氯甲烷或氯仿?lián)]發(fā)；
c)按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的馬來酰亞胺基與EpDT3-SH的疏基反應(yīng)摩爾比為(1-3): 1，將PLGA-PEG-MAL制成的全氟溴辛烷納米的乳劑與EpDT3_SH溶液混合，室溫條件下緩慢攪拌反應(yīng)6-10小時即得所述的祀向試劑；或者
在室溫下向PLGA-PEG-COOH制成的全氟溴辛烷納米粒混懸液中加入EDC、NHS和TEA，溫和攪拌活化10-30min，再按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的羧基與EpDT3_NH2的氨基反應(yīng)摩爾比為(1-3):1加入EpDT3-NH2混勻，室溫攪拌反應(yīng)2_4h，超濾分離即得所述的靶向試劑。
[0017]步驟a)中所述的縮合劑選自EDC (1-乙基_3_ (3_ 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺)或DCC (二環(huán)己基碳二亞胺)，步驟a)中所述的催化劑選自三乙胺(TEA)、N，N-二異丙基乙胺(DIEA)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的一種或幾種的組合，步驟a)中所述的縛酸劑為三乙胺和/或N，N-二異丙基乙胺，步驟b)中所述的乳化劑選自膽酸鈉、聚乙烯醇(PVA)^S沙姆、十二烷基硫酸鈉(SDS-Na)、吐溫80、司盤80中的一種或幾種的組合。
[0018]為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
如上任一所述的靶向試劑在制備前列腺癌診斷試劑中的應(yīng)用。 [0019]需要說明的是，所采用的PLGA-C00H為端基為羧基的不同比例的乙交酯、丙交酯所得到的共聚物，優(yōu)選乙丙交酯比的數(shù)值范圍為1-3，但不僅限于此；所用的“/”的意思是“或”。
[0020]本發(fā)明優(yōu)點在于:本發(fā)明將巰基或氨基修飾的EpDT3核酸適體用于修飾全氟溴辛烷納米粒，制備獲得適體靶向的全氟溴辛烷納米粒前列腺癌超聲診斷試劑。通過荷瘤裸鼠靶向顯像研究得出，本發(fā)明的靶向試劑相比于未加修飾的全氟溴辛烷納米粒造影劑，能更多的滯留于腫瘤血管床，具備優(yōu)異的靶向性，顯影效果顯著提高，同時，相比于使用巰基或氨基化A10-3.2核酸適體修飾的全氟溴辛烷納米粒造影劑，本發(fā)明的靶向試劑顯影效果也顯著增強，取得了預料不到的技術(shù)效果。
【具體實施方式】
[0021]下面對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0022]實施例lEpDT3_SH修飾的前列腺癌超聲診斷靶向試劑制備(一)
1、巰基修飾的EpDT3適體(EpDT3-SH)的制備
取0.1 μ mo I巰基保護的EpDT3適體(巰基保護的EpDT3適體具體序列組成為5’ -GCGACUGGUUACCCGGUCG- (CH2) 6- S- S- (CH2) 6- OH- 3’)，溶于 2.5ml 0.lmol/1 二硫蘇糖醇(DTT)溶液(pH 8.0)，室溫攪拌反應(yīng)30分鐘，過Glen Gel-Pak ? 2.5脫鹽柱(GlenResearch, Sterling, VA)除去未反應(yīng)的DTT，獲得純的巰基修飾的EpDT3適體。巰基修飾的 EpDT3 適體具體序列組成為 5’ - GCGACUGGUUACCCGGUCG- (CH2) 6- SH- 3’，且具有 2’-氟代嘧啶修飾。EpDT3適體的核苷酸序列編號如SEQ ID N0.1所示。[0023]2、納米載體材料PLGA-PEG-MAL的合成
取5g PLGA-C00H (乙丙交酯比:75/25)溶于20ml 二氯甲烷，加入50mg縮合劑EDC(1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)、20mg DMAPC 4- 二甲氨基吡啶)和NHS(N_羥基丁二酰亞胺)30mg,混合均勻，室溫下反應(yīng)24h ;然后加入560mg NH2-PEG-MAL (雙功能聚乙二醇)和150μL縛酸劑TEA (三乙胺)繼續(xù)反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去二氯甲烷；加入A 二甲基甲酰胺(DMF)溶解，把溶液用透析袋透析除掉小分子雜質(zhì)和未反應(yīng)掉的PEG，冷凍干燥得到納米載體材料PLGA-PEG-MAL。核磁分析結(jié)果表明，約85%的PEG連接到PLGA上。
[0024]3、全氟溴辛烷納米粒的制備
將20mg PLGA-PEG-MAL、12PL PFOB (全氟溴辛烷)加入0.4ml 二氯甲烷溶液中，然后加1%膽酸鈉水溶液2 mL,在冰水浴中用均質(zhì)機混合約60 S，將分散液在冰水浴中用200W功率間斷超聲180 s后再用均質(zhì)機間斷處理300 S。將所得納米乳劑在20°C條件下開口攪拌約3小時使二氯甲烷揮發(fā)。所得納米乳劑經(jīng)激光光散射測定全氟溴辛烷納米粒粒徑為110nm, PFOB包封率約80%。
[0025]4、巰基修飾的EpDT3適體和全氟溴辛燒納米粒表面的連接
按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的馬來酰亞胺基與巰基修飾的EpDT3適體的疏基反應(yīng)摩爾比為3:1，將全氟溴辛烷納米乳劑與巰基修飾的EpDT3適體溶液混合，20°C條件下緩慢攪拌反應(yīng)8小時即得終產(chǎn)物靶向超聲造影劑。所得靶向超聲造影劑經(jīng)激光光散射測定其粒徑為180 nm, PFOB的含量為2.4mg/g。
[0026]實施例2EpDT3_SH修飾的前列腺癌超聲診斷靶向試劑制備(二)
1、巰基修飾的EpDT3適體的制備
具體方法同實施例1。
[0027]2、納米載體材料PLGA-PEG-MAL的合成
取5g PLGA-C00H (乙丙交酯比:75/25)溶于20ml 二氯甲烷，加入50mg縮合劑DCC (二環(huán)己基碳二亞胺)、20mg TEA (三乙胺)和NHS 30mg,混合均勻，室溫下反應(yīng)24h ;然后加入560mg NH2-PEG-MAL和150μL縛酸劑DIEA (N, N- 二異丙基乙胺)繼續(xù)反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去二氯甲烷JPADMF 二甲基甲酰胺)溶解，把溶液用透析袋透析除掉小分子雜質(zhì)和未反應(yīng)掉的PEG，冷凍干燥得到納米載體材料PLGA-PEG-MAL。核磁分析結(jié)果表明，約82%的PEG連接到PLGA上。
[0028]3、全氟溴辛烷納米粒的制備
將20mg PLGA-PEG-MAL、12μL PFOB加入0.4ml氯仿溶液中，然后加1%十二烷基硫酸鈉(SDS-Na)水溶液2 mL,在冰水浴中用均質(zhì)機混合約60 S，將分散液在冰水浴中用200W功率間斷超聲180 s后再用均質(zhì)機間斷處理300 S。將所得納米乳劑在20°C條件下開口攪拌約3小時使氯仿?lián)]發(fā)。所得納米乳劑經(jīng)激光光散射測定全氟溴辛烷納米粒粒徑為110 nm,PFOB包封率約80%。
[0029]4、巰基修飾的EpDT3適體和全氟溴辛烷納米粒表面的連接
按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的馬來酰亞胺基與巰基修飾的EpDT3適體的疏基反應(yīng)摩爾比為2:1，將全氟溴辛烷納米乳劑與巰基修飾的EpDT3適體溶液混合，20°C條件下緩慢攪拌反應(yīng)6小時即得終產(chǎn)物靶向超聲造影劑。所得靶向超聲造影劑經(jīng)激光光散射測定其粒徑為180 nm, PFOB的含量為2.36mg/g。
[0030]實施例3EpDT3_SH修飾的前列腺癌超聲診斷靶向試劑制備(三)
1、巰基修飾的EpDT3適體的制備 具體方法同實施例1。
[0031 ] 2、納米載體材料PLGA-PEG-MAL的合成 具體方法同實施例1。
[0032]3、全氟溴辛烷納米粒的制備
將20mg PLGA-PEG-MAL、12PL PFOB加入0.4ml氯仿溶液中，然后加1%聚乙烯醇(PVA)水溶液2 mL，在冰水浴中用均質(zhì)機混合約60 S，將分散液在冰水浴中用200W功率間斷超聲180 s后再用均質(zhì)機間斷處理300 S。將所得納米乳劑在20°C條件下開口攪拌約3小時使氯仿?lián)]發(fā)。所得納米乳劑經(jīng)激光光散射測定全氟溴辛烷納米粒粒徑為110 nm，PF0B包封率約 80%ο
[0033]4、巰基修飾的EpDT3適體和全氟溴辛烷納米粒表面的連接
按全氟溴辛烷納米粒 表面PEG鏈末端的馬來酰亞胺基與巰基修飾的EpDT3適體的疏基反應(yīng)摩爾比為1: 1，將全氟溴辛烷納米乳劑與巰基修飾的EpDT3適體溶液混合，20°C條件下緩慢攪拌反應(yīng)10小時即得終產(chǎn)物靶向超聲造影劑。所得靶向超聲造影劑經(jīng)激光光散射測定其粒徑為180 nm, PFOB的含量為2.36mg/g。
[0034]實施例4EpDT3_NH2修飾的前列腺癌超聲診斷靶向試劑制備(一)
1、氨基修飾的EpDT3適體(EpDT3-NH2)的制備
委托生物科技公司合成5’端通過六乙二醇連接氨基，3’端是倒置的T帽結(jié)構(gòu)，RNA的嘧啶環(huán)2’位羥基用氟原子取代的適體EpDT3，即氨基修飾的EpDT3適體:EpDT3_NH2，其具體序列組成為 5’ -NH2-spacer-GCGACUGGUUACCCGGUCG inverted T_3’，具有 2’ -氟代嘧啶，3’ -倒置T帽，并且5’ -氨基通過六乙二醇連接。
[0035]2、納米載體材料PLGA-PEG-COOH的合成
取0.25g PLGA-C00H (乙丙交酯比:50/50)溶于3ml 二氯甲烷，加入3mg EDCUmgTEA,4.8mg NHS,混合均勻，室溫下攪拌反應(yīng)24h ;然后加入20.4mg NH2-PEG-C00H和7.5mg縛酸劑DIEA (N, N- 二異丙基乙胺)繼續(xù)反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去二氯甲烷；沉淀用乙醚/甲醇清洗，離心除去未反應(yīng)的PEG，冷凍干燥得到納米載體材料PLGA-PEG-COOH。核磁分析結(jié)果表明，約80%的PEG連接到PLGA上。
[0036]3、全氟溴辛烷納米粒的制備
將20mg PLGA-PEG-COOH、12PL PFOB加入0.4ml 二氯甲烷溶液中，然后與1% PVA水溶液
2mL在冰水浴中用均質(zhì)機混合約60 S。將分散液在冰水浴中超聲120 s后再用均質(zhì)機處理120 S。將所得納米乳劑在20°C條件下開口攪拌約3小時使二氯甲烷揮發(fā)。然后低溫透析5小時得到終產(chǎn)物。所得納米乳劑粒徑經(jīng)激光光散射測定其水合動力學粒徑為105 nm,PFOB包封率約80%。
[0037]4、氨基修飾的EpDT3適體和全氟溴辛烷納米粒表面的連接
在20°C下將40mmol EDCUOOmmol NHS及10μL TEA加入2ml全氟溴辛烷納米?；鞈乙褐?，溫和攪拌活化20min，按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的羧基與氨基修飾的EpDT3適體的氨基反應(yīng)摩爾比為3:1加入氨基修飾的EpDT3適體，混勻，室溫攪拌反應(yīng)3h，超濾分離得到適體修飾的靶向納米粒。所得靶向超聲造影劑經(jīng)激光光散射測定其粒徑為160 nm。
[0038]實施例5EpDT3_NH2修飾的前列腺癌超聲診斷靶向試劑制備(二)
1、氨基修飾的EpDT3適體的制備
具體方法同實施例4。
[0039]2、納米載體材料PLGA-PEG-COOH的合成
取0.25g PLGA-C00H (乙丙交酯比:50/50)溶于3ml 二氯甲烷，加入3mg EDC、4.8mgNHSUmg DMAP，混合均勻，室溫下攪拌反應(yīng)24h ;然后加入20.4mg NH2-PEG-C00H和7.5mg縛酸劑TEA繼續(xù)反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去二氯甲烷；沉淀用乙醚/甲醇清洗，離心除去未反應(yīng)的PEG，冷凍干燥得到納米載體材料PLGA-PEG-COOH。核磁分析結(jié)果表明，約82%的PEG連接到PLGA上。
[0040]3、全氟溴辛烷納米粒的制備
將20mg PLGA-PEG-COOH、12PL PFOB加入0.4ml氯仿溶液中，然后與2%泊洛沙姆水溶液2 mL在冰水浴中超聲 約I min。將分散液在冰水浴中超聲120 s后再超聲3 min。將所得納米乳劑在20°C條件下開口攪拌約3小時使氯仿?lián)]發(fā)。然后低溫透析5小時得到終產(chǎn)物。所得納米乳劑粒徑經(jīng)激光光散射測定其水合動力學粒徑為105 nm。
[0041]4、氨基修飾的EpDT3適體和全氟溴辛燒納米粒表面的連接
在20°C下將40mmol EDCUOOmmol NHSUOPL TEA加入2ml全氟溴辛烷納米?；鞈乙褐?，溫和攪拌活化lOmin，按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的羧基與氨基修飾的EpDT3適體的氨基反應(yīng)摩爾比為2:1加入氨基修飾的EpDT3適體，混勻，室溫攪拌反應(yīng)4h，超濾分離得到適體修飾的靶向納米粒。所得靶向超聲造影劑經(jīng)激光光散射測定其粒徑為160 nm。
[0042]實施例6EpDT3_NH2修飾的前列腺癌超聲診斷靶向試劑制備(三)
1、氨基修飾的EpDT3適體的制備
具體方法同實施例4。
[0043]2、納米載體材料PLGA-PEG-COOH的合成 具體方法同實施例4。
[0044]3、全氟溴辛烷納米粒的制備
將20mg PLGA-PEG-COOH、12PL PFOB加入0.4ml 二氯甲烷溶液中，然后與1%泊洛沙姆水溶液2 mL在冰水浴中用均質(zhì)機混合約60 S。將分散液在冰水浴中超聲120 s后再用均質(zhì)機處理120 S。將所得納米乳劑在20°C條件下開口攪拌約3小時使二氯甲烷揮發(fā)。然后低溫透析5小時得到終產(chǎn)物。所得納米乳劑粒徑經(jīng)激光光散射測定其水合動力學粒徑為105nm, PFOB包封率約80%。
[0045]4、氨基修飾的EpDT3適體和全氟溴辛燒納米粒表面的連接
在20°C下將40mmol EDCUOOmmol NHS及10μL TEA加入2ml全氟溴辛烷納米?；鞈乙褐?，溫和攪拌活化30min，按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的羧基與氨基修飾的EpDT3適體的氨基反應(yīng)摩爾比為1:1加入氨基修飾的EpDT3適體，混勻，室溫攪拌反應(yīng)3h，超濾分離得到適體修飾的靶向納米粒。所得靶向超聲造影劑經(jīng)激光光散射測定其粒徑為160 nm。
[0046]實施例7本發(fā)明的前列腺癌超聲診斷靶向試劑的靶向顯影實驗 一、實驗材料與儀器
BALB / c-nu裸鼠50，雄性，4~6周齡，體質(zhì)量18~22 g，平均(20±2)g。人前列腺癌細胞株LNCaP。ATL HDI 5000彩色多普勒超聲診斷儀。
[0047]二、實驗方法
1.建立荷人前列腺癌裸鼠移植瘤模型:常規(guī)培養(yǎng)LNCaP細胞，制備細胞懸液。BALB/c-nu裸鼠按1-50編號，每鼠無菌條件下消毒局部，分別于頸背部和腋下部皮下注射LNCaP人前列腺癌細胞懸液0.1ml，細胞數(shù)約1.0X IO7個/ml，定期觀察腫瘤的生長情況。
[0048]2.研究方案:肉眼觀察裸鼠瘤體長至直徑約1.0cm左右時，進行荷瘤裸鼠超聲造影檢查。50只實驗鼠隨機分為5組，每組10只。實驗前將檢查室用紫外線燈照射lh，實驗人員穿無菌衣，戴無菌手套。將裸鼠瘤體置于溫水浴中，探頭與瘤體之間距離約1.0cm左右。采用C5-2探頭FICon/Gen條件掃查，探頭中心頻率3.5MHz,圖像深度5.0-6.0cm,平均灰度40，TGC居中，機械指數(shù)1.4，以上條件在實驗過程中保持不變。造影前每只實驗鼠均先行能量多普勒血流檢查，然后經(jīng)尾靜脈分別推注造影劑。普通組:全氟溴辛烷納米粒造影劑；EpDT3-SH組:實施例1制備的超聲診斷靶向試劑；EpDT3-NH2組:實施例4制備的超聲診斷靶向試劑；A10-3.2-SH組:按照實施例1的方法制備的A10-3.2-SH修飾的前列腺癌超聲診斷靶向試劑，不同之處僅在于使用巰基修飾的A10-3.2適體來修飾全氟溴辛烷納米粒，巰基修飾的A10-3.2適體序列組成為5’ -GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCA⑶CXU- (CH2) 6- SH- 3’，且具有2’-氟代嘧啶修飾；A10-3.2-見12組:按照實施例4的方法制備的A10-3.2-NH2修飾的前列腺癌超聲診斷靶向試劑，不同之處僅在于使用氨基修飾的A10-3.2適體來修飾全氟溴辛烷納米粒，A10-3.2適體序列組成為5’-NH2-Spacer-GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCU inverted T-3 ’，具有 2’ -氟代嘧啶,3 ’ -倒置 T 帽，并且5’-氨基通過六乙二醇連接。A10-3.2適體的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。每只實驗鼠推注造影劑0.05ml, 12min后行能量多普勒顯像，顯示腫瘤能量多普勒信號增強圖像，按照2min內(nèi)每5s、2min后每30s，連續(xù)觀察5min，將圖像以BMP格式存入電腦硬盤，繼續(xù)觀察直至信號完全消失。實 驗中密切觀察實驗鼠生命體征變化。
[0049]3.資料分析:以Photoshop軟件對存入硬盤的BMP圖像進行分析。選取腫瘤區(qū)域為感興趣區(qū)，以直方圖法測量能量圖腫瘤最大截面內(nèi)血流信號與該截面的像素數(shù)，計算腫瘤界面內(nèi)血流信號所占的面積比(blood flow area ratio, BFAR)。本研究中，BFAR=腫瘤內(nèi)血流面積/腫瘤截面面積。比較每組不同時間點的BFAR，觀察其變化趨勢，并記錄其峰值。
[0050]三、統(tǒng)計學方法
采用SPSS10.0軟件對各組造影后能量多普勒顯像的BFAR峰值進行配對t檢驗。
[0051]四、實驗結(jié)果
1、成功建立荷人前列腺癌裸鼠模型
50只裸鼠均于頸背部皮下和腋下長出腫瘤結(jié)節(jié)，經(jīng)測量最小者約0.8X0.9cm，最大者約1.4X1.5cm，呈橢圓形或結(jié)節(jié)狀，突出于體表，質(zhì)稍硬，瘤體表面呈粉紅色，肉眼可見移植瘤組織表面有細小的血管分支。模型建立過程中無動物死亡。實驗過程中生命體征平穩(wěn)。
[0052]2、荷瘤裸鼠能量多普勒顯像
每只實驗鼠造影前腫瘤組織行能量多普勒血流檢測，可見瘤體周邊散在的環(huán)繞血流信號和內(nèi)部稀疏的點狀血流信號，經(jīng)尾靜脈推注攜帶巰基修飾EpDT3適體-SH或氨基修飾適體EpDT3-NH2的靶向造影劑12min后行能量多普勒顯像，視覺觀察實驗鼠瘤體周邊及內(nèi)部能量多普勒信號明顯增多，而后能量多普勒信號逐漸減少，持續(xù)顯影時間約2.5min，而普通組、A10-3.2-SH組和A10-3.2_NH2組的實驗鼠在推注相應(yīng)造影劑12min后，瘤體內(nèi)能量多普勒信號與造影前相比變化不明顯。
[0053]3、統(tǒng)計學分析
結(jié)果見表1。EpDT3-SH組和EpDT3-NH2組的BFAR峰值造影前后差異均有統(tǒng)計學意義(P〈0.01), A10-3.2-SH組和A10-3.2_NH2組造影前后差異也有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)，而普通組造影前后差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造影后，EpDT3-SH組和EpDT3_NH2組分別與普通組比較，BFAR差異有統(tǒng)計學意義(P〈0.01)，分別與A10-3.2-SH組比較，BFAR差異有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)，分別與A10-3.2-見12組比較，BFAR差異有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)。以上結(jié)果表明實施例1和3制備的造影劑更多的滯留于腫瘤血管床，具備優(yōu)異的靶向性。
[0054]表1能量多普勒顯像后各組BFAR峰值(％，χ 土S)
【權(quán)利要求】
1.一種前列腺癌超聲診斷靶向試劑，所述的靶向試劑含有全氟溴辛烷納米粒，其特征在于，所述的全氟溴辛烷納米粒被EpDT3適體所修飾，所述的EpDT3適體選自: a)EpDT3-SH:5’ - GCGACUGGUUACCCGGUCG- (CH2) 6- SH- 3’，且具有 2’-氟代嘧啶修飾，或
b)EpDT3-NH2:5’-NH2-spacer_GCGACUGGUUACCCGGUCG inverted T_3’，具有 2’-氟代嘧啶，3’ -倒置T帽，并且5’ -氨基通過六乙二醇連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前列腺癌超聲診斷靶向試劑，其特征在于，所述的EpDT3適體為EpDT3-SH，所述的靶向試劑是通過以下方法制備的:按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的馬來酰亞胺基與EpDT3-SH的疏基反應(yīng)摩爾比為(1-3): 1，將全氟溴辛烷納米乳劑與EpDT3-SH溶液混合，室溫條件下緩慢攪拌反應(yīng)6-10小時即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的前列腺癌超聲診斷靶向試劑，其特征在于，所述的全氟溴辛烷納米粒是通過以下方法制備的: a)將PLGA-COOH溶解于二氯甲烷中，然后加入縮合劑、催化劑和N-羥基丁二酰亞胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEG-MAL和縛酸劑，得到PEG修飾的共聚物PLGA-PEG-MAL ；
b)將PLGA-PEG-MAL、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化劑及水，超聲或均質(zhì)化制得所述的全氟溴辛烷納米粒的乳劑，再攪拌令二氯甲烷或氯仿?lián)]發(fā)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前列腺癌超聲診斷靶向試劑，其特征在于，所述的EpDT3適體為氨基修飾的EpDT3適體，所述的靶向試劑是通過以下方法制備的:在室溫下向全氟溴辛烷納米?；鞈乙褐屑尤隕DC、NHS和TEA，溫和攪拌活化10_30min，再加入EpDT3_NH2混勻，室溫攪拌反應(yīng)2-4h，超濾分離即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的前列腺癌超聲診斷靶向試劑，其特征在于，所述的全氟溴辛烷納米粒是通過以下方法制備的: a)將PLGA-C00H溶解于二氯甲烷中，然后加入縮合劑、催化劑和N-羥基丁二酰亞胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEg-COOH和縛酸劑，得到PEG修飾的共聚物PLGA-PEG-C00H ； b)將PLGA-PEG-C00H、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化劑及水，超聲或均質(zhì)化制得所述的全氟溴辛烷納米粒的乳劑，再攪拌令二氯甲烷或氯仿?lián)]發(fā)。
6.權(quán)利要求1所述的前列腺癌超聲診斷靶向試劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: a)將PLGA-C00H溶解于二氯甲烷中，然后加入縮合劑、催化劑和N-羥基丁二酰亞胺得到活性酯改性的PLGA-NHS，再加入NH2-PEG-MAL/NH2-PEG-C00H和縛酸劑，得到PEG修飾的共聚物 PLGA-PEG-MAL/PLGA-PEG-C00H ； b)將PLGA-PEG-MAL/PLGA-PEG-C00H、全氟溴辛烷加入到二氯甲烷或氯仿中，然后加入一定量的乳化劑及水，超聲或均質(zhì)化制得所述的全氟溴辛烷納米粒的乳劑，再攪拌令二氯甲烷或氯仿?lián)]發(fā)； c)按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的馬來酰亞胺基與EpDT3-SH的疏基反應(yīng)摩爾比為(1-3): 1，將PLGA-PEG-MAL制成的全氟溴辛烷納米的乳劑與EpDT3_SH溶液混合，室溫條件下緩慢攪拌反應(yīng)6-10小時即得所述的祀向試劑；或者 在室溫下向PLGA-PEG-COOH制成的全氟溴辛烷納米?；鞈乙褐屑尤隕DC、NHS和TEA，溫和攪拌活化10-30min，再按全氟溴辛烷納米粒表面PEG鏈末端的羧基與EpDT3_NH2的氨基反應(yīng)摩爾比為(1-3):1加入EpDT3-NH2混勻，室溫攪拌反應(yīng)2_4h，超濾分離即得所述的靶向試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟a)中所述的縮合劑選自1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺或二環(huán)己基碳二亞胺，步驟a)中所述的催化劑選自三乙胺、N，N- 二異丙基乙胺DIEA和4- 二甲氨基吡啶中的一種或幾種的組合，步驟a)中所述的縛酸劑為三乙胺和/或N，N-二異丙基乙胺，步驟b)中所述的乳化劑選自膽酸鈉、聚乙烯醇、泊洛沙姆、十二烷基硫酸鈉、吐溫80、司盤80中的一種或幾種的組合。
8.權(quán)利要求1-5 任一所述的靶向試劑在制備前列腺癌診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K49/22GK103977433SQ201410200726
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】朱全剛, 陳中建, 童仙君, 徐蓓蕾, 張若曦 申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院