一種異葉青蘭分級提取物的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種異葉青蘭分級提取物的制備方法及其應用，與現(xiàn)有抗病毒合成藥相比，其毒性低，安全可靠，藥效作用強，而且異葉青蘭原料豐富，價廉，萃取工藝簡單，制備成本低，可以制成各種劑型。
【專利說明】一種異葉青蘭分級提取物的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬中藥鄰域，涉及一種抗呼吸道病毒藥物，具體涉及異葉青蘭揮發(fā)油在制備抗呼吸道病毒藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]藏藥異葉青蘭為唇形科植物異葉青蘭(Dracocephalum heterophyllum Benth)的干燥地上部分，屬多年生草本植物，又名白花枝子花、白花夏枯草、吉孜青保(藏藥名)，新疆維語稱馬爾贊居西、祖帕爾。異葉青蘭地上部分具有清瀉肝熱的功效，是維族、藏族用于治療咳喘病和胃病的傳統(tǒng)用藥。主要用于治療黃疸性發(fā)燒、肝熱、熱性病頭痛、眼翳、口腔潰瘍、支氣管炎、高血壓等多種病癥。是藏藥部頒標準收錄品種。異葉青蘭分布于山西，內(nèi)蒙古，寧夏，甘肅，四川西北部、西部，青海，西藏及新疆；生于山地草原及半荒漠的多石干燥地區(qū)，青海甘肅以東分布于海拔1100-2800米間，以西則可達5000米，新疆則在2200-3100米間，資源豐富。
[0003]異葉青蘭全草含有揮發(fā)油、黃酮、多糖、帖類、木脂素等成分，值得進行開發(fā)利用。王李梅通過對異葉青蘭地上全草進行了系統(tǒng)的化學成分研究，共分離得到21個化合物，并對分離得到的化合物進行了體外抗氧化活性研究，結果表明，黃酮類化合物和苯丙素類化合物均具有較強的抗氧化活性[山東大學碩士論文2011]。羅智敏等應用HPLC測定不同產(chǎn)地異葉青蘭中齊墩果酸和烏蘇甲酯的含量，為異葉青蘭藥材的質(zhì)量標準建立提供參考[《分析試驗室》，2009，28 (zl) 8-10]。余江柳等采用分光光度法，以蘆丁為標準品測定異葉青蘭中的總黃酮含量，確定異葉青蘭總黃酮提取工藝的研究。秦波等采用毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對異葉青蘭揮發(fā)性化學成分進行了研究，經(jīng)毛細管色譜分離出184多個峰，共確認了其中154種成分，所鑒定化合物的含量占全油的的83.52% [《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》2000年12(1)4-11期]。任愛梅等對異葉青蘭化學成分及抑菌活性研究進行了分析，從甲醇提取物中分離得到9個化合 物，其中化合物4對金黃色葡萄球菌有弱的抑制作用[《中草藥》2011,42(4)38-41]
[0004]目前病毒性疾病給人類的生命和健康造成了嚴重危害，從天然藥物中開發(fā)研制新的抗病毒藥物成為熱點。臨床上常用多種類型的抗病毒西藥除了對病毒有抑制作用外，或多或少都存在細胞毒作用，長期用藥還易產(chǎn)生耐藥性，病毒株也會發(fā)生變異成為新的耐藥菌株，這使現(xiàn)有抗病毒西藥的臨床應用和新的抗病毒西藥的研發(fā)面臨巨大的挑戰(zhàn)。而在我國中醫(yī)、藏醫(yī)長期的臨床實踐中，應用傳統(tǒng)中草藥和藏藥治療病毒性疾病取得了卓越成效，但缺乏有關有效化學成份以及藥理學作用，抗病毒活性以及機制的研究。運用現(xiàn)代藥理學理論去研究傳統(tǒng)民族藥，篩選分離有效化合物，明確其藥效學作用及機制，是目前抗病毒藥物研究的熱點和難點。
[0005]流行性感冒病毒，簡稱流感病毒，甲、乙、丙三型，引起人和動物流感。甲型流感病毒是反復流行最為頻繁和引起流感全球流行的重要病原體。近些年來，H1N1，H7N9流感病毒的流行肆虐，造成嚴重危害，引起社會的恐慌。流感病毒呈球形或絲狀，球形直徑80-20nm，新分離株絲狀多于球形，是有包膜，單鏈分片段的RNA病毒。流感病毒包膜刺突的表面結構為血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。血凝素(HA)柱狀，為三聚體，它基本上以相同的間距覆蓋了病毒的全部表面。是病毒保護性抗原。神經(jīng)氨酸酶(NA)是四個亞單位組成的四聚體，并不平均分布在病毒表面，聚合成群，與病毒釋放有關。流感的爆發(fā)流行主要由病毒抗原漂移(antigenic drift)和抗原轉(zhuǎn)換(antigenic shift)引起,抗原漂移(antigenicdrift)因HA或NA的點突變造成，變異幅度小，屬量變，引起局部中、小型流行?？乖D(zhuǎn)換(antigenic shift)因HA或NA的大幅度變異造成,屬質(zhì)變,導致新亞型的出現(xiàn),引起世界性的暴發(fā)流行。近些年來，爆發(fā)流行的甲型HlNl流感，以及最新H7N9流感均是由變異后的新型甲型流感病毒所引起的急性呼吸道傳染病。
[0006]呼吸道合胞病毒(RSV)是一個世界范圍內(nèi)嬰幼兒最常見的呼吸道感染的病原體。目前，對RSV的防治仍無有效的疫苗和藥物。RSV是有包膜的單股負鏈RNA病毒，包膜刺突為G蛋白，RSV感染嬰幼兒致細支氣管炎和細支氣管肺炎，感染成人致上呼吸道感染，通過手、污染物品和呼吸道傳播，易在冬季流行，是醫(yī)源性感染的重要病原體。RSV在呼吸道上皮細胞內(nèi)增殖，支氣管壞死物與粘液、纖維蛋白粘連在一起，易導致氣道阻塞，可并發(fā)嚴重的細支氣管炎和肺炎，感染后免疫力不強，不能防止再感染，至今未有有效的預防疫苗。
[0007]在藏醫(yī)藥長期的臨床實踐中，應用傳統(tǒng)藏藥治療病毒性疾病取得了卓越成效，藏醫(yī)認流感的易感人群為青壯年，是由赤巴之邪引起的熱性傳染疾病之一。異葉青蘭是清熱解毒類藥物，傳統(tǒng)藏醫(yī)中用來治療淋巴結炎、肺熱咳嗽，瘟病時疫。因此，從傳統(tǒng)藏藥中開發(fā)更好的抗呼吸道病毒藥物具有重要的應用價值和市場前景。
[0008]本發(fā)明提供了一種異葉青蘭揮發(fā)油可以在制備抗病毒藥物中應用，與現(xiàn)有抗病毒合成藥相比，其毒性低，安全可靠，藥效作用強，而且異葉青蘭原料豐富，價廉，萃取工藝簡單，制備成本低，可以制成各種劑型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供一種異葉青蘭分級提取物的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0010]第一步，稱取 3kg異葉青蘭全草，并將其切碎成小于IOcm的小段或者將全草打成粉末，置于20L的玻璃缸中，加工業(yè)酒精使得酒精和異葉青蘭全草的質(zhì)量比3:1，浸潰7天，每隔24小時攪拌一次，每次攪拌時間為30min。
[0011]第二步，析出上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀第一次回流蒸發(fā)回收酒精，水域溫度為60°C，第一次回流蒸發(fā)回收酒精完畢后，補充酒精至蒸發(fā)前的量，重復采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀第二次回流蒸發(fā)回收酒精，再次補充酒精至蒸發(fā)前的量，重復采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀第三次回流蒸發(fā)回收酒精，即得到總浸膏，所述總浸膏的質(zhì)量約約400g。
[0012]第三步，將第二步中所制得的總浸膏用500ml蒸餾水溶解，用500ml石油醚萃取，將石油釀和加入蒸懼水后的總浸骨裝入2000ml的分液漏斗中，將其S封后震湯IOmin,使其充分混合，靜止等待其分層，然后將水相從下部放出，石油醚相從上層放出，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓回流蒸發(fā)石油醚相，水域溫度為65°C，即得到大約20g石油醚提取物，所述水相大約為500ml。
[0013]第四步，將第三步所得到水相用等體積乙酸乙酯萃取，將水相和乙酸乙酯置于分液漏斗中，密封震蕩lOmin，使其充分混合，靜止等待其分層，將剩余水從下部放出，乙酸乙酯相從上層放出，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓回流蒸發(fā)乙酸乙酯相，水域溫度為65°C，即得到大約20g乙酸乙酯提取物，所述剩余水約為500ml。
[0014]第五步，將剩余水用500ml正丁醇萃取，萃取步驟同步驟四的萃取過程，將正丁醇相回流蒸發(fā)，得到約20g正丁醇提取物和500ml水相。
[0015]第六步，將第五步所制得的水相回流蒸發(fā)，水域溫度為75°C，收集剩余液體即為水提取物(約20g)。
[0016]第七步，所制得的提取物，按極性大小依次為水提取物，正丁醇提取物，乙酸乙酯提取物，石油醚提取物，收集四種提取物室溫靜置干燥，4°C保藏，用紫外照射30min滅菌。
[0017]一種異葉青蘭分級提取物的制備方法，所制得的異葉青蘭分級提取物可用于抗呼吸道病毒藥物。
[0018]有益效果:
[0019]本發(fā)明所提供的異葉青蘭揮發(fā)油和分級提取物可以在抑制病毒吸附，預防病毒侵染，抑制病毒基因復制、直接滅活病毒等多環(huán)節(jié)發(fā)揮明顯的抗病毒作用，故而異葉青蘭揮發(fā)油及提取物可以在制備抗病毒藥物中應用。本發(fā)明提供的異葉青蘭提取物可以在制備抗病毒藥物以以單味或者復方方式制備成藥物組合物。尤其是以單味或者復方方式在制備治療呼吸道病毒感染的藥物組合物中應用。由于軟膠囊、硬膠囊、滴丸、片劑、分散片、顆粒劑、注射液、口服液、栓劑等藥物劑型的制備是本領域的研究人員所能理解的，可以方便地實現(xiàn)異葉青蘭提取物與相應載體組合而制備成各種藥物劑型；軟膠囊、或硬膠囊、或滴丸、或片劑、或分散片、或顆粒劑、或注射液 、或口服液、或栓劑。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0021]1、異葉青蘭為純藏藥，毒性低，安全性高。
[0022]2、異葉青蘭揮發(fā)油及提取物可以在抑制病毒吸附，預防病毒侵染，抑制病毒基因復制、直接滅活病毒等多環(huán)節(jié)發(fā)揮明顯的抗呼吸道病毒作用，異葉青蘭揮發(fā)油及提取物可以在制備抗呼吸道病毒藥物中應用。具有明顯抗流感病毒，抗腺病毒的作用。
[0023]3、能夠治療呼吸道疾病，有很好的藥用前景。
[0024]4、原料豐富、價廉、萃取工藝簡單、制備成本低，可以方便地制備成各種劑型?！揪唧w實施方式】
[0025]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0026]實施例一異葉青蘭揮發(fā)油及提取物的制備
[0027](一)異葉青蘭揮發(fā)油的制備
[0028]取適量異葉青蘭全草(碎成約Icm長)加入2000ml圓底燒瓶，通水蒸汽，用水蒸汽蒸餾1.5h，收集餾出液；用無水乙醚少量多次萃取餾出液，收集有機相；加無水Na2SO4干燥有機相；將有機相在沸石存在的情況下常壓蒸餾，回收餾出液乙醚，收集燒瓶中黃色油狀物，得到異葉青蘭揮發(fā)油；將揮發(fā)油在-20°C保藏，用前紫外照射30min滅菌。
[0029](二)異葉青蘭分級提取物的制備
[0030]一種異葉青蘭分級提取物的制備方法，其特征在在于該方法包括以下步驟:
[0031]第一步，稱取3kg異葉青蘭全草，并將其切碎成小于IOcm的小段或者將全草打成粉末，置于20L的玻璃缸中，加工業(yè)酒精使得酒精和異葉青蘭全草的質(zhì)量比3:1，浸潰7天，每隔24小時攪拌一次，每次攪拌時間為30min。
[0032]第二步，析出上清液，周旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀第一次回流蒸發(fā)回收酒精，水域溫度為60°C，第一次回流蒸發(fā)回收酒精完畢后，補充酒精至蒸發(fā)前的量，重復采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀第二次回流蒸發(fā)回收酒精，再次補充酒精至蒸發(fā)前的量，重復采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀第三次回流蒸發(fā)回收酒精，即得到總浸膏，所述總浸膏的質(zhì)量約約400g。
[0033]第三步，將第二步中所制得的總浸膏用500ml蒸餾水溶解，用500ml石油醚萃取，將石油釀和加入蒸懼水后的總浸骨裝入2000ml的分液漏斗中，將其S封后震湯IOmin,使其充分混合，靜止等待其分層，然后將水相從下部放出，石油醚相從上層放出，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓回流蒸發(fā)石油醚相，水域溫度為65°C，即得到大約20g石油醚提取物，所述水相大約為500ml。
[0034]第四步，將第三步所得到水相用等體積乙酸乙酯萃取，將水相和乙酸乙酯置于分液漏斗中，密封震蕩lOmin，使其充分混合，靜止等待其分層，將剩余水從下部放出，乙酸乙酯相從上層放出，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓回流蒸發(fā)乙酸乙酯相，水域溫度為65°C，即得到大約20g乙酸乙酯提取物，所述剩余水約為500ml。
[0035]第五步，將剩余水用500ml正丁醇萃取，將正丁醇相回流蒸發(fā)，得到約20g正丁醇提取物和500ml水相。
[0036]第六步，將第五步所制得的水相回流蒸發(fā)，水域溫度為75°C，收集剩余液體即為水提取物(約20g)。
[0037]第七步，所制得的提取物，按極性大小依次為水提取物，正丁醇提取物，乙酸乙酯提取物，石油醚提取物，收集四種提取物室溫靜置干燥，4°C保藏，用紫外照射30min滅菌。
[0038]所制得的異葉青蘭分級提取物可用于抗呼吸道病毒藥物。
[0039]實施例二異葉青蘭揮發(fā)油氣質(zhì)聯(lián)用分析
[0040]異葉青蘭揮發(fā)油成分用氣相色譜-質(zhì)譜分析(Trace DSQ GC-MS聯(lián)用儀,美國熱電公司)。氣相色譜條件為:色譜柱DB-5ms ;柱長:30m ;液膜厚度:0.25 μ m ;內(nèi)徑:0.25mm ;載氣:He ;流速:1.0mL / min ;柱溫:程序升溫40~250°C (10°C / min),恒溫20min ;進樣量I μ L。質(zhì)譜條件:分流模式進樣，分流比30:1 ;進樣口溫度:250°C ;輔助線溫度:280°C ;離子源溫度:250°C ;電離方式:EI ;電子能量:70eV ;電子倍增管電壓:1256kV ;采集方式:掃描；掃描質(zhì)量范圍:40~600amu。
[0041]用氣-質(zhì)聯(lián)用對揮發(fā)油進行分析，各種成分的保留時間(按先后順序)、名稱、分子式、相對百分含量及符合度見表1。異葉青蘭揮發(fā)油得率0.083% (W / W)。從異葉青蘭揮發(fā)油中初步鑒定了 40個化合物。其中有19個組分含量大于1%，占揮發(fā)油總量的87.53%。含量較高的有桉葉油素(22.18% )，6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇(11.28% )，順式萜品醇(11.11% ),4-(1-甲基乙基)_ 苯甲醛(5.79 % ), [1S_(1，2，5)]-4，6，6-三甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-3-烯-2-醇(4.91% ),4-(1-甲基乙基)-2-環(huán)乙烯-1-酮(4.74%), [15-(1，3，5)]-6，6-二甲基-2-亞甲基-二環(huán)[3,1,1]庚烷 _3_ 醇(4.13% ), (1,2, 5)-2,6,6-甲基-二環(huán)[3,1,1]庚烷 _3_ 酮(4.03% )。異葉青蘭揮發(fā)油含萜69.20%，其中萜醇占34.45%，單萜28.76%、倍半萜5.99%.[0042]表1異葉青蘭揮發(fā)油化學成分
[0043]
【權利要求】
1.一種異葉青蘭分級提取物的制備方法，其特征在在于該方法包括以下步驟: 第一步，稱取3kg異葉青蘭全草，并將其切碎成小于IOcm的小段或者將全草打成粉末，置于20L的玻璃缸中，加工業(yè)酒精使得酒精和異葉青蘭全草的質(zhì)量比3:1，浸潰7天，每隔24小時攪拌一次，每次攪拌時間為30min ； 第二步，析出上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀第一次回流蒸發(fā)回收酒精，水域溫度為60°C，第一次回流蒸發(fā)回收酒精完畢后，補充酒精至蒸發(fā)前的量，重復采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀第二次回流蒸發(fā)回收酒精，再次補充酒精至蒸發(fā)前的量，重復采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀第三次回流蒸發(fā)回收酒精，即得到總浸膏，所述總浸膏的質(zhì)量約約400g ； 第三步，將第二步中所制得的總浸膏用500ml蒸餾水溶解，用500ml石油醚萃取，將石油醚和加入蒸餾水后的總浸膏裝入2000ml的分液漏斗中，將其密封后震蕩lOmin，使其充分混合，靜止等待其分層，然后將水相從下部放出，石油醚相從上層放出，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓回流蒸發(fā)石油醚相，水域溫度為65°C，即得到大約20g石油醚提取物，所述水相大約為500ml ； 第四步，將第三步所得到水相用等體積乙酸乙酯萃取，將水相和乙酸乙酯置于分液漏斗中，密封震蕩lOmin，使其充分混合，靜止等待其分層，將剩余水從下部放出，乙酸乙酯相從上層放出，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓回流蒸發(fā)乙酸乙酯相，水域溫度為65°C，即得到大約20g乙酸乙酯提取物，所述剩余水約為500ml ； 第五步，將剩余水用500ml正丁醇萃取，將正丁醇相回流蒸發(fā)，得到約20g正丁醇提取物和500ml水相； 第六步，將第五步所制得的水相回流蒸發(fā)，水域溫度為75°C，收集剩余液體即為水提取物(約20g)；. 第七步，所制得的提取物，按極性大小依次為水提取物，正丁醇提取物，乙酸乙酯提取物，石油醚提取物，收集四種提取物室溫靜置干燥，4°C保藏，用紫外照射30min滅菌。
2.如權利要求1所述一種異葉青蘭分級提取物的制備方法，所制得的異葉青蘭分級提取物可用于抗呼吸道病毒藥物。
【文檔編號】A61P31/12GK103463182SQ201310377190
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月26日 優(yōu)先權日:2013年8月26日
【發(fā)明者】張春江 申請人:蘭州大學