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一種半滑舌鰨雌性特異csw3蛋白及其基因與應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):1295597閱讀:161來(lái)源:國(guó)知局
一種半滑舌鰨雌性特異csw3蛋白及其基因與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白及其基因與應(yīng)用,屬于水產(chǎn)生物技術(shù)中的功能基因篩選與應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】,半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1;編碼上述CSW3蛋白的CSW3基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2。本發(fā)明的CSW3基因的體外重組半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白能夠明顯升高雌性相關(guān)基因foxl2的表達(dá)水平,具有刺激雌性相關(guān)基因表達(dá)的生物活性;同時(shí)具有降低雄性相關(guān)基因sox9和amh表達(dá)水平的生物活性。將CSW3基因重組表達(dá)產(chǎn)物作為飼料添加劑使用后能夠刺激雌性性腺發(fā)育,提高雌魚(yú)比例,因此,半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白在半滑舌鰨性別控制和提高雌性魚(yú)苗比例方面具有應(yīng)用潛力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白及其基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)中的功能基因篩選與應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一種半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白及其基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鑒于魚(yú)類(lèi)性別決定基因在魚(yú)類(lèi)性別決定機(jī)制基礎(chǔ)和應(yīng)用研究上的重要意義,美國(guó)、日本、德國(guó)、法國(guó)、加拿大等國(guó)家的科學(xué)家們分別以大馬哈魚(yú)、羅非魚(yú)和青鏘等為材料開(kāi)展了魚(yú)類(lèi)性別特異基因篩選和性別決定機(jī)理的研究。其中最為成功的是日本科學(xué)家以青鏘為材料發(fā)現(xiàn)了魚(yú)類(lèi)第一個(gè)性別決定基因DMY (Matsuda etal.,Nature, 2002,417:559-563)。不過(guò),后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),DMY只在青鏘和弓背青鏘中發(fā)現(xiàn),而在其它魚(yú)類(lèi)中未見(jiàn) DMY 雄性決定基因(Matsuda et al., Zoolog Sci, 2003:159-161; Kondoet al., Curr Biol, 2003:416-420;Volff et al., Trends Genet, 2003:19:196-199)。
[0003]半滑舌鰨(Cynogloss μ s semilaevis)是我國(guó)特有的名貴經(jīng)濟(jì)海水魚(yú)類(lèi),屬于近海溫水性底層魚(yú)類(lèi),主要分布于黃海、渤海(鄧景耀等,海洋水產(chǎn)研究,1988,9:10-98),由于其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富,深受消費(fèi)者喜愛(ài)。2002年,我國(guó)突破了半滑舌鰨人工育苗技術(shù)難關(guān)(柳學(xué)周等,海洋水產(chǎn)研究,2006,27:25-32),目前,半滑舌鰨已成為我國(guó)海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種之一,年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)15-20億元。不過(guò),半滑舌鰨雌、雄個(gè)體生長(zhǎng)速率上存在巨大差異,雌性比雄性生長(zhǎng)快2-4倍。由于半滑舌鰨雄性個(gè)體生長(zhǎng)緩慢、個(gè)體小,致使增加了半滑舌鰨的養(yǎng)殖成本、降低了養(yǎng)殖產(chǎn)量和效益,嚴(yán)重影響了半滑舌鰨苗種的推廣,阻礙了養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此,開(kāi)展半滑舌 鰨性別控制技術(shù)研究、培育半滑舌鰨高雌性化苗種,對(duì)于提高半滑舌鰨的養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益至關(guān)重要。而半滑舌鰨雌雄特異基因的篩選鑒定及其功能的分析研究是揭示半滑舌鰨性別決定機(jī)制的重要基礎(chǔ)。另外,由于半滑舌鰨性別決定類(lèi)型為ZW型,即雌性具有特異的W染色體(周麗青等,水產(chǎn)學(xué)報(bào),2005:417-419)。而有關(guān)魚(yú)類(lèi)雌性特異或決定基因的篩選與克隆,特別是半滑舌鰨雌性特異基因的篩選與克隆目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,魚(yú)類(lèi)性別特異/決定基因,特別是半滑舌鰨雌性特異或決定基因的篩選與克隆以及性別決定分子機(jī)制的研究是目前國(guó)內(nèi)外亟待攻克的重要科學(xué)問(wèn)題,也是建立半滑舌鰨性別控制技術(shù)的重要理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白及其基因與應(yīng)用,為半滑舌鰨性別控制和全雌苗種研制提供基因資源和技術(shù)方法。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0006]本發(fā)明一個(gè)方面涉及半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白,其氨基酸序列為SEQ IDNO:1 ;
[0007]編碼上述CSW3蛋白的CSW3基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于重組表達(dá)CSW3蛋白的重組質(zhì)粒,所述的重組質(zhì)粒中插入了序列為SEQ ID NO:3的DNA片段。
[0009]本發(fā)明再一個(gè)方面涉及CSW3蛋白在半滑舌鰨性別控制和提高雌性魚(yú)苗比例中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明再一個(gè)方面涉及一種包含CSW3蛋白的飼料添加劑或飼料。
[0011]上述CSW3蛋白作為飼料添加劑,用于刺激半滑舌鰨雌性性腺發(fā)育。
[0012]本發(fā)明再一個(gè)方面涉及包含所述的CSW3蛋白的藥物。
[0013]本發(fā)明的CSW3基因的體外重組半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白能夠明顯升高雌性相關(guān)基因foxl2的表達(dá)水平,具有刺激雌性相關(guān)基因表達(dá)的生物活性;同時(shí)具有降低雄性相關(guān)基因sox9和amh表達(dá)水平的生物活性。將CSW3基因重組表達(dá)產(chǎn)物作為飼料添加劑使用后能夠刺激雌性性腺發(fā)育,提高雌魚(yú)比例,因此,半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白在半滑舌鰨性別控制和提高雌性魚(yú)苗比例方面具有應(yīng)用潛力。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0014]圖1:半滑舌鰨雌雄魚(yú)中CSW3基因的表達(dá)分析
[0015]圖2:半滑舌鰨不同組織中CSW3基因的表達(dá)水平分析;
[0016]圖3:半滑舌鰨不同發(fā)育時(shí)期雌魚(yú)卵巢和雄魚(yú)精巢中CSW3基因的表達(dá)水平分析;
[0017]圖4:半滑舌鰨CSW3基因重組表達(dá)載體pET32a_CSW3的大腸桿菌培養(yǎng)總蛋白及純化后重組CSW3蛋白電泳圖;
[0018]其中圖A為pET32a_CSW3的大腸桿菌培養(yǎng)總蛋白電泳圖。1、pET32a_CSW3未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體上清電泳圖,2、pET32a-CSW3未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體沉淀電泳圖,3、pET32a-CSW3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體上清電泳圖,4、pET32a_CSW3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體沉淀電泳圖,M為康為世紀(jì)公司的廣譜蛋白Marker。圖B為重組CSW3蛋白純化后電泳圖。5、重組CSW3蛋白純化后電泳圖,M為康為世紀(jì)公司的廣譜蛋白Marker。
[0019]圖5:半滑舌鰨重組CSW3蛋白注射后foxl2基因在O小時(shí),6小時(shí),12小時(shí),24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)和96小時(shí)的表達(dá)分析;
[0020]圖6:半滑舌鰨重組CSW3蛋白注射后sox9基因在O小時(shí),6小時(shí),12小時(shí),24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)和96小時(shí)的表達(dá)分析;
[0021]圖7:半滑舌鰨重組CSW3蛋白注射后amh基因在O小時(shí),6小時(shí),12小時(shí),24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí)和96小時(shí)的表達(dá)分析。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合附圖實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說(shuō)明。但實(shí)例僅限于說(shuō)明,并不限于此。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通??砂闯R?guī)條件,如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫(xiě)的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。
[0023]實(shí)施例1、半滑舌鰨雌性特異CSW3基因的克隆及其序列
[0024]對(duì)半滑舌鰨雌、雄魚(yú)分別進(jìn)行了全基因組測(cè)序,通過(guò)生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)ZW雌性個(gè)體基因組中具有一個(gè)特異的CSW3基因,采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù),從半滑舌鰨卵巢中克隆到了雌性特異基因CSW3基因的cDNA,其全長(zhǎng)序列為SEQ ID N0:2,編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
[0025]半滑舌鰨雌性特異基因CSW3的cDNA序列全長(zhǎng)為1674bp,包括414bp的開(kāi)放閱讀框(0RF區(qū)域),編碼137個(gè)氨基酸,5'非編碼區(qū)長(zhǎng)173bp,3'非編碼區(qū)長(zhǎng)1090bp,有多聚腺苷酸加尾信號(hào)和多聚腺苷酸尾巴。
[0026]具體步驟如下:
[0027]1、半滑舌鰨雌性特異基因的篩選與克隆
[0028]本發(fā)明專(zhuān)利中的雌性特異基因序列來(lái)源于半滑舌鰨基因組測(cè)序項(xiàng)目,對(duì)半滑舌鰨雌性個(gè)體和雄性個(gè)體采用SOLEXA測(cè)序技術(shù)分別進(jìn)行全基因組測(cè)序和組裝,采用生物信息學(xué)方法對(duì)獲得的雌魚(yú)基因組序列和雄魚(yú)基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析,從中篩選出半滑舌鰨雌性特異候選基因;對(duì)其中一個(gè)雌性特異候選基因CSW3基因設(shè)計(jì)引物(CSW3-JS:TGCTGGTAGGTTGACATACTGGAA, CSW3-JA:GAACAAAGGTAGGGCCAAACTG),對(duì)半滑舌鰨雌雄魚(yú)基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)CSW3基因只在雌魚(yú)基因組DNA中存在,而在雄魚(yú)基因組中擴(kuò)增不出來(lái)(圖1)。
[0029]2、半滑舌鰨雌性特異基因的序列
[0030]采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù),采用CSW3基因的特異PCR引物(CSW3-5 ' GSP:AGGCCAGGACAAAAGATATACATGCTTCC, CSW3-3 ' GSP:GATCAAAGCCAGAGACATCGTTCCTGGAG),從半滑舌鰨卵巢中克隆到了雌性特異基因CSW3基因的全長(zhǎng)cDNA,其全長(zhǎng)序列為SEQ ID NO:2,其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0031 ] cDNA序列獲得采取cDNA末端擴(kuò)增(RACE),方法按照SMARTer? RACE cDNAAmplification Kit (Clonte`ch),其具體操作條件如下:
[0032]RACE所用的體系以及反應(yīng)條件:
[0033]50 μ I反應(yīng)體系
[0034]5 μ I IOX BD Advantage 2 PCR Buffer
[0035]I μ I dNTP Mix(IOmM)
[0036]5 μ I μ PM
[0037]I μ I GSP
[0038]2 μ I 3,-RACE-Ready cDNA
[0039]I μ 150Χ BD Advantage 2 Polymerase Mix
[0040]35 μ I PCR-grade water
[0041]反應(yīng)條件如下:
[0042]94°C變性30秒,72°C延伸3分鐘,5個(gè)循環(huán)后改為94°C變性30秒,70°C退火30秒,72°C延伸3分鐘,5個(gè)循環(huán)后改為94°C變性30秒,68 °C退火30秒,72°C延伸3分鐘,反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。
[0043]5' RACE所用體系及反應(yīng)條件:
[0044]50 μ I反應(yīng)體系
[0045]5 μ I IOX BD Advantage 2 PCR B μ ffer
[0046]I μ I dNTP Mix(IOmM)
[0047]5 μ I μ PM
[0048]I μ I GSP[0049]2 μ I 5’-RACE-Ready cDNA
[0050]I μ I 50Χ BD Advantage 2 Polymerase Mix
[0051]35 μ I PCR-grade water
[0052]反應(yīng)條件如下:
[0053]94°C變性30秒,72°C延伸3分鐘,5個(gè)循環(huán)后改為94°C變性30秒,70°C退火30秒,72°C延伸3分鐘,5個(gè)循環(huán)后改為94°C變性30秒,68 °C退火30秒,72°C延伸3分鐘,反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。
[0054]將3' RACE和5' RACE的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),用膠回收試劑盒(Omega)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收和純化,再與pMD_18T載體(Takara)連接,挑選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒,3730DNA Analyzer (ABI)測(cè)序,測(cè)得的序列經(jīng)CLUSTER分析拼接得到全長(zhǎng)序列。
[0055]半滑舌鰨雌性特異基因CSW3的cDNA序列全長(zhǎng)為1674bp,包括414bp的開(kāi)放閱讀框(0RF區(qū)域),編碼137個(gè)氨基酸,5'非編碼區(qū)長(zhǎng)173bp,3'非編碼區(qū)長(zhǎng)1090bp,有多聚腺苷酸加尾信號(hào)和多聚腺苷酸尾巴。
[0056]實(shí)施例2半滑舌鰨雌性特異基因CSW3在不同組織及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式
[0057]1、半滑舌鰨雌性特異CSW3基因在不同組織的表達(dá)模式:采用半定量和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了 CSW3基因 在半滑舌鰨不同組織(心、肝、鰓、皮、血、腎、腸、腦、脾、肌肉、垂體、卵巢、精巢及偽雄魚(yú)精巢)的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)CSW3基因在雌魚(yú)卵巢、肝臟、垂體中表達(dá)水平最高,鰓、腦、脾表達(dá)量次之,心、血、腸、偽雄魚(yú)精巢重表達(dá)量最低,皮、肌肉和雄魚(yú)精巢中幾乎沒(méi)有表達(dá)(圖2)。雌魚(yú)和偽雄魚(yú)遺傳性別的鑒定按照已報(bào)道的方法進(jìn)行(Chen etal.,Mar Biotechnol, 2012,14:120-128)。實(shí)時(shí)定量 PCR 分析的具體步驟為:
[0058](I)半滑舌鰨不同組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄:取250-500克重的半滑舌鰨雌魚(yú)的心、肝、鰓、皮、血、腎、腸、腦、脾、肌肉、垂體、卵巢、雄魚(yú)精巢和偽雄魚(yú)精巢組織,用RNA提取試劑盒提取總RNA,采用常規(guī)方法通過(guò)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0059](2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件
[0060]根據(jù)半滑舌鰨CSW3基因cDNA序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物CSW3-S(AGAAGGGAAGTCTTTATGGGAGC), CSW3-A (CATCCTCAGCATTGCGTTCAT),對(duì)半滑舌鰨雌魚(yú)不同組織(心、肝、鰓、皮、血、腎、腸、腦、脾、肌肉、垂體、卵巢)以及雄魚(yú)精巢,偽雄魚(yú)精巢中CSW3基因的表達(dá)進(jìn)行分析。
[0061]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件:
[0062]20 μ I反應(yīng)體系
[0063]10 μ I SYBR Taq
[0064]0.4 μ I primer F
[0065]0.4 μ I Primer R
[0066]0.4μ I Rox RD II
[0067]0.5 μ I cDNA (600ng/ μ I)
[0068]8.3 μ I H2O
[0069]發(fā)現(xiàn)CSW3基因在卵巢中表達(dá)水平最高,在雄魚(yú)精巢中幾乎不表達(dá),因此,CSW3基因是半滑舌鰨雌魚(yú)特異表達(dá)基因。[0070]2、半滑舌鰨雌性特異CSW3基因在半滑舌鰨不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá):采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)了半滑舌鰨雌性特異CSW3基因在半滑舌鰨雌魚(yú)和雄魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期(4天、62天、131天、5月、8月、10月、I年、2年)魚(yú)體或性腺中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)CSW3基因在雌魚(yú)卵巢中檢測(cè)到表達(dá),其中62天的卵巢中有微弱表達(dá),131天開(kāi)始表達(dá)量逐漸增加,至一年表達(dá)量最高,兩年時(shí)表達(dá)量稍有降低。在精巢中,各個(gè)階段CSW3基因的表達(dá)水平都非常低,甚至幾乎檢測(cè)不到表達(dá),且不同階段無(wú)顯著性差異(圖3)。由此證明,CSW3基因在半滑舌鰨雌魚(yú)性腺分化和發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。
[0071]雌雄魚(yú)遺傳性別的鑒定按照已報(bào)道的方法進(jìn)行(Chen et al., MarBiotechnol, 2012, 14:120-128)。CSW3基因在半滑舌鰨不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)檢測(cè)的具體步驟為:
[0072](I)半滑舌鰨不同發(fā)育時(shí)期雌魚(yú)、雄魚(yú)魚(yú)體或性腺總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄:取半滑舌鰨雌魚(yú)/雄魚(yú)4天、62天、131天、5月、8月、10月、I年、2年等不同發(fā)育時(shí)期的魚(yú)苗或成魚(yú)的卵巢/精巢,用RNA提取試劑盒提取Total RNA, M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Takara)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0073](2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件:
[0074]對(duì)不同發(fā)育時(shí)期(4天、62天、131天、5月、8月、10月、I年、2年)雌魚(yú)性腺的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)突光定量PCR分析,反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下:
[0075]20 μ I反應(yīng)體系
[0076]10 μ I SYBR Taq
[0077]0.4 μ I primer `F
[0078]0.4 μ I Primer R
[0079]0.4μ I Rox RD II
[0080]0.5 μ I cDNA (600ng/ μ I)
[0081]8.3μ I H2O
[0082]結(jié)果表明CSW3基因隨著魚(yú)體的生長(zhǎng)和雌性性腺發(fā)育,卵巢中CSW3基因在62天時(shí)有微弱表達(dá),131天開(kāi)始表達(dá)量逐漸增加,至一年表達(dá)量最高,兩年時(shí)表達(dá)量稍有降低。在精巢中,各個(gè)階段CSW3基因的表達(dá)水平都非常低,甚至幾乎檢測(cè)不到表達(dá),且不同階段無(wú)顯
著性差異。
[0083]3、半滑舌鰨魚(yú)苗和成魚(yú)的遺傳性別鑒定:
[0084]從半滑舌鰨魚(yú)苗或成魚(yú)上采取0.1克的尾鰭組織,按照常規(guī)的酚/氯仿方法提取基因組DNA,隨后采用中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所陳松林實(shí)驗(yàn)室建立的半滑舌鰨性別連鎖微衛(wèi)星標(biāo)記和建立的遺傳性別鑒定方法(Chen et al., Mar Biotechnol, 2012,14:120-128)進(jìn)行半滑舌鰨魚(yú)苗和成魚(yú)的遺傳性別鑒定。
[0085]實(shí)施例3、半滑舌鰨雌性特異CSW3基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的重組表達(dá)和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化
[0086]采用常規(guī)PCR技術(shù),擴(kuò)增了 CSW3基因的開(kāi)放閱讀框ORF區(qū)域,其序列為SEQ IDN0:3,并將其克隆到pET32a ( + )表達(dá)載體上,構(gòu)建了 CSW3基因原核表達(dá)載體pET32_CSW3。將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,進(jìn)行了 CSW3基因的體外重組表達(dá),獲得了重組表達(dá)產(chǎn)物,重組表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)GE公司His-tag親和層析柱純化后,獲得了純化的重組CSW3蛋白,重組CSW3蛋白分子量為33kD左右。實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的具體方案如下:
[0087]1、CSW3基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法:
[0088]本發(fā)明中采用的重組載體為Novagen公司的pET原核表達(dá)系統(tǒng)。
[0089]通過(guò)PCR技術(shù),使用對(duì)pET32a_CSW3 ( + )載體序列和CSW3基因ORF區(qū)序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析,并設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)特異引物PET-32-CSW3S和PET-32-CSW3A,序列如下:(PET-32-CSW3S:AGCGGATCCATGGAGAACGCTCACATGAA, PET-32-CSW3A:AGCAAGCTTCTACAATGTCTCCAGGAACG)。上游5'端含BamHI酶切位點(diǎn),下游3'端含HindIII酶切位點(diǎn)。以卵巢cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增CSW3基因編碼區(qū)。將PCR產(chǎn)物純化與pET32a ( + )同時(shí)用HindIII和BamHI進(jìn)行雙酶切,瓊脂糖電泳回收CSW3基因片段與表達(dá)載體質(zhì)粒,按照連接酶說(shuō)明書(shū),用T4DNA連接酶連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-CSW3,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài),將檢測(cè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序正確的克隆提取質(zhì)粒。再將pET32a-CSW3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)感受態(tài)BL21(DE3)細(xì)菌,將15% (體積比)的甘油加到感受態(tài)細(xì)菌菌種中于_80°C冷凍保存作為保種菌。
[0090]2、重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與表達(dá)產(chǎn)物的分析
[0091]取5 μ I保種大腸桿菌菌株加入到ImL新鮮的TB培養(yǎng)基中(含終濃度為100 μ g/mL氨芐青霉素),250C,200r/min過(guò)夜培養(yǎng),將1% (體積比)的過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌接種到20mL新鮮的TB培養(yǎng)基中(含終濃度為100 μ g/mL氨芐青霉素),250C,250r/min培養(yǎng)至0D600達(dá)到
0.6-0.8時(shí),在實(shí)驗(yàn)組(pE T32a-CSW3)菌液中加入IPTG誘導(dǎo),使IPTG終濃度為0.5mM,對(duì)照組(pET32a-CSW3)菌液中不加 IPTG,28°C,250r/min 繼續(xù)培養(yǎng) 16 小時(shí),離心(4°C,12000r/min,5分鐘)收集菌體,采用JY92-1IDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞,離心后分別取上清和沉淀,進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在CSW3基因重組表達(dá)載體pET32a_CSW3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體上清中有I條分子量為33kD的蛋白帶,而菌體沉淀和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照組中則無(wú)此條蛋白帶(圖4A)。
[0092]3.重組蛋白的分離純化
[0093]將表達(dá)陽(yáng)性的原菌液1:100 (體積比)接種于1000mL TB培養(yǎng)基中,在37°C培養(yǎng)至0D600為0.6-0.8時(shí),加入終濃度為0.5mM的IPTG,在25°C繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí),離心收集菌體,將菌體沉淀重懸于25ml pH7.9冰預(yù)冷的結(jié)合緩沖液(25mL結(jié)合緩沖液中含有0.5M NaCl,20mM Tris-HCl,5mM咪唑)中。超聲破碎裂解細(xì)胞,離心(4°C,12000r/min,10分鐘)收集上清,將上清用0.45 μ m的過(guò)濾器過(guò)濾,將過(guò)濾液收集備用。應(yīng)用His Trap HP (GE公司)親和層析柱進(jìn)行分離純化,具體操作如下:
[0094]首先,用5mL蒸餾水洗ImL柱子一次,隨后5mL結(jié)合緩沖液(20mM Na3PO4,0.5MNaCl, 20mM咪唑)洗柱子,再將收集的過(guò)濾液過(guò)柱子,流速為l_2mL/min,用5mL結(jié)合緩沖液洗柱子,再用5mL的洗脫緩沖液(20mM Na3P04,0.5M NaCl,500mM咪唑)洗脫一次,最后用5mL的結(jié)合緩沖液再生柱子。
[0095]收集經(jīng)過(guò)親和層析后純化的重組蛋白樣品,采用Solarbio公司的透析帶進(jìn)行過(guò)夜透析處理后,在Thermo公司的凍干機(jī)Heto PowerDry LL3000上真空冷凝干燥,PBS溶解。12%SDS-PAGE電泳檢測(cè),觀察到重組蛋白分子量為33kD左右(圖4B),命名為CSW3蛋白。
[0096]4.蛋白濃度測(cè)定
[0097]采用北京天根生化科技有限公司的BCA蛋白定量試劑盒對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行定量分析,具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。[0098]四、半滑舌鰨CSW3重組表達(dá)產(chǎn)物生物活性的測(cè)定及其應(yīng)用
[0099]將CSW3蛋白注射到100-200克重的半滑舌鰨雄魚(yú)精巢,檢測(cè)了重組CSW3蛋白對(duì)性腺fOX12、SOX9、amh三種性別相關(guān)基因表達(dá)水平的影響,發(fā)現(xiàn)注射CSW3蛋白,雌性相關(guān)基因foxl2的表達(dá)水平在12、24、72小時(shí)都有升高趨勢(shì)(圖5)。與此相反,雄性相關(guān)基因sox9的表達(dá)水平在注射后24-96小時(shí)之間都有下降趨勢(shì)(圖6),雄性相關(guān)基因amh的表達(dá)水平在注射后12、48、72、96小時(shí)有下降趨勢(shì)(圖7)。
[0100]具體檢測(cè)方法如下:
[0101]取100-200克重的一齡半滑舌鰨雄魚(yú)40尾,其中4尾取性腺,檢測(cè)其中的foxl2、sox9,amh三種性別相關(guān)基因表達(dá)水平作為O小時(shí)對(duì)照。取18尾魚(yú)注射CSW3蛋白(15 μ 1, 1.5mg/mL),另18尾注射失活CSW3蛋白(沸水浴5min失活,注射量為15 μ 1,1.5mg/mL)作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別在注射后6小時(shí),12小時(shí),24小時(shí),48小時(shí),72小時(shí),96小時(shí)取性腺迅速投入液氮中,每個(gè)組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣3尾。根據(jù)NCBI中報(bào)道的半滑舌鰨性別相關(guān)基因 Foxl2 (GQ402462)、Sox9a (GQ402461)和 Amh (JN100095)等序列設(shè)計(jì)定量 PCR引物,各引物的序列如下:
[0102]Foxl2-S:GAGAGGAAGGGCAACTACTGGA
[0103]Foxl2-A:TGGTTGGAAGTGCGTGGG
[0104]Sox9a-S:CGATTCCCCTGCGTCCA
[0105]Sox9a-A:GCTTCAGTTCGGCTTTATTGG
[0106]Amh-S:GAGGATTGGCATTGAAAC
[0107]人工設(shè)計(jì)的弓I 物序列 Amh-A:GACAAGCAGAAGCGGAGT
[0108]結(jié)果表明,本發(fā)明的CSW3基因的體外重組蛋白CSW3蛋白能夠明顯升高雌性相關(guān)基因foxl2的表達(dá)水平,具有刺激雌性相關(guān)基因foxl2表達(dá)的生物活性,同時(shí)還有降低雄性相關(guān)基因sox9和amh表達(dá)水平的生物活性。因此,將CSW3重組表達(dá)產(chǎn)物CSW3蛋白作為飼料添加劑或藥物使用后將具有刺激半滑舌鰨雌性性腺發(fā)育的作用,產(chǎn)生提高雌魚(yú)比例的效果。因此,本發(fā)明篩選的半滑舌鰨雌性特異基因及其重組表達(dá)蛋白CSW3蛋白在半滑舌鰨性別控制和提高雌性魚(yú)苗比例方面具有應(yīng)用潛力。
【權(quán)利要求】
1.一種半滑舌鰨雌性特異CSW3蛋白,其特征在于它的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
2.編碼權(quán)利要求1所述CSW3蛋白的CSW3基因,其特征在于它的核苷酸序列為SEQIDN0:2。
3.一種用于重組表達(dá)CSW3蛋白的重組質(zhì)粒,其特征在于所述的重組質(zhì)粒中插入了序列為SEQ ID NO:3的DNA片段。
4.一種權(quán)利要求1所述的CSW3蛋白在半滑舌鰨性別控制和提高雌性魚(yú)苗比例中的應(yīng) 用。
5.一種包含權(quán)利要求1所述的CSW3蛋白的飼料添加劑或飼料。
6.一種包含權(quán)利要求1所述的CSW3蛋白的藥物。
【文檔編號(hào)】A61P15/00GK103739696SQ201410012879
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】王娜, 胡喬木, 王天姿, 陳松林 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
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