甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法
【專利摘要】甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，首先將甘草通過常用的提取方法進行提取，得到甘草酸溶液。從而實現(xiàn)了對甘草酸和甘草黃酮的同時提取；然后根據甘草酸和甘草黃酮在水中溶解性和電離常數(pKa)上的差異，以水和乙醇為溶劑，通過對干燥后提取物用不同濃度梯度的水/乙醇溶解和對溶液pH值的精密控制，使含有甘草酸和甘草黃酮的混合液依次通過聚酰胺類的樹脂和大孔吸附樹脂混合床吸附柱吸附/解吸的方法，實現(xiàn)甘草酸和甘草黃酮的高效分離，制備出較高純度甘草酸和甘草黃酮。
【專利說明】甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從甘草中同時提取甘草酸和甘草黃酮的方法。
【背景技術】
[0002]甘草為常用大宗藥材，年需量約6萬噸左右，甘草提取物被廣泛應用于工業(yè)、化工等領域，并大量出口。由于生產周期較長，致使原料供給不足，目前市場上甘草品質下降，價格持續(xù)增長。甘草中含有甘草酸、甘草黃酮等活性成分。是一種具有抗炎、抗病毒、保肝解毒及增強免疫等多項功能的中藥材。
[0003]目前從甘草中提取甘草酸和甘草黃酮的方法主要有以下幾種:
(I)水提法:但建明等發(fā)表的論文“甘草渣中黃酮類化合物的提取工藝研究”(石河子大學學報，1995，26(1)，39-44)，該方法主要以水作為溶劑，將甘草放入提取器中，進行水煮提取，結果表明雖然提取工藝簡單、溶劑成本低、環(huán)保。但此法存在提取雜質多、提取液存放易腐敗變質、后續(xù)處理繁瑣等缺點。
[0004](2)超聲提取法:隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，超聲技術已廣泛應用于中草藥有效成分的提取中。超聲波能破壞植物的細胞，從而加速藥材有效成分在溶劑中的溶解，縮短提取時間，提高有效成分的提出率，為中草藥成分的提取提供了一種快速、高效的新方法。李炳奇等發(fā)表的論文“超聲法聯(lián)合提取甘草黃酮和甘草酸的研究”(山東中醫(yī)雜志，2005，24 (I)，38-40)，采用超聲技術對甘草中黃酮和甘草酸進行聯(lián)合提取，確定了影響提取效果的主要因素，摸索出一套恰當的甘草酸和黃酮的提取方法。但對于超聲提取，耗能大、浪費能源、成本高、不利于工業(yè)化生產，同時也破壞了天然藥材的有效成分。
[0005](3)氨水提取法:崔杏雨等發(fā)表的論文“甘草酸制備新工藝的研究”(太原理工大學學報，2001，32(3): 271-273)，該方法主要以氨水作為溶劑進行提取，結果表明雖然提取率高于水提法，但氨水造成環(huán)境污染，不易采用。
[0006]盡管現(xiàn)有的工藝能滿足現(xiàn)有企業(yè)對甘草中主要成分的分離，但是，現(xiàn)有的工藝都有它的不足之處，例如:超濾法成本太高,不利于工業(yè)化生產,但是對于甘草中主要成分的分離，現(xiàn)有的工藝往往采用大孔樹脂分離的方法，不能同時將甘草黃酮和甘草酸連續(xù)分離出來，往往是針對其中的一種成分進行分離的。即采用單一的樹脂來分離，得到的純度很低，不利于回收。
[0007]雖然目前對MAR應用的研究已經相當廣泛，但研究主要集中在利用合成或市售的某一種MAR對底物的吸附分離實驗。由于不同的MAR在極性、功能基、孔徑、孔容及比表面積等結構參數方面都有所不同，而某一種MAR對多種成分也有不同程度的吸附，因此，對于一些物質結構較為相似的成分分離，采用單一類型的MAR往往很難達到預期的分離效果，這在一定程度上限制了 MAR應用研究更好地發(fā)展。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的是提高一種甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法。[0009]本發(fā)明是甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其步驟為:
(1)將烘干粉碎的甘草，通過常用的方法進行提取，得到含有甘草酸和甘草黃酮的提取液，然后再將提取液濃縮、烘干干燥；
(2)按水、梯度水/乙醇、乙醇的次序分別對樣品進行充分溶解；
(3)得到系列梯度溶液，分別測定各梯度溶液中甘草酸和甘草黃酮的含量；
(4)取甘草酸提取物干品，用水/乙醇使其完全溶解；
(5)用AlCl3和NaNO2顯色法測定甘草總黃酮含量；
通過用不同大孔吸附樹脂在相同條件下進行吸附/解吸實驗，并采用相同方法測定殘液和解吸液中甘草總黃酮的含量，根據吸附值和解吸率選擇對甘草黃酮吸附/解吸性能優(yōu)異的大孔吸附樹脂；
(6)再將解吸液濃縮烘干，通過顯色法測其純度；
(7)取市售純度為98%的甘草酸樣品，加水完全溶解，用HPLC法測定溶液濃度；
采用與步驟(5)中同樣的方法，進行分離甘草酸的大孔吸附樹脂混合床選擇；
(8)再將解吸液濃縮烘干，通過HPLC法測其純度。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點是:
(1)實現(xiàn)了甘草黃酮和甘草酸的同時提取、分離技術；
(2)在最佳工藝條件下，采用動、靜態(tài)吸附相結合的方法，首先采用靜態(tài)吸附方法對MAR進行篩選，篩選出較好的混合床，然后再通過動態(tài)吸附的方法對其進行分離純化；
(3)實現(xiàn)了對兩種成分的更高效分離，為工業(yè)化生產打下了基礎；
(4)本發(fā)明所涉及到的工藝路線、所用試劑等均為國際上所公認的綠色環(huán)保技術。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為技術路線圖，圖2為甘草酸標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0012]如圖1所示，甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其步驟為:
(1)將烘干粉碎的甘草，通過常用的方法進行提取，得到含有甘草酸和甘草黃酮的提取液，然后再將提取液濃縮、烘干干燥；
(2)按水、梯度水/乙醇、乙醇的次序分別對樣品進行充分溶解；
(3)得到系列梯度溶液，分別測定各梯度溶液中甘草酸和甘草黃酮的含量；
(4)取甘草酸提取物干品，用水/乙醇使其完全溶解；
(5)用AlCl3和NaNO2顯色法測定甘草總黃酮含量；
通過用不同大孔吸附樹脂在相同條件下進行吸附/解吸實驗，并采用相同方法測定殘液和解吸液中甘草總黃酮的含量，根據吸附值和解吸率選擇對甘草黃酮吸附/解吸性能優(yōu)異的大孔吸附樹脂；
(6)再將解吸液濃縮烘干，通過顯色法測其純度；
(7)取市售純度為98%的甘草酸樣品，加水完全溶解，用HPLC法測定溶液濃度；
采用與步驟(5)中同樣的方法，進行分離甘草酸的大孔吸附樹脂混合床選擇；
(8)再將解吸液濃縮烘干，通過HPLC法測其純度。[0013]本發(fā)明中所采用的大孔吸附樹脂為:從極性樹脂和非極性樹脂中選出來的幾種混
合在一起。
[0014]本發(fā)明中大孔吸附樹脂含水率的測定及其活化方法如下:
(I)大孔吸附樹脂含水率的測定
稱取一定量的MAR，在110°c的真空干燥箱中烘36 h，取出并置于干燥器內冷卻0.5 h，稱重；在同樣的溫度條件下再烘30 min，取出并置于干燥器內冷卻0.5 h，稱重。重復前面測重過程，直到前后兩次質量差(0.05 mg。根據烘干前后的質量差計算其含水率。每種樹脂在測定含水率時取兩份平行樣，以保證稱量的精確性。
[0015](2)大孔吸附樹脂的活化與純化
稱取干重約為28 g的聚酰胺樹脂和32g MAR，分別放入250 mL瓶杯中，加入150 mL乙醇浸泡24 h后，回收浸泡液。再加入適量乙醇洗滌至加入3倍體積的蒸餾水已無白色渾濁物出現(xiàn)。加入適量的蒸餾水洗滌樹脂，浸泡5 min以后棄去洗滌液，如此反復三次，使得殘留在樹脂中的乙醇能夠較充分的被水逐漸替換。
[0016]本發(fā)明中，純度的測定和計算方法如下:
用移液管分別移取對照品溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL，分別置于25 mL容量瓶中，向容量瓶中加入蒸餾水至刻度。在波長254 nm處通過HPLC測峰面積，繪制標準曲線，結果見圖 2。所得線性回歸方程為:y= 573572.lx-1863.46 (R2 = 0.996)，且在 0.08 ~0.8 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。甘草黃酮標準曲線通過用NaNO2-AlCl3-NaOH顯色法來測其吸光度，A = 10.837C + 0.00161 (R2 = 0.9991 )，且在 0.002 ~0.07 mg/mL 濃度范圍內線性關系良好。
`[0017](3)甘草黃酮和甘草酸吸附率、吸附量、解吸量、解吸率的計算
將活化處理過的聚酰胺樹脂裝入內徑為1.6 cm的交換柱中，準確移取1000 mL總濃度為2.00 mg/mL pH為9的甘草提取物溶液，控制流速為1.6 BV/h行吸附，收集殘液，用顯色法測定殘液中甘草黃酮的含量。將吸附后的MAR用蒸餾水洗滌3次，每次間隔5 min，然后準確移取2倍樹脂床體積的pH=8的70%乙醇溶液進行解吸，控制其流速為2.5 BV/h進行洗脫，收集解吸液，用顯色法測定解吸液中甘草黃酮的含量。然后再將交換柱中的聚酰胺樹脂換成MAR，將聚酰胺樹脂吸附殘液PH調到6以1.2 BV/h的流速進通過MAR進行吸附，收集殘液,通過HPLC測定殘液中甘草酸的含量，再通過2倍樹脂床體積的pH為7的70%進行解吸，控制其流速為2 BV/h進行洗脫，收集解吸液，用HPLC法測定解吸液中甘草酸的含量，依式(I)- (4)分別計算聚酰胺樹脂和MAR的吸附率、解吸率、吸附量及解吸量；依下式(5)計算經吸附解吸附分離過程后所得樣品的純度。
[0018]吸附率:
【權利要求】
1.甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其步驟為: (1)將烘干粉碎的甘草，通過常用的方法進行提取，得到含有甘草酸和甘草黃酮的提取液，然后再將提取液濃縮、烘干干燥； (2)按水、梯度水/乙醇、乙醇的次序分別對樣品進行充分溶解； (3)得到系列梯度溶液，分別測定各梯度溶液中甘草酸和甘草黃酮的含量； (4)取甘草酸提取物干品，用水/乙醇使其完全溶解； (5)用AlCl3和NaNO2顯色法測定甘草總黃酮含量； 通過用不同大孔吸附樹脂在相同條件下進行吸附/解吸實驗，并采用相同方法測定殘液和解吸液中甘草總黃酮的含量，根據吸附值和解吸率選擇對甘草黃酮吸附/解吸性能優(yōu)異的大孔吸附樹脂； (6)再將解吸液濃縮烘干，通過顯色法測其純度； (7)取市售純度為98%的甘草酸樣品，加水完全溶解，用HPLC法測定溶液濃度； 采用與步驟(5)中同樣的方法，進行分離甘草酸的大孔吸附樹脂混合床選擇； (8)再將解吸液濃縮烘干，通過HPLC法測其純度。
2.根據權利要求1所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于步驟(1)中所述為提取過程，干燥溫度為20~60°C。`
3.根據權利要求1所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于步驟(2)、(3)中所述為提取物的梯度溶解，濃度范圍0-10g/L。
4.根據權利要求1所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于步驟(4)、(5)、(6)中所述為甘草黃酮大孔吸附樹脂混合床的選擇，吸附溫度為30-60°C，解吸溫度為 30-60°C。
5.根據權利要求1所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于步驟(5)中所述大孔吸附樹脂混合床采用“接枝法”進行篩選，即先用單一大孔吸附樹脂對甘草酸標準液進行吸附/解吸，然后選出吸附分離效果最好的大孔吸附樹脂為“干枝”，分離效果較好和一般的為側枝，進行接枝，以此類推，最后篩選出效果好的大孔吸附樹脂組成混合床。
6.根據權利要求1所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于步驟(7)、(8)中所述為分離甘草酸大孔吸附樹脂混合床的選擇，烘干溫度為20~60 °C。
7.根據權利要求1中所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于，本發(fā)明中所述大孔吸附樹脂是從極性樹脂和非極性樹脂中選出的。
8.根據權利要求1中所述的甘草酸和甘草黃酮的連續(xù)分離純化方法，其特征在于，最終選用的大孔吸附混合床是從極性樹脂和非極性樹脂中選出來的幾種混合在一起組成的。
【文檔編號】A61K36/484GK103724394SQ201410000244
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權日:2014年1月2日
【發(fā)明者】陳振斌, 龍佳朋, 劉曉嬌 申請人:蘭州理工大學