利用超聲處理使絲纖蛋白凝膠化的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種通過超聲處理快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。在適當?shù)臈l件下，在超聲處理之后兩個小時內(nèi)控制凝膠化發(fā)生?？蓪ɑ罴毎趦?nèi)的生物材料或治療劑包封于本方法所制備的水凝膠中，并用作遞送載體。
【專利說明】利用超聲處理使絲纖蛋白凝膠化的方法
[0001]本申請是申請日為2008年5月29日、發(fā)明名稱為“利用超聲處理使絲纖蛋白凝膠化的方法”的申請?zhí)枮?00880100926.0的專利申請的分案申請。
[0002]本發(fā)明是在美國國立健康研究院(National Institutes ofHealth)資助的組織工程研究中心基金號為P41EB002520的聯(lián)邦政府的支持下完成的。美國政府對本發(fā)明享有一定的權利。
[0003]相關申請
[0004]本發(fā)明涉及2007年5月29日遞交的標題為“Method for Silk Fibroin GelationUsing Sonication”的美國臨時專利申請60/940，554，并要求其優(yōu)先權，將其并入本文作為參考。
【技術領域】
[0005]本發(fā)明提供了通過超聲處理快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。由本方法形成的水凝膠是有用的，例如用作生物遞送載體(biodelivery vehicles)。
【背景技術】
[0006]生物相容且可生物 降解的聚合物水凝膠是遞送用于例如在組織工程和受控藥物釋放中的生物醫(yī)學應用的生物活性分子和細胞的有用載體。純化的天然絲纖蛋白從水溶液中形成富含β_折疊的交聯(lián)水凝膠結構，其方法的細節(jié)和凝膠特性受環(huán)境參數(shù)的影響。對于天然絲纖蛋白水溶液而言，上述的膠凝時間經(jīng)常需要幾天到幾周，高溫和低PH是造成凝膠化動力學增進的原因。那些條件雖然適于結合某些生物活性分子，但對于活化細胞和不穩(wěn)定的生物活性分子的結合可能過于緩慢。
[0007]因此，在現(xiàn)有技術中需要一種在溫和的生理條件下快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及一種快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。本方法將絲纖蛋白進行處理，所述處理包括超聲處理足夠長的一段時間以起始凝膠化。例如在特定條件下，凝膠化發(fā)生在超聲處理的24小時內(nèi)。
[0009]本發(fā)明的實施方式還涉及一種控制絲纖蛋白膠凝時間的方法，所述方法通過將絲纖蛋白溶液進行超聲處理足夠長的一段時間以起始凝膠化。在一個實施例中，所述膠凝時間少于兩個小時。
[0010]另一個實施方式涉及一種在絲纖蛋白中包封藥劑的方法。所述方法包括:將絲纖蛋白溶液進行超聲處理足夠長的一段時間以起始凝膠化，并在所述絲纖蛋白溶液中發(fā)生實質(zhì)上的凝膠化之前，將所述藥劑引入所述絲纖蛋白溶液，從而形成絲纖蛋白包封的藥劑。或者，可在超聲處理之前，將藥劑加入絲纖蛋白中。所述藥劑可為治療劑(例如藥物)或生物材料(例如細胞)。例如，在超聲處理之后，將源自人骨髓的間充質(zhì)干細胞(hMSC)成功地結合到絲纖蛋白水凝膠中，隨后快速凝膠化并保持細胞功能。
[0011]由本發(fā)明方法產(chǎn)生的水凝膠顯示了良好的機械性能和蛋白水解降解表現(xiàn)。例如，超聲處理4%、8%和12% (w/v)的絲纖蛋白溶液，隨后加入hMSC，在0.5小時到2小時內(nèi)發(fā)生凝膠化。所述細胞在4%的凝膠中生長并增殖超過二十一天。另外，可使用低濃度的K+和低PH來促進凝膠化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1描述了在各種超聲處理條件下的絲纖蛋白(SF)凝膠化。使用0.5ml水溶液，以20%振幅進行超聲處理，并且將超聲處理時間由5秒變化到30秒。數(shù)值是每組至少N=3個樣品的平均值土標準偏差。*各組之間具有顯著性差異(Student t-檢驗，p〈0.01)。
[0013]圖2A-2C描述了在凝膠化過程中，絲折疊結構的動力學形成。圖2Α顯示在超聲處理120分鐘之后,對超聲處理后的2% (w/v)絲纖蛋白水溶液每8分鐘進行波長掃描來進行圓二色性(⑶)測定。圖2B顯示在217nm處(β-折疊結構的峰值)記錄的橢圓率隨時間增加的圖。圖2C是絲凝膠化機理的示意圖。凝膠化過程包含兩個動力學步驟:(a)在短時間內(nèi)，結構由無規(guī)卷曲變?yōu)榫哂幸恍╂滈g物理交聯(lián)的折疊；(b) β-折疊結構延伸，形成大量的鏈間β -折疊交聯(lián)連接，然后在相對長時間內(nèi)，分子組織成凝膠網(wǎng)狀物。
[0014]圖3A-3C顯示鹽和pH對絲纖蛋白凝膠化的影響。在超聲處理之前，將K+(圖3Α)和Ca2+(圖3B)補充到各種濃度的溶液中至最終濃度20mM至200mM。圖3C顯示在超聲處理之前調(diào)節(jié)絲纖蛋白水溶液PH的效果。將所有樣品以20%振幅進行超聲處理15秒。數(shù)值為每組至少N=3個樣品的平均值土標準偏差。*，?在各組之間存在顯著性差異(Studentt-檢驗，p<0.05)。
[0015]圖4A-4C顯示對絲纖蛋白水凝膠機械性能進行分析的圖表。圖4A描述了在30Amp、40Amp或50Amp的條件下，在4%、8%和12%的不同濃度時(X軸)，絲纖蛋白凝膠的屈服強度(kPa) (Y軸)。圖4B描述了在30Amp、40Amp或50Amp的條件下，在4%、8%和12%的不同濃度時(X軸)，絲纖蛋白凝膠的傳統(tǒng)彈性模量(砂幻(￥軸)。圖4C描述了在4%、8%和12%的不同濃度時(X軸)，絲纖蛋白凝膠的平衡模量(kPa) (Y軸)。
[0016]圖5描述了絲纖蛋白水凝膠的酶促降解。通過超聲處理制備4%、8%以及12% (w/V)的水凝膠，并且浸于pH7.4的PBS (對照)或蛋白酶XIV的PBS溶液(5U/ml)中七天。通過在每個時間點上將凝膠塊的濕重與原來的濕重進行比較來確定剩余量。數(shù)值為至少N=4個樣品的平均值土標準偏差。
[0017]圖6用圖形描述包封在絲纖蛋白水凝膠中的hMSC的DNA定量結果。用PicoGreen試驗分析每個凝膠組中的DNA含量，而用每個凝膠塊的濕重來使結果歸一化。數(shù)值為至少N=4個樣品的平均值土標準偏差。*在各組之間存在顯著性差異(Student t_檢驗，ρ〈0.05)。
【具體實施方式】
[0018]應當理解本發(fā)明并不局限于本文所描述的特定的工藝、方案和試劑等，并且上述這些都可以改變。本文所使用的術語其目的僅僅在于描述特定的實施方式，并不意味著對本發(fā)明范圍的限定，而本發(fā)明的范圍僅僅通過權利要求書進行限定。[0019]在本文及權利要求書中所用的單數(shù)形式也包含復數(shù)的含義，反之亦然，除非文中另行明確指出。除了在操作實施例中或另外指出的情況以外，本文用以表示組分或反應條件的量的所有數(shù)值在一切情況下都應理解為由術語“大約”所限定。
[0020]出于描述和公開的目的，在此以引用的方式清楚地將本發(fā)明指明的所有專利和其他出版物并入，例如，在此類出版物中描述的、可用于本發(fā)明的方法學。提供此類出版物僅僅是因為它們的公開早于本申請的申請日。在這點上，不應將任何事物視為發(fā)明人無權根據(jù)在先發(fā)明或因任何其他原因使本發(fā)明的內(nèi)容早于這些公開內(nèi)容的認定。所有關于日期的陳述或關于此類文件內(nèi)容的表達均基于 申請人:可得的信息，不構成對此類文件的日期或內(nèi)容的正確性的任何認定。
[0021]除非另有定義，本文所用的所有技術術語和科學術語與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同。雖然在本發(fā)明的實際操作或測試中可使用任何已知的方法、裝置和原料，但是在這方面本文仍對所述方法、裝置和原料進行了描述。
[0022]本發(fā)明涉及一種快速形成絲纖蛋白凝膠化的方法。本方法對絲纖蛋白進行處理的方式包括超聲處理足夠長的一段時間以起始凝膠化。本方法提供了基于超聲處理的、以暫時可控的方式加速溶膠-凝膠轉換的方法。根據(jù)使用的超聲處理參數(shù)(能量輸出、持續(xù)時間等)和生理學相應條件下的絲纖蛋白濃度，可以將膠凝時間控制在幾分鐘到幾小時的范圍。在超聲處理之后，對應于凝膠化，絲纖蛋白經(jīng)歷了由無規(guī)卷曲到β_折疊的快速結構變化?？梢栽诔曁幚碇啊⑵陂g或之后加入藥劑例如治療劑或生物制劑，并且在凝膠化時進行包封。因此本發(fā)明提供了用于各種生物醫(yī)學應用的方法，例如細胞的包封對時間敏感的那些應用。
[0023] 由于水凝膠具有通常大于30%的高水含量(Park&Lakes，BIOMATS:INTR0.(第2版)，Plenum出版社，紐約，1992年)，其被認為是細胞和生物活性分子包封和遞送的有用支架(scaffolds)，例如用于組織工程和細胞治療應用。用于此類應用的水凝膠具有與某些組織和細胞外基質(zhì)(ECM)相似的機械性能和結構性質(zhì)，因此可將其植入用于組織修復或治療因子的局部釋放。為了包封和遞送細胞，優(yōu)選所形成水凝膠應具有下列性質(zhì):不破壞細胞、對于細胞和周邊組織無毒、具有生物相容性、具有適當?shù)奈镔|(zhì)運送能力以允許營養(yǎng)素和代謝物的擴散、具有充分的機械完整性和強度以承受與植入相關的操作、具有可控制的使用期限、并且應當根據(jù)應用情況在植入之后的合理時間內(nèi)保持凝膠的體積(Drury&Mooney，24Biomats.4337-51 (2003))。
[0024]已經(jīng)將各種合成材料，例如聚環(huán)氧乙烷(PEO)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸(PAA)、聚富馬酸丙二醇酯-乙二醇共聚物(P(PF-co-EG))以及天然來源的材料，例如瓊脂糖、藻酸鹽/酯、殼聚糖、膠原、纖維蛋白、明膠和透明質(zhì)酸(HA)用于形成水凝膠。當聚合物鏈由化學試劑(例如交聯(lián)劑)或物理刺激(例如PH和/或溫度)引發(fā)，以化學方式或物理方式交聯(lián)成網(wǎng)狀物時，貝1J發(fā)生凝膠化。通過利用特定的分子量、嵌段結構(block structure)和交聯(lián)模式，由合成的聚合物形成的水凝膠提供了可控且可重現(xiàn)的凝膠化作用和凝膠性質(zhì)的有利效果。天然來源的聚合物由于其大分子特性更接近于細胞外基質(zhì)并且降解產(chǎn)物無毒，因而傾向于將這些聚合物作為細胞和生物活性分子的載體用于組織工程和植入式醫(yī)療器械(Lee等人，221，Int，I J.Pharma.1-22(2001) ;Smidsr0d等人，8Trends Biotech.71-78 (1990))，但通常這些聚合物的凝膠化可控性較低。[0025]在天然來源的生物材料中，已經(jīng)對天然蠶纖維中的白組裝結構蛋白——絲纖蛋白進行了研究，這是由于其具有優(yōu)良的機械性能、生物相容性、可控的降解速度并且可導致結晶β-折疊結構網(wǎng)狀物的形成(Altman等人,24Biomats.401-16 (2003)；Jin&Kaplan,424Nature1057-61 (2003) ；Horan 等人，26Biomats.3385-93 (2005) ；Kim 等人，26Biomats.2775-85 (2005) ;Ishida 等人，23Macromolecules88_94 (1990) ；Nazarov 等人，5Biomacromolecules718-26 (2004))。已經(jīng)將絲纖蛋白制成各種用于組織工程和藥物控制釋放應用的材料形式，包括薄膜、三維多孔支架、靜電紡絲纖維和微球體(Jin等人，5Biomacromolecules711-7 (2004) ； Jin 等人，3Biomacro-molecules，1233-39 (2002) ；Hino等人，266J.Colloid Interface Sc1.68-73 (2003) ；ffang 等人，117J.Control Release,360-70(2007))。同時參見美國專利申請序列號11/020,650 ;序列號10/541，182 ;序列號11/407，373 ;以及序列號 11/664，234 ；PCT/US07/020789 ;PCT/US08/55072。
[0026]在自然界中，絲纖蛋白水溶液產(chǎn)生于蠶的腺體后部并儲存在中部直至濃度為30%(w/v)，絲纖蛋白水溶液包含高含量的無規(guī)卷曲或α-螺旋結構。在纖維進入空氣中紡絲時，高剪切力和拉伸流動誘導了自組裝和向β_折疊結構的結構轉變，實現(xiàn)固體纖維的形成(Vollrath&Knight, 410Nature, 541-48 (2001))。在腺體的不同部位中存在的金屬離子和pH 的改變影響了這種轉變(Chen 等人,3Biomacromolecules644_8 (2002) ；Zhou 等人，109J.Phys.Chem.B16937-45(2005) ；Dicko 等人，5Biomacromolecules704-10(2004) ；Terry 等人，5Biomacromolecules768-72 (2004))。在體外，純化的絲纖蛋白水溶液經(jīng)過自組裝形成β -折疊結構并形成水凝膠。該溶膠-凝膠轉換受到溫度、pH和離子強度的影響(Wang等人，36Int，I J.Biol.Macromol.66-70 (2005) ；Kim 等人，5Biomacromolecules786-92 (2004)；Matsumoto 等人，110J.Phys.Chem.B21630-38 (2006))。絲水凝膠(silk hydrogel)的壓縮強度和壓縮模量隨著絲纖蛋白濃度和溫度的增加而增加(Kim等人，2004)。
[0027]絲纖蛋白水凝膠在許多生物醫(yī)學應用方面令人關注。例如，絲纖蛋白水凝膠被用作骨填充生物材料來治 愈兔股骨遠端臨界尺寸的多孔缺損，其中絲凝膠(silk gel)顯示出比聚(D，L-丙交酯-乙交酯)對照材料具有更好的骨骼治愈效果(Fini等人，26Biomats.3527-36(2005))。
[0028]就許多基于細胞的應用而言，必須在相對短的時間內(nèi)(幾小時內(nèi))在溫和條件下誘導凝膠化。但是，除非在對天然絲纖蛋白沒有化學修飾的情況下考慮非生理學處理(例如低pH、高溫、添加劑)，否則膠凝時間可能會過長。對于從0.6%到15% (w/v)的絲纖蛋白濃度而言，在室溫或37°C下，溶膠-凝膠轉換需要幾天到幾周(Kim等人，2004;Matsumoto等人,2006 ；Fini等人,2005)。將鹽加到生理學水平以上并不會明顯改變凝膠化動力學(Kim等人，2004)。較低pH(pH〈5)或提高溫度(>60°C )可以將膠凝時間減少到幾個小時(Kim 等人，2004 ；Fini 等人，2005 ；Motta 等人，15J.Biomater.Sc1.Polymer.Edu.851-64(2004))，但是這些條件可能會潛在地改變細胞功能并影響細胞生存能力。
[0029]在本發(fā)明中，通過超聲處理實現(xiàn)了用來加速過程并控制絲纖蛋白凝膠化的新方法。更具體地說，本發(fā)明提出了一種基于超聲處理的、以暫時可控的方式來加速溶膠-凝膠轉換的新方法。該方法以機械方式通過絲纖蛋白鏈的疏水水合作用的改變誘導β_折疊的物理交聯(lián)。這容許在超聲處理之后添加細胞，繼之以快速凝膠化。可根據(jù)使用的超聲處理參數(shù)(能量輸出和持續(xù)時間)以及絲纖蛋白濃度，將膠凝時間控制為幾分鐘到幾小時。本方法進一步提供了:控制PH和鹽濃度對凝膠化的影響；在凝膠化之后絲狀結構的動力學變化以及包封細胞(例如源自人骨髓的間充質(zhì)干細胞(hMSC))在絲凝膠中的行為。
[0030]可根據(jù)本發(fā)明使用任何種類的絲纖蛋白。由蠶(例如家蠶(Bombyx mori))產(chǎn)生的絲纖蛋白是最普遍的，并表現(xiàn)為環(huán)保的、可更新的來源。有機的蠶繭可在市面上購得。然而，存在許多可替代使用的不同的絲，包括蜘蛛絲、轉基因絲、遺傳工程絲及其變體。利用本領域已知的技術可由蠶繭制備絲纖蛋白水溶液。在例如美國專利申請序列號11/247,358 ；W0/2005/012606以及PCT/US07/83605中公開了制備絲纖蛋白溶液的適當方法。例如，可通過從家蠶(B.mori)的繭中提取絲膠來獲得在絲生物聚合物中使用的絲。
[0031]實質(zhì)上的凝膠化通常發(fā)生在超聲處理之后二十四小時之內(nèi)。例如，在超聲處理之后不足四小時(例如在超聲處理之后兩小時之內(nèi))形成絲纖蛋白凝膠。在特定的實施方式中，絲纖蛋白在超聲處理之后大約五分鐘到大約兩個小時的時間范圍內(nèi)發(fā)生凝膠化。因此，根據(jù)需要，基于溶液制備中使用的超聲處理，膠凝時間可從幾分鐘到幾小時。
[0032]超聲處理在本領域是已知的。就本申請的目的而言，術語“超聲處理(ultrasonication) ”和“超聲(sonication) ”可交換使用，并具有相同的含義?？梢园凑毡绢I域已知的對絲纖蛋白進行超聲處理的任何方式進行超聲處理。所述超聲處理可包括將絲纖蛋白進行超聲處理一次，或可包括多次分別處理。已經(jīng)在蛋白結構變化的范圍內(nèi)研究了超聲處理(Meinel 等人，71 J.Biomed.Mater.Res.A25-34(2004) ;Meinel 等人，88Biotechnol.Bioeng.379-91 (2004))并已經(jīng)用于產(chǎn)生大的液-氣界面、局部熱效應、機械應力/剪切應力以及自 由基反應。相比之下，在關于肽凝膠化的其它研究中，通過超聲處理將凝膠中已組裝的肽納米纖維碎裂成更小的片段(Hung等人，32Ann.Biomed.Eng.35-49 (2004))。在聚合物溶膠-凝膠轉換方面，一般使用超聲處理打碎凝膠網(wǎng)狀物并重新溶解水凝膠。本發(fā)明提供了將超聲處理用于誘導絲的溶膠-凝膠轉換的新用途。
[0033]所述超聲處理持續(xù)的時間應足以起始凝膠化過程，但是為了兼顧水凝膠的機械性能又不應持續(xù)太長時間。根據(jù)使用絲纖蛋白的量、溶液的濃度以及本領域普通技術人員已知的其它因素，所述超聲處理一般可持續(xù)大約5秒到大約60秒。例如，所述超聲處理持續(xù)大約15秒到大約45秒。凝膠化一般從超聲處理起始開始，并在處理結束之后繼續(xù)進行。
[0034]所述超聲處理可包括有助于凝膠化過程的其它處理。例如，所述處理可包括鹽溶液。本領域已知鹽溶液可有助于誘導凝膠化。可使用包含鉀、鈣、鈉、鎂、銅和/或鋅離子的代表性鹽溶液。在這方面，鉀在鹽溶液中較為有利。
[0035]所述處理還可包括調(diào)節(jié)絲纖蛋白水溶液的pH。如本領域已知的那樣，調(diào)節(jié)水溶液的PH可有助于誘導膠凝化。調(diào)節(jié)pH至更高或更低可以起效。因此，例如，可使用具有大約PH4或更低，或者大約pH7.5或更高的水溶液。
[0036]特別地，利用低濃度和低pH的鉀鹽溶液常常是有效的。特定的實施方式是利用鹽濃度小于IOOmM并且該溶液pH約為4或更低的鉀鹽。
[0037]本發(fā)明還提供了一種控制絲纖蛋白膠凝時間的方法，所述方法在使凝膠化發(fā)生于約兩小時內(nèi)的條件下，通過將絲纖蛋白溶液進行超聲處理足夠長的一段時間以起始凝膠化。超聲處理過程引起絲纖蛋白鏈之間的相互作用。特定的實施方式提供了一種控制膠凝時間的方法，以使絲纖蛋白在超聲處理之后在大約五分鐘到大約兩個小時的時間范圍內(nèi)經(jīng)歷凝膠化。[0038]另外，各種其它因素可用于控制膠凝時間。例如，可通過超聲處理的振幅和絲纖蛋白溶液的濃度控制膠凝時間。例如，振幅的范圍為從大約25%到大約35%功率輸出(通常為7瓦特到10瓦特)，而絲纖蛋白濃度的范圍為從大約10%到大約15% (w/v) 0在另一個實施方式中，振幅的范圍為從大約25%到大約55%功率輸出(通常為7瓦特到21瓦特)，而絲纖蛋白濃度的范圍為從大約5%到大約10% (w/v) 0本領域的普通技術人員根據(jù)本申請有能力改變超聲處理的振幅和絲纖蛋白溶液的濃度來獲得希望的凝膠化水平和希望的發(fā)生凝膠化的時間范圍。
[0039]還可通過加入鹽溶液和調(diào)節(jié)絲纖蛋白溶液的濃度以及鹽溶液的濃度來控制膠凝時間。所述鹽溶液可包含鉀離子，但也可使用其它鹽溶液。在特定的實施方式中，所述絲纖蛋白的濃度為4% (w/v)或更低，而所述鉀鹽溶液的濃度范圍為20mM到100mM。
[0040]另外，可通過調(diào)節(jié)鹽溶液的濃度和pH來控制膠凝時間，特別是當鹽溶液包含鉀離子時更是如此。在特定的實施方式中，所述鹽溶液為PH大約為4或更低的鉀鹽溶液。例如，所述鉀鹽溶液具有20mM到IOOmM的濃度。
[0041]本發(fā)明還涉及一種在絲纖蛋白中包封至少一種藥劑的方法。所述方法包括:(a)將絲纖蛋白溶液進行超聲處理一段時間以起始凝膠化；以及(b)在所述絲纖蛋白溶液中發(fā)生實質(zhì)上的凝膠化之前，將所述藥劑引入所述絲纖蛋白溶液，從而形成絲纖蛋白包封的藥劑?？稍诔曁幚碇?、期間或之后將藥劑引入絲纖蛋白溶液。
[0042]所述藥劑可表示能被包封進絲纖蛋白凝膠的任何物質(zhì)。例如，所述藥劑可為治療劑，例如小分子和藥物；或生物材料，例如細胞(包括干細胞)、蛋白、肽、核酸(DNA、RNA、siRNA)、肽核酸(PNA)、適配子、抗體、激素、生長因子、細胞因子或酶。因為包封產(chǎn)物可用于生物醫(yī)學用途，所以人們 希望對治療劑或生物材料進行包封。
[0043]如果治療劑被包封，由于超聲處理對于大多數(shù)治療劑不會產(chǎn)生不利影響，可在超聲處理之前、期間或之后將治療劑引入絲纖蛋白溶液。另一方面，如果生物材料被包封，由于超聲處理可對所述生物材料產(chǎn)生不利影響，通常直到超聲處理后才將其引入絲纖蛋白溶液。這并非對于所有生物材料都是必需的，但已知超聲處理可損害或破壞活細胞，所以應加
以注意。
[0044]在超聲處理之后引入藥劑的情況下，可調(diào)節(jié)超聲處理的條件以使凝膠化在超聲處理之后一段時間發(fā)生。如果在超聲處理期間或其后立即發(fā)生凝膠化，則用來將藥劑引入絲纖蛋白溶液的時間可能會不足。例如，在超聲處理之后引入藥劑的情況下，在超聲處理之后大約五分鐘到大約兩個小時的時間范圍內(nèi)，使所述絲纖蛋白經(jīng)歷凝膠化。
[0045]如果在超聲處理之前或期間引入藥劑，則可以在超聲處理期間、其后立即或超聲處理后一段時間發(fā)生凝膠化。所以，當在超聲處理之前或期間引入藥劑時，可使絲纖蛋白在超聲處理之后大約兩個小時內(nèi)經(jīng)歷凝膠化。
[0046]當將治療劑或生物材料引入絲纖蛋白時，還可隨所述藥劑加入本領域已知的其它材料。例如，可能希望加入的材料具有下列作用:促進藥劑的生長(就生物材料而言)；在藥劑從包封中釋放之后，促進藥劑的功能；或增加藥劑在包封期間存活或保持其功效的能力。促進細胞生長的已知材料包括細胞生長培養(yǎng)基，例如Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS);非必需氨基酸和抗生素；以及生長因子和形態(tài)發(fā)生因子，例如成纖維細胞生長因子(FGF)、轉化生長因子(TGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、骨形態(tài)發(fā)生生長因子(BMP)、神經(jīng)生長因子，并且可以使用相關蛋白。用于通過凝膠遞送的另外的選擇包括:DNA、siRNA、反義、質(zhì)粒、脂質(zhì)體和用于遞送遺傳物質(zhì)的相關體系；激活細胞信號級聯(lián)的肽和蛋白；促進來自細胞的礦化作用或相關事件的肽和蛋白；用于改進凝膠-組織界面的粘附肽和蛋白；抗菌肽；以及蛋白及相關化合物。
[0047]絲纖蛋白包封的治療劑或生物材料適合于生物遞送裝置。使用絲纖蛋白作為生物遞送裝置的技術見于例如美國專利申請序列號N0.10/541，182 ；N0.11/628,930 ；N0.11/664，234 ；N0.11/407，373 ；PCT/US207/020789 ;PCT/US08/55072。
[0048]絲纖蛋白水凝膠結構使生物遞送載體能夠進行可控釋放?？煽蒯尫乓钥蒯寗恿W使得劑量的給予隨時間變化。在某些情況下，持續(xù)(例如超過幾個星期)將治療劑或生物材料遞送到需要處理的部位。隨著時間的可控釋放(例如超過幾天或幾星期或更久)容許治療劑或生物材料持續(xù)遞送來獲得更好的治療?？煽剡f送載體是有利的，因為其保護了治療劑或生物材料在體液和組織中在體內(nèi)不被例如蛋白酶降解。
[0049]進一步關于利用超聲處理誘導絲凝膠形成的方法，按下文描述的方式超聲處理
0.5mL的1%、2%、6%和20% (w/v)的絲纖蛋白水溶液樣品。當功率輸出保持恒定(20%振幅)時，絲纖蛋白膠凝時間隨超聲處理時間增加而縮短(圖1)。對于絲濃度從1%到6%(w/v)的每次增加，膠凝時間顯著縮短(在圖1的*樣品之間，ρ〈0.01)。20% (w/v)的樣品與6% (w/v)的樣品相比具有類似甚至更長的膠凝時間(圖1)。20%樣品的這一結果很可能是由于溶液具有高粘性因而在該溶液中超聲波不能有效地傳播。當使用高于30%振幅的功率輸出時，超聲處理產(chǎn)生稠密的泡沫，絲纖蛋白不能以均相方式膠凝。
[0050]當超聲處理的體積增加到5ml時，即使在高達55%振幅的功率水平上也觀察不到該泡沫。然而，當在體積超過5ml的情況下，對高濃度進行超聲處理時，會發(fā)生非均相凝膠化。將小體積的絲溶液(silk solution)(未經(jīng)高壓滅菌)用于超聲處理的優(yōu)化和膠凝的性質(zhì)表征(pH、鹽效應和圓二色性測定)，而將高壓滅菌的絲溶液用于機械性、降解和細胞包封的研究。有趣的是，與原始溶液相比，高壓滅菌并未顯著地改變所使用的超聲處理參數(shù)和相關的膠凝時間，表明絲纖蛋白保持了其原始溶液狀態(tài)結構的重要特征，并在高壓滅菌之后保持了在形成膠凝中將結構轉變?yōu)棣耞折疊狀態(tài)的能力?？蛇M一步研究由于高壓滅菌處理產(chǎn)生的結構變化，而這方面的研究為藥劑大規(guī)模制備提供了便利。
[0051]在絲纖蛋白凝膠化期間，通過在圓二色性測定中觀察到的變化，將溶膠-凝膠轉換與β_折疊形成的增加聯(lián)系起來(圖2Α)?；跈E圓率在217nm處的增加(圖2B)，觀察到在超聲處理之后β_折疊結構的迅速形成，隨后更為緩慢轉換。在該轉換點上發(fā)生了絲纖蛋白凝膠化，而β_折疊結構起初的迅速形成則減慢。該轉換與以前進行的研究(Matsumoto等人,2006) —致,表明可涉及相類似的機理。β -折疊結構的形成源于改變的疏水相互作用及隨后的物理交聯(lián)。該起始步驟后，在與初始超聲處理誘導的變化相比相對長的時間內(nèi)，為較緩慢的鏈的組織以及凝膠網(wǎng)狀物的形成。將這一包括兩個步驟的絲凝膠化機制示意性地描述于圖2C中。
[0052]可 將所研究的影響凝膠化速率的參數(shù)看作一種概括天然的蠶紡絲過程的方法。關鍵的處理參數(shù)包括超聲處理效應，其作為模擬在蠶的腺體前部經(jīng)歷的剪切力增加；陽離子類型和濃度；以及pH。[0053]人們公認在超聲處理中，機械振動導致泡沫的形成和破裂。作為這一空化作用(cavitation)的結果,培養(yǎng)基可經(jīng)歷極端的局部效應:高溫(ΙΟ,ΟΟΟΚ)、高壓(200bar)和高應變率(IO7S-1) (Paulusse&Siibesma, 44J.Polym.Sc1.-Polym.Chem.5445-53(2006)；Kemmere 等人,290Macromol.Mater.Eng.302-10 (2005))。在各種應用中已經(jīng)利用了 這些物理現(xiàn)象，所述應用包括:N-異丙基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物的自組裝和凝膠化(Seida等人，90J.Appl.Polym.Sc1.2449-52 (2003))、含有金屬化 Onetalated)肽的有機流體(Isozaki, 119Angew Chem.2913-15 (2007))以及合成的自組裝妝(Yokoi 等人，102ProcNat Acad Sci USA8414-19 (2005))。除了肽以外，已經(jīng)利用超聲處理研究了蛋白質(zhì)例如人血清白蛋白和肌紅蛋白，其中將超聲處理作為表征與疾病狀態(tài)相關的聚合和自組裝的方法(Stathopulos 等人，13Protein Sc1.3017-27(2004) ；Mason&Peters, PRACTICAL S0N0CHEM:USES&APPL.ULTRASOUND (第2版，齊切斯特，西薩塞克斯郡，英國(2002))。
[0054]考慮到聚合物體系響應超聲處理的行為幅度，很可能一些與超聲處理相關的物理因素(包括局部溫度提高、機械力/剪切力、以及增加的氣-液界面)影響了絲纖蛋白快速凝膠化的過程。特別地，超聲處理誘導的疏水水合作用方面的變化將引起物理交聯(lián)(例如與折疊形成相關的初始鏈相互作用)的加速形成。在本研究中，在超聲處理期間，溶液溫度在短時間內(nèi)(5分鐘-6分鐘)從室溫增加到40°C _71°C，其表現(xiàn)在局部溫度上瞬時尖峰。在過去的研究中，當本體樣品維持在60°C且無超聲處理時，凝膠化需要幾天的時間(Kim等人，2004)。因此，局部溫度的影響可能有助于增進凝膠化動力學，但這不僅僅是造成所觀察到的短時響應的原因。受瞬時溫度增加的影響，疏水鏈的局部的鏈動力學和水合狀態(tài)上的變化可能是形成疏水性物理交聯(lián)的原因。
[0055]由于在鏈內(nèi)和鏈間相互作用的調(diào)控下水所發(fā)揮的關鍵作用，絲纖蛋白鏈中獨特的疏水性嵌段序列(block sequence)特征特別適合于這類技術(Jin等人,2003)。這對于將該技術延伸到其它生物聚合 物體系來測定鏈化學對鏈組裝的超聲處理調(diào)控過程的影響可能是有用的。已經(jīng)報道了與超聲處理有關的膠原降解作為將鏈打碎為片段以促進重組裝研究的方法(Giraud-GuiIle&Besseau, 113J.Struct.Biol.99-106 (1994))。應當注意到，由于使用了基于SDS-PAGE分析的短時間超聲處理過程，本方法不會導致顯著的鏈降解。
[0056]在超聲處理之前，向絲纖蛋白水溶液補充K+和Ca2+至各種生理學相應的濃度。如圖3A所示，在低K+濃度(20mM-50mM)下，膠凝時間隨K+濃度增加而顯著縮短(在*樣品之間，p〈0.05)。然而，在高K+濃度(100mM-200mM)下，凝膠化被抑制(圖3A)。絲纖蛋白濃度在0.5%到8% (w/v)的范圍內(nèi)，觀察到了這些結果。超過8%時，因為在所有樣品中凝膠化都很快地發(fā)生(〈2分鐘)，所以觀察不到鹽效應。與K+相比，具有相同濃度的Ca2+誘導的絲纖蛋白凝膠化要慢一些(比較圖3A和3B)。當Ca2+濃度從20mM增加到200mM時，絲纖蛋白膠凝時間顯著增長(在圖3B的*樣品之間，p〈0.05)。相反，在此前的研究成果中，Ca2+促進了絲纖蛋白凝膠化而K+則沒有效果(Kim等人，2004)，這是與本方法觀察相比所不同的結果。
[0057]在超聲處理之前，為了測定對凝膠化的影響，調(diào)節(jié)絲纖蛋白水溶液的pH。降低或升高PH促進了凝膠化(在圖3C的*樣品之間，p〈0.05)。與此前的研究(Kim等人，2004 ；Matsumoto等人,2006) —致,在誘導凝膠化方面,低pH (pH〈4)的效果要比高pH(pH>9)更顯著(在圖3C的?樣品之間，ρ〈0.05)。[0058]由機械測試得到的應力-應變曲線在平坦區(qū)域之前顯示出線性，表明所述凝膠具有較大(~5%-10%應變)且可能的粘彈性特征，之后由裂縫形成而誘導永久性損傷。本研究中制備的凝膠與此前的研究成果中研究的凝膠表現(xiàn)相似(Kim等人，2004)，其中，相應的絲纖蛋白濃度在屈服強度(圖4A)和“傳統(tǒng)的”彈性模量(圖4B)上得到相似的數(shù)值。這兩個量度看起來都與絲凝膠濃度正相關。通過檢驗，絲纖蛋白濃度(w/v)上的差異是最終水凝膠機械性能的更重要的決定因素，而非由于超聲處理條件的變化(圖4A和4B)。同樣，平衡模量值看起來與絲凝膠濃度正相關(圖4C)。
[0059]當與其它可降解的包封有細胞的水凝膠例如藻酸鹽/酯、瓊脂糖、聚乙二醇交聯(lián)凝膠、纖維蛋白原及其它體系(Almany&Seliktar26 (15) Biomats.4023-29 (2005) ；Kong等人，24 (22)Biomats.4023-29(2003) ;Hung 等人，2004 ;Bryant 等人，86 (7)BiotechnolBioeng747-55(2004) ；Kang 等人，77 (2) J.Biomed.Mater.Res.A331-39 (2006) ；Rowley等人，20 (I) Biomats.45-53 (1999) ；Broderick 等 Α? 72J.Biomed.Mater.Res.B-ApplBiomater.37-42 (2004) ；Zhang 等人，15J.Mater.Sc1.Mater.Med.865-75 (2004))相比時，高濃度、快速形成的絲水凝膠顯示出了優(yōu)良的機械性能(表1)?；诩毎夂蜋C械性能試驗方案的相似性收集數(shù)據(jù)，其中測定了 “傳統(tǒng)”的模量或平衡模量的數(shù)值。
[0060]表1.由用于細胞包封的可降解聚合物制得的凝膠體系機械性能的比較
【權利要求】
1.一種在絲纖蛋白中包封至少一種藥劑的方法，所述方法包括: a.將所述藥劑引入絲纖蛋白溶液；以及 b.將絲纖蛋白溶液進行超聲處理以起始凝膠化，其中，所述超聲的功率為3-21瓦特；并且其中，在所述超聲處理后不超過24小時形成實質(zhì)上的絲纖蛋白凝膠化， c.從而形成絲纖蛋白包封的藥劑。
2.—種在絲纖蛋白中包封至少一種藥劑的方法，所述方法包括: a.將絲纖蛋白溶液進行超聲處理以起始凝膠化，其中，所述超聲的功率為3-21瓦特；以及 b.在所述絲纖蛋白溶液中發(fā)生實質(zhì)上的凝膠化之前，將所述藥劑引入所述絲纖蛋白溶液， c.從而形成絲纖蛋白包封的藥劑。
3.—種控制絲纖蛋白膠凝時間的方法，所述方法通過將絲纖蛋白溶液進行超聲處理以起始凝膠化，其中，所述超聲的功率為3-21瓦特；并且其中，在所述超聲處理后不超過24小時形成實質(zhì)上的絲纖蛋白凝膠化。
4.一種快速形成 絲纖蛋白凝膠化的方法，所述方法包括將絲纖蛋白進行處理，所述處理包括超聲處理以起始凝膠化，其中，所述超聲的功率為3-21瓦特；并且其中，在所述超聲處理后不超過24小時形成實質(zhì)上的絲纖蛋白凝膠化。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，在所述超聲處理后不超過2小時形成實質(zhì)上的絲纖蛋白凝膠化。
6.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，實質(zhì)上的凝膠化發(fā)生在五分鐘到兩個小時的時間范圍內(nèi)。
7.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述起始凝膠化的時間為5秒-60秒。
【文檔編號】A61K9/50GK104013598SQ201410072156
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2008年5月29日 優(yōu)先權日:2007年5月29日
【發(fā)明者】王曉沁, 喬恩·克盧格, 加里·G·萊斯克, 戴維·L·卡普蘭 申請人:塔夫茨大學信托人