專利名稱：抗生素替加環(huán)素在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物新功能,尤其涉及的是抗生素替加環(huán)素(Tigcycline)具有抑制胃癌細胞增殖與誘導(dǎo)其自噬的抗癌新功能。
背景技術(shù)：
目前在世界范圍內(nèi)，在癌癥引發(fā)的死亡中胃癌的死亡率排名第二，而且晚期胃癌病人往往具有很低的生存率。在我國其發(fā)病率和死亡率居各類腫瘤的首位，嚴重威脅人類健康。雖然在過去的二十年中胃癌的發(fā)生率出現(xiàn)了一定程度的降低，但是這類疾病仍然具有很高的死亡率(700000人/年)。在東亞，東歐以及美洲南部和中部地區(qū)，胃癌仍然是最普遍的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。雖然近來在治療消化系統(tǒng)惡性腫瘤的方法上(包括外科手術(shù)、藥物化學(xué)治療以及放射化學(xué)治療)取得了一定的進展，但是沒有哪種方法能夠?qū)ν砥诎┌Y病人產(chǎn)生非常良好的療效。鑒于過去幾十年中胃癌的治療方法都沒有發(fā)生根本的變化，因此能夠發(fā)現(xiàn)新的有效的治療手段或者方法將對胃癌的治療產(chǎn)生積極的影響。我們基于這種想法，利用老藥新用這一策略，積極的篩選有效的抵抗胃癌的藥物，其中篩選得到替加環(huán)素(Tigcycline)就能夠有效的抵抗胃癌。替加環(huán)素(Tigcycline)，商品名泰格(Tygacil)，是2005年由美國食品及藥品管理局(FDA)批準上市的第一種甘氨環(huán)素類抗生素，其由米諾環(huán)素(一種半合成的四環(huán)素)衍生而來，化學(xué)名為:(4S，4aS, 5aR, 12aS)-9_(2_叔丁基氨基乙酰氨基)_4，7-雙二甲氨基 _1，4, 4a, 5, 5a, 6, 11, 12a-八氧-3, 10, 12, 12a-四輕基 _1，11- _■氧代-2_ 并四苯甲酸胺。目前臨床上的替加環(huán)素是作為一種廣譜類抗生素使用，與四環(huán)素類抗生素在結(jié)構(gòu)、功能及作用機制上均具有非常大的相似性，同時又具有不同于舊一代四環(huán)素類抗生素的優(yōu)越性。過去的研究表明，在黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等一些前期臨床的腫瘤模型中，舊一代的四環(huán)素類抗生素如米諾環(huán)素、多西環(huán)素等均具有一定的抗癌效果。腫瘤細胞最主要的 特征是持續(xù)不斷地增殖，主要原因之一就是腫瘤細胞細胞周期的不停滯性。細胞周期分為Gl期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(有絲分裂期)4個時期，并存在G1/S (調(diào)節(jié)Gl — S進程)、S/G2、G2/M三個調(diào)控點，其中G1/S是細胞周期關(guān)鍵調(diào)控點，一旦調(diào)節(jié)此調(diào)控點的基因過度表達將導(dǎo)致細胞不斷地增殖。細胞周期素Cyclin E (CCNE)是S期標記物，在Gl晚期合成，其過表達對Gl — S進程過渡起著重要作用，是細胞周期G1/S調(diào)控點的關(guān)鍵調(diào)控因子之一。DNA合成期細胞比(S期細胞比，SPF)與腫瘤細胞增殖能力密切相關(guān)，是反映腫瘤細胞增殖周期和增殖潛能的主要指標之一?，F(xiàn)有的多種抗腫瘤藥物就是利用將細胞周期阻滯于G0/G1期而達到抑制腫瘤細胞增殖的抗腫瘤功效。自噬現(xiàn)象是一種高度保守的細胞行為，是細胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要途徑。相對于主要降解短半衰期蛋白質(zhì)的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，細胞的自噬被認為參與絕大多數(shù)長半衰期蛋白質(zhì)的降解，表現(xiàn)為細胞漿中出現(xiàn)大量包裹著細胞漿和細胞器的空泡結(jié)構(gòu)和溶酶體對空泡內(nèi)成分的降解。自噬與細胞的生長，增殖以及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。LC3是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是細胞自噬泡膜的通用標記物。細胞中新合成的LC3經(jīng)過加工，成為胞漿可溶性LC3I(LC3A)，后者經(jīng)泛素樣加工修飾過程，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，稱為LC3II(LC3B)，LC3II含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比，因此LC3II含量的變化在某種程度上反映了細胞的自噬活性。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素除了其自身的廣譜抗生素特點之外，具有能夠抵抗胃癌的新功能，主要包括抑制胃癌細胞生長，阻斷細胞周期以及誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，而且進一步的胃癌動物模型實驗也證實了以上的實驗結(jié)論，表明替加環(huán)素可以作為一種潛在的抗胃癌藥物進行進一步的開發(fā)利用。。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:抗生素替加環(huán)素在制備抗癌藥物中的應(yīng)用?？股靥婕迎h(huán)素在制備抗胃癌藥物中的應(yīng)用。根據(jù)上述的應(yīng)用制備獲得的抗癌藥物。發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn):替加環(huán)素(TIG)能夠抑制胃癌細胞系MKN-45及胃癌低傳代細胞GAM-016的生長；替加環(huán)素(TIG)能夠阻斷胃癌細胞系MKN-45及胃癌低傳代細胞GAM-016的細胞周期；替加環(huán)素(TIG)能夠促進胃癌細胞系MKN-45及胃癌低傳代細胞GAM-016的自噬；替加環(huán)素(TIG)在胃癌的荷瘤鼠模型上具有抑制胃癌生長的功能。


圖1為替加環(huán)素(TIG)能夠抑制胃癌細胞系MKN-45及胃癌低傳代細胞GAM-016的生長；A.臺盼藍計數(shù)顯示不同濃度(OuM，IuM, 5uM, IOuM)替加環(huán)素處理72小時對不同胃癌細胞的增殖抑制作用MTT生長曲線測定不同濃度(OuM，5uM, IOuM)替加環(huán)素對不同胃癌細胞的生長抑制作用；C.BrdU細胞增殖檢測IOuM濃度的替加環(huán)素處理72小時對不同胃癌細胞的增殖抑制作用；(注:*表示與對照組比較P〈0.05，**表示與對照組比較P〈0.01)；圖2為替加環(huán)素(TIG)能夠阻斷胃癌細胞系MKN-45及胃癌低傳代細胞GAM-016的細胞周期；A.流式細胞周期檢測IOuM濃度的替加環(huán)素處理72小時對不同胃癌細胞的周期分布情況的影響免疫印跡實驗檢測IOuM濃度的替加環(huán)素處理72小時對不同胃癌細胞周期調(diào)控蛋白表達的影響；(注:*表示與對照組比較p〈0.05, **表示與對照組比較Ρ〈0.01)；圖3為替加環(huán)素(TIG)能夠促進胃癌細胞系MKN-45及胃癌低傳代細胞GAM-016的自噬；A.MDC染色檢測IOuM濃度的替加環(huán)素對不同胃癌細胞處理不同時間(24h，48h)后細胞內(nèi)自噬小體形成情況；B.細胞免疫熒光檢測IOuM濃度的替加環(huán)素對不同胃癌細胞分別處理不同時間(24h，48h)后細胞內(nèi)LC3II表達情況；C.免疫印跡檢測IOuM濃度的替加環(huán)素對不同胃癌細胞分別處理不同時間(24h，48h)后LC3II蛋白表達水平；圖4為替加環(huán)素(TIG)在胃癌的荷瘤鼠模型上具有抑制胃癌生長的功能；A.腫瘤體積生長曲線；B.腫瘤形態(tài)大小展示；C.腫瘤組織相關(guān)蛋白表達水平檢測；(注:*表示與對照組比較P〈0.05，**表示與對照組比較P〈0.01)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實驗方法與步驟1.1、細胞培養(yǎng)人胃癌細胞系MKN-45細胞呈貼壁生長，培養(yǎng)于含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100U/mL,的RPM1-1640培養(yǎng)基中，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，每2_3天更換培養(yǎng)基或傳代培養(yǎng)。人胃癌原代細胞GAM-016由病人胃癌組織培養(yǎng)而成，胃癌組織先經(jīng)0.3%IV型膠原酶消化處理后，生長于含有20ng/L EGF以及20ng/L b-FGF的無血清RPM1-1640培養(yǎng)基中，形成一定數(shù)量的胃癌原代細胞后同MKN-45 —樣的條件進行培養(yǎng)。1.2、藥物處理替加環(huán)素(商品名泰閣，Tygacil, Wyeth)采購輝瑞,溶解于100%的DMSO中，配制成IOOmM的存儲液，分裝，-20°C保存。按處理濃度稀釋為I μ M，10 μ M，100 μ M分別對胃癌細胞系ΜΚΝ-45及胃癌原代細胞GAM-016進行處理，對照組添加等體積的DMS0，普通觀察顯微鏡細胞形態(tài)。1.3、臺盼藍計數(shù)將實驗組與對照組的細胞分別消化成細胞懸液，取10 μ L細胞懸液(可根據(jù)細胞數(shù)量進行稀釋)與0.5%臺盼藍染色液按1:1體積比混合均勻后，將一小滴(約μ L)滴于細胞計數(shù)池中，沉降I分鐘，低倍鏡下計數(shù)細胞計數(shù)板四大中格中結(jié)構(gòu)完整的細胞，小細胞團計數(shù)為I ;計數(shù)時如果細胞壓在格 上，則數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，然后按下式計算出每毫升懸液中的細胞數(shù):細胞數(shù)/每毫升細胞懸液=(四大中格細胞數(shù)/4) X IO4X稀釋倍數(shù)。1.4、ΜΤΤ生長曲線檢測將細胞懸液按400個/孔(200 μ I)接種于96孔板上，5孔/組，共接種7板，置于37°C、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。每日取出一板，棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗一遍，每孔加20 μ IMTT(5g/L)，培養(yǎng)液200μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，加DMS0200 μ I/孔，震蕩器震蕩lOmin，使紫色結(jié)晶充分溶解，置酶聯(lián)免疫檢測儀上測定波長570nm下的吸光度值，取吸光度值的平均值，然后以吸光度值為縱坐標，以時間(day)為橫坐標繪制生長曲線。1.5、免疫熒光取處于對數(shù)生長期的細胞，稀釋成3 X IO5個/ml，接種于24孔板(孔板上鋪有NUNC玻片)。24h后見細胞基本貼壁，實驗組10 μ M替加環(huán)素(TIG)分別作用ΜΚΝ-45及GAM-016細胞一定時間后(陰性對照組只加等量DMS0)，取出玻片，PBS洗2次，用4%多聚甲醛固定細胞20min，并加入0.1% TritonX-lOOlOmin，PBS洗3次。在常溫下用封閉液封閉Ih后加入一抗，在室溫下孵育2h，PBS洗3次。然后在避光下加入二抗，室溫下孵育lh。PBS洗3次。再用DAPI染核，90%的甘油封片。最后在熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察。1.6、細胞周期檢測流式細胞儀檢測細胞周期，采用PI染色法。實驗組10 μ M替加環(huán)素(TIG)分別作用ΜΚΝ-45及GAM-016細胞72h后(陰性對照組只加等量DMS0)，分別收集各組細胞，每組各設(shè)3個復(fù)孔，PBS清洗I遍。注入預(yù)冷70%乙醇，固定18h。離心棄乙醇后用PBS洗I次。加入RNA酶37°C作用I 2h,加入Triton X-100PI (100 μ g/ml) 100 μ I,混勻置冰上30min后，在流式細胞儀上檢測。
1.7、蛋白免疫印跡收集經(jīng)處理的細胞，PBS洗滌2次，加入細胞裂解液100 μ 1，12000rpm離心15min，定量蛋白，取50 μ g蛋白，加入上樣緩沖液，950C下變性5min。10 % 15 %的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂牛奶封閉后依次加入一抗、二抗，在室溫下孵育 2h，TBST 緩沖液(IOmmol / L Tris-HCl，ρΗ7.4，150mmoI / LNaCl，0.1 % Tween20)洗滌3次,每次IOmin,暗室ECL顯色。1.8、單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色取處于對數(shù)生長期的細胞，稀釋成3 X IO5個/ml，接種于24孔板(孔板上鋪有NUNC玻片)。24h后見細胞基本貼壁，實驗組10 μ M替加環(huán)素(TIG)分別作用ΜΚΝ-45及GAM-016細胞一定時間后(陰性對照組只加等量DMS0)，加入0.05mM的單丹(磺)酰戊二胺(MDC)，37°C、5%C02條件下繼續(xù)避光培養(yǎng)15min，取出玻片，PBS洗2次，用4%多聚甲醛固定細胞15min, PBS洗2次，最后在熒光顯微鏡下觀察。1.9、荷瘤鼠動物模型檢測取對數(shù)生長期的胃癌原代細胞GAM-016100萬個注射到4周大的免疫缺陷鼠皮下。每只小鼠左右各注射一個點，在生長7天后出現(xiàn)肉眼可見腫瘤，形成荷瘤鼠模型，然后開始采取腹腔給藥，實驗組按100mg/kg劑量的替加環(huán)素給藥，對照組注射等體積的溶劑DMS0，每組六個重復(fù)，連續(xù)5天后停止給藥，然后每隔一天記錄荷瘤鼠身上腫瘤的體積(體積=長X寬2X0.5236)變化情況，連續(xù)測量9天后，對荷瘤鼠進行解剖，取出腫瘤組織，拍照。2.實驗結(jié)果及分析2.1替加環(huán)素(Tigcycline)能夠抑制胃癌細胞系MKN-45及胃癌原代細胞GAM-016的生長臺盼藍計數(shù)法表明，替加環(huán)素對胃癌細胞系MKN-45及胃癌原代細胞GAM-016的增殖具有明顯的抑制作用，在替加環(huán)素處理72小時的情況下，IOuM濃度(胃癌細胞MKN-45實驗組50.03%,對照組100.00% ；胃癌原代細胞實驗組38.23% ;對照組100.00%), IOOuM濃度(胃癌細胞MKN-45實驗組18.08%,對照組100.00% ;胃癌原代細胞實驗組17.27% ;對照組100.00%)的替加環(huán)素均能夠明顯的抑制胃癌細胞的增殖，并呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)(如圖LA)。MTT生長曲線測定結(jié)果顯示，替加環(huán)素能夠明顯的抑制胃癌細胞的生長并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，對比于對照組，10uM，IOOuM濃度的替加環(huán)素均能夠明顯的抑制胃癌細胞的生長(如圖1.B)。BrdU細胞增殖檢測，IOuM濃度的替加環(huán)素處理72小時后的胃癌細胞，其BrdU的陽性率發(fā)生明顯的降低(胃癌細胞MKN-45實驗組27.01%，對照組39.00% ;胃癌原代細胞實驗組22.61% ;對照組44.72%)，表明IOuM濃度的替加環(huán)素能夠明顯的抑制胃癌細胞的增殖(如圖1.C)。(BrdU作為一種胸腺嘧啶核苷的類似物，像胸腺嘧啶核苷一樣可摻入到細胞合成的DNA中。當(dāng)細胞處于DNA合成期而同時又有BrdU存在時，就會有BrdU摻入新合成的DNA中，只要細胞不消亡，這種BrdU就在胞核的DNA中長期存留。摻入到DNA的BrdU可通過抗BrdU單克隆抗體得以顯示，其陽性率直接反應(yīng)了細胞的增殖率。)
2.2替加環(huán)素能夠阻斷胃癌細胞的細胞周期流式細胞周期檢測個時期細胞所占的比例，結(jié)果顯示IOuM濃度的替加環(huán)素處理胃癌細胞72小時后，處于細胞周期Gl期的細胞發(fā)生了明顯的增加(胃癌細胞MKN-45實驗組70.02%,對照組48.92% ；胃癌原代細胞實驗組69.95% ;對照組50.57%)，而處于S期(胃癌細胞MKN-45實驗組21.29%，對照組32.10% ;胃癌原代細胞實驗組21.86% ;對照組30.96%)，G2期(胃癌細胞MKN-45實驗組8.68%，對照組19.01% ；胃癌原代細胞實驗組8.18% ;對照組18.47%)的細胞均減少了(如圖2.A)，表明替加環(huán)素能夠阻斷胃癌細胞的正常周期，從而達到抑制其增殖的目的。免疫印跡實驗檢測周期調(diào)控蛋白的表達情況，其中胃癌細胞中周期蛋白El的表達量隨著替加環(huán)素的處理發(fā)生了顯著的下降(如圖2.B)，該蛋白主要是調(diào)控細胞周期Gl期向S期運轉(zhuǎn)，當(dāng)其表達量下降時會導(dǎo)致細胞周期發(fā)生G1/S阻滯，從而使腫瘤細胞生長受到抑制。2.3替加環(huán)素能夠促進胃癌細胞的自噬MDC染色檢測自噬小體的形成情況，實驗結(jié)果顯示IOuM濃度的替加環(huán)素處理后的胃癌細胞自噬小體明顯的增加了，而且隨著處理時間的延長，自噬小體呈現(xiàn)增加的趨勢，表明替加環(huán)素能夠誘導(dǎo)胃癌細胞自噬(如圖3.A)。(單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法，是自噬發(fā)生過程中分析分子水平機制的一種特異的檢測自噬體方法。自噬體形成依賴的第二個泛素樣結(jié)合系統(tǒng)(ApgS)是位于自噬囊泡膜上與MDC特異結(jié)合的生化標志，通過熒光染色，在熒光顯微鏡下可見核周區(qū)域陽性顯色。)自噬小體相關(guān)蛋白LC 3II(LC3B)表達情況檢測，細胞免疫熒光及免疫印跡實驗結(jié)果均顯示IOuM濃度的替加環(huán)素處理后的胃癌細胞LC3II (LC3B)的表達情況發(fā)生了明顯的增加(如圖3.B, C)。而且隨著替加環(huán)素處理時間的增加LC3II的表達水平也逐漸增加，進一步說明了替加環(huán)素能夠誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生自噬。2.4替加環(huán)素在胃癌的荷瘤鼠模型上具有抑制胃癌生長的功能腫瘤體積生長曲線測定，對免疫缺陷鼠采取皮下注射胃癌原代細胞GAM-016 (100萬個)，在生長7天后出現(xiàn)肉眼可見腫瘤，開始采取腹腔給藥，實驗組按100mg/kg劑量的替加環(huán)素給藥，對照組注射等體積的溶劑DMS0，每組六個重復(fù)，連續(xù)5天后停止給藥，然后每隔一天測量荷瘤鼠身上的腫瘤體積，連續(xù)測量9天后，對荷瘤鼠進行解剖，取出腫瘤。實驗結(jié)果顯示在不影響荷瘤鼠正?；顒拥那闆r下藥物組荷瘤鼠腫瘤的生長情況明顯受到抑制，表明替加環(huán)素在胃癌動物模型上也具有抗腫瘤的功能(如圖4.A，B)。免疫印跡實驗檢測組織水平相關(guān)蛋白表達情況，分別對實驗組和對照組荷瘤鼠身上的腫瘤組織進行蛋白提取后檢測周期蛋白El (CCNEl)和微管相關(guān)蛋白-3(LC-3)表達量，實驗結(jié)果顯示注射替加環(huán)素治療的荷瘤鼠腫瘤組織中的CCNEl蛋白表達量發(fā)生了明顯的降低，而LC3II的表達量發(fā)生了明顯的升高，這些結(jié)果分別表明替加環(huán)素在個體水平上能夠?qū)е履[瘤的周期阻滯以及誘導(dǎo)其發(fā)生自噬(如圖4.C)，從而進一步說明了替加環(huán)素具有抗胃癌腫瘤的功能。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1.抗生素替加環(huán)素在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
2.抗生素替加環(huán)素在制備抗胃癌藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1 或2所述的應(yīng)用制備獲得的抗癌藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗生素替加環(huán)素的一種新功能，即抗生素替加環(huán)素的抗癌功能。發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素(TIG)能夠抑制胃癌細胞系MKN-45及胃癌低傳代細胞GAM-016的生長；替加環(huán)素(TIG)能夠阻斷胃癌細胞系MKN-45及胃癌低傳代細胞GAM-016的細胞周期；替加環(huán)素(TIG)能夠促進胃癌細胞系MKN-45及胃癌低傳代細胞GAM-016的自噬；替加環(huán)素(TIG)在胃癌的荷瘤鼠模型上具有抑制胃癌生長的功能。
文檔編號A61K31/65GK103142624SQ20131006652
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者崔紅娟, 湯春鈴, 楊麗群, 夏慶友, 向伸懷 申請人:西南大學(xué)