一種用于治療膿毒癥急性肺損傷的小核酸藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了膽固醇修飾的HuR干擾siRNA在制備膿毒癥急性肺損傷的治療藥物中的用途。本研究涉及到的HuR干擾siRNA是一種人工合成的，且膽固醇修飾過的小核酸藥物，通過靜脈給藥發(fā)現(xiàn)該HuR?siRNA能較豐富地分布于肺組織，并進入肺部細胞，抑制多種3’-UTR具有HuR結(jié)合位點的炎癥因子mRNA，如TNFα的表達，促進TNFαmRNA的降解，從而抑制細菌脂多糖LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。該小核酸藥物作用明顯，對肺部炎癥的緩解作用明顯，適應(yīng)于靜脈、吸入或氣道內(nèi)給藥，在目前急性肺損傷缺少相關(guān)有效核酸藥物的前提下，是一種很有應(yīng)用價值與前景的用以治療急性肺損傷的小核酸藥物。
【專利說明】一種用于治療膿毒癥急性肺損傷的小核酸藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種小分子RNA即HuR siRNA在制備膿毒癥急性肺損傷或肺部炎癥疾病的治療藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的以頑固性的低氧血癥和呼吸窘迫為特征的全身炎癥反應(yīng)綜合征。急性肺損傷常見的病因有膿毒癥、創(chuàng)傷、休克等。膿毒癥(sepsis)是其最多見的病因。
[0003]目前膿毒癥急性肺損傷的主要發(fā)病機制包括以下幾種，(I)細胞機制:參與炎癥的主要細胞有中性粒細胞、肺泡巨噬細胞、肺血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞、淋巴細胞等。Lea F等研究顯示，中性粒細胞凋亡與膿毒癥嚴(yán)重度成反比例關(guān)系。膿毒癥時可激活肺泡巨噬細胞釋放大量前炎癥細胞因子。此外血管內(nèi)皮細胞和/或上皮細胞損傷加速急性肺損傷的發(fā)展。在ALI時，活化的淋巴細胞數(shù)目和活化的強度都有增高，參與ALI的發(fā)展。
(2)促炎細胞因子和抗炎細胞因子機制:在膿毒癥致急性肺損傷過程中，機體釋放多種促炎癥細胞因子和炎癥介質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)。與此同時，機體也出現(xiàn)了各種抗炎癥細胞因子，兩者之間的平衡維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，若兩者失衡，則出現(xiàn)失控性全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，研究顯示全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的開始是膿毒癥致急性肺損傷發(fā)病機制的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，決定是否發(fā)生肺損傷，成為急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病的基礎(chǔ)。促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)包括腫瘤壞死因子a (TNFa )、白介素(IL) 21、IL26、IL28、磷脂酶A2、血小板激活因子(PAF)、一氧化氮(NO)等。其中，TNFa是導(dǎo)致膿毒癥及其相關(guān)性AL I的重要的啟動因子。(3)血凝和纖維蛋白溶解抑制:在正常情況下，全身循環(huán)和肺中凝血及纖維蛋白沉積得到控制，在嚴(yán)重膿毒癥、ALI和ARDS的失控性炎癥環(huán)境中，這些系統(tǒng)轉(zhuǎn)向促凝和抗纖維蛋白溶解，炎癥介質(zhì)通過`損害抗凝和纖維蛋白溶解來促進這些反應(yīng)。反過來，凝血酶形成增加炎癥反應(yīng)和加重?fù)p傷。纖維蛋白沉積和隨后刺激成纖維細胞聚集及膠原的分泌，導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化。最近的研究表明抗凝劑對嚴(yán)重膿毒癥致急性肺損傷的發(fā)展顯示了積極效果。
[0004]雖然在臨床上應(yīng)用藥物治療ALI有一定的進展，但ALI發(fā)病的具體機制的認(rèn)識還不全面。因此，對膿毒癥致急性肺損傷的機制進行系統(tǒng)深入的研究，在膿毒癥和AL I/ARDS的治療上具有重要的意義(占利民等，安徽醫(yī)藥，膿毒癥相關(guān)性急性肺損傷發(fā)病機制研究進展，2010)。
[0005]由于急性肺損傷病因病機復(fù)雜，病死率高，目前臨床上尚無確切有效的控制病死率的藥物。常用的治療方法有機械通氣、β 2受體激動劑、抗炎抗氧化、抗凝溶栓、表面活性劑等。
[0006]目前有一些siRNA已被研究認(rèn)為對ALI有治療作用，這些siRNA作用的靶基因有H0-1、MIP-2、Fas ligand、angiogenic growth factor-2、discoidin-2、ENaC、Cavelin-1、C5A receptor等。這些研究均從實驗上提供了有力的證據(jù)表明siRNA是治療急性肺損傷很有前景的藥物。但值得注意的是siRNA應(yīng)用于臨床仍面臨許多挑戰(zhàn)，例如如何確保siRNA的組織特異性并能被靶細胞有效地攝取。目前認(rèn)為未修飾的siRNA經(jīng)吸入或支氣管注入能特異地作用于肺組織，而siRNA的使用量與其能否被靶細胞攝取及能否有效地阻斷靶基因相關(guān)。另外，siRNA的使用時期也取決于疾病的病理狀態(tài)。
[0007]HuR是一種常見的RNA結(jié)合蛋白，能結(jié)合于多種細胞因子的3’ -UTR上富含AUUUA序列，從而穩(wěn)定目標(biāo)RNA或促進目標(biāo)RNA的翻譯。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)參與急性肺損傷的很多炎癥因子如TNF a，C0X-2mRNA的3’ -UTR含有很多AUUUA序列，HuR能結(jié)合這些序列，從而穩(wěn)定這些炎癥因子表達促進炎癥發(fā)展。到目前為止，并沒有針對HuR設(shè)計siRNA用于膿毒癥急性肺損傷治療。根據(jù)該不足，本發(fā)明設(shè)計HuR的干擾siRNA，通過膽固醇修飾后增加肺部細胞對siRNA的攝取，尾靜脈給藥siRNA用于治療急性肺損傷，結(jié)果表明膽固醇修飾的HuR siRNA能顯著緩解膿毒癥急性肺損傷。表明膽固醇修飾后的HuR siRNA能用于緩解或治療肺部急性肺損傷，對肺部炎癥性疾病有很能好的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供膽固醇修飾的HuR siRNA在制備急性肺損傷的治療藥物中的用途。
[0009]本發(fā)明為了實現(xiàn)上述目的，設(shè)計并篩選了一條HuR siRNA干擾序列，發(fā)現(xiàn)該序列能在體外抑制LPS或者其它致炎因子哇巴因(ouabain)誘導(dǎo)的肺上皮細胞炎癥因子TNF α表達。且促進TNFa mRNA的降解。通過分子生物學(xué)研究手段發(fā)現(xiàn)，HuR作為一種RNA結(jié)合蛋白，能結(jié)合于TNF α 3’-UTR富含AUUUA序列區(qū)穩(wěn)定TNF a mRNA,相應(yīng)地HuR siRNA能解除該穩(wěn)定作用。為驗證HuR siRNA的 體內(nèi)作用，本發(fā)明采用霧化吸入LPS方法建立急性肺損傷小鼠模型，將該HuR siRNA膽固醇修飾,并標(biāo)記cy5進行體內(nèi)示蹤。尾靜脈注射HuR siRNA,發(fā)現(xiàn)該小核酸藥物不僅能大量分布于肺部組織，也能明顯緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，并在體內(nèi)抑制炎癥因子TNFa的釋放。因此，針對HuR的炎癥因子穩(wěn)定功能，設(shè)計膽固醇修飾的HuR siRNA是很有前景的治療急性肺損傷的小核酸藥物。
[0010]本發(fā)明公開發(fā)膽固醇修飾的HuR siRNA在制備治療膿毒癥急性肺損傷藥物中的應(yīng)用，所述 HuR siRNA 序列為 5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’ (SEQ ID N0.1)。該 HuRsiRNA為人工合成序列。
[0011]本發(fā)明中，該HuR siRNA通過膽固醇修飾增強其對細胞的侵入能力，也可以制備成相應(yīng)病毒如腺病毒表達載體，通過靜脈注射給藥，或肺部給藥如霧化吸入，氣管內(nèi)給藥等。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的優(yōu)勢
[0013](I)核酸藥物相對于蛋白質(zhì)藥物具有免疫原性小，制作合成工藝相對簡單，成本低廉等優(yōu)點。
[0014](2)制約核酸藥物的很大因素在于給藥系統(tǒng)的不足。無論是對miRNA還是siRNA小核酸藥物，傳統(tǒng)的給藥方式是設(shè)計合適表達載體，并采用相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑將該表達載體轉(zhuǎn)入組織與細胞中，但實際上很多轉(zhuǎn)染試劑具有毒性、轉(zhuǎn)染細胞無選擇性、構(gòu)建的載體要在細胞內(nèi)是否能表達、表達效率如何等等，這些都是限制核酸藥物發(fā)揮作用的主要障礙。本發(fā)明針對上皮細胞豐富的膽固醇受體這一特點，將直接人工合成的siRNA進行膽固醇修飾后給藥，結(jié)果表明這些siRNA能很好地富集于肺部部位，并進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此在小核酸藥物給藥方式上是較好的創(chuàng)新。
[0015](3)HuR是一種作用非常廣泛的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，能穩(wěn)定多種炎癥因子3’ -UTR上富含AUUUA序列，從而穩(wěn)定這些炎癥因子或促進這些因子的表達。因此HuR是一個很有前景的炎癥治療靶蛋白。但是到目前為止，很少見到相關(guān)報道。本研究首次應(yīng)用HuR siRNA進行急性肺損傷治療，具有明顯的開創(chuàng)性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1HuR siRNA在肺上皮細胞A549中的干擾效果驗證
[0017]圖2A549細胞轉(zhuǎn)染HuR干擾片段24小時后，對TNF- a mRNA降解的影響
[0018]圖3TNF- α 3 ’ UTR及其變體示意圖
[0019]圖4TNF- α 3 ’ -UTR的Τ55變體能夠代替全長3 ’ -UTR發(fā)揮調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性作用
[0020]圖5致炎因子哇巴因能穩(wěn)定TNF- α 3’ -UTR的Τ55變體的Iuciferase活性
[0021]圖6TNF- α 3’ -UTR的Τ55變體中AUUUA序列突變示意圖
[0022]圖7完整的AUUUA序列是調(diào)節(jié)TNF mRNA穩(wěn)定性的重要因素
[0023]圖8HuR siRNA下調(diào)ouabain誘導(dǎo)的T55報告基因的表達,過表達HuR上調(diào)ouabain誘導(dǎo)的T55報告基因的表達。#ρ〈0.01，***ρ<0.001，與對照組相比
[0024]圖9膽固醇修飾的HuR siRNA示意圖
[0025]圖10小鼠尾靜脈注射Cy5標(biāo)記的HuR siRNA,藥物分布于肺部組織中
[0026]圖11肺組織冰凍切片顯示膽固醇修飾的siRNA進入細胞，scale bars:50 μ m
[0027]圖12Western驗證HuR siRNA干擾片段體內(nèi)干擾效果
[0028]圖13HuR siRNA給藥LPS誘導(dǎo)急性小鼠肺損傷后，肺組織MPO活性
[0029]圖14HuR siRNA給藥LPS誘導(dǎo)急性小鼠肺損傷后，肺組織H&E染色結(jié)果
[0030]圖15HuR siRNA給藥LPS誘導(dǎo)急性小鼠肺損傷后，肺組織炎癥因子表達結(jié)果，scale bar=100 μ m, *ρ〈0.05，**ρ〈0.01，***ρ〈0.001 與對照組相比。
【具體實施方式】
[0031 ]實施例一:HuR siRNA 去穩(wěn)定 TNF- a mRNA
[0032]為了確定HuR涉及對TNF- a mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控，我們針對HuR篩選、合成了多條siRNA，從中選擇一條干擾效果最好的片段，為5’ -AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3’ (SEQ IDN0.27)ο 將這條 siRNA 米用 lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染至 A549 細胞，western blot 驗證蛋白質(zhì)表達，發(fā)現(xiàn)該RNAi幾乎完全抑制HuR的表達(圖1)。在此情況下，研究HuR siRNA對TNF- a mRNA降解速率的影響，方法是逆轉(zhuǎn)錄PCR法，在HuR siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)加入Act D (mRNA合成抑制劑)，然后收集Act D處理后1，2小時細胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR擴增，該實驗結(jié)果表明干擾HuR后，TNF- a mRNA的半衰期明顯縮短(圖2)。表明HuR對TNF- a mRNA具有明顯的穩(wěn)定作用。
[0033]實施例二:HuR能結(jié)合TNF- a mRNA3’ UTR起到穩(wěn)定作用
[0034]TNF- α 3’ UTR在mRNA穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用，本發(fā)明為了確定TNF- α 3’ UTR上最小敏感性反應(yīng)元件，采用PCR與分子克隆方法構(gòu)建人TNF3’ -UTR全長和4個截短變體的Iuciferase報告質(zhì)粒，分別命名為Τ789、Τ430、Τ360、Τ142和Τ55 (圖4)。其構(gòu)建所涉及PCR引物如下:
【權(quán)利要求】
1.膽固醇修飾的HuRSiRNA在制備治療膿毒癥急性肺損傷藥物中的應(yīng)用，HuR siRNA序列如SEQ ID N0.27所示。根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于該HuR siRNA為人工合成序列。
2.一種用于治療膿毒癥急性肺損傷的小核酸藥物，其特征在于，是膽固醇修飾的HuRsiRNA, HuR siRNA 序列如 SEQ ID N0.27 所示。
【文檔編號】A61K48/00GK103656681SQ201310652876
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】殷武, 曹丹, 卞金俊, 華子春 申請人:南京大學(xué), 上海長海醫(yī)院