專利名稱：：蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蓮藕中」L茶素類小分子的提取方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：醫(yī)學(xué)研究表明活性氧與很多衰老相關(guān)疾病都有聯(lián)系，包括腫瘤、糖尿病、動(dòng)脈硬化癥、癌癥、哮喘、心肌缺血再灌注、早老性癡呆癥、關(guān)節(jié)炎、白內(nèi)障、皮炎、視網(wǎng)膜損傷以及肝臟損傷等，同時(shí)活性氧還可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。近幾年研究表明氧化損傷與病毒引起的疾病如AIDS有著密切的關(guān)系。人們?nèi)粘Ｊ秤玫氖卟酥泻泻芏嗫寡趸镔|(zhì)。如茄子、苔菜、尖椒、西紅柿等對(duì)DPPH自由基的抑制率較高；香椿、蘆蒿、萵筍葉、水芹、茼蒿、藕等具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并且其抗氧化能力與其中總酚含量密切相關(guān)。蓮(NulumbonuciferraGaertn)又名芙蓉、荷、水芝、玉環(huán)、六月春等，在我國各地均有種植，以其肥嫩根狀莖供食用，是千百年來及其重要的水生蔬菜，也是人們喜愛的健康蔬菜之一。目前國內(nèi)外對(duì)蓮的抗氧化、抗病毒等藥理作用的研究主要集中在蓮子、荷葉、藕節(jié)等，而對(duì)人們?nèi)粘Ｊ秤米疃嗟纳徟旱目寡趸芯肯鄬?duì)較少。傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取蓮藕中總酚的方法未能明確指出其抗氧化成分的結(jié)構(gòu)，并且由于有機(jī)溶劑毒性的殘留，為藥物及保健食品的開發(fā)帶來了困難。水-乙醇體系提取蓮藕中兒茶素類小分子的工藝方法及提取物生物活性的研究尚未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種無毒的水_乙醇提取蓮藕中兒茶素類小分子的方法及其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。提取到的活性成分經(jīng)鑒定為兒茶素和沒食子兒茶素，它們都具有天然的高效抗氧化、抗HIV-I逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，可制成藥品或保健食品用于疾病治療以及提高機(jī)體免疫力。蓮藕是極為常見的蔬菜，在我國種植廣泛，資源豐富，提取方便，無毒安全，廣為人們所接受。本發(fā)明蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法，該小分子活性成分通過水浸提、大孔樹脂吸附、葡聚糖凝膠過濾，得到兩種純化產(chǎn)物沒食子兒茶素和兒茶素。蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法，經(jīng)過下述步驟(1)取新鮮蓮藕，粉碎，去離子水4°C浸泡過夜，過濾除去殘?jiān)?000rpm離心IOmin取上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去多余的水分，_45°C冷凍干燥得到粗提物L(fēng)；(2)將粗提物L(fēng)溶于去離子水中，上樣于大孔吸附樹脂，洗脫，先用去離子水洗去雜質(zhì)Li，再用30%的乙醇洗脫得到有效成分樣品L2，柱子用90%乙醇洗去雜質(zhì)L3；(3)得到的樣品L2冷凍干燥后稱、取上樣于1.2X80cm的葡聚糖凝膠柱LH-20，洗脫，先用去離子水和乙醇依次洗去雜質(zhì)L2aL2d，再用乙醇洗脫，通過測(cè)量OD28tl得到三個(gè)洗脫峰，分別命名為L(zhǎng)2e、L2f和L2g，收集第二個(gè)峰，為抗氧化活性總產(chǎn)物L(fēng)2f；(4)L2f冷凍干燥后用制備型HPLC的C18柱，以水和甲醇混合液洗脫，洗脫速度為3ml/min，洗去雜質(zhì)L2f_l后，收集得到兩個(gè)抗氧化活性純品峰，命名為L(zhǎng)2f_2，鑒定為沒食子兒茶素，以及L2f-3，鑒定為兒茶素。所述的步驟(1)中為冷水浸提。所述的步驟(2)中使用1.5X35cm的弱極性大孔吸附樹脂NKA柱，僅用水和30%乙醇即可從粗提物L(fēng)中一步分離出活性總產(chǎn)物L(fēng)2。所述的步驟(3)中使用1.2X80cm的葡聚糖凝膠柱LH-20，僅用水和不同濃度乙醇即可對(duì)活性總產(chǎn)物進(jìn)行用分離，用60%的乙醇有效純化得到兒茶素類有效成分L2f。所述的步驟⑷中，僅用水和甲醇即可在C18反向柱上用HPLC法純化出單一活性成分，甲醇與水的體積比例為37。所述的提取物L(fēng)2f_2和L2f_3，可應(yīng)用于體內(nèi)外抗氧化以及抗病毒藥物或保健品。本發(fā)明提取方法的具體步驟1、取新鮮蓮藕，粉碎，去離子水4°C浸泡過夜，過濾除去殘?jiān)?000rpm離心IOmin取上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去多余的水分，_45°C冷凍干燥得到粗提物L(fēng)；2、粗提物L(fēng)，溶于去離子水中，上樣于1.5X35cm的弱極性大孔吸附樹脂NKA柱，洗脫，先用去離子水洗去雜質(zhì)Li，再用乙醇洗脫得到樣品L2，柱子再用90%乙醇洗去雜質(zhì)L3(附圖1)，再用去離子水沖洗再生，可連續(xù)使用；3、得到的樣品L2冷凍干燥后上樣于1.2X80cm的葡聚糖凝膠柱LH-20，洗脫速度為3ml/15min，先用去離子水和30%乙醇依次洗去雜質(zhì)L2￡TL2d，再用60%乙醇洗脫得到L2e、L2f和L2g，收集抗氧化活性總產(chǎn)物L(fēng)2f(附圖2)；柱子用依次用50%丙酮和去離子水再生可連續(xù)使用；4、L2f冷凍干燥后用制備型HPLC的C18柱，以水甲醇=73的比例洗脫，洗去雜質(zhì)L2f-1后，收集得到兩個(gè)抗氧化活性純品峰，L2f-2和L2f-3(附圖3)，經(jīng)鑒定為沒食子兒茶素和兒茶素。本發(fā)明提取的蓮藕中沒食子兒茶素和兒茶素不僅具有很強(qiáng)的體外、細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性，更具有高效清除活性氧自由基的活性以及抗HIV的活性，可提高機(jī)體免疫水平，預(yù)防與自由基相關(guān)的各種疾病。本發(fā)明具有抗氧化和抗HIV的特點(diǎn)，原材料資源豐富，成本低廉，提取方便，安全無毒，可用于藥物或天然保健品開發(fā)。圖1蓮藕粗提物上樣于大孔樹脂NKA洗脫2:L2上樣于S印hadexLH-20的洗脫3組分L2f在HPLCC18柱上的洗脫曲線圖4:L2f-2的高分辨率ESI負(fù)離子質(zhì)譜5:L2f-3與兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品LC-MS對(duì)比圖6:L2f-2和L2f_3對(duì)HIV-1RT活性的影響具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.蓮藕中小分子活性物質(zhì)提取與純化(1)取新鮮蓮藕10kg，粉碎，IOL去離子水4°C浸泡過夜，過濾除去殘?jiān)?000rpm離心IOmin取上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去多余的水分，_45°C冷凍干燥得到粗提物L(fēng)；(2)稱取Ig粗提物L(fēng)，溶于去離子水中，上樣于1.5X35cm的弱極性大孔吸附樹脂NKA柱，購于天津南開和成科技有限公司，洗脫速度為lml/min，先用200ml去離子水洗去雜質(zhì)Li，再用30%的乙醇洗脫得到樣品L2，柱子用90%乙醇洗去雜質(zhì)L3，再用去離子水沖洗再生可連續(xù)使用；(3)得到的樣品L2冷凍干燥后稱取IOOmg上樣于1.2X80cm的葡聚糖凝膠柱LH-20，洗脫速度為3ml/15min，先用200ml去離子水和200ml30%乙醇依次洗去雜質(zhì)L2a^L2d,再用200ml60%乙醇洗脫得到L2e、L2f和L2g，收集抗氧化活性總產(chǎn)物L(fēng)2f；柱子用依次用50%丙酮和去離子水再生可連續(xù)使用；(4)L2f冷凍干燥后用制備型HPLC的C18柱，以水甲醇=73的比例洗脫，洗脫速度為3ml/min，洗去雜質(zhì)L2f_l后，收集得到兩個(gè)抗氧化活性純品峰，命名為L(zhǎng)2f_2和L2f-3。2.蓮藕中小分子活性物質(zhì)成分的鑒定(1)高分辨率ESI負(fù)離子質(zhì)譜高分辨率ESI負(fù)離子質(zhì)譜確定L2f_2的分子量為306.607，分子式為C15H14O7(附圖4)。(2)核磁共振氫譜NMR測(cè)定是在Mercury-300BB型NMR儀上進(jìn)行，以D2O及氘代DMSO為溶劑。取Img樣品，溶于0.25-0.30mL的D2O中，過濾后，將此樣品溶液移至直徑為5mm的樣品管中。置于MercUry-300BB型NMR儀樣品窗口，調(diào)節(jié)分辨率旋鈕，使磁場(chǎng)的均勻性達(dá)到最佳狀態(tài)，進(jìn)行光譜測(cè)定。L2f-2的核磁共振氫譜見附圖5(溶劑DMS0-d6)。(3)液質(zhì)聯(lián)用對(duì)有活性的未知成分進(jìn)行質(zhì)譜分析，使用儀器為=ThermoFirmiganLCQAdvantageLC-MS，采用ESI離子源，操作條件為Mode+C/_C;Massrange50-1000(m/z)；IsprayVotage4.OKv；Solvent:methanol/water。L2f_3與標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素的對(duì)照液質(zhì)聯(lián)用圖見附圖6。(4)紅外光譜采用溴化鉀壓片法取2mg樣品置于瑪瑙研缽中研細(xì)。再向研缽中加入200mgKBr粉末充分研磨均勻。把上述均勻混合物置于模具中，在真空下加壓成直徑為5mm或13mm的半透明片子。把此片置于Magna-560型付里葉變換紅外光譜儀的樣品窗口，在參比窗口放上空白KBr片，進(jìn)行測(cè)譜。L2f-3與標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素的對(duì)照紅外光譜圖。實(shí)施例2蓮藕中小分子兒茶素類成分抗氧化活性1.細(xì)胞水平抗氧化活性測(cè)定正常昆明種雄性小鼠摘眼球取血，收集于冰浴的0.15MNaCl的離心管中，于2500rpm離心lOmin，將紅細(xì)胞與血漿和破碎細(xì)胞膜分離。并用10倍體積pH7.4的PBS溶液(IOmMpH7.4Na2HP04-NaH2P031沖液，125mMNaCl)洗滌2次，最后得到完整的紅細(xì)胞(MikiM,TamaiH,MinoM,etal.Free-radicalchainoxidationofratredbloodcellsbymolecularoxygenanditsinhibitionbyα-tocopherol.ArchIntPhysiolBiochimBiophys1987，258373380.)。此分析體系采用過氧自由基造成紅細(xì)胞溶血(SugiyamaH,FungKP.andWuTW.Purpruogallinasanantioxidantprotectorofhumanerythrocytesagainstlysisbyperoxylradicals.J.LifeSci.,1993,5339~43.)，以pH7.4的PBS制備20%的紅細(xì)胞懸液，加入到等體積的200mMAAPH中(溶于PBS)，其中含有待測(cè)樣品。反應(yīng)混合物置于37°C溫浴振蕩lh。溫浴結(jié)束后將此體系以8倍體積的PBS稀釋，2500rpm離心lOmin，于540nm測(cè)定上清液的吸光值A(chǔ)。同時(shí)，將此體系以8倍體積的蒸餾水稀釋，以達(dá)到紅細(xì)胞完全溶血，并于540nm測(cè)定上清的吸光值B。L-抗壞血酸作為正對(duì)照。樣品抑制溶血百分率按下式計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2.組織水平抗氧化活性測(cè)定(NgTB,LiuF,WangZT.Antioxidativeactivityofnaturalproductsfromplants[J].LifeSci,2000,60:709.)取正常昆明種雄性小鼠的腦，剪成小塊后，用PoIytron電動(dòng)勻漿器，在冰凍Tris-HCL緩沖液(20mmol·ΛρΗ7·4)中，得到1/10勻漿。所得勻漿以14000r.mirT1離心15min，將勻漿中的上清均分成Iml加到含有待測(cè)樣品、10μmo1·L-1FeSO4和0.Immol·L-1維生素C的試管中，于37°C保溫lh。保溫結(jié)束后，加入1.0ml三氯醋酸(TCA，28%)終止反應(yīng)，再加入1.5ml硫代巴比妥酸(TBA，1%)，然后將此體系于100°C加熱15min。離心除去蛋白質(zhì)沉淀后，于532nm測(cè)定丙二醛(MDA)-TBA復(fù)合物的吸光度。BHA(丁化羥基苯甲醚)為陽性對(duì)照。待測(cè)樣品的抗氧化活性以下式計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中A為對(duì)照的吸光度，A1為含待測(cè)樣品體系的吸光度。表1蓮藕中活性成分含量及抗氧化活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3.體外抗氧化活性測(cè)定(1)清除超氧陰離子自由基反應(yīng)體系為3.OmL的Tris-HCl緩沖液(16mM,pH8.0)，包括78μM的NADH,50μM的ΝΒΤ，10μM的PMS和不同濃度的樣品。超氧陰離子自由基和NBT的顯色反應(yīng)在560nm下測(cè)定。(2)清除羥基自由基反應(yīng)體系為3mL的PBS緩沖液(0.15mM，ρΗ7.4)，包含IOOmM的Vc，100μM的CuS04,12μM的細(xì)胞色素C和不同濃度的樣品。反應(yīng)混合物在25°C下溫育90分鐘，然后在550nm下測(cè)定其分光光度值的變化。清除率的計(jì)算公式為抑制率(％)=(T-T2)/(T-Tl)X100%T為OH-系統(tǒng)的光度值，Tl和T2是對(duì)照和樣品的光度值。表二蓮藕中活性成分L2f_2和L2f_3自由基清除活性樣品濃度(Mg/ml)清除超氧陰離子活性清除輕基自由基活性L2f-2_Ι_12.89士0.23_21.12±2·39_2032.79±0.8649.00±2.114062.77±0.7469.06±0.928087.02±0.5179.15±3.43L2f-3108.33±0.6923.11±2.612022.39±0.4129.88±1.594040.77±1.1034.00±1.88_80_62.89±1.13_56.57±4.53_實(shí)施例3蓮藕中小分子兒茶素類成分抗HIV-I逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV-IRT)活性在1.5ml的離心管中依次加入20μ1不同濃度的樣品、20μ1RT(0.2ng/y1)和20μ1模板與核苷酸混合物組成60μ1反應(yīng)體系，于37°C反應(yīng)Ih(正對(duì)照以20μ1lysisbuffer代替樣品；空白對(duì)照以40μ1lysisbuffer代替樣品和RT)。將60μ1反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到MTP板的小孔中，37°C反應(yīng)lh，完全吸去殘液后用250μ1洗液洗滌5次，每次洗30s，棄盡殘液，每孔加入200μIAnti-DIG-POD(200mU/ml)，加膜，37°C反應(yīng)lh。吸去殘液后用250μ1洗液洗5次，每次洗30s，棄盡殘液，每孔加入200μ1ABTS(約1.3mg/ml)，于15_25°C反應(yīng)約40min顯色。以490nm為本底，在405nm測(cè)吸光度。抑制率％=100%_(樣品-負(fù)對(duì)照)/(正對(duì)照-負(fù)對(duì)照)％正對(duì)照反應(yīng)體系中不含有HIV-I逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑負(fù)對(duì)照反應(yīng)體系中不含有HIV-I逆轉(zhuǎn)錄酶。權(quán)利要求一種蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法，其特征在于該小分子活性成分通過水浸提、大孔樹脂吸附、葡聚糖凝膠過濾，得到兩種純化產(chǎn)物沒食子兒茶素和兒茶素。2.如權(quán)利要求1所述的蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法，其特征在于，經(jīng)過下述步驟(1)取新鮮蓮藕，粉碎，去離子水4°C浸泡過夜，過濾除去殘?jiān)?000rpm離心lOmin取上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去多余的水分，_45°C冷凍干燥得到粗提物L(fēng)；(2)將粗提物L(fēng)溶于去離子水中，上樣于大孔吸附樹脂，洗脫，先用去離子水洗去雜質(zhì)L1，再用30%的乙醇洗脫得到有效成分樣品L2，柱子用90%乙醇洗去雜質(zhì)L3；(3)得到的樣品L2冷凍干燥后稱、取上樣于1.2X80cm的葡聚糖凝膠柱LH-20，洗脫，先用去離子水和乙醇依次洗去雜質(zhì)L2al2d，再用乙醇洗脫，通過測(cè)量OD280得到三個(gè)洗脫峰，分別命名為L(zhǎng)2e、L2f和L2g，收集第二個(gè)峰，為抗氧化活性總產(chǎn)物L(fēng)2f；(4)L2f冷凍干燥后用制備型HPLC的C18柱，以水和甲醇混合液洗脫，洗脫速度為3ml/min，洗去雜質(zhì)L2f-1后，收集得到兩個(gè)抗氧化活性純品峰，命名為L(zhǎng)2f2，鑒定為沒食子兒茶素，以及L2f-3，鑒定為兒茶素。3.按照權(quán)利要求2所述的蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法，其特征在于，步驟(1)中為冷水浸提。4.按照權(quán)利要求2所述的蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法，其特征在于，步驟(2)中使用1.5X35cm的弱極性大孔吸附樹脂NKA柱，僅用水和30%乙醇即可從粗提物L(fēng)中一步分離出活性總產(chǎn)物L(fēng)2。5.按照權(quán)利要求2所述的蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法，其特征在于，步驟(3)中使用1.2X80cm的葡聚糖凝膠柱LH-20，僅用水和不同濃度乙醇即可對(duì)活性總產(chǎn)物進(jìn)行用分離，用60%的乙醇有效純化得到兒茶素類有效成分L2f。6.按照權(quán)利要求2所述的蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法，其特征在于，步驟(4)中，僅用水和甲醇即可在C18反向柱上用HPLC法純化出單一活性成分，甲醇與水的體積比例為37。7.—種權(quán)利要求1和2所述的蓮藕中兒茶素類小分子的應(yīng)用方法，其特征在于，提取物L(fēng)2f-2和L2f-3，可應(yīng)用于體內(nèi)外抗氧化以及抗病毒藥物或保健品。全文摘要本發(fā)明蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法及其應(yīng)用，本發(fā)明蓮藕中兒茶素類小分子的提取方法，為通過水浸提、大孔樹脂吸附、葡聚糖凝膠過濾，得到兩種純化產(chǎn)物沒食子兒茶素和兒茶素。本發(fā)明提取的蓮藕中沒食子兒茶素和兒茶素不僅具有很強(qiáng)的體外、細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性，更具有高效清除活性氧自由基的活性以及抗HIV的活性，可提高機(jī)體免疫水平，預(yù)防與自由基相關(guān)的各種疾病。本發(fā)明具有抗氧化和抗HIV的特點(diǎn)，原材料資源豐富，成本低廉，提取方便，安全無毒，可用于藥物或天然保健品開發(fā)。文檔編號(hào)A61P31/12GK101824021SQ20091007079公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2009年10月14日優(yōu)先權(quán)日2009年10月14日發(fā)明者劉方,呂鵬云,張聃,曲麗媛,李寧,江筠,王常榮,陳芝惠申請(qǐng)人:南開大學(xué)