一種構(gòu)建再生的神經(jīng)血管化骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種通過預(yù)先制作的陰模形狀支架，構(gòu)建人體神經(jīng)血管化骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的方法。首先通過計算機(jī)輔助設(shè)計/制造技術(shù)三維打印缺損組織或器官的陰模支架；然后通過手術(shù)于機(jī)體內(nèi)形成骨膜和/或軟骨膜面，將陰模支架放置并固定縫合于自體骨膜和/或軟骨膜生發(fā)層上，使其形成一閉合空間；待骨膜和/或軟骨膜面生發(fā)層與陰模構(gòu)建的空間內(nèi)再生出與陰模對應(yīng)的陽模形狀的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官后，完整取出新生組織，去除陰模支架，將其移植到組織或器官缺損/缺失處進(jìn)行重建。本發(fā)明通過自體預(yù)構(gòu)所得的新生組織或器官具有豐富的新生血管和神經(jīng)，且不含任何外源性物質(zhì)參與組織再生，安全性高，同時形狀精確，與正常組織或器官極為相似。
【專利說明】一種構(gòu)建再生的神經(jīng)血管化骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種構(gòu)建再生的神經(jīng)血管化骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]各種創(chuàng)傷、腫瘤等原因造成的組織、器官缺損和功能障礙是造成人體損傷的主要原因。而人體組織器官受到損傷后，如何使受損的組織器官結(jié)構(gòu)、功能修復(fù)和重建是目前生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)界面臨的重大難題。重要組織、器官的缺損通常都需要采用自體或異體組織、器官移植進(jìn)行修復(fù)，而自體、異體移植的方法各自存在很多無法避免的缺陷，如自體移植的供區(qū)來源不足，異體移植存在免疫排斥、倫理問題等。[0003]上世紀(jì)80年代提出了組織工程的概念。隨之的提出、建立和發(fā)展，人們對體外組織構(gòu)建有了更深入研究，并為體內(nèi)重建奠定了基礎(chǔ)。在此發(fā)展的基礎(chǔ)上，人們對器官再生的研究掀起了新的熱潮。并使醫(yī)學(xué)研究進(jìn)入了 “再生醫(yī)學(xué)時代”。
[0004]幾十年來，組織工程的體外再生首先獲得了廣泛成功，如骨、軟骨、皮膚、氣管、神經(jīng)、血管、肌腱、角膜等組織的構(gòu)建與修復(fù)取得了舉世矚目的成績，并被國內(nèi)外廣泛的報道與認(rèn)可。但其在種子細(xì)胞、生物材料、信息因子三大核心領(lǐng)域存在著許多一直沒法突破的缺憾,如:細(xì)胞來源、構(gòu)建組織的體內(nèi)相容性、安全性、免疫排斥、倫理性等。而且體外構(gòu)建的組織普遍存在著無法構(gòu)建血管神經(jīng)化問題，這些問題都有待深入的探討，同時這些問題也延緩了組織工程及再生醫(yī)學(xué)在臨床應(yīng)用的腳步。
[0005]“體內(nèi)再生”、“體內(nèi)生物反應(yīng)器”概念的出現(xiàn)，將上述目標(biāo)成為可能。“體內(nèi)生物反應(yīng)器”是利用生物體的自身能力再生所需的組織結(jié)構(gòu)，并用來修復(fù)相應(yīng)的組織缺損。應(yīng)用“體內(nèi)生物反應(yīng)器”可以根據(jù)受體需要，預(yù)構(gòu)定制形狀的組織結(jié)構(gòu)。由于是自體組織再生獲得的器官，移植到受區(qū)不存在免疫排斥反應(yīng)等問題。
[0006]Warnke充分發(fā)揮人體潛能，以定制型鈦網(wǎng)為輪廓支架，填充羥基磷灰石/rhBMP_7混合物，利用含胸背動脈的背闊肌肌袋作為生物反應(yīng)器，構(gòu)建血管化下頜骨體，用來修復(fù)自體下頜骨缺損，獲得了較好的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了通過動物實(shí)驗轉(zhuǎn)化到人的體內(nèi)組織預(yù)構(gòu)。PaoloM等人，成功修復(fù)了左主支氣管狹窄，使氣道功能性修復(fù)，實(shí)驗者將自體的健側(cè)氣管上皮細(xì)胞接種在異體脫細(xì)胞氣管支架上，再利用體外“氣液相”生物反應(yīng)器在體外培養(yǎng)96小時，使細(xì)胞與支架充分粘附后，將細(xì)胞和支架的復(fù)合體移植在氣管狹窄的區(qū)域，術(shù)后移植物成活良好，并獲得了良好的功能性恢復(fù)。Chang H Lee等人，完全利用體內(nèi)環(huán)境，通過細(xì)胞的歸巢作用，自體修復(fù)關(guān)節(jié)部分缺損結(jié)構(gòu)，作者利用三維CT成像和快速成型技術(shù)制造定制型TCP材料的兔肱骨上端肩關(guān)節(jié)缺損模型，在其支架材料上放置成軟骨生長因子TGF-β 3，將其復(fù)合體種植入體內(nèi)相應(yīng)關(guān)節(jié)缺損模型內(nèi)，6個月后，材料在體內(nèi)細(xì)胞的遷移與自身的修復(fù)作用下，形成了相應(yīng)的關(guān)節(jié)面軟骨結(jié)構(gòu)，關(guān)節(jié)功能逐漸恢復(fù)。
[0007]基于以上前人的成功報道，學(xué)者們利用人體自身的組織結(jié)構(gòu)作為生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)了自體重建再生目的物的理念。這些突破性成就，對于構(gòu)建血管神經(jīng)化骨、氣管、關(guān)節(jié)軟骨，都體現(xiàn)了體內(nèi)再生的巨大潛力。然而，一方面，這些方法仍然沒有完全避免體外培養(yǎng)過程、外源性生長因子、外源性基因等參與。并且再生組織植入后，外源性細(xì)胞、材料、生長因子等極易引發(fā)排異反應(yīng)、感染、囊腫形成、材料不能夠降解、外露等并發(fā)癥，該安全性問題一直沒有完全解決，嚴(yán)重制約了以上構(gòu)建的血管神經(jīng)化骨、氣管、關(guān)節(jié)軟骨等在臨床的應(yīng)用。另一方面，目前所構(gòu)建的組織難以神經(jīng)血管化，因此其植入體內(nèi)后發(fā)生退化、無法進(jìn)一步與自體融合生長等等問題，仍不能滿足其缺損修復(fù)和功能重建的要求。第三，關(guān)節(jié)或其他器官是由多種組織結(jié)構(gòu)復(fù)合而成，單純體外構(gòu)建一種組織形態(tài)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足機(jī)體的要求的。第四，組織或器官的損傷和缺失是多種多樣的，我們需要通過精確設(shè)計，實(shí)現(xiàn)個性化的需求。
[0008]綜上所述，為促進(jìn)組織和器官缺損或功能障礙的修復(fù)，尤其是推動其在臨床的直接應(yīng)用，提高手術(shù)滿意度，亟需構(gòu)建一種無外源性物質(zhì)參與、形狀精確、完全依靠體內(nèi)構(gòu)建獲得神經(jīng)血管化組織或器官的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供利用與缺損/缺失的組織/器官呈陰模形狀的支架，構(gòu)建神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的方法。
[0010]本發(fā)明的再一的目的是，提供一種再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官。
[0011]本發(fā)明的另一的目的是，提供所述的再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的用途。
[0012]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
利用與缺損/缺失的組織/器官呈陰模形狀的支架，構(gòu)建神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的方法，包括以下步驟:
a)獲得欲構(gòu)建的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的陰模支架；
b)通過手術(shù)于機(jī)體內(nèi)制備一個完整的骨膜和/或軟骨膜面，將步驟a)的陰模支架放置于機(jī)體內(nèi)的骨膜和/或軟骨膜生發(fā)層上，固定縫合陰模支架邊緣，使其形成一個閉合空間；
c)閉合步驟b)手術(shù)過程中形成的切口，待所述的骨膜和/或軟骨膜面生發(fā)層側(cè)再生出與陰模支架對應(yīng)的陽模形狀的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官后，完整取出神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官。
[0013]步驟a)所述的“獲得預(yù)構(gòu)建的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的陰模支架”具體是:利用計算機(jī)輔助設(shè)計或制造技術(shù)，對缺損的組織或器官影像學(xué)掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，構(gòu)建缺損部位組織形態(tài)，再根據(jù)重建的數(shù)據(jù)，通過三維打印技術(shù)制作缺損組織陰模。
[0014]步驟b)中所述的“通過手術(shù)于機(jī)體內(nèi)制備一個完整的骨膜和/或軟骨膜面”具體是:于肋骨和/或軟骨正上方逐層切開皮膚、皮下、肌肉層，并沿肋骨肋軟骨膜中線處切開，小心剝離骨膜和軟骨膜，結(jié)合陰模支架大小取出合適的肋骨和/或軟骨，整個過程仔細(xì)保護(hù)骨膜和/或軟骨膜的生發(fā)層，再連接縫合相鄰骨膜和/或軟骨膜，使其展平形成一個完整的骨膜和/或軟骨膜面。
[0015]步驟b)中，所述的陰模支架的設(shè)計面面向骨膜和/或軟骨膜生發(fā)層放置。[0016]步驟b)中所述的“機(jī)體”為動物體，所述的動物可以是人、豬、兔、狗、大鼠、小鼠等。
[0017]為實(shí)現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:
一種再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官，所述的再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官由骨和/或軟骨構(gòu)成。
[0018]所述再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官形狀與陰模支架正好相互補(bǔ)。
[0019]所述的再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官為再生的神經(jīng)血管化的關(guān)節(jié)、顱骨、鼻骨或耳軟骨。
[0020]為實(shí)現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采 取的技術(shù)方案是:
如上任一所述的再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的用途，用于制備修復(fù)缺損或缺失的組織或器官。
[0021]如本文所用，所述的“再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官”還可以按照其組織類型劃分為單純骨、單純軟骨、以及骨和軟骨的復(fù)合組織三種類型。
[0022]如本文所用，所述的“骨和/或軟骨”是指骨、軟骨、或骨和軟骨的復(fù)合組織，所述的“骨和軟骨的復(fù)合組織”優(yōu)選為骨與軟骨結(jié)合于一體的組織，該組織包含骨、軟骨，以及骨和軟骨的過渡區(qū)域。鼻、關(guān)節(jié)等均屬于“骨和軟骨的復(fù)合組織”范疇。
[0023]如本文所用，所述的“陰?！笔侵敢环N模具，該模具一面的凹凸形狀特征與正常組織或器官對應(yīng)面的凹凸形狀特征相互吻合。所述的陰模支架可為羥基磷灰石、硅膠等材質(zhì)，只要可制作成缺損組織陰模形狀，并可植入體內(nèi)起到組織再生時的塑形作用即可。
[0024]如本文所用，所述的“陰模支架的設(shè)計面”是指陰模支架用于讓新生骨、軟骨、或骨和軟骨的復(fù)合組織附著生長的那一面，該面的形狀是依據(jù)欲構(gòu)建的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的形狀設(shè)計。
[0025]如本文所用，所述的“骨膜和/或軟骨膜面”是指骨膜面、軟骨膜面、或骨膜面和軟骨膜面及二者的過渡區(qū)。
[0026]本發(fā)明中，所述的“關(guān)節(jié)”指骨與骨(如股骨和髖骨)之間的連接點(diǎn)，如指關(guān)節(jié)，膝關(guān)節(jié)，甚至局部關(guān)節(jié)缺損；所述的“體表器官”包括耳、鼻、指關(guān)節(jié)等器官。
[0027]本發(fā)明中，構(gòu)建再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官時，如再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官其本質(zhì)為單純骨，則將所述陰模支架置于骨膜的生發(fā)層；如再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官其本質(zhì)為單純軟骨，則將所述陰模支架置于軟骨膜的生發(fā)層；如再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官其本質(zhì)為骨與軟骨的復(fù)合組織，則將所述陰模支架置于骨膜和軟骨膜及二者交界處的生發(fā)層。
[0028]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于:
本發(fā)明探討建立了一種完全利用體內(nèi)環(huán)境，構(gòu)建個性化定制型神經(jīng)血管化的組織或器官的方法，從而用來修復(fù)和重建組織及器官缺損，尤其是用來修復(fù)和重建自體組織及相應(yīng)器官缺損。以此為患者提供最安全、有效、持久的治療方案，并可成為臨床廣泛應(yīng)用的堅實(shí)依據(jù)。
[0029]具體地，本發(fā)明利用計算機(jī)輔助設(shè)計/制造技術(shù)(CAD/CAM)，對缺損的組織或器官影像學(xué)掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，構(gòu)建缺損部位組織形態(tài)。根據(jù)重建的數(shù)據(jù)，通過三維打印技術(shù)制作缺損組織陰模支架。利用骨膜/軟骨膜及其血管神經(jīng)束作為“體內(nèi)再生源”，將個性化的陰模支架放置于體內(nèi)成骨/成軟骨最重要的結(jié)構(gòu)——骨膜/軟骨膜(陰模凸起面面向骨膜/軟骨膜生發(fā)層)， 并固定縫合材料邊緣于骨膜/軟骨膜。所形成的一個閉合空間用于自體構(gòu)建缺損的組織或器官。這種方式構(gòu)建的神經(jīng)血管化組織及器官(如耳、鼻等)具有以下優(yōu)點(diǎn):①制作的是缺損組織或器官的陰模支架，將陰模支架置入機(jī)體后，能直接獲得與所需組織或器官形狀完全一致且不包含支架材料的再生組織或器官，相比于現(xiàn)有技術(shù)中使用陽模材料和/或體外培養(yǎng)細(xì)胞及生長因子共同置入機(jī)體，使組織或器官在其上再生的做法，更加安全，形狀更加精確；②完全利用自體再生的潛能構(gòu)建缺損的目的性組織或器官，在整個預(yù)構(gòu)骨/軟骨再生過程中，無體外細(xì)胞培養(yǎng)過程、外源性生長因子、外源性基因等參與，從而保證體內(nèi)組織預(yù)構(gòu)的安全性，克服了外源性細(xì)胞、材料、生長因子等植入體內(nèi)而存在的后期排異反應(yīng)、感染、囊腫形成、材料不能夠降解、外露等并發(fā)癥的缺陷，因此可以直接應(yīng)用于臨床最終所獲得的再生組織或器官完全為骨和/或軟骨，不含有任何支架材料，支架材料在體內(nèi)組織再生過程中僅起到幫助塑形的作用，而非參與再生，在二期手術(shù)中可將支架材料取出，不會因其遺留體內(nèi)而造成的后期感染、排異等并發(fā)癥；④充分動員了體內(nèi)骨/軟骨生成的重要要素一骨膜/軟骨膜，選擇在肋骨/肋軟骨的骨膜/軟骨膜生發(fā)層置入陰模支架，再生的組織或器官有骨膜/軟骨膜覆蓋，其具有明確的血管神經(jīng)蒂，不但可以保證預(yù)構(gòu)組織或器官的神經(jīng)血管化，同時也提供了可供吻合的血管神經(jīng)，為組織移植、修復(fù)供區(qū)缺損提供了充分條件。并且骨膜軟骨膜所形成的天然連接結(jié)構(gòu)，為骨軟骨復(fù)合組織所形成的關(guān)節(jié)過渡性結(jié)構(gòu)提供了必要條件；⑤經(jīng)CAD/CAM技術(shù)制作的陰模支架在體內(nèi)組織預(yù)構(gòu)過程中起到了精確的塑形作用，再生的骨/軟骨組織無需重新雕刻，大大降低了對手術(shù)醫(yī)生的要求，縮短了手術(shù)時間，減少了創(chuàng)傷，并且避免了正常組織或器官與人工雕刻的組織或器官形狀上所存在的差異性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1.根據(jù)CT三維重建數(shù)據(jù)及計算機(jī)輔助設(shè)計/制造(CAD/CAM)技術(shù)，重建個性化患側(cè)耳。
[0031]圖2.根據(jù)重建數(shù)據(jù)，通過3D打印技術(shù)制作正常的患側(cè)耳樹脂模型。
[0032]圖3.羥基磷灰石材料(HA)灌注耳形支架，獲得其陰模。
[0033]圖4.按圖中A設(shè)計，將第6、7、8肋軟骨取出，仔細(xì)保護(hù)骨膜和軟骨膜的生發(fā)層。如圖中B所示，縫合相鄰軟骨膜，使其形成一個完整的軟骨膜。如圖中C所示，將事先準(zhǔn)備好的陰模凸起面向軟骨膜生發(fā)層縫合，使其形成一個閉合腔隙，用于軟骨組織再生。
[0034]圖5.術(shù)后第3個月對預(yù)構(gòu)組織進(jìn)行影像學(xué)監(jiān)測，可見預(yù)構(gòu)軟骨組織具有確切的影像學(xué)成像。
[0035]圖6.預(yù)構(gòu)的耳形軟骨組織輪廓精確清晰。
[0036]圖7.帶軟骨膜完整取出預(yù)構(gòu)的軟骨組織，進(jìn)一步修剪再生軟骨周圍少量軟組織。
[0037]圖8.對修剪多余的再生軟骨軟骨組織進(jìn)行阿里新蘭染色，結(jié)果顯示經(jīng)典的軟骨陷窩、軟骨基質(zhì)。II型膠原免疫組織化學(xué)染色可見典型的軟骨基質(zhì)。
[0038]圖9.實(shí)施例1的體內(nèi)預(yù)構(gòu)軟骨的彈性模量。
[0039]圖10.實(shí)施例1的體內(nèi)預(yù)構(gòu)軟骨的最大彎曲載荷。
[0040]圖11.根據(jù)顱骨缺損，利用(CAD/CAM)技術(shù)，精確個性化的三維打印缺損骨組織的樹脂模型。[0041]圖12.根據(jù)樹脂模型，制作HA陰模，用于預(yù)構(gòu)缺損骨組織。
[0042]圖13.根據(jù)陰模的大小，于第6、7、8根肋骨位置設(shè)計出預(yù)構(gòu)的骨組織需要的相應(yīng)肋骨骨膜面積及相應(yīng)的肋骨位置。
[0043]圖14.將第6、7、8肋相應(yīng)陰模大小的肋骨取出，整個過程仔細(xì)保護(hù)骨膜的生發(fā)層。展開并連接縫合相鄰骨膜，使其鋪平形成一個完整的骨膜面(左)。將事先準(zhǔn)備好的陰模，設(shè)計面面向軟骨膜生發(fā)層放置，邊緣縫合固定于骨膜上(中)，使其與骨膜形成一個閉合腔隙，用于骨組織再生(右)。
[0044]圖15.于術(shù)后第3個月對預(yù)構(gòu)組織進(jìn)行影像學(xué)監(jiān)測，可見預(yù)構(gòu)組織具有確切的影像學(xué)骨組織再生證據(jù)。
[0045]圖16.帶骨膜完整取出預(yù)構(gòu)的骨組織(如需要，可同時攜帶血管神經(jīng)束共同取出供移植)。
[0046]圖17.VG染色鏡下可見典型的骨小梁骨髓腔及成骨細(xì)胞，髓腔內(nèi)血管豐富。
[0047]圖18.三色法染色、OC免疫組織化學(xué)染色可見典型的骨小梁樣結(jié)構(gòu)，豐富的血管布滿骨髓腔。
[0048]圖19.術(shù)后隨訪一年見，預(yù)構(gòu)骨組織無明顯吸收。面部形態(tài)良好。
[0049]圖20.骨組織VG(A)、三色法染色⑶可見典型的骨小梁骨髓腔及成骨細(xì)胞，髓腔內(nèi)血管豐富。OC免疫組織化學(xué)染色(D)可見典型的骨小梁樣結(jié)構(gòu)；阿里新蘭染色，col II免疫組織化學(xué)染色(E)可見典型的軟骨細(xì)胞及豐富的胞漿結(jié)構(gòu)。甲苯胺藍(lán)快綠染色(C)可見骨軟骨復(fù)合組織的過渡結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0050]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0051]實(shí)施例1體內(nèi)耳形軟骨預(yù)構(gòu)及重建外耳 其具體方法通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
(I)根據(jù)組織\器官缺損，利用(CAD/CAM)技術(shù)精確個性化的三維打印需要構(gòu)建組織形
狀
為了對個性化小耳畸形患者行耳再造，于術(shù)前進(jìn)行頭部CT掃描。將CT資料以DICOM(Digital Imaging and Communications in Medicine)格式輸出，通過Medgraphics軟件和Magic.RP (Magic Rapid Prototyping)軟件進(jìn)行三維建模處理,得到耳的三維模型(圖1)。采用鏡像技術(shù)，按照正常側(cè)耳形狀，對患側(cè)耳進(jìn)行三維模擬重建處理，得到患側(cè)正常耳的三維模型,然后通過立體光刻(Stereolithography, SLA)快速原型的制作,得到患側(cè)正常耳的樹脂模型(圖2)。考慮到掃描重建的耳廓組織包括了軟組織覆蓋，因此為了再造耳經(jīng)皮膚覆蓋后輪廓清晰，故本研究采用的SLA模型是將耳廓CT數(shù)據(jù)的精確結(jié)構(gòu)加深1.16倍制作，預(yù)留并彌補(bǔ)了術(shù)后因皮膚覆蓋而造成的耳部亞單位精細(xì)程度下降。將HA (羥基磷灰石)粉末(〈40目)與促凝劑按照4:6的重量比調(diào)和攪拌成液劑后注入樹脂模型取其陰模(圖3)。高壓消毒后獨(dú)立包裝備用。
[0052] (2)體內(nèi)組織預(yù)構(gòu)
在自身預(yù)構(gòu)過程中，我們動員體內(nèi)成軟骨的最重要結(jié)構(gòu)——軟骨膜及其血管神經(jīng)束作為“體內(nèi)再生源”，完全性自體再生精確形狀的個性化耳廓軟骨。按照術(shù)前設(shè)計(圖4A)，于第7肋軟骨正上方逐層切開皮膚、皮下、肌肉層，分別將第6、7、8相應(yīng)陰模大小的肋軟骨取出，整個過程仔細(xì)保護(hù)軟骨膜的生發(fā)層。連接縫合相鄰軟骨膜，使其展平形成一個完整的軟骨膜面(圖4B)。將事先準(zhǔn)備好的陰模凸起面面向軟骨膜生發(fā)層放置，邊緣縫合固定于軟骨膜上，使其與軟骨膜形成一個閉合空間，用于軟骨組織再生(圖4C)。將取出的軟骨置于皮下，并放置引流，逐層組織縫合。
[0053](3)再生耳形軟骨組織用于耳再造
分別在術(shù)后1、3個月對預(yù)構(gòu)組織進(jìn)行影像學(xué)監(jiān)測，待預(yù)構(gòu)組織具有確切的影像學(xué)證據(jù)后行二期手術(shù)(圖5)。術(shù)中沿原切口逐層切開皮膚，將預(yù)置的HA材料小心取出。見預(yù)構(gòu)的耳形軟骨組織輪廓精確清晰(圖6)。帶軟骨膜完整取出預(yù)構(gòu)的耳形軟骨組織(如需要，可同時攜帶血管神經(jīng)束共同取出移植)。還納埋置于皮下的肋軟骨，留置引流?？p合皮膚。進(jìn)一步修剪再生軟骨周圍少量軟組織(圖7)。
[0054]將修剪下的預(yù)構(gòu)軟骨行組織學(xué)及生物力學(xué)檢測:
I)組織學(xué)檢測:將少量修剪掉的再生軟骨組織用4%多聚甲醛浸泡固定(ΡΗ=7.0-7.5的PBS配置而成)，4°C保存，每隔12小時更換一次，共3天。PBS沖洗，酒精梯度脫水。常規(guī)石蠟包埋進(jìn)行組織切片(5 — 10 μ m)。并行HE、阿利新蘭、免疫組化COL II (II型膠原蛋白)染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察新生成軟骨細(xì)胞、胞漿形態(tài)。
[0055]結(jié)果顯示:阿利新蘭、免疫組化COL II (II型膠原蛋白)染色可見典型的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，胞漿豐富(圖8)。 [0056]2)生物力學(xué)測定:取預(yù)構(gòu)的殘余軟骨標(biāo)本，_20°C冷凍，測試前于室溫條件下，PBS液浸泡，材料試驗機(jī)測定軟骨垂直最大壓縮載荷和彈性模量等。并選擇正常肋軟骨作為對照組。
[0057]結(jié)果顯示:預(yù)構(gòu)的軟骨在術(shù)后三個月時具有與正常肋軟骨相似的彈性模量(為正常肋骨的90.5±3.9%)(圖9)和最大壓縮載荷(正常肋骨的86.4±4.9%)(圖10)，顯示再生組織的彈性模量與正常軟骨之間無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。
[0058](4)耳再造術(shù)
將預(yù)構(gòu)的耳形軟骨組織進(jìn)一步修剪后，二期行耳再造術(shù)。按照術(shù)前設(shè)計的切口，處理預(yù)構(gòu)的耳部皮膚和外耳道形態(tài)，植入預(yù)構(gòu)耳形軟骨組織。覆蓋并縫合皮膚，留置引流。包扎固定。術(shù)后7天拆除縫線。3個月后行顱耳角成形術(shù)。分別于術(shù)后第1、3、6和12個月隨訪，行影像學(xué)檢查，觀察軟骨組織成活情況。
[0059]術(shù)后隨訪結(jié)果顯示:CT可見植入的預(yù)構(gòu)軟骨組織成活良好，術(shù)后隨訪一年見，預(yù)構(gòu)軟骨組織無明顯吸收。耳部輪廓形態(tài)良好。
[0060]實(shí)施例2體內(nèi)骨預(yù)構(gòu)及重建顱骨缺損 其具體方法通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
(I)根據(jù)顱骨缺損，利用(CAD/CAM)技術(shù)，精確個性化的三維打印需要構(gòu)建的組織形狀為了對個性化骨缺損患者行重建，于術(shù)前對患者骨缺損/畸形部位進(jìn)行CT掃描。將CT 資料以 DICOM(Digital Imaging and Communications in Medicine)格式輸出，通過Medgraphics軟件和Magic.RP (Magic Rapid Prototyping)軟件進(jìn)行三維建模處理，得到骨的三維模型。按照正常側(cè)骨組織形狀，采用鏡像技術(shù)，對患側(cè)骨缺損處進(jìn)行三維模擬重建處理，得到患處正常的骨形態(tài)三維模型，然后通過立體光刻(Stereolithography, SLA)快速原型的制作，得到缺損骨組織的樹脂模型(圖11)?？紤]到掃描重建的骨組織包括了軟組織覆蓋，因此為了重建后輪廓清晰，故本研究采用的SLA模型是將骨缺損/畸形CT數(shù)據(jù)的精確結(jié)構(gòu)加深1.16倍制作，預(yù)留并彌補(bǔ)了術(shù)后因皮膚覆蓋而造成的局部亞單位精細(xì)程度下降。將HA (羥基磷灰石)粉末(〈40目)與促凝劑按照4:6的重量比調(diào)和攪拌成液劑后注入樹脂模型取其陰模。高壓消毒后獨(dú)立包裝備用(圖12)。并根據(jù)陰模的大小計算出需要的骨膜的面積。
[0061]同時，對患者行胸廓三維CT掃描，并進(jìn)行三維重建。利用Minics 10軟件重建出胸廓結(jié)構(gòu)。根據(jù)陰模的大小，于第61根肋骨位置設(shè)計出預(yù)構(gòu)的骨組織需要的相應(yīng)肋骨骨膜面積及相應(yīng)的肋骨位置。
[0062](2)體內(nèi)組織預(yù)構(gòu) 按照術(shù)前設(shè)計(圖13)，于第7肋軟骨正上方逐層切開皮膚、皮下、肌肉層，分別將第61肋相應(yīng)陰模大小的肋骨取出，整個過程仔細(xì)保護(hù)骨膜的生發(fā)層。展開并連接縫合相鄰骨膜，使其鋪平形成一個完整的骨膜面。將事先準(zhǔn)備好的陰模設(shè)計面面向骨膜生發(fā)層放置，邊緣縫合固定于骨膜上，使其與骨膜形成一個閉合空間，用于骨組織再生(圖14)。
[0063]( 3)預(yù)構(gòu)骨組織的獲取
分別在術(shù)后1、3個月對預(yù)構(gòu)組織進(jìn)行影像學(xué)監(jiān)測，待預(yù)構(gòu)組織具有確切的影像學(xué)骨組織再生證據(jù)后行二期手術(shù)(圖15)。術(shù)中沿原切口逐層切開皮膚，將預(yù)置的HA材料小心取出。見預(yù)構(gòu)骨組織輪廓精確清晰。帶骨膜完整取出預(yù)構(gòu)的骨組織(如需要，可同時攜帶血管神經(jīng)束共同取出供移植)(圖16)。術(shù)中保證胸膜和腹膜的完整性。還納埋置于皮下的肋骨，留置引流。縫合肌肉、皮下組織及皮膚層。進(jìn)一步修剪再生骨周圍少量軟組織及多余的預(yù)構(gòu)骨組織。
[0064]將修剪下來的預(yù)構(gòu)骨行組織學(xué)及生物力學(xué)檢測:
O組織學(xué)檢測:將少量修剪掉的再生骨組織用4%多聚甲醛浸泡固定(ρΗ=7.0-7.4的PBS配置而成)，4°C保存，每隔12小時更換一次，共3天。PBS沖洗，EDTA (10%)緩慢脫鈣。三天更換脫鈣液一次。待脫鈣完全后，PBS沖洗，酒精梯度脫水。常規(guī)石蠟包埋進(jìn)行組織切片(5 — ΙΟμπι)。并行HE、VG、快綠、三色法染色、免疫組化OC (骨鈣蛋白)染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察新生成骨細(xì)胞、骨小梁、骨髓腔的形態(tài)及血管再生情況。
[0065]結(jié)果顯示:VG染色鏡下可見典型的骨小梁骨髓腔及成骨細(xì)胞，髓腔內(nèi)血管豐富。三色法染色、OC免疫組織化學(xué)染色可見典型的骨小梁樣結(jié)構(gòu)、豐富的血管結(jié)構(gòu)布滿骨髓腔(圖 17，18)。
[0066]2)生物力學(xué)測定:取預(yù)構(gòu)的殘余骨標(biāo)本，_20°C冷凍，測試前于室溫條件下，PBS液浸泡，測定軟骨最大壓縮載荷和彈性模量等。并選擇正常肋骨作為對照組。
[0067]結(jié)果顯示:預(yù)構(gòu)的顱骨在術(shù)后三個月時具有與正常肋骨相似的彈性模量(為正常肋骨的88±5.6%)和最大壓縮載荷(正常肋骨的108±3.4%)。顯示再生組織的彈性模量與正常骨之間無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。
[0068](4)顱骨缺損修復(fù)重建畸形矯正術(shù)
將取出的預(yù)構(gòu)骨組織植入顱骨缺損部位，行二期顱骨缺損修復(fù)重建術(shù)。具體地:將修剪好的預(yù)構(gòu)骨組織植入骨缺損部位?？p合皮膚，包扎固定。術(shù)后7天拆除縫線。分別于第1、
3、6和12個月隨訪，行影像學(xué)檢查，觀察骨組織成活及骨融合現(xiàn)象。[0069]術(shù)后隨訪結(jié)果顯示:CT可見植入的預(yù)構(gòu)骨組織成活良好，與上頜骨融合生長。術(shù)后隨訪一年見，預(yù)構(gòu)骨組織無明顯吸收，面部形態(tài)良好，輪廓明顯改善。(圖19)。
[0070]實(shí)施例3體內(nèi)鼻形骨/軟骨預(yù)構(gòu)及重建鼻骨 其具體方法通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
(I)根據(jù)骨缺損，利用(CAD/CAM)技術(shù)，精確個性化的三維打印需要構(gòu)建組織形狀為了對個性化骨缺損患者行重建，于術(shù)前對患者頭部進(jìn)行CT掃描。將CT資料以DICOM(Digital Imaging and Communications in Medicine)格式輸出，通過Medgraphics軟件和Magic.RP (Magic Rapid Prototyping)軟件進(jìn)行三維建模處理,得到頭部軟組織的三維模型。按照正常頭部組織形狀，對鼻缺損處進(jìn)行三維模擬重建處理，得到與面部輪廓匹配的鼻形態(tài)。并與患者進(jìn)一步溝通，了解患者對術(shù)后鼻部輪廓的要求，達(dá)到一致后行鼻再造術(shù)。
[0071]按照三維模擬的鼻部輪廓形態(tài)，三維打印出患者理想的鼻輪廓模型，然后通過立體光刻(Stereolithography, SLA)快速原型的制作,得到缺損鼻部組織的輪廓樹脂模型?？紤]到掃描重建的骨 組織包括了軟組織覆蓋，因此為了重建后輪廓清晰，故本研究采用的SLA模型是將鼻輪廓軟組織數(shù)據(jù)的精確結(jié)構(gòu)增加至1.2倍制作，預(yù)留并彌補(bǔ)了術(shù)后因皮膚覆蓋而造成的局部亞單位精細(xì)程度的下降。將HA (羥基磷灰石)粉末(〈40目)與促凝劑按照4:6的重量比調(diào)和攪拌成液劑后注入樹脂模型取其陰模。高壓消毒后獨(dú)立包裝備用。
[0072]同時，對患者行胸廓三維CT掃描，并進(jìn)行三維重建。利用Minics 10軟件重建出胸廓結(jié)構(gòu)。根據(jù)陰模的大小，于第6、7根肋骨位置，按照陰模的大小計算出需要的骨膜和軟骨膜的面積及預(yù)構(gòu)組織的精確位置。
[0073](2)體內(nèi)組織預(yù)構(gòu)
按照術(shù)前設(shè)計，于第6、7肋骨軟骨交界處正上方逐層切開皮膚、皮下、肌肉層，分別將第6、7肋相應(yīng)陰模大小的肋骨和肋軟骨取出，整個過程仔細(xì)保護(hù)骨膜和軟骨膜的生發(fā)層。展開并連接縫合相鄰的骨膜和軟骨膜，使其鋪平形成一個完整的骨膜和軟骨膜面。將事先準(zhǔn)備好的陰模設(shè)計面面向骨膜和軟骨膜生發(fā)層放置，邊緣縫合固定于骨膜和軟骨膜上，使其與骨膜和軟骨膜形成一個閉合空間，用于骨和軟骨組織再生。將取出的軟骨置于皮下，并放置引流，逐層組織縫合。
[0074](3)再生組織對供區(qū)的修復(fù)與重建
分別在術(shù)后1、3個月對預(yù)構(gòu)組織進(jìn)行影像學(xué)監(jiān)測，待預(yù)構(gòu)組織具有確切的影像學(xué)骨和軟骨組織再生證據(jù)后行二期手術(shù)。術(shù)中沿原切口逐層切開皮膚，將預(yù)置的HA材料小心取出。見預(yù)構(gòu)骨和軟骨組織輪廓精確清晰。帶骨膜和軟骨膜完整取出預(yù)構(gòu)的鼻形骨/軟骨組織(如需要，可同時攜帶血管神經(jīng)束共同取出，供移植)。術(shù)中保證胸膜和腹膜的完整性。還納埋置于皮下的肋骨和肋軟骨。留置引流?？p合肌肉、皮下組織及皮膚層。進(jìn)一步修剪再生骨周圍少量軟組織及多余的骨軟骨預(yù)構(gòu)組織。
[0075]將修剪下的預(yù)構(gòu)骨/軟骨行組織學(xué)及生物力學(xué)檢測:
O組織學(xué)檢測:將少量修剪掉的再生骨和軟骨組織用4%多聚甲醛浸泡固定(ΡΗ=7.0~7.5的PBS配置而成)，4°C保存，每隔12小時更換一次，共3天。PBS沖洗，EDTA(10%)緩慢脫鈣。三天更換脫鈣液一次。待脫鈣完全后，PBS沖洗，酒精梯度脫水。常規(guī)石蠟包埋進(jìn)行組織切片(5 — 10 μ m)。并行HE、VG、快綠-甲苯胺藍(lán)染色、免疫組化OC (骨鈣蛋白)、COL II染色。于光學(xué)顯微鏡下觀察新生成骨細(xì)胞、骨小梁、骨髓腔、軟骨細(xì)胞的形態(tài)。
[0076]結(jié)果顯示:鏡下可見典型的骨小梁骨髓腔及成骨細(xì)胞，髓腔內(nèi)血管豐富。OC免疫組織化學(xué)染色可見典型的骨小梁樣結(jié)構(gòu)；典型的軟骨細(xì)胞及豐富的胞漿結(jié)構(gòu)。COL II染色可見軟骨陷窩結(jié)構(gòu)(圖20)。
[0077]2)生物力學(xué)測定:取預(yù)構(gòu)的殘余骨和軟骨標(biāo)本，-20°C冷凍，測試前于室溫條件下，PBS液浸泡，分別測定骨/軟骨垂直最大壓縮載荷和彈性模量等。并選擇正常肋骨/軟骨作為對照組。
[0078]結(jié)果顯示:預(yù)構(gòu)的骨/軟骨在術(shù)后三個月時具有與正常肋骨及肋軟骨相似的彈性模量(為正常肋軟骨的81.3±6.4%)和最大壓縮載荷(正常肋骨的108.7±5.7 %)。顯示再生組織的彈性模量與正常骨/軟骨之間無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。
[0079](4)鼻缺損畸形重建矯正術(shù)
將預(yù)構(gòu)的鼻形骨/軟骨組織進(jìn)一步修剪后，行二期鼻再造術(shù)。按照術(shù)前設(shè)計的切口，處理預(yù)構(gòu)的鼻部皮膚和襯里，于鼻背部植入預(yù)構(gòu)鼻形骨/軟骨組織。邊緣固定于上頜骨相應(yīng)位置。覆蓋并縫合皮膚，保證鼻背皮膚及鼻內(nèi)襯里組織完全覆蓋預(yù)構(gòu)的鼻型組織。鼻管支撐。包扎固定。術(shù)后7天拆除縫線。分別于術(shù)后第1、3、6和12個月隨訪，行影像學(xué)檢查，觀察骨組織成活及骨融合現(xiàn)象。
[0080]術(shù)后隨訪結(jié)果顯示:CT可見植入的預(yù)構(gòu)骨/軟骨組織成活良好，與上頜骨融合生長。術(shù)后隨訪一年見，預(yù)構(gòu)骨/軟骨組織無明顯吸收。鼻部形態(tài)良好。
[0081] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.利用與缺損/缺失的組織/器官呈陰模形狀的支架，構(gòu)建神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)獲得欲構(gòu)建的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的陰模支架； b)通過手術(shù)于機(jī)體內(nèi)制備一個完整的骨膜和/或軟骨膜面，將步驟a)的陰模支架放置于機(jī)體內(nèi)的骨膜和/或軟骨膜生發(fā)層上，固定縫合陰模支架邊緣，使其形成一個閉合空間； c)閉合步驟b)手術(shù)過程中形成的切口，待所述的骨膜和/或軟骨膜面生發(fā)層側(cè)再生出與陰模支架對應(yīng)的陽模形狀的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官后，完整取出神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)所述的“獲得預(yù)構(gòu)建的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的陰模支架”具體是:利用計算機(jī)輔助設(shè)計或制造技術(shù)，對缺損的組織或器官影像學(xué)掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行三維重建，構(gòu)建缺損部位組織形態(tài)，再根據(jù)重建的數(shù)據(jù)，通過三維打印技術(shù)制作缺損組織陰模。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)中所述的“通過手術(shù)于機(jī)體內(nèi)制備一個完整的骨膜和/或軟骨膜面”具體是:于肋骨和/或軟骨正上方逐層切開皮膚、皮下、肌肉層，并沿肋骨肋軟骨膜中線處切開，小心剝離骨膜和軟骨膜，結(jié)合陰模支架大小取出合適的肋骨和/或軟骨，整個過程仔細(xì)保護(hù)骨膜和/或軟骨膜的生發(fā)層，再連接縫合相鄰骨膜和/或軟骨膜，使其展平形成一個完整的骨膜和/或軟骨膜面。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)中，所述的陰模支架的設(shè)計面面向骨膜和/或軟骨膜生發(fā)層放置。
5.一種再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官，其特征在于，所述的再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官由骨和/或軟骨構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官，其特征在于，所述再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官形狀與陰模支架正好相互補(bǔ)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官，其特征在于，所述的再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官為再生的神經(jīng)血管化的關(guān)節(jié)、顱骨、鼻骨或耳軟骨。
8.權(quán)利要求5-7任一所述再生的神經(jīng)血管化的骨、軟骨、關(guān)節(jié)或體表器官的用途，其特征在于，用于制備修復(fù)缺損或缺失的組織或器官。
【文檔編號】A61L27/50GK103948457SQ201410191569
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】魏皎, 戴傳昌, 李青峰 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院