飛龍掌血總生物堿有效部位提取物的制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明屬中藥制藥領域，涉及飛龍掌血總生物堿有效部位提取物的制備方法和用途。本發(fā)明以飛龍掌血總生物堿的含量為指標，制備總生物堿含量高、質(zhì)量可控、穩(wěn)定、藥效顯著的飛龍掌血總生物堿提取物；該飛龍掌血總生物堿有效部位提取物中，總生物堿含量50%以上。本發(fā)明所述的制備方法提純工藝經(jīng)濟、簡便、適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，制得的提取物具有顯著的抑制腫瘤細胞增殖的作用，能誘導腫瘤細胞凋亡，可用于制備抗腫瘤的藥物。
【專利說明】飛龍掌血總生物堿有效部位提取物的制備方法和用途

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬中藥制藥領域，涉及飛龍掌血總生物堿有效部位提取物的制備方法及藥用用途，具體涉及飛龍掌血總生物堿有效部位提取物的制備方法及在制備抗腫瘤藥物中的用途。

【背景技術】
[0002]現(xiàn)有技術公開了飛龍掌血是一味收載于苗族、土家族等少數(shù)民族藥物志中的常用民族藥，為蕓香科植物飛龍掌血Tbt/Wia asiatica Lam.的干燥根；其味辛、微苦、性溫、有小毒，有祛風止痛、散瘀止血、解毒消腫之功。苗醫(yī)常用該飛龍掌血與白茅根、牛膝、百草霜等配伍，用于治療風濕痹痛、腰痛、胃痛、痛經(jīng)、經(jīng)閉、跌打損傷、勞傷吐血、衄血、瘀滯崩漏、瘡痛腫毒等。
[0003]研究顯示，所述飛龍掌血中所含有的白屈菜紅堿、氯化兩面針堿等生物堿成分具有顯著的抗腫瘤活性，但含量較低；此外，其總生物堿部分的抗腫瘤作用尚在研究中。
[0004]現(xiàn)有文獻I和2中涉及對日本沖繩所產(chǎn)的飛龍掌血中提取的二氫光花椒堿以及其衍生物進行體外抗腫瘤實驗，顯示上述成分可誘導肺癌(A549)的凋亡，并證實該地區(qū)飛龍掌血具有細胞毒性，能誘導腫瘤細胞凋亡。文獻3涉及飛龍掌血根皮的鎮(zhèn)痛作用；文獻4和5涉及到從飛龍掌血中分離鑒定出多個單體,如小葉九里香內(nèi)酯(Murraxocin)、原阿片堿(Protopine)、8_ 羥基二氫白屈菜紅堿(8_Hydroxydihydrochelerythrine)、花椒堿(Y-Fagarine)、茵芋堿(Skimmianine)、飛龍掌血新雙香豆素(Toddalosin)、6-甲基光葉花椒堿(6-Methylnitidine)等。所述文獻6中趙麗戀等測定出飛龍掌血根中氯化兩面針堿的含量為0.55 mg/g ;所述文獻7中涉及到采自貴陽不同地區(qū)的10批藥材的指紋圖譜。
[0005]目前，中國專利CN03123772.X和CN200710098448.1涉及到白屈菜、血水草、博落回和飛龍掌血總生物堿相關的提取及抗腫瘤作用研究；其中，CN03123772.X提及上述植物的總生物堿制劑具有抗腫瘤的作用，主要是通過抑制多重藥物抗性蛋白(MRP)得以實現(xiàn)。CN200710098448.1對CN03123772.X的提取純化工藝進行了改進，采用酸液提取、酸液洗脫；但經(jīng)本發(fā)明人實驗證實，傳統(tǒng)工藝依然有著高效便捷的優(yōu)勢；首先，選用含水乙醇對藥材進行提??；飛龍掌血藥材中所含有的生物堿，包括極性較小的生物堿類成分，也包含極性較大的季銨堿類成分，通過對提取溶劑的研究發(fā)現(xiàn)，用含水醇作為提取液，加熱回流能比酸液提取得到含量更高的生物堿部位，且后期濃縮處理時，水溶液得到的成分中有較多糖類成分，濃縮干燥均具有一定困難；而醇提液可在較低溫度下減壓回收溶劑，保證所提取的化學成分不會因高溫而遭到破壞，又便于濃縮和干燥；
其次，CN200710098448. 1中選擇將陽離子交換后的洗脫液改為酸液洗脫，并得到較可觀的白屈菜總生物堿分離率；但經(jīng)本申請的發(fā)明人對飛龍掌血總生物堿酸洗脫液和堿洗脫液進行研究發(fā)現(xiàn)，酸洗脫液得到的總生物堿含量并未高于堿洗脫液；所述酸洗脫液與生物堿結合形成生物堿鹽的同時也與樹脂柱上其他離子形成鹽而被洗脫，降低了生物堿的純度；而用堿-醇系統(tǒng)進行洗脫，則能得到游離的生物堿，且氨水、乙醇等均易于揮發(fā)，不會造成雜質(zhì)的殘留，不會引入新的離子。
[0006]本申請的發(fā)明人擬提供一種提純工藝經(jīng)濟、簡便、適用于工業(yè)化大生產(chǎn)的制備飛龍掌血總生物堿有效部位提取物的方法，且所得提取物具有顯著的抑制腫瘤細胞增殖的作用，可用于制備抗腫瘤藥物。
[0007]與本發(fā)明有關的文獻有:
文獻[I]:1wasaki H, Okabe T, Takara K, et al.Tumor-selective cytotoxicityof benzo[c]phenanthridine derivatives from Toddalia asiatica Lam[J].CancerChemotherapy and Pharmacology.2010 Mar, 65 (4):719-26.文獻[2]:1wasaki H, Okabe T, Takara K, et al.The tumor specificcytotoxicity of dihydronitidine from Toddalia asiatica Lam[J].CancerChemotherapy and Pharmacology, 2006 Nov, 58(4):451-459.文獻[3]:王順祥，魏經(jīng)建，等.9種中草藥鎮(zhèn)痛作用的篩選實驗[J].河南中醫(yī)，2006，26(1):37-39.文獻[4]:楚冬海.飛龍掌血化學成分的研究[D].西北農(nóng)林科技大學，2008.文獻[5]:朱克剛.飛龍掌血中的生物堿和香豆精[J].國外醫(yī)藥.植物藥分冊，1980，(02):32-33.文獻[6]:趙麗戀，劉韶，等.RP-HPLC法測定飛龍掌血中氯化兩面針堿的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2009,15(4): 26-28.文獻[7]:劉志剛，劉曉燕，秦晉穎.飛龍掌血的HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材，2010，33(8):1240-1243.


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的缺陷和不足，提供一種飛龍掌血總生物堿有效部位提取物的制備方法。本發(fā)明的制備方法其提純工藝經(jīng)濟、簡便、適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供飛龍掌血總生物堿有效部位提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
[0010]具體的，本發(fā)明的飛龍掌血總生物堿有效部位提取物的制備方法，其特征在于，包括步驟:
(1)提取
飛龍掌血根粉碎后，用50%~95%含水乙醇加熱回流提取f 3次，每次溶媒用量約為生藥量的6~10倍，每次提取時間h，制得的提取液濃縮成浸膏備用；
(2)純化
將步驟(1)所得浸膏經(jīng)酸水溶液溶解，調(diào)整PH值，使浸膏中生物堿充分溶解于酸水中，制得上樣液，經(jīng)樹脂吸附，用水淋洗除去雜質(zhì)，再用醇-氨水系統(tǒng)洗脫，將洗脫液濃縮至稠浸膏后真空干燥或除去洗脫液后噴霧干燥，制得飛龍掌血總生物堿有效部位提取物，其中總生物堿含量為50%以上。
[0011]本發(fā)明所述制備方法的步驟(2)中，上樣液pH為2至6 ;
本發(fā)明所述制備方法的步驟(2)中，上樣液濃度為0.05~5 mg生藥/ml ；
本發(fā)明所述制備方法的步驟(2)中，樹脂為離子交換樹脂；所述的離子交換樹脂選自強酸型、強堿型陽離子交換大孔樹脂或凝膠樹脂；所述離子交換樹脂徑高比為1:3~1:12。
[0012]本發(fā)明所述制備方法的步驟(2)中，洗脫劑選自氨水、乙醇-氨水、鹽酸等；所述乙醇-氨水為95%乙醇-氨水；
本發(fā)明所述制備方法的步驟(2)中，上樣流速為0.5~5 BV/h，洗脫流速為2飛BV/h。
[0013]本發(fā)明中，將所得飛龍掌血總生物堿有效部位提取物進行含量測定:
以氯化兩面針堿為對照品，采用酸性染料比色法測定飛龍掌血提取物中總生物堿的含量；結果顯示，飛龍掌血提取物中總生物堿的含量為50%以上，達到有效部位的要求。
[0014]本發(fā)明進行了體外抑制人腫瘤細胞A549、AGS、SGC-7901、SMMC-7721增殖實驗，和體內(nèi)抑制S18tl荷瘤小鼠腫瘤增殖的實驗，結果表明，所制得的提取物在體外能顯著抑制人肺癌(A549)、胃癌(SGC-7901、AGS)、肝癌(SMMC-7721)等人腫瘤細胞的增殖；體內(nèi)能顯著抑制小鼠黑色素瘤S18tl的增殖，且對小鼠免疫器官沒有損傷；
通過流式細胞技術、RT_PCR、TUNEL等分子生物學手段進行檢測，結果顯示，所述提取物能改變腫瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡，激活以調(diào)控一系列細胞凋亡和細胞周期相關基因的表達。
[0015]實驗結果還表明，所述的為，所述的提取物能通過上調(diào)重要的抑癌基因調(diào)控相關靶基因，進一步證實所述的提取物具有調(diào)控腫瘤細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡的作用。
[0016]本發(fā)明以飛龍掌血總生物堿的含量為指標，提供了總生物堿含量高、質(zhì)量可控、穩(wěn)定、藥效顯著的飛龍掌血總生物堿提取物；所述的飛龍掌血總生物堿有效部位提取物中，總生物堿含量50%以上。
[0017]本發(fā)明所述的制備方法中采用傳統(tǒng)的堿-醇洗脫劑體系進行洗脫，其提純工藝經(jīng)濟、簡便、適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，所得提取物具有顯著的抑制腫瘤細胞增殖的作用，可用于制備抗腫瘤的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1顯示了飛龍掌血總生物堿對P53及其靶基因的調(diào)控作用。

【具體實施方式】
[0019]通過下面給出的本發(fā)明的具體實施例可以進一步清楚地了解本發(fā)明，但它們不是對本發(fā)明的限定。
[0020]實施例1
稱取粉碎后的飛龍掌血根50g，用70%乙醇浸潰12h后熱提2次，每次溶媒用量10倍，每次提取時間為2小時，合并2次提取液，濃縮至稠浸膏，真空干燥，制得本發(fā)明的飛龍掌血醇提有效部位提取物，重5.091g，通過高效液相測得氯化兩面針堿的含量為0.183mg。
[0021]實施例2
稱取粉碎后的飛龍掌血根5 g,用70%乙醇浸潰12 h后熱提3次，每次溶媒用量10倍，每次提取時間為60 min，合并3次提取液，濃縮至稠浸膏，用I mol/L鹽酸調(diào)整上樣液pH=2，上樣液濃度為0.1 mg生藥/ml，以1.5 BV/h的流速通過30 ml DOOl型陽離子交換大孔樹脂，依次用500 ml水洗脫除去雜質(zhì)，再用約為300 ml 95%乙醇-氨水(9:1)洗脫，收集洗脫液，濃縮至稠浸膏，真空干燥，制得所述的飛龍掌血總生物堿有效部位提取物，三批樣本所得總生物堿在浸膏中的含量如表1所示，
表1 提取純化工藝驗證 __

【權利要求】
1.一種飛龍掌血總生物堿有效部位提取物的制備方法，其特征在于，其包括步驟: (1)提取 飛龍掌血根粉碎后，用50%~95%含水乙醇加熱回流提取f 3次，每次溶媒用量為生藥量的6~10倍，每次提取時間f 3 h，制得的提取液濃縮成浸膏； (2)純化 將步驟(1)所得浸膏經(jīng)酸水溶液溶解，調(diào)整PH值，使浸膏中生物堿充分溶解于酸水中，得上樣液，經(jīng)樹脂吸附，用水淋洗除去雜質(zhì)，再用醇-氨水系統(tǒng)洗脫，將洗脫液濃縮至稠浸膏后真空干燥或除去洗脫液后噴霧干燥，制得飛龍掌血總生物堿有效部位提取物，其中總生物堿含量為50%以上。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，上樣液pH為2至6。
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，上樣液濃度為0.05~5 mg生藥/ml。
4.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，樹脂為離子交換樹脂。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的離子交換樹脂選自強酸型、強堿型陽離子交換大孔樹脂或凝膠樹脂。
6.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述離子交換樹脂徑高比為1:3~1:12。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，洗脫劑選自氨水、乙醇-氨水或鹽酸。
8.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，上樣流速為0.5^5BV/h，洗脫流速為2飛BV/h。
9.權利要求1所述制備方法制得的飛龍掌血總生物堿有效部位提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
【文檔編號】A61K36/75GK104069218SQ201310107380
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權日:2013年3月29日
【發(fā)明者】朱國福, 范圣潔, 高玉瓊 申請人:上海中醫(yī)藥大學