一種抗hiv中藥的有效部位及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗HIV中藥的有效部位及其制備方法。本發(fā)明的制備方法包括如下步驟：（1）稱取地龍適量，加入無水乙醇，超聲提取，濾液減壓除去乙醇；（2）加入石油醚，超聲溶解后抽濾，濾液中加入水萃取，取上相，減壓除去石油醚；（3）將上述提取物上硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫，收集石油醚-乙酸乙酯比例為20：3的洗脫液，減壓除去石油醚-乙酸乙酯，得抗HIV的中藥有效部位。本發(fā)明制備得到的抗HIV有效部位的CC50值為146.93±4.43μg/ml，CC50值比其抗R5病毒感染活性的IC50值大得多，表明其可在較大濃度范圍內(nèi)對病毒感染產(chǎn)生抑制作用，而不對細(xì)胞造成較大的毒性。
【專利說明】一種抗HIV中藥的有效部位及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抗HIV中藥有效部位的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV) 感染引起的一種嚴(yán)重傳染性疾病。自美國1981年診斷出首例艾滋病病人以來，艾滋病病毒在全球范圍內(nèi)的傳播速度驚人，已有200余個國家和地區(qū)受到艾滋病的嚴(yán)重威脅。艾滋病在全球的迅速蔓延，引起了世界衛(wèi)生組織和各國的高度重視，投入了巨大的人力和財力用于抗HIV新藥及疫苗的研發(fā)。目前已上市的抗HIV的藥物，根據(jù)不同的作用機(jī)制可分為6大類:核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(nucleoside analog reverse transcriptase inhibitors,NR-TIs)、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(non- nucleoside analog reverse transcriptaseinhibitors, NNRT Is)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitors, Pis)、融合抑制劑(fusioninhibitors, FIs)、進(jìn)入抑制劑(entry Inhibitors, Els)和整合酶抑制劑(integraseinhibitors, Hs)。然而，現(xiàn)存的藥物存在著抗耐藥性差和毒副作用大等弊端，所以繼續(xù)開發(fā)高效低毒且具有抗耐藥性的艾滋病藥物是當(dāng)前新藥研發(fā)領(lǐng)域具有挑戰(zhàn)性的重大課題。
[0003]在當(dāng)前 藥物存在弊端和抗艾滋病新藥研發(fā)緩慢的形勢下，人們開始關(guān)注傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，尋找天然抗HIV藥物的研究正在蓬勃展開。到目前為止，已從天然藥物中分離得到了生物堿類、黃酮類、香豆素類、木脂素類、萜類等具有抗HIV活性的化學(xué)成分，這些天然成分具有專屬性強(qiáng)、毒副反應(yīng)少、方便有效等優(yōu)點。因此，從藥用植物與海洋生物等天然藥物中尋找抗HIV活性成分的研究受到越來越多的重視，現(xiàn)已成為抗HIV藥物研究的新趨勢(崔祥龍，等，天然藥物中抗HIV活性成分研究進(jìn)展【J】.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10 (15):2989)ο

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種一種抗HIV中藥有效部位的制備方法。
[0005]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種抗HIV中藥有效部位的制備方法，包括如下步驟:
(1)稱取地龍適量，加入無水乙醇，超聲提取，抽濾，濾液留用，重復(fù)該步驟2~3次，合并濾液，減壓除去乙醇；
(2)在上述提取物中加入石油醚，超聲溶解，靜置后抽濾，在濾液中加入水萃取，取上相，重復(fù)2~3次，減壓除去石油醚；
(3)將上述提取物上硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫，收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液，減壓除去石油醚-乙酸乙酯，得抗HIV的中藥有效部位。
[0006]作為優(yōu)選的，步驟(1)無水乙醇的用量為地龍重量的2~4倍。
[0007]作為優(yōu)選的，步驟(1)超聲提取的條件為:25~30°C，200~300 W超聲提取0.5 ~2h0
[0008]作為優(yōu)選的，步驟(2)在濾液中加入等量的水萃取。
[0009]由上述方法制備得到的抗HIV中藥有效部分。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明制備得到的抗HIV有效部位的CC5tl值為146.93 ±4.43 Pg/ml，其細(xì)胞毒性較小。該抗HIV有效部位的CC5tl值比其抗R5病毒感染活性的IC5tl值大得多，表明其可在較大濃度范圍內(nèi)對病毒感染產(chǎn)生抑制作用，而不對細(xì)胞造成較大的毒性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是本發(fā)明抗HIV有效部位與N36結(jié)合的HPCE電泳圖，其中，A為單獨進(jìn)本發(fā)明有效部位的電泳圖，B為依次進(jìn)本發(fā)明有效部位和N36 (100 μδ/πι1)的電泳圖，C為依次進(jìn)本發(fā)明有效部位和Ν36 (200 Pg/ml)的電泳圖；
圖2是對照藥TF與N36結(jié)合的HPCE電泳圖，其中，D為單獨進(jìn)TF的電泳圖，E為依次進(jìn)TF和N36的電泳圖；
圖3是本發(fā)明抗HIV有效部位與TF抑制HIV六螺旋束核心結(jié)構(gòu)形成的N-PAGE電泳圖，其中，I是C34的電泳結(jié)果，2是N36和C34共孵育后的電泳結(jié)果，3是終濃度為454 μδ/ml的本發(fā)明有效部位與N36和C34共孵育后的電泳結(jié)果，4是終濃度為454 μδ/πι1的TF與Ν36和C34共孵育后的電泳結(jié)果；
圖4是本發(fā)明抗HIV有效部位與TF抑制HIV六螺旋束核心結(jié)構(gòu)形成的N-PAGE電泳圖，其中，I是C34的電泳結(jié)果，2是Ν36和C34共孵育后的電泳結(jié)果，3_5是終濃度分別為227Pg/ml、114 Pg/ml、45 Pg/ml的本發(fā)明有效部位與N36和C34共孵育后的電泳結(jié)果。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0013]實施例1
稱取地龍50g，加入150 ml無水乙醇，靜置30 min，28°C，250 W超聲提取I h，抽濾，濾液留用，藥渣再加125 ml無水乙醇提取兩次，抽濾，合并三次濾液，減壓除去乙醇；在提取物中加入200 ml石油醚，超聲溶解，靜置2 h，抽濾，在濾液中加入等量水萃取，取上相，加入等量的水萃取，取上相，減壓除去石油醚；提取物上硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫(混合液梯度為20:1，20:2，20:3 ；20:4……)，收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液，減壓除去石油醚-乙酸乙酯，得抗HIV的中藥有效部位。
[0014]實施例2
稱取地龍50g，加入200 ml無水乙醇，靜置30 min,30°C,300 W超聲提取1.5 h，抽濾，濾液留用，藥渣再加100 ml無水乙醇提取兩次，抽濾，合并三次濾液，減壓除去乙醇；在提取物中加入200 ml石油醚，超聲溶解，靜置2 h，抽濾，在濾液中加入等量水萃取，取上相，加入等量的水萃取，取上相，減壓除去石油醚；提取物上硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫(混合液梯度為20:1,20:2,20:3 ；20:4……)，收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液，減壓除 去石油醚-乙酸乙酯，得抗HIV的中藥有效部位。
[0015]實施例3稱取地龍50g，加入100 ml無水乙醇，靜置30 min，25°C，200 W超聲提取I h，抽濾，濾液留用，藥渣再加150 ml無水乙醇提取三次，抽濾，合并四次濾液，減壓除去乙醇；在提取物中加入200 ml石油醚，超聲溶解，靜置2 h，抽濾，在濾液中加入等量水萃取，取上相，加入等量的水萃取，取上相，減壓除去石油醚；提取物上硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫(混合液梯度為20:1,20:2,20:3 ；20:4……)，收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液，減壓除去石油醚-乙酸乙酯，得抗HIV的中藥有效部位。
[0016]本發(fā)明制備得到的抗HIV有效部分作用于HIVgp41六螺旋束核心結(jié)構(gòu)，為了證明其所具有的技術(shù)效果，我們采用實施例1制備得到的抗HIV有效部位進(jìn)行了以下實驗:
一、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)柱端微反應(yīng)器對本發(fā)明有效部位與N36結(jié)合的檢測。
[0017]1.實驗方法
I)配制磷酸鹽緩沖液(PBS)，其組成為:30 mM NaH2PO4-Na2HPO4, pH 7.2。
[0018]2)實施例1抗HIV有效部位用無水乙醇配成濃度為1000 μδ/πι1的溶液；茶黃素(TF)用PBS配成濃度為1000 μδ/πι1的溶液；Ν36用PBS配成濃度為100 μδ/πι1的溶液。
[0019]3)以PBS為緩沖液，電壓為17 kV，重力進(jìn)樣，本發(fā)明有效部位及TF樣品進(jìn)樣時間為10秒，N36溶液的進(jìn)樣時間為3分鐘，用HW-2000色譜工作站進(jìn)行譜圖采集。首先分別獲得本發(fā)明有效部位、TF和N36單獨進(jìn)樣時的譜圖，然后再獲得依次進(jìn)本發(fā)明有效部位和N36的譜圖以及依次進(jìn)TF和N36的譜圖。
[0020]2.實驗結(jié)果
本發(fā)明抗HIV有效部位與N36結(jié)合的效果如圖1和圖2的HPCE電泳圖所示，從圖中可以看出，在進(jìn)了 N36的譜圖中，本發(fā)明有效部位和TF的峰高明顯降低，峰形發(fā)生了變化，可見，N36與樣品在毛細(xì)管電泳過程中發(fā)生了結(jié)合；比較圖1B和圖1C，增大N36的濃度可使本發(fā)明有效部位的峰高降低更顯著，可見，本發(fā)明有效部位與N36的結(jié)合呈劑量依賴性。
[0021]二、天然凝膠電泳(N-PAGE)法對本發(fā)明有效部位抑制HIVgp41六股螺旋束結(jié)構(gòu)形成活性的檢測。
[0022]1.實驗方法
O配制不連續(xù)天然聚丙烯酰胺凝膠，其中分離膠為18%，積層膠為5%。
[0023]2)將有效部位10 μL與400 μδ/πι1的Ν36 6 μL在37°C共同孵育30分鐘，再加入400 μδ/πι1的C34 6 μL在37°C共同孵育30分鐘。
[0024]3)將孵育好的混合液與8 μL 2 X Tris-甘氨酸天然凝膠上樣緩沖液混勻，加樣到10X0.1 cm的天然聚丙烯酰胺凝膠孔中(每孔25 μL)，靜置5分鐘。室溫120 V電壓電泳2小時，考馬斯藍(lán)R250染色，脫色后用佳能400D相機(jī)拍照記錄。
[0025]2.實驗分組
本發(fā)明實驗組:稱取實施例1抗HIV有效部位適量，用DMSO溶解，用PBS配成濃度為1000 M-g/ml> 500 M-g/ml>250 M-g/ml 和 100 M-g/ml 的溶液。
[0026]TF對照組:茶黃素(TF)用水溶解，用PBS配成濃度為1000 μδ/πι1的溶液。
[0027] 3.實驗結(jié)果
本發(fā)明有效部位對HIVgp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的抑制效果如圖3和圖4的N-PAGE電泳圖所示，從圖中可以看出，在未加藥物作用的的空白對照樣品中，N36和C34混合物形成兩條帶，箭頭A所指的是gp41六螺旋束的條帶，箭頭B所指的是過量的C34的條帶，其形成是因為N36發(fā)生了部分聚集而不能充分與C34結(jié)合形成六螺旋束，導(dǎo)致C34過剩；加入本發(fā)明有效部位或TF的樣品中，六螺旋束結(jié)構(gòu)的條帶消失或僅可見很淺的條帶，說明六螺旋束結(jié)構(gòu)的形成明顯受到了抑制。本發(fā)明有效部位在終濃度為227 μδ/πι1時幾乎能完全抑制六螺旋束結(jié)構(gòu)的形成，在濃度為114 μδ/πι1時能抑制大部分六螺旋束結(jié)構(gòu)的形成，在濃度為45 μδ/πι1時能抑制部分六螺旋束結(jié)構(gòu)的形成，其抑制程度隨劑量的遞增而增加。本實驗證明本發(fā)明有效部位能夠抑制HIVgp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成。由此可見，本發(fā)明抗HIV有效部位具有抗HIV活性。
[0028]三、本發(fā)明有效部位抗HIV-1jkfl假病毒感染活性的檢測
1、化合物抗R5病毒感染活性的檢測 (O實驗方法
按I X IO4/孔細(xì)胞濃度接種TZMb-1細(xì)胞100 μ I，次日細(xì)胞生長狀態(tài)良好后，加入化合物(50 μ I)與R5病毒(50 μ I)于37 °C預(yù)孵育30 min得到的混合物，感染過夜，更換新鮮培養(yǎng)基。48小時后，用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測化學(xué)發(fā)光。
[0029]抑制率的計算公式為:抑制率=(I 一加藥孔OD值/對照孔OD值)X 100%,半數(shù)有效濃度(IC5tl)采用CalcuSyn軟件計算。
[0030]2)實驗結(jié)果
本發(fā)明有效部位的IC5tl值為32.14±1.16 Pg/ml，小于陽性對照藥T-20的IC5tl值(見表1和表2)，說明本發(fā)明有效部位具有抗R5病毒感染的活性。
[0031]表1
【權(quán)利要求】
1.一種抗HIV中藥有效部位的制備方法，包括如下步驟: (1)稱取地龍適量，加入無水乙醇，超聲提取，抽濾，濾液留用，重復(fù)該步驟2~3次，合并濾液，減壓除去乙醇； (2)在上述提取物中加入石油醚，超聲溶解，靜置后抽濾，在濾液中加入水萃取，取上相，重復(fù)2~3次，減壓除去石油醚； (3)將上述提取物上硅膠柱，以石油醚-乙酸乙酯混合液梯度洗脫，收集石油醚-乙酸乙酯比例為20:3的洗脫液，減壓除去石油醚-乙酸乙酯，得抗HIV的中藥有效部位。
2.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)無水乙醇的用量為地龍重量的2~4倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)超聲提取的條件為:25~30 0C，200~300 W超聲提取0.5~2h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)在濾液中加入等量的水萃取。
5.一種抗HIV中藥有效部分，其特征在于，其是由權(quán)利要求1~4任一項的方法制備得到。
【文檔編號】A61K35/56GK103948631SQ201410166156
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】劉利紅, 徐小英, 李琳, 張萱萱 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)