覆盆子提取物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥開(kāi)發(fā)利用領(lǐng)域，具體涉及覆盆子開(kāi)發(fā)利用。本發(fā)明提取物包括水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分任一部分；提取物具有預(yù)防、治療抗老年癡呆作用。原料來(lái)自綠色植物，具有廣闊的開(kāi)發(fā)空間及應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】覆盆子提取物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥開(kāi)發(fā)利用領(lǐng)域，具體設(shè)計(jì)覆盆子開(kāi)發(fā)利用。
【背景技術(shù)】
[0002]進(jìn)入21世紀(jì)，老齡化社會(huì)正在悄然來(lái)臨，我國(guó)于1999年末成為老年型國(guó)家，而且我國(guó)老年人口以3%的速度增長(zhǎng)。在老年人中疾病的排列順序是心臟病、腫瘤、腦血管病，第四位是老年性癡呆。據(jù)估計(jì)，在65歲以上的老年人中，有10%患有輕度和中度癡呆。4-5%患有嚴(yán)重癡呆，85歲以上的老人這個(gè)比例超過(guò)15%。有專家預(yù)言，老年性癡呆將是21世紀(jì)人類第一殺手，目前全球的老年性癡呆病人估計(jì)在2000-2500萬(wàn)。美國(guó)超過(guò)400萬(wàn)，中國(guó)已超過(guò)500萬(wàn)。癡呆給病人、家庭和社會(huì)帶來(lái)諸多方面的危害，如個(gè)人生活質(zhì)量下降，治療藥物、醫(yī)療、護(hù)理照料費(fèi)用，由于病人的精神癥狀、行為和人格障礙給社會(huì)和他人帶來(lái)?yè)p失。在美國(guó)老年性癡呆(Alzheimer’ s disease, AD)的費(fèi)用僅次于心臟病和腫瘤而居第三位,在1994年為830億。我國(guó)雖然沒(méi)有對(duì)AD病人費(fèi)用統(tǒng)計(jì)，每年估計(jì)至少花費(fèi)50億元。到2050年，我國(guó)老年癡呆病人將超過(guò)3000萬(wàn)，預(yù)計(jì)費(fèi)用將超過(guò)I萬(wàn)億元。癡呆患者不僅對(duì)本人極為痛苦，而且對(duì)家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)很大，因此，尋找有效藥物以延緩、控制AD病情的發(fā)展是極為重要的。
[0003]迄今，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無(wú)能終止或逆轉(zhuǎn)老年性癡呆病理改變而起到根本治療作用的療法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種覆盆子提取物，及其在制備預(yù)防、治療抗老年癡呆藥物中的應(yīng)用?！?br> [0005]本發(fā)明具體方案如下:
覆盆子提取物，包括水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分任一部分；
所述水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分依照下列步驟提
取:
1、取覆盆子藥材粉碎，用75%乙醇滲漉到基本無(wú)色，分別用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶劑后，分別得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏；
2、氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水濕法裝柱的聚酰胺柱，水洗脫后，收集水洗脫液即氯仿部位水洗脫液；
聚酰胺柱水洗脫后，再用乙醇洗脫，收集洗脫液得氯仿部位乙醇洗脫液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脫，洗脫液用4mol/L鹽酸中和pH至中性后，上DlOl大孔樹(shù)脂，用70%丙酮洗脫，收集洗脫液得氯仿部位丙酮洗脫液；
3、乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水濕法裝柱的聚酰胺柱，水洗脫，收集水洗脫液得乙酸乙酯部位水洗脫液；聚酰胺柱水洗后，用乙醇洗脫，收集洗脫液得乙酸乙酯部位乙醇洗脫液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脫，將洗脫液用4mol/L鹽酸中和至中性，上DlOl大孔樹(shù)脂，70%丙酮洗脫，以除去無(wú)機(jī)鹽，得乙酸乙酯部位丙酮洗脫液；
4、步驟2)氯仿部位水洗脫液浸膏與步驟3)乙酸乙酯部位水洗液合并，減壓濃縮，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得水洗部分；該部分主要成分為留醇和萜類成分；將氯仿部位丙酮洗脫液與乙酸乙酯部位丙酮洗脫液合并，回收丙酮后，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得丙酮洗脫部分，該為部分主要成分為鞣質(zhì)和黃酮聚合物。
[0006]取氯仿部位乙醇洗脫液，回收乙醇后，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得氯仿部分；該部分主要成分為黃酮和酚酸類；
取乙酸乙酯部位乙醇洗脫液，回收乙醇后，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得乙酸乙酯部分，該部分主要成分為黃酮和酚酸類；
本發(fā)明還涉及上述提取物在制備預(yù)防、治療抗老年癡呆藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提取物來(lái)自植物成分覆盆子，具有良好的抑制老年癡呆的作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1 HE染色照片
A空白組海馬CAl區(qū)HEX400 B模型組海馬CAl區(qū)HEX400 C腦復(fù)康組海馬CAl區(qū)HE X 400 D水洗高劑量組海馬CAl區(qū)HE X 400 E水洗低劑量組海馬CAl區(qū)HEX 400 F氯仿高劑量組海馬CAl區(qū)HEX400 G氯仿低劑量組海馬CAl區(qū)HEX400 H丙酮高劑量組海馬CAl區(qū)HEX400 I丙酮低劑量組海馬CAl區(qū)HEX400 J乙酸乙酯高劑量組海馬CAl區(qū)HEX400 K乙酸乙酯低劑量組海馬CAl區(qū)HEX400。
[0009]圖2免疫組化照片`
L 空白組 Pser404_tauX400 M 模型組 Pser404_tauX400 N 腦復(fù)康組Pser404-tau X 400 O 水洗高劑量組 Pser404_tau X 400 P 水洗高劑量組 Pser404_tauX400Q丙酮高劑量組Pser404-tauX400 R丙酮低劑量組Pser404-tauX400 S氯仿高劑量組Pser404_tau X 400 T氯仿低劑量組Pser404_tau X 400 U乙酸乙酯高劑量組Pser404-tau X 400 V 乙酸乙酯低劑量組 Pser404_tauX400。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1覆盆子提取物制備
1、取覆盆子藥材粉碎，用75%乙醇滲漉到基本無(wú)色，分別用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶劑后，分別得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏；
2、氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水濕法裝柱的聚酰胺柱，水洗脫后，收集水洗脫液即氯仿部位水洗脫液；
聚酰胺柱水洗脫后，再用乙醇洗脫，收集洗脫液得氯仿部位乙醇洗脫液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脫，洗脫液用4mol/L鹽酸中和pH至中性后，上DlOl大孔樹(shù)脂，用70%丙酮洗脫，收集洗脫液得氯仿部位丙酮洗脫液；
3、乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水濕法裝柱的聚酰胺柱，水洗脫，收集水洗脫液得乙酸乙酯部位水洗脫液；聚酰胺柱水洗后，用乙醇洗脫，收集洗脫液得乙酸乙酯部位乙醇洗脫液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脫，將洗脫液用4mol/L鹽酸中和至中性，上DlOl大孔樹(shù)脂，70%丙酮洗脫，以除去無(wú)機(jī)鹽，得乙酸乙酯部位丙酮洗脫液；
4、水洗部分:步驟2)氯仿部位水洗脫液浸膏與步驟3)乙酸乙酯部位水洗液合并，減壓濃縮，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得水洗部分；該部分主要成分為留醇和萜類成分；
丙酮洗脫部分:將氯仿部位丙酮洗脫液與乙酸乙酯部位丙酮洗脫液合并，回收丙酮后，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得丙酮部分，該為部分主要成分為鞣質(zhì)和黃酮聚合物；
氯仿部分:取氯仿部位乙醇洗脫液，回收乙醇后，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得氯仿部分；該部分主要成分為黃酮和酚酸類；
乙酸乙酯部分:取乙酸乙酯部位乙醇洗脫液，回收乙醇后，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得乙酸乙酯部分，該部分主要成分為黃酮和酚酸類。 [0011]實(shí)施例2覆盆子提取物對(duì)腎陽(yáng)虛型老年性癡呆大鼠海馬CAl區(qū)形態(tài)學(xué)及tau蛋白過(guò)度磷酸化的影響實(shí)驗(yàn)
兔抗Pser404-tau試劑盒，Abgent公司產(chǎn)品；兔SP檢測(cè)試劑盒,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為11137A10 ;DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為911882A。
[0012]I實(shí)驗(yàn)方法
1.1造模與給藥
SD大鼠120只，雄性，SPF級(jí)，體重180-220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(湘)2009-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)I周后，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選動(dòng)物，剔除10只后(剔除離群，在逃避潛伏期內(nèi)總是找不到平臺(tái)的大鼠)，隨機(jī)分成11組:空白組、模型組、腦復(fù)康組、覆盆子水洗高劑量組、水洗低劑量組、丙酮洗脫高劑量組、丙酮洗脫低劑量組、氯仿醇洗高劑量組、氯仿醇洗低劑量組、乙酸乙酯提取高劑量組、乙酸乙酯提取低劑量組，每組10只。每天觀察記錄動(dòng)物的一般情況，每5天稱體重一次，觀察體重變化情況。
[0013]空白組腹腔注射生理鹽水(0.5ml/100g)，其余各組均腹腔注射D-半乳糖(125mg/kg)，連續(xù)6周，造成亞急性衰老模型。然后空白組和模型組灌胃生理鹽水(lml/100g )，腦復(fù)康(西藥單一成分:吡拉西坦)組(0.4g/100g.d)預(yù)防性灌胃腦復(fù)康混懸液；
各給藥組灌胃覆盆子提取物，取實(shí)施例1覆盆子水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分，所得計(jì)量以覆盆子原藥材計(jì)，分別分為高劑量組和低劑量組。高劑量各組均預(yù)防性灌胃2.4g/100g.d，低劑量各組均預(yù)防性灌胃1.2g/100g.d，連續(xù)4周。
[0014]灌胃最后2周，采用氫化可的松混懸液給大鼠肌肉注射(25mg/kg)造成腎陽(yáng)虛模型，造模完成后進(jìn)行歷時(shí)6天的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。
[0015]1.2腦標(biāo)本處理
心臟取血后直視下將輸液針刺入左心室至升主動(dòng)脈，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，用0.9%溫生理鹽水250ml灌注至肝臟完全變白，右心室流出澄清液體后，右腦快速取出放預(yù)冷的4%多聚甲醛固定24h，乙醇系列脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片厚2-4μπι，連續(xù)切片，每5張取一張，分別進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。光鏡下每張切片計(jì)數(shù)3個(gè)視野(400X)的細(xì)胞，總和除以3作為該大鼠的細(xì)胞計(jì)數(shù)。
[0016]1.3形態(tài)學(xué)檢測(cè)
HE染色:⑴烤片30min_lh “2)二甲苯I IOmin ;(3)二甲苯II IOmin ;⑷無(wú)水乙醇I 3min ；
(5)無(wú)水乙醇 II 3min ；(6) 95% 乙醇 I 3min ；(7) 95% 乙醇 II 3min ；(8) 75% 乙醇 3min ;(9)自來(lái)水洗去乙醇幾秒；(1Φ蘇木精染色5min ;(11)自來(lái)水泛藍(lán)30min ;(12)伊紅10-30秒；(13) 95%乙醇I過(guò)；(14) 95%乙醇II過(guò)；(15)無(wú)水乙醇I 3min ;(16)無(wú)水乙醇II 3min ;(17)干燥；(18)二甲苯I 2min ；(19)二甲苯II 2min ;?)干燥，中性樹(shù)膠封片。
[0017]1.4免疫組化染色法檢測(cè)海馬CAl區(qū)Pser404_tau陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)
⑴58°C烤片1.5h ;⑵常規(guī)脫臘至水:二甲苯I lOmin—二甲苯II IOmin —無(wú)水乙醇I 5min —無(wú)水乙醇 II 5min — 95% 乙醇 I 3min — 95% 乙醇 II 3min — 80% 乙醇 3min —雙蒸水3minX3次；⑶抗原修復(fù):高壓鍋煮沸后修復(fù)lOmin，PBS沖洗3minX3次；⑷滴加3%H202去離子水37°C孵育lOmin，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗3minX3次；(5)滴加封閉用正常山羊血清工作液37°C孵育15min，傾去，勿洗；(6)滴加一抗工作液，4°C過(guò)夜；
(7)37°C復(fù)溫45min，PBS沖洗5minX3次；⑶滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37°C孵育15min，PBS沖洗5minX3次；(9)滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37°C孵育15min，PBS沖洗5minX3次；(W)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5min,自來(lái)水沖洗30min ;(11)蘇木精復(fù)染5min,自來(lái)水沖洗20min ;02)脫水透明:95%乙醇I (過(guò))一95%乙醇II (過(guò))一無(wú)水乙醇I 3min —無(wú)水乙醇II 3min —干燥一二甲苯I 2min — 二甲苯II 2min —干燥一中性樹(shù)膠封片。
[0018]2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有數(shù)據(jù)用f 表示，使用SPSSl1.5軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間用LSD法。
[0019]3 結(jié)果
3.1海馬CAl區(qū)HE染色結(jié)果
結(jié)果見(jiàn)表1及圖1。正常組:大鼠海馬形態(tài)完整，細(xì)胞排列致密整齊，形態(tài)正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，核仁清晰，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量多。
[0020]模型組:大鼠海馬形態(tài)破碎，結(jié)構(gòu)異常，細(xì)胞變形，空泡壞死，胞核固縮，核深染，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少。
[0021]給藥組:相比較模型組而言，除水洗低劑量和氯仿低劑量，各給藥組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)均有不同程度的恢復(fù)。神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量比模型組多，染色較正常，排列較整齊，結(jié)構(gòu)較正常，分布較均勻。
[0022]表1覆盆子活性成分對(duì)腎陽(yáng)虛型老年性癡呆大鼠海馬CAl區(qū)細(xì)胞總數(shù)、
【權(quán)利要求】
1.覆盆子提取物，其特征在于包括水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分任一部分； 所述水洗部分、丙酮洗脫部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分依照下列步驟提取: 1)取覆盆子藥材粉碎，用75%乙醇滲漉到基本無(wú)色，分別用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶劑后，分別得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏； 2)氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水濕法裝柱的聚酰胺柱，水洗脫后，收集水洗脫液即氯仿部位水洗脫液； 聚酰胺柱水洗脫后，再用乙醇洗脫，收集洗脫液得氯仿部位乙醇洗脫液； 聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脫，洗脫液用4mol/L鹽酸中和pH至中性后，上大孔樹(shù)脂，用丙酮洗脫優(yōu)選用70%丙酮洗脫，收集洗脫液得氯仿部位丙酮洗脫液； 3)乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水濕法裝柱的聚酰胺柱，水洗脫，收集水洗脫液得乙酸乙酯部位水洗脫液； 聚酰胺柱水洗后，用乙醇洗脫，收集洗脫液得乙酸乙酯部位乙醇洗脫液； 聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脫，將洗脫液用4mol/L鹽酸中和至中性，上大孔樹(shù)脂，70%丙酮洗脫，以除去無(wú)機(jī)鹽，得乙酸乙酯部位丙酮洗脫液； 4)取步驟2)氯仿部位水洗脫液浸膏與步驟3)乙酸乙酯部位水洗液合并，減壓濃縮，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得水洗部分； 取氯仿部位乙醇洗脫液，回收乙醇后，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得氯仿部分； 將氯仿部位丙酮洗脫液與乙酸乙酯部位丙酮洗脫液合并，回收丙酮后，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得丙酮洗脫部分； 取乙酸乙酯部位乙醇洗脫液，回收乙醇后，使其濃度相當(dāng)于每毫升浸膏含藥材重2g，得乙酸乙酯部分。
2.如權(quán)利要求1所述覆盆子提取物，其特征在于所述步驟2)和3)中大孔樹(shù)脂為DlOl大孔樹(shù)脂。
3.權(quán)利要求1所述覆盆子提取物在制備預(yù)防、治療抗老年癡呆藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K36/73GK103623082SQ201310624223
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】謝一輝, 黃麗萍, 樊浩, 張雨恬, 龔嘉華, 練波 申請(qǐng)人:江西中醫(yī)藥大學(xué)