小葉黃楊有效組分的制備方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種小葉黃楊有效組分的制備方法與用途，屬于中藥有效組分提取領(lǐng)域。它的制備過程包括以下步驟：a、取小葉黃楊，用質(zhì)量濃度為0～95%乙醇水溶液進(jìn)行提取，得提取液；b、將所述提取液回收溶劑至少至無醇味后，得小葉黃楊水溶液或浸膏，然后用酸水酸化，至酸化后水溶液的pH為1～6，再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取后的水部分；c、將所述水部分用堿堿化，至堿化后溶液的pH為8～14，然后用氯仿萃取，再將氯仿萃取液濃縮，干燥，即得小葉黃楊有效組分。本發(fā)明的有益效果是：利用合理的提取、富集、分離方法，得到具有對心肌氧化損傷有較強(qiáng)保護(hù)作用，可用于制備抗心肌氧化損傷藥物的小葉黃楊有效組分。
【專利說明】小葉黃楊有效組分的制備方法與用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥有效組分提取領(lǐng)域，具體涉及一種小葉黃楊有效組分的制備方法與用途。
【背景技術(shù)】
[0002]黃楊木粉一直都是民間驗方治療“心病”的有效藥物，同時黃楊屬植物中的黃楊生物堿在相關(guān)研究中也表現(xiàn)出明顯改善冠心病患者心臟功能的作用(黃丹丹，徐立。環(huán)維黃楊星D心血管系統(tǒng)藥理作用研究進(jìn)展[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報.2013，35 (1):241-243)。同屬于黃楊科(Buxaceae)黃楊屬(Buxus)的常綠灌木或小喬木植物小葉黃楊(Buxussinica(Rehd.Et Wils.) Cheng),又名青明矮、千年矮、黃頭艾、萬年青、黃木、錦熟黃楊，主產(chǎn)分布我國南部各省、區(qū)，是貴州道地藥材，收載于2003年版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，具有祛風(fēng)除濕、行氣止痛、活血通絡(luò)之功效，臨床上主要用于胸痹、心痛、風(fēng)濕痹痛、胸腹氣脹等癥的治療。在心血管疾病頻繁多發(fā)的當(dāng)今社會，貴州安泰藥業(yè)有限公司研制生產(chǎn)的“心腦寧膠囊”以小葉黃楊為主要原料，在臨床上用于氣滯血瘀的胸痹、頭痛、眩暈以及冠心病、腦動脈硬化等疾病的治療，獲得了患者的廣泛認(rèn)可。
[0003]有報道稱小葉黃楊的非生物堿成分主要為黃酮類成分(黃楊中的非生物堿化學(xué)成分，云南植物研究，2006，28 (4): 429-432)，但其治療心血管疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)未可知，作為該屬中特有的活性成分——生物堿類化合物也未見相關(guān)報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種小葉黃楊有效組分的制備方法及其用途。
[0005]本發(fā)明的小葉黃楊有效組分，其制備過程包括以下步驟:
[0006]a、取小葉黃楊，用質(zhì)量濃度為O~95%乙醇水溶液進(jìn)行提取，得提取液；
[0007]b、將所述提取液回收溶劑至少至無醇味后，得小葉黃楊水溶液或浸膏，然后用酸水酸化，至酸化后水溶液的pH為I~6,再用乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯萃取后的水部分；
[0008]C、將所述水部分用堿堿化，至堿化后溶液的pH為8~14，然后用氯仿萃取，再將氯仿萃取液濃縮，干燥，即得小葉黃楊有效組分。
[0009]優(yōu)選的，所述步驟a中提取的次數(shù)為I~4次，每次提取的時間為0.5~4小時，每次提取的乙醇水溶液用量是所述小葉黃楊重量的5~20倍。
[0010]優(yōu)選的，所述步驟b中酸選自乙酸、甲酸、磷酸、鹽酸或硫酸中的一種。
[0011]優(yōu)選的，所述步驟b中采用乙酸乙酯萃取的次數(shù)為I~5次，每次萃取所加乙酸乙酯的體積量為所述小葉黃楊水溶液體積量的0.5~10倍。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟c中堿選自Na0H、K0H、Ca(0H)2、NH3.H20、Na2CO3、二乙胺或三乙胺中的一種。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟c中采用氯仿萃取的次數(shù)為I~5次，每次萃取所加氯仿的體積量為所述小葉黃楊水溶液體積量的0.5~10倍。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟c中濃縮采用減壓濃縮或常壓濃縮中的一種。
[0015]優(yōu)選的，所述步驟c中干燥的方法為常壓干燥、減壓干燥或冷凍干燥中的一種。
[0016]一種所述的小葉黃楊有效組分為活性成分制成的藥用制劑，所述小葉黃楊有效組分加入藥用添加劑按照藥劑學(xué)允許的制備方法制成的藥用制劑。
[0017]一種小葉黃楊有效組分在制備抗心肌氧化損傷藥物中的應(yīng)用。其中，抗心肌氧化損傷采用H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用來驗證的。
[0018]本發(fā)明專利申請以0-95%乙醇水溶液提取物經(jīng)酸溶堿沉和溶劑萃取法分離和富集有效組分為關(guān)鍵技術(shù)，并通過調(diào)整酸、堿性溶液PH值，萃取溶劑體積等參數(shù)，達(dá)到最為理想的制備目的，得到富含大量生物堿類成分的有效組分。
[0019]本發(fā)明通過酸溶堿沉和溶劑萃取制備了小葉黃楊有效組分。該制備方法首先需在酸性水溶液中溶解提取物，使得生物堿類成分成離子狀態(tài)而溶解，利用乙酸乙酯萃取去除非生物堿的酸性雜質(zhì)，水部位經(jīng)堿化，生物堿類化合物呈游離狀態(tài)析出，氯仿萃取，即獲得主要含生物堿的有效組分。
[0020]本發(fā)明制備的小葉黃楊有效組分具有活血通絡(luò)、行氣止痛的功效，主治胸痹心痛，臨床可用于治療冠心病和腦動脈硬化等疾病。為了證明本發(fā)明所制備的有效組分的活性及制備方法的必要性， 申請人:進(jìn)行了以下的實驗。
[0021]分別將實施例中所述乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物(即為本發(fā)明的有效組分)、正丁醇萃取物、水部位以及多糖組分進(jìn)行了藥效學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明有效組分的抗心肌細(xì)胞氧化損傷活性顯著。在實驗中它表現(xiàn)出了劑量依賴性的抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷活性，能夠用于治療心肌細(xì)胞氧化損傷的心血管疾病。
[0022]本發(fā)明的有益效果在于:
[0023]( I)本發(fā)明有效組分制備方法，僅采用了簡單的酸溶堿沉結(jié)合溶劑萃取的方法，可大大提高廣泛運用的可操作性，采用本技術(shù)獲得以生物堿類成分為主要成分的有效組分，可用于小葉黃楊相關(guān)藥理和藥效研究。
[0024](2)本發(fā)明制備方法，利用合理的提取、富集、分離方法，依據(jù)生物堿類化合物的結(jié)構(gòu)特點及與其他類型化合物理化性質(zhì)上的差異，去除了小葉黃楊中非生物堿類成分，有效地提高了藥效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0026]圖1為本發(fā)明實施例一中乙酸乙酯萃取物對H9c2心肌細(xì)胞的安全濃度測試圖；
[0027]圖2為本發(fā)明實施例一中氯仿萃取物對H9c2心肌細(xì)胞的安全濃度測試圖；
[0028]圖3為本發(fā)明實施例一中正丁醇萃取物對H9c2心肌細(xì)胞的安全濃度測試圖；
[0029]圖4為本發(fā)明實施例一中水部分萃取物對H9c2心肌細(xì)胞的安全濃度測試圖；
[0030]圖5為本發(fā)明實施例一中多糖組分對H9c2心肌細(xì)胞的安全濃度測試圖；
[0031]圖6為本發(fā)明實施例一中乙酸乙酯萃取物對H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷能力的測試圖；[0032]圖7為本發(fā)明實施例一中氯仿萃取物對H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷能力的測試圖；
[0033]圖8為本發(fā)明實施例一中正丁醇萃取物對H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷能力的測試圖；
[0034]圖9為本發(fā)明實施例一中水部分萃取物對H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷能力的測試圖；
[0035]圖10為本發(fā)明實施例一中多糖組分對H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷能力的測試圖?！揪唧w實施方式】
[0036]為使本領(lǐng)域技術(shù)人員詳細(xì)了解本發(fā)明的生產(chǎn)工藝和技術(shù)效果，下面以具體的生產(chǎn)實例來進(jìn)一步介紹本發(fā)明的應(yīng)用和技術(shù)效果。
[0037]實施例一:
[0038]100g小葉黃楊粉碎后用10倍量質(zhì)量濃度為75%乙醇水溶液回流提取2次，每次提取的時間為2小時，合并提取液，過濾，減壓濃縮至無醇味，得400毫升小葉黃楊水溶液。
[0039]小葉黃楊水溶液用硫酸水溶液酸化，至酸化后溶液的pH值為3，用450毫升乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮至浸膏，得乙酸乙酯萃取物；
[0040]乙酸乙酯萃取后水部位用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH值為9,用450毫升氯仿萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，常壓干燥，得氯仿萃取物，即得小葉黃楊有效組分；
[0041]乙酸乙酯萃取后水部位繼續(xù)用等體積水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，分別將正丁醇萃取液和水溶液濃縮至浸膏得正丁醇萃取物以及水部位萃取物；
[0042]醇提后小葉黃楊藥渣水煎煮2次，水提液合并減壓濃縮后，加95%乙醇至含乙醇量60%，沉淀出多糖，用水溶解粗多糖，再用Sevag法除去多糖中的蛋白后得精制的多糖組分。
[0043]實施例二:
[0044]100g小葉黃楊粉碎后用20倍量質(zhì)量濃度為95%乙醇水溶液回流提取4次，每次提取的時間為0.5小時，合并提取液，過濾，減壓濃縮回收溶劑，得小葉黃楊浸膏
[0045]小葉黃楊浸膏用150mL水懸浮,水溶液用鹽酸水溶液酸化,至酸化后溶液的pH值為1，用150毫升乙酸乙酯萃取I次，得乙酸乙酯萃取后的水部位；乙酸乙酯萃取后的水部位用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)至PH值為14，用150毫升氯仿萃取2次，合并萃取液，減壓濃縮，常壓干燥，即得小葉黃楊有效組分。
[0046]實施例三:
[0047]100g小葉黃楊粉碎后用5倍量質(zhì)量濃度為50%乙醇水溶液回流提取3次，每次提取的時間為4小時，合并提取液，過濾，減壓濃縮至無醇味，繼續(xù)濃縮，得200毫升小葉黃楊水溶液。
[0048]小葉黃楊水溶液用甲酸水溶液酸化,至酸化后溶液的pH值為6，用200毫升乙酸乙酯萃取5次，得乙酸乙酯萃取后的水部位；乙酸乙酯萃取后的水部位用氫氧化鈣溶液調(diào)節(jié)至PH值為8，用200毫升氯仿萃取4次，合并萃取液，減壓濃縮，常壓干燥，即得小葉黃楊有效組分。
[0049]實施例四:
[0050]100g小葉黃楊粉碎后用20倍量水回流提取3次，每次提取的時間為4小時，合并提取液，過濾，減壓濃縮，得200毫升小葉黃楊水溶液。
[0051]小葉黃楊水溶液用磷酸水溶液酸化,至酸化后溶液的pH值為6，用200毫升乙酸乙酯萃取5次，得乙酸乙酯萃取后的水部位；乙酸乙酯萃取后的水部位用二乙胺溶液調(diào)節(jié)至PH值為8，用200毫升氯仿萃取4次，合并萃取液，減壓濃縮，常壓干燥，即得小葉黃楊有效組分。
[0052]實施例五:
[0053]為研究小葉黃楊總生物堿一氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水部位、多糖組分抗心肌細(xì)胞氧化損傷作用，本實驗采用H202誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷實驗檢測實施例一中所得各組分對氧化損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
[0054]實驗材料
[0055]1、受試藥物:小葉黃楊乙酸乙酯萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物、水部位、多糖
組分由貴州省藥物制劑重點實驗室提供。
[0056]2、實驗用細(xì)胞:H9c2大鼠心肌細(xì)胞，購自中科院上海細(xì)胞庫。
[0057]3、試劑:所用化學(xué)試劑乙醇、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇均為分析純，購自上海申博化工；乙腈為色譜純，購自美國Merck ;高糖DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶(美國GIBC0)，胎牛血清(德國Biochrom),四氮唑 蘭(美國Sigma), H2O2,維生素E等。
[0058]實驗方法與結(jié)果
[0059]實驗方法:
[0060]1、心肌細(xì)胞的培養(yǎng):H9c2心肌細(xì)胞置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37°C,5% CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期、生長良好的細(xì)胞，以細(xì)胞密度約3X IO5個/mL種植于96孔培養(yǎng)板中,將培養(yǎng)板置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后,用于實驗。
[0061]2、受試樣品對H9c2細(xì)胞安全濃度的確定:取對數(shù)生長期、生長良好的細(xì)胞，以每孔100 μ L細(xì)胞密度約3 X IO5個/mL種植于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h?？瞻讓φ战M每孔加入100 μ L DMEM培養(yǎng)液；乙酸乙酯萃取物組分別加入100 μ L不同濃度含藥培養(yǎng)液(3.125,6.25、12.5、25、50 μ g/mL)，氯仿萃取物組分別加入100 μ L不同濃度含藥培養(yǎng)液(6.25、12.5、25、50、100μ g/mL)，正丁醇萃取物組分別加入100 μ L不同濃度含藥培養(yǎng)液(12.5、25、50、100、200μ8/πιυ，水部位組分別加入IOOyL不同濃度含藥培養(yǎng)液(31.25、62.5、125、250、500μ8/πιυ，多糖組分別加入100 μ L不同濃度含藥培養(yǎng)液(31.25,62.5、125、250、500μ g/mL)，作用 24h 后用 MTT 法檢測。
[0062]3、試驗用氧化損傷心肌細(xì)胞模型制備:取生長狀態(tài)良好H9c2心肌細(xì)胞，以每孔100 μ L細(xì)胞密度約3 X IO5個/mL種植于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。分別設(shè)空白對照組、不同濃度H202 (700，900，1100，1300，1500ymol/L)組?？瞻讓φ战M每孔加入100 μ L DMEM培養(yǎng)液，H2O2組分別加入100 μ L含不同濃度過氧化氫培養(yǎng)液作用心肌細(xì)胞，作用4h后用MTT法檢測。選擇H9c2心肌細(xì)胞存活率在40%~60%之間的H2O2濃度為造模濃度。
[0063]4、對過氧化氫所致H9c2細(xì)胞氧化損傷狀態(tài)下細(xì)胞存活率的影響:取生長狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞，以每孔100 μ L細(xì)胞密度約3 X IO5個/mL種植于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。實驗分別設(shè)空白組對照、H2O2模型組(1500 μ mol/L)、Vitamin E陽性對照組(10 μ mol/L)和多濃度實驗組。空白對照組與H2O2模型組每孔加入100 μ L DMEM培養(yǎng)液；VitaminE陽性對照組加入含10 μ mol/L Vitamin E的DMEM培養(yǎng)液100 μ L ;多濃度實驗組乙酸乙酯萃取物(6.25、12.5、25 μ g/mL)，氯仿萃取物(2.5、5、10 μ g/mL),正丁醇萃取物(12.5、25、5(^8/11^)，水部位(125、250、50(^8/1^)，多糖組分(15.63,31.25、62.5 μ g/mL)分別加入相應(yīng)含不同濃度試藥DMEM培養(yǎng)液100 μ L預(yù)培養(yǎng)24h ；正常對照組每孔加入100 μ L DMEM培養(yǎng)液，其余各組加入含1500 μ mol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)液100 μ L，作用4h后用MTT法檢測細(xì)胞存活率。
[0064]結(jié)果:
[0065]各組分安全濃度實驗結(jié)果見圖1-5。從圖中可以看出，當(dāng)乙酸乙酯萃取物< 25 μ g/mL,氯仿萃取物< 12.5 μ g/mL,正丁醇萃取物< 50 μ g/mL,水部位< 500 μ g/mL,多糖組分< 62.5 μ g/mL時，各組分對H9c2心肌細(xì)胞均無明顯毒性(與空白對照組相比，細(xì)胞存活率沒有顯著性差異P>0.05)。因此在后續(xù)的藥效評價實驗中，各組分分別在其安全濃度范圍內(nèi)的3個濃度上進(jìn)行評價。
[0066]實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過氧化氫濃度為1500 μ mol/L時，細(xì)胞存活率可以達(dá)到50%左右(見圖6-10)，因此選用該濃度為造模濃度。
[0067]本發(fā)明實施例一制備的各組分對H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用見圖6-10。結(jié)果表明，在安全濃度范圍內(nèi)，氯仿萃取物具有明顯的抗氧化損傷保護(hù)活性(見圖7，與模型組相比，*#P < 0.001，**P < 0.01，或*P < 0.05，各測試濃度組均有顯著性差異)，在給藥濃度為10 μ g/mL時細(xì)胞存活率接近70%，與模型組比較其存活率提高了近20%，且在一定濃度范圍呈現(xiàn)劑 量依賴趨勢，而乙酸乙酯萃取物(圖6)、正丁醇萃取物(圖8)、水部位(圖9)和多糖組分(圖10)未見保護(hù)作用，且大都在一定濃度下明顯加重了心肌細(xì)胞的氧化損傷(#*P < 0.001，**P < 0.01，或*P < 0.05)。從實驗結(jié)果分析來看，雖然小葉黃楊氯仿組分安全濃度和范圍較小，但是與其他組分比較起來，該組分能夠在較低的濃度時就表現(xiàn)較明顯的抗氧化損傷活性并且呈現(xiàn)劑量依賴趨勢，這也同時表明，小葉黃楊的氯仿組分在心血管疾病的治療中具有重要意義。
[0068]圖6-10中，本發(fā)明實施例一制備的各組分對H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。.ρ<0.001表示H2O2模型組與空白組相比在0.001水平上具有顯著性差異；*Ρ < 0.05，#Ρ < 0.01，< 0.001則分別表示實驗組與模型組相比，差異有不同水平的統(tǒng)計意義。另圖中VE指維生素E陽性對照組。
[0069]實驗中所用的細(xì)胞為生長良好的H9c2心肌細(xì)胞，經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后導(dǎo)致氧化損傷的心肌細(xì)胞。乙酸乙酯萃取物是實施例一中所述乙酸乙酯萃取物；氯仿萃取物是實施例一中所述氯仿萃取物；正丁醇萃取物是實施例一中所述正丁醇萃取物；水部位是實施例一中所述的水部位萃取物；多糖組分是實施例一中所述的多糖組分。
[0070]最后應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
【權(quán)利要求】
1.一種小葉黃楊有效組分的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: a、取小葉黃楊，用質(zhì)量濃度為O~95%乙醇水溶液進(jìn)行提取，得提取液； b、將所述提取液回收溶劑至少至無醇味后，得小葉黃楊水溶液或浸膏，然后用酸水酸化，至酸化后水溶液的pH為I~6,再用乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯萃取后的水部分； C、將所述水部分用堿堿化,至堿化后溶液的pH為8~14,然后用氯仿萃取,再將氯仿萃取液濃縮，干燥，即得小葉黃楊有效組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小葉黃楊有效組分的制備方法，其特征在于:所述步驟a中提取的次數(shù)為I~4次，每次提取的時間為0.5~4小時，每次提取的乙醇水溶液用量是所述小葉黃楊重量的5~20倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小葉黃楊有效組分的制備方法，其特征在于:所述步驟b中酸選自乙酸、甲酸、磷酸、鹽酸或硫酸中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小葉黃楊有效組分的制備方法，其特征在于:所述步驟b中采用乙酸乙酯萃取的次數(shù)為I~5次，每次萃取所加乙酸乙酯的體積量為所述小葉黃楊水溶液體積量的0.5~10倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小葉黃楊有效組分的制備方法，其特征在于:所述步驟c中堿選自NaOH、KOH、Ca(OH)2、NH3.H20、Na2C03、二乙胺或三乙胺中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小葉黃楊有效組分的制備方法，其特征在于:所述步驟c中采用氯仿萃取的次數(shù)為I~5次，每次萃取所加氯仿的體積量為所述小葉黃楊水溶液體積量的0.5~10倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的小葉黃楊有效組分的制備方法，其特征在于:所述步驟c中濃縮采用減壓濃縮或常壓濃縮中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小葉黃楊有效組分的制備方法，其特征在于:所述步驟c中干燥的方法為常壓干燥、減壓干燥或冷凍干燥中的一種。
9.一種利用權(quán)利要求1-8中任意一項所述的小葉黃楊有效組分為活性成分制成的藥用制劑，其特征在于:所述小葉黃楊有效組分加入藥用添加劑按照藥劑學(xué)允許的制備方法制成的藥用制劑。
10.一種利用權(quán)利要求1-8中任意一項所述的小葉黃楊有效組分在制備抗心肌氧化損傷藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P9/00GK103655648SQ201310703831
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】廖尚高, 王永林, 劉俊宏, 關(guān)煥玉, 張越浩, 鐘瑞鋒, 李勇軍, 孫佳, 何迅, 蘭燕宇 申請人:貴陽醫(yī)學(xué)院