P選擇素抑制劑在防治兔門靜脈血栓中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及門靜脈血栓形成的防治應(yīng)用，尤其涉及一種P選擇素抑制劑rPSLG-Ig在防治兔門靜脈血栓中的應(yīng)用。所述P選擇素抑制劑為PSGL-1免疫球蛋白重組體。PSGL-1免疫球蛋白重組體(recombinantPSGL-1immunoglobulin,rPSLG-Ig)作為PSGL-1抗體，能通過競爭P-sel的天然配體的PSGL-1，以達到拮抗P-sel作用，從而抑制損傷動脈表面循環(huán)中血小板的活化，并能抑制活化血小板與中性粒細胞結(jié)合。通過阻斷P-sel與其配體的相互作用對相關(guān)疾病的治療具有重要意義。
【專利說明】P選擇素抑制劑在防治兔門靜脈血栓中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及門靜脈血栓形成的防治應(yīng)用，尤其涉及一種P選擇素抑制劑rPSLG-1g在防治兔門靜脈血栓中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]門靜脈血栓形成(portal vein thrombosis, PVT )是指發(fā)生于門靜脈主干、腸系膜上靜脈、腸系膜下靜脈或脾靜脈的血栓，是肝硬化門靜脈高壓癥患者針對脾臟功能亢進及食管胃底靜脈曲張破裂出血行脾臟切除(或聯(lián)合血管斷流)術(shù)后嚴重并發(fā)癥之一 [I]。Okuda報道日本病理協(xié)會247728例患者的尸解結(jié)果，門靜脈栓塞的發(fā)生率為0.55%，肝硬化患者門靜脈栓塞率為6.59%，脾切除術(shù)后PVT發(fā)生率為37.5%~43.5%[2]。一旦PVT形成可導(dǎo)致肝臟血流灌注不足及胃腸淤血加重，若同時合并急性腸系膜靜脈血栓形成則可致腸壞死；廣泛的門脈血栓將嚴重影響后期肝移植成功率[3]。故如何防治手術(shù)后PVT是外科臨床極為關(guān)注的問題。
[0003]CN101961465A(2011-2-2)公開了一種治療門靜脈血栓的中藥，然而該中藥需要服用的時間長，并且對預(yù)防門靜脈血栓的作用甚微。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種能指導(dǎo)早期預(yù)防用藥且能治療該疾病的P選擇素抑制劑在防治兔門靜脈血栓中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的:
P選擇素抑制劑在防治兔門靜脈血栓中的應(yīng)用，其所述P選擇素抑制劑為PSGL-1免疫球蛋白重組體。
[0006]研究發(fā)現(xiàn)PSGL-1是P-sel高親和力配體，其主要表達于中性粒細胞和單核細胞。P-sel通過與PSGL-1結(jié)合，導(dǎo)致中性粒細胞β 2-整合素活化，活化后的β 2-整合素可與細胞間黏附分子-1結(jié)合，促進中性粒細胞酪氨酸磷酸化，誘導(dǎo)單核細胞釋放單核細胞趨化蛋白-1及腫瘤壞死因子_α及淋巴細胞上遲現(xiàn)抗原-4及⑶Ilb的表達，最終導(dǎo)致血栓形成。而 PSGL-1 免疫球蛋白重組體(recombinant PSGL-1 immunoglobulin, rPSLG-1g)作為PSGL-1抗體，能通過競爭P-sel的天然配體的PSGL-1，以達到拮抗P_sel作用，從而抑制損傷動脈表面循環(huán)中血小板的活化，并能抑制活化血小板與中性粒細胞結(jié)合。通過阻斷P-sel與其配體的相互作用對相關(guān)疾病的治療具有重要意義。
[0007]體內(nèi)血栓形成的凝血反應(yīng)均起始于血小板活化，而血小板活化標志物是P選擇素(P-selectin, P_sel)，其存在于血管內(nèi)皮細胞的WeibelPalade小體膜上及血小板A顆粒膜上，可通過介導(dǎo)血小板、內(nèi)皮細胞黏附及與白細胞的相互作用，參與啟動血栓形成的病理生理起始過程，是血栓形成的重要介質(zhì)和靶分子。動物實驗證實采用P-sel或P-選擇素糖蛋白配體-1 (PSGL-1)基因剔除技術(shù)后纖維蛋白形成和血栓塊可明顯減少?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0008]圖1是rPSLG-1g在預(yù)防PVT形成中作用研究路線圖；
圖2是rPSLG-1g在PVT溶栓過程中作用研究路線圖。
【具體實施方式】
[0009]以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0010]本實驗旨在通過門靜脈置管結(jié)扎法建立穩(wěn)定的門靜脈血栓動物模型，通過隨機對照實驗方法，研究全身使用rPSLG-1g在PVT形成中預(yù)防作用，并采用局部給藥觀察其在PVT溶栓過程中作用及療效，為rPSLG-1g防治PVT提供動物實驗基礎(chǔ)。
[0011]1、工作基礎(chǔ)條件
(I)人員組合及配備:本實驗組人員配備及分工合理，共組建以下四小組:手術(shù)組、檢驗組、數(shù)據(jù)收集統(tǒng)計組及影像組。人員均具有較高的臨床實踐能力及科研能力，已完成市、廳級項目多項，曾獲市科技進步獎及市自然科學(xué)優(yōu)秀論文獎各一項。
[0012](2)科研項目工作條件:本院是地區(qū)專病中心，肝膽胰外科是省重點扶植學(xué)科。資金配套方面，醫(yī)院以1:1配套。院中心實驗室是本地區(qū)重點實驗室，曾承擔過多項省、部級及國家級科研項目，有著豐富的科研基礎(chǔ)，已取得多項科研成果?，F(xiàn)已具備本實驗的所需的儀器設(shè)備、器械及動物試驗條件，SAS9.1及SPSS17統(tǒng)計軟件已就緒，可保證實驗的順利完成。
[0013](3)既往門靜脈血栓相關(guān)的研究:本實驗組既往承擔過與本實驗相關(guān)的市科技局科研項目:監(jiān)測P-sel、TpP、D-D對門脈高壓脾切后PVT早期預(yù)測研究(2010YSB08)，研究通過連續(xù)觀察手術(shù)前及術(shù)后各時間點P-sel的變化，建立依時協(xié)變量COX風險模型，提示P-sel可作為門脈高壓癥脾切術(shù)后門脈血栓早期預(yù)測敏感指標，可指導(dǎo)早期藥物預(yù)防。對于P-sel在脾切除術(shù)后PVT形成過程中表達規(guī)律及相關(guān)機理有了深入的研究，為進一步藥物防治研究奠定了基礎(chǔ)。
[0014](4)實驗前期預(yù)實驗:門靜脈結(jié)扎置管法建立兔門靜脈血栓模型的研制:我們已熟練掌握兔門靜脈血栓模型的成模方法。按標書要求購得8只新西蘭兔(實驗動物許可證號:SCXK (浙)2009-0039)，成功造模6只，成模率為75%，造模后經(jīng)門脈造影發(fā)現(xiàn)門靜脈血栓最早時間為30min左右，解剖兔門靜脈可正確評估血栓大小及范圍，有利于評估藥物的作用。
[0015]2、研究方法
(I)采用門靜脈結(jié)扎置管法建立兔門靜脈血栓模型。
[0016]①實驗動物:健康，雌雄不限，清潔級新西蘭白兔50只，體重2_4kg。
[0017]②實驗過程:
A、術(shù)前準備:術(shù)前實驗兔禁食過夜，自由飲水。
[0018]B、麻醉方法:氯胺酮(2 ml /支,100 mg)和咪唑安定(5 ml /支，5mg)各2ml等體積混合液后，再以生理鹽水I倍稀釋，經(jīng)耳緣靜脈注射，并觀察兔反應(yīng)，當發(fā)現(xiàn)其頭部下垂時即停止注射，30 min后若發(fā)現(xiàn)兔有蘇醒躁動征象，可在不超過安全用量(兩種藥物安全用量:氯胺酮50 mg / kg,咪唑安定5 mg / kg)情況下,追加上述藥物。
[0019]C、手術(shù)方法:麻醉后進行施術(shù)區(qū)備皮、消毒等術(shù)前準備，逐層進腹，分離門靜脈，經(jīng)自制半套管式置管法插入2Fr的頸內(nèi)靜脈導(dǎo)管，以導(dǎo)管為內(nèi)支撐，3-0線結(jié)扎門靜脈，每間隔I分鐘結(jié)扎2分鐘，共3次，撤除結(jié)扎線，導(dǎo)管以6-0 Prolene線縫合固定，并引出體外，牢固固定。
[0020](2)研究數(shù)據(jù)收集:
隨機分組后分別于血栓形成前及溶栓過程中應(yīng)用rPSLG-1g，并收集實驗組與對照組血栓形成時間、成栓率、血栓大小、溶栓后血管再通率及各時間點P-sel等觀察指標，以此評價rPSLG-1g在預(yù)防PVT形成及溶栓過程中作用。
[0021]①門靜脈血栓數(shù)據(jù)的獲取:
A、通過實驗兔動態(tài)門靜脈造影獲取血栓形成時間、部位及血栓再通率:造?；蚓植咳芩ㄖ委熀蟾鲿r點將術(shù)后門靜脈血栓模型兔蒙眼后置于大小合適的紙板盒內(nèi)，將動脈延長管排氣后與導(dǎo)管連接，并引至盒外以備用，造影劑量為30%優(yōu)維顯5ml等量稀釋I倍后緩慢注入，以55KV、63mA及160mS為血管造影條件射片，動態(tài)觀察門靜脈成栓時間、部位范圍及局部溶栓后血管栓塞再通情況，從而評價其藥物預(yù)防作用和溶栓療效。
[0022]B、通過實驗兔門靜脈解剖獲取血栓大小:經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉后，解剖顯露門靜脈，白熾燈光源透視照射下觀察，結(jié)合擠壓試驗判定門靜脈系統(tǒng)血栓形成部位，完整切除門靜脈并縱向剖開血管，取出門脈血栓標本，測量其大小。按大小分為4等級:0級為無血栓，I級為縱徑長小于等于0.5cm, 2級為縱徑長0.6-1.5cm, 3級為縱徑長1.6-2.0cm, 4級為縱徑長大于等于2.1cm0
[0023]C、通過實驗兔門靜脈導(dǎo)管抽取血液檢測P-選擇素含量:按各時間點抽取造模后實驗兔門靜脈血2ml，保存在 裝有含檸檬酸鈉109 nmol / L的溶液0.3ml的試管中，即送實驗室離心后，取血漿0.5ml置人-70°C冰箱，檢測方法為ELISA法，按照公司提供的試劑盒說明進行操作。
[0024](3)技術(shù)路線圖
①rPSLG-1g在預(yù)防PVT形成中作用研究(實驗一)
具體實驗路線見圖1。
[0025]②rPSLG-1g在PVT溶栓過程中作用研究(實驗二)
具體實驗路線見圖2。
[0026](4)統(tǒng)計分析，得出實驗結(jié)論。
[0027]采用SAS9.1及SPSS17.0統(tǒng)計軟件，分別對全身預(yù)防性用藥(實驗一)與局部溶栓性用藥(實驗二)建立如下的統(tǒng)計模型，進行相關(guān)的統(tǒng)計分析:
①針對實驗一中PVT形成時間和實驗二中溶栓時間的觀測值，建立上述兩種情形下實驗組和對照組時間曲線的Kaplan-Meier估計，并利用1grank檢驗比較其分布曲線的差
巳
升；
②針對實驗一和實驗二，分別建立實驗組與對照組樣本的P- s e I隨時間變化的均值-方差模型與非參數(shù)模型，體現(xiàn)不同情形下P-sel分布及變化的規(guī)律與特征；
③在②的基礎(chǔ)上，分別以血栓形成率和血管再通率為響應(yīng)變量，以P-sel、實驗組與對照組為協(xié)變量，建立兩個實驗不同時間的logistic模型，定量描述rPSLG-1g使用對預(yù)防PVT形成和促使溶栓的整體效果；
④對實驗一，在③的基礎(chǔ)上，進一步建立有序多分類的logistic模型，研究rPSLG-1g使用對形成血栓大小等級的影響；對實驗二，可以分別通過溶栓時間曲線和優(yōu)勢比(OddsRatio)來比較單獨使用rPSLG-1g、尿激酶在PVT溶栓中的影響。
[0028] 本具體實施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對本實施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護。
【權(quán)利要求】
1.P選擇素抑制劑在防治兔門靜脈血栓中的應(yīng)用，其特征在于:所述P選擇素抑制劑為PSGL-1免疫球蛋白 重組體。
【文檔編號】A61P7/02GK103690950SQ201310703695
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】魏云海, 張國雷, 戴利成, 慎華平, 吳萬波, 徐杰偉 申請人:魏云海