專利名稱：無抗多效價遲鈍愛德華氏菌載體活疫苗、其制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及減毒突變株技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及魚用細菌性減毒活疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種遲鈍愛德華氏菌疫苗株的重組無抗多效價疫苗載體、相關(guān)制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在各個國家都呈現(xiàn)出大規(guī)模、集約化的發(fā)展趨勢，它在為人類提供食物的環(huán)節(jié)中扮演著非常重要的角色。隨著全球的人口在增長，人類對食物的需要量在不斷的加大，當(dāng)然對魚類的需求量也在加大。然而，隨著漁業(yè)養(yǎng)殖的不斷穩(wěn)步發(fā)展，各種病害問題日益突出，對養(yǎng)殖產(chǎn)量及成長造成嚴重影響。在我國，近幾年發(fā)展起來的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖魚類的突發(fā)性、爆發(fā)性疾病頻繁發(fā)生。目前，我國的海水養(yǎng)殖平均死亡損失率在30%以上，每年的經(jīng)濟損失多達160億元，病害問題已成為制約海水養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。疫苗具有針對性強、抗病周期長、可終身免疫、效果顯著和防治主動的特點。以病原菌細胞滅活體為基礎(chǔ)形式的滅活疫苗(Inactivated Vaccine)為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治提供了有效手段，但滅活疫苗普遍具有給藥不便(注射給藥才具有較好的免疫保護力)的技術(shù)應(yīng)用缺陷，減毒活疫苗因具有給藥方便(可浸泡給藥)、免疫效價高(可減少給藥劑量)、成本低廉、可開發(fā)廣譜疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保護性)的新技術(shù)優(yōu)勢，已成為當(dāng)前國際上水產(chǎn)養(yǎng)殖用疫苗研究和開發(fā)的熱點和前沿領(lǐng)域。多效價載體疫苗是以減毒活疫苗為疫苗載體，通過將多種不同病原菌的抗原插入到同一個表達的質(zhì)粒載體上，避免了減毒活疫苗存在的潛在的毒力返還風(fēng)險，在宿主體內(nèi)激發(fā)免疫反應(yīng)時免疫應(yīng)答效果更好，被廣泛用于疫苗開發(fā)。傳統(tǒng)的載體疫苗都是通過質(zhì)粒來表達異源抗原的，而通常質(zhì)粒都是采用抗生素作為篩選標記的，這樣對于疫苗存在兩個主要的問題需要解決。當(dāng)疫苗進入到宿主體內(nèi)時，宿主體內(nèi)是不存在抗生素的選擇壓力的，使用了高拷貝質(zhì)粒的疫苗，因為沒有選擇壓力的存在，會大量丟失質(zhì)粒，使得異源抗原的表達量下降迅速，最終會導(dǎo)致疫苗效價降低。另外，疫苗構(gòu)建過程中使用抗性選擇基因使得后期疫苗的應(yīng)用存在很大的潛在安全性問題。自然界中基因會發(fā)生漂移，抗性基因也不例外，因此目前人畜使用的疫苗對抗性基因的使用非常嚴格，雖然水產(chǎn)疫苗還沒有相關(guān)的政策，但是水產(chǎn)養(yǎng)殖的魚類做為人類的食物來源，安全性是值得重視的。如果一個菌株因為自然突變或者是人工的方式變成了營養(yǎng)缺陷型，因為其染色體上的某個基因缺失后產(chǎn)生對某一種營養(yǎng)物質(zhì)的依賴，那么這個缺失突變株可以通過一個有功能的、存在于質(zhì)粒上的基因進行回補，這種回補就可以通過在培養(yǎng)基中添加這類營養(yǎng)物質(zhì)來進行篩選而不是抗生素，如果培養(yǎng)基中不含有這種營養(yǎng)物質(zhì)那么只有帶有回補質(zhì)粒的菌株才可以生長。同樣，這種質(zhì)粒在宿主體內(nèi)也可以穩(wěn)定的存在，因為質(zhì)粒上的篩選壓力來自于疫苗株的生存，而不是需要額外的合成抗生素等物質(zhì)。通過這種染色體-質(zhì)?；匮a的形式構(gòu)建的系統(tǒng)就被稱為平衡致死系統(tǒng)。 因為平衡致死系統(tǒng)可以替代抗性篩選標記而不需要再使用抗性篩選表達，將這種系統(tǒng)用于構(gòu)建非抗性選擇標記的疫苗，解決了抗性選擇標記所帶來的生物安全性問題。愛德華氏菌屬是導(dǎo)致淡水、海水養(yǎng)殖魚類細菌性疾病的一類常見的病原體，具體分為遲純愛德華氏菌(Edwardsiella tarda),魚愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)和?？茞鄣氯A氏菌(Edwardsiella hoshinae)。由其引起的魚類出血性敗血癥統(tǒng)稱為愛德華氏菌病(Edwardsiellosis)。該病傳播面積廣，無明顯季節(jié)性，感染率及死亡率高，危害的種類多，有鯉魚，羅非魚，鰻鱺，鯔魚，鮭魚，鱒魚，鲆鰈等大多數(shù)具有較高經(jīng)濟價值的魚種。此外，遲鈍愛德華氏菌還感染貝類、爬行類、兩棲類、鳥類、哺乳類。值得注意，遲鈍愛德華氏菌還是一種重要的人畜共患病原菌，它是愛德華氏菌屬中唯一感染人類的成員。目前，我國養(yǎng)殖魚類愛德華氏菌病病害比較嚴重的病原體主要為遲鈍愛德華氏菌，并有存在病原體向人體轉(zhuǎn)移的巨大威脅。美國專利有利用利福平篩選得到野生毒株的自然減毒突變體作為減毒活疫苗的報道(Evans J J, Klesius, P H and Shoemaker C A2006Modified liveEdwardsiella tarda vaccine for aquatic animals;United States Patent7067122)。目前在我國尚無該病害的有效防治措施。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明構(gòu)建了一種遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株，其特征在于，所述遲鈍愛德華氏菌基因組缺失天冬氨酸半縮醛合成酶基因asdB，并含有回補質(zhì)粒，所述回補質(zhì)粒含有SD-asdB片段和異源免疫原編碼序列，所述 SD-asdB片段由操作性相連的SD序列和遲鈍愛德華氏菌天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列構(gòu)成，所述回補質(zhì)粒不含抗生素標記，所述異源免疫原編碼序列與調(diào)控序列操作性相連從而能夠在遲鈍愛德華氏菌中表達。本發(fā)明通過基因組缺失-質(zhì)粒回補的平衡致死系統(tǒng)構(gòu)建了安全、高效的多效價載體活疫苗。天冬氨酸半縮醛合成酶是遲鈍愛德華氏菌生長所必需的，天冬氨酸半縮醛合成酶基因asdB缺失株無法正常生長。本發(fā)明采用asdB基因替代高拷貝質(zhì)粒中的抗性基因作為篩選標記構(gòu)建得到無抗回補質(zhì)粒，以該回補質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺失株來回補基因組asdB缺失，轉(zhuǎn)化得到的回補株能夠正常生長。本發(fā)明的回補質(zhì)粒是不含抗性標記的質(zhì)粒表達系統(tǒng)。本發(fā)明對于用來構(gòu)建回補質(zhì)粒的出發(fā)質(zhì)粒沒有特別限制，只要能夠在在遲鈍愛德華氏菌內(nèi)存活和/或復(fù)制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)轉(zhuǎn)化的對象和轉(zhuǎn)化目的，例如是為表達、擴增還是整合到基因組等，依照現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)做出合適的選擇。例如，可以選用質(zhì)粒載體，例如后文實施例所用的PUTt質(zhì)粒。實施方式之一中，本發(fā)明用遲鈍愛德華氏菌asdB基因的SD-asdB片段替代高拷貝質(zhì)粒中的抗性基因作為篩選標記構(gòu)建得到無抗回補質(zhì)粒。本發(fā)明中，“SD-asdB片段”由操作性相連的SD序列和遲鈍愛德華氏菌天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列構(gòu)成。本發(fā)明實施方式之一中，所述天冬氨酸半縮醛合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。實施方式之一中，所述SD-asdB片段來自遲鈍愛德華氏菌EIB202 JBSEQ ID NO: 2所示，其中第1_4位的“AGGA”為SD序列，第11-1111位為天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列，第11-13位的“ATG”為起始密碼子，第1112-1114位的“TAG”為終止密碼子?？紤]到回補質(zhì)粒中基因的過量表達可能對菌體的生長代謝產(chǎn)生負擔(dān)，我們采用無啟動子的asdB基因進行回補，并改動了 asdB基因的SD序列以及起始密碼子來優(yōu)化回補結(jié)果。實施方式之一中，我們將野生型的SD序列由AGGA改變?yōu)锳AGA。實施方式之一中，我們將天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列的起始密碼子由ATG改變?yōu)镚TG。實施方式之一中，回補質(zhì)粒中的SD-asdB片段序列如SEQ ID N0:3所示。本發(fā)明的回補質(zhì)粒還含有與調(diào)控序列操作性相連的異源免疫原編碼序列。本發(fā)明中，“異源免疫原”指非遲鈍愛德華氏菌來源的免疫原，其能夠中魚類中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。本發(fā)明實施方式之一中，所述異源免疫原是甘油醛三磷酸脫氫酶(GATOH)。該酶在各類生物是高度保守的，其參與糖酵解途徑，關(guān)于其免疫和免疫保護特性在很多研究中已經(jīng)得到證明。本發(fā)明實施方式之一中，所述GAPDH是嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的GAPDH,其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。本發(fā)明實施方式之一中，所述GAPDH的編碼序列如SEQ IDN0:5所示。本發(fā)明中，“操作性相連”的序列包括與感興趣的基因毗連或相距一定距離的表達控制序列，該操作性連接方式使得所述調(diào)控序列能夠控制感興趣基因的表達，使其在宿主細胞內(nèi)得以轉(zhuǎn)錄和表達。選擇合適的調(diào)控序列屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技能。本發(fā)明實施方式之一中，所述異源免疫原的編碼序列與遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動子Pdps(在此簡稱Pdps)操作性相連，Pdps由此控制啟動異源免疫原基因的表達。本發(fā)明實施方式之一中，所述遲鈍愛德華氏菌Pdps來自遲鈍愛德華氏菌EIB202，其序列如SEQ IDNO:6所示。用于構(gòu)建本發(fā)明無抗多效價載體活疫苗株的出發(fā)菌株優(yōu)選減毒疫苗株。實施方式之一中，采用的起始疫苗株是保藏號為CCTCC N0:M2010278的遲鈍愛德華氏菌WED。遲鈍愛德華氏菌WED是高效減毒疫苗株，其基因組缺失了分支酸合成酶基因aroC，三型分泌系統(tǒng)效應(yīng)元件基因eseB, escA, eseC和eseD,并且缺失了內(nèi)源性質(zhì)粒pEIBl。本發(fā)明進一步敲除了遲鈍愛德華氏菌WED的基因組天冬氨酸半縮醛脫氫酶基因asdB。實施方式之一中，本發(fā)明由WED菌株構(gòu)建得到含有回補質(zhì)粒的無抗多效價活疫苗株遲鈍愛德華氏菌EIB AVMl，其保藏號為 CCTCC N0:M2012341o本發(fā)明還提供了制造遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株方法，包括:敲除遲鈍愛德華氏菌出發(fā)菌株的基因組天冬氨酸半縮醛合成酶基因asdB，制得asdB缺失菌株；獲取回補質(zhì)粒，所述回補質(zhì)粒含有SD-asdB片段和異源免疫原編碼序列，所述SD-asdB片段由操作性相連的SD序列和遲鈍愛德華氏菌天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列構(gòu)成，所述回補質(zhì)粒不含抗生素標記，所述異源免疫原編碼序列與調(diào)控序列操作性相連從而能夠在遲鈍愛德華氏菌中表達；用所述回補質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述asdB缺失菌株，得到所述遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株。實施方式之一中，所述遲鈍愛德華氏菌出發(fā)菌株是保藏號為CCTCC N0:M2010278的遲鈍愛德華氏菌WED。實施方式之一中，所述回補質(zhì)粒以pUTt質(zhì)粒為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建而成。實施方式之一中，所述回補質(zhì)粒中天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列編碼SEQ IDNO:1所示氨基酸序列。實施方式之一中，所述回補質(zhì)粒中天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列的起始密碼子是GTG。實施方式之一中，所述SD-asdB片段中的SD序列是AAGA。實施方式之一中，所述SD-asdB片段的序列是SEQ ID NO: 2，另一實施方式中為SEQ ID NO: 3所示。實施方式之一中，所述異源免疫原是嗜水氣單胞菌的甘油醛三磷酸脫氫酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。實施方式之一中，所述甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)的編碼序列如SEQ ID NO:5中所示。
實施方式之一中，所述回補質(zhì)粒含有與所述異源免疫原操作性相連的遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動子Pdps,例如遲鈍愛德華氏菌EIB202基因組擴增獲得鐵誘導(dǎo)性啟動子Pdps，其序列如SEQ ID N0:6所示。本發(fā)明還提供了所述遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株防治遲鈍愛德華氏菌和/或嗜水氣單胞菌感染的醫(yī)藥用途，例如用于制造魚用藥物。本發(fā)明的無抗多效價載體活疫苗具有高效的針對遲鈍愛德華氏菌以及嗜水氣單胞菌的雙重免疫保護力，消除了傳統(tǒng)減毒載體活疫苗中所包含的抗生素標記，大大降低了普遍存在的潛在環(huán)境和產(chǎn)品安全風(fēng)險，是針對養(yǎng)殖魚類疾病的一種安全、有效、經(jīng)濟的疫苗。實施方式之一中，本發(fā)明提供了一種遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株的制齊U，其中包含本發(fā)明遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株和在藥理上可接受的載體。實施方式之一，所述載體活疫苗株的菌體細胞濃度為IO2 109CFU/ml數(shù)量級，或者IO4 106CFU/ml數(shù)量級，例如107CFU/ml。實施方式之一中，所述載體是無菌生理鹽水，例如NaC19g/L，pH為7.2的生理鹽水。本發(fā)明還提供采用本發(fā)明遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株或本發(fā)明多效價載體活疫苗株制劑防治養(yǎng)殖魚類的遲鈍愛德華氏菌病和嗜水氣單胞菌病中的方法。實施方式之一中，所述遲鈍愛德華氏菌載體活疫苗株或所述制劑通過注射方式給藥，其中菌體細胞濃度為IO2 109CFU/ml數(shù)量級，或者IO4 106CFU/ml數(shù)量級，例如107CFU/ml。本發(fā)明的有益效果包括:1.本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌無抗表達體系，替換了一般質(zhì)粒載體上的抗性篩選標記，避免了抗性基因可能產(chǎn)生漂移所帶來的生物安全性問題，具有實際的商業(yè)開發(fā)價值。2.本發(fā)明的遲鈍愛德華氏菌無抗表達體系，使疫苗株依賴于質(zhì)粒存活，使質(zhì)粒可以更穩(wěn)定的存在于疫苗株體內(nèi)而不發(fā)生質(zhì)粒的丟失，從而促進質(zhì)粒上的抗原基因持續(xù)、穩(wěn)定的表達，與傳統(tǒng)的多效價疫苗相比，能夠激發(fā)更高效的魚體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更好的免疫保護效果。3.本發(fā)明的無抗質(zhì)粒表達體系為構(gòu)建多效價載體疫苗的商業(yè)化進程提供了現(xiàn)實的開發(fā)和應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明實施方式之一，基因敲除法構(gòu)建asdB缺失菌株流程圖。圖2是Overlap PCR方法擴增構(gòu)建無抗回補質(zhì)粒pUTta4流程圖，其中，圖A為本發(fā)明中構(gòu)建無抗回補質(zhì)粒PUTta的結(jié)構(gòu)圖譜，圖B為本發(fā)明中優(yōu)化pUTta無抗質(zhì)粒獲得最終的pUTta4的構(gòu)建策略圖。圖3是pUTta4DGap的結(jié)構(gòu)圖。圖4是以大菱鲆為試驗動物的浸泡給藥免疫E.tarda EIB202和LSA34的免疫保護力試驗結(jié)果柱狀圖。
具體實施方式
為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實施例詳細說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本申請的保護范圍。實施例材料與方法:pDMK質(zhì)粒和pUTt質(zhì)粒由華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院上海阿華生物工程研究所構(gòu)建，并已經(jīng)公開于 “Edwardsiella tarda T6SS component evpP is regulated by esrBand iron, and plays essential roles in the invasion of fish，，，Wang, X 等，F(xiàn)ishShellfish Immumol,27(3):469-477，2009 和“Iron-regulated lysis ofrecombinantEscherichia coli in host releases protective antigen and confers biologicalcontainment”，Guan, L.等，Infect Immun, 79 (7):p.2608-18, 2011。SMlO 菌株由中國疾病控制中心流行病研究所惠贈，E.coli A asd和WED/pUTDGap為本實驗室所有。申請人華東理工大學(xué)在此聲明保證從本申請申請日起二十年內(nèi)向公眾按需提高PDMK質(zhì)粒、pUTt質(zhì)粒、SMlO 菌株、E.coli A asd 菌株和 WED/pUTDGap。大腸桿菌E.coli ToplO:購自英駿生物技術(shù)(Invitrogen)公司。遲鈍愛德華氏菌毒株EIB202:已于2008年5月I日提交武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC N0:M208068。該菌株的相關(guān)記載另可見于 “Isolation and identification of fish pathogen Edwardsiella tarda frommariculture in China，，，Xiao, J 等，Aquacult Res, Vol.40, 2009。嗜水氣單胞菌LSA34:已于2009年6月10日提交武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC N0:M209124。該菌株的相關(guān)記載另可見于中國專利公開 CN101659958(申請?zhí)?CN200910054113.9)。遲鈍愛德華氏菌減毒株WED:已于2010年10月24日提交武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC N0:M2010278o該菌株的相關(guān)記載另可見于中國專利申請公開CN101974472A。遲鈍愛德華氏菌減毒株EIB AVMl:已于2012年9月12日提交武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC N0:M2012341LB 液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck)5g/L，NaC15g/L，pH7.5 ；LB斜面培養(yǎng)基:胰蛋白胨(Difco) 10g/L，酵母浸出物(Merck) 5g/L，NaC15g/L，瓊脂 18g/L，pH7.5 ；種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨(Difco) 10g/L,酵母浸出物(Merck)5g/L, NaC15g/L,苯丙氨酸20mg/L,酪氨酸20mg/L,色氨酸20mg/L,對輕基苯甲酸20mg/L,對氨基苯甲酸20mg/L,pH7.5 ；發(fā)酵培養(yǎng)基:胰蛋白胨(Difco) 10g/L,酵母浸出物(Merck)5g/L, NaC15g/L,苯丙氨酸20mg/L,酪氨酸20mg/L,色氨酸20mg/L,對輕基苯甲酸20mg/L,對氨基苯甲酸20mg/L,pH6.8 ；生理鹽水:NaC19g/L，pH7.2，121°C滅菌 20 分鐘。以下例實施例中，除非特別說明，所涉方法、操作或步驟皆按照本領(lǐng)域常識、常規(guī)中常用條件下進行， 例如《分子克隆:實驗室手冊》(New York:Cold Spring HarborLaboratore Press, 1989)中所述或廠商推薦的條件和流程。實施例1遲鈍愛德華氏菌無抗重組疫苗株的構(gòu)建( 一 ) asdB基因缺失菌株的構(gòu)建I) PCR擴增獲得所需基因片段如圖1所示，以遲鈍愛德華氏菌EIB202(保藏編號:CCTCC_M208068)的基因組為模版，利用下列擴增引物:Pl:GAAGATCTTCGCTACGCCGTCAACGCCGCAGAA, SEQ ID NO:7P2:TTCGGATAGATACTGCTGCCTTGGATGGTGACGAGTTGC, SEQ ID NO:8P3:CAGTATCTATCCGCCTTTACCGTGGGC, SEQ ID NO:9P4:CATGCATGCGTGAACGCCTACCTGGAGATCGAGAA, SEQ ID NO: 10首先分別用Pl和P2、P3和P4擴增獲得Overlap PCR所需的上下片段F1，F(xiàn)2?；厥崭髌魏?，利用Overlap PCR技術(shù)采用Pl和P4獲得asdB基因缺失片段F1F2。采用TIANGEN公司的膠回收試劑盒回收目標基因片段。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)束后，EB染色，在長波紫外燈上迅速切下目的條帶，裝入Eppendorf管并稱取重量，加入3倍體積的溶膠液PN，50°C水浴放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解；將得到的溶液加入吸附柱中離心(12，OOOrpm離心30sec)，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700 ii I漂洗液PW，12，OOOrpm離心30sec，倒掉廢液，再用500 ill漂洗液PW 12，OOOrpm離心30sec，倒掉廢液。將離心吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm離心2min，盡量出去漂洗液，再將吸附柱置于室溫或50°C溫箱數(shù)分鐘，徹底地晾干后，將其放到一個干凈地離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加不少于30 Ul的洗脫緩沖液EB buffer,室溫放置2min，12，OOOrpm離心Imin收集含目的片段的DNA溶液，電泳檢測回收DNA濃度。2)構(gòu)建自殺工具質(zhì)粒如圖1所示，將pDMK載體多克隆位點的BglII位點和SphI位點切開后，將片段F1F2與切割后的質(zhì)粒用T4DNA連接酶16°C連接過夜。CaCl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化SMlO，得到質(zhì)粒載體 pDMKasdB。3)接合如圖1所示，將攜帶有pDMKasdB質(zhì)粒的SMlO按體積比2比I的比率與遲鈍愛德華氏菌疫苗株WED (保藏號:CCTCC N0:M2010278)混合離心，去除上清液，用10微升新鮮LB培養(yǎng)基重懸沉淀。將0.22微米滅菌后的水性濾膜平整鋪放在新鮮半固體LB培養(yǎng)基上，取出全部菌懸液點置于水性膜中央。37°C培養(yǎng)24小時后，用0.2M的MgCl2將水性膜上的菌落洗脫下，涂布于卡那霉素/多粘菌素雙重抗性平板。4)正向篩選asdB基因插入失活克隆如圖1所不，自殺質(zhì)粒pDMKasdB插入到基因組上asdB基因中。利用卡那霉素/多粘菌素雙重抗性平板篩選，挑取陽性克隆，以P1/P4為引物的PCR擴增驗證插入。5)篩選asdB基因缺失菌株如圖1所示，在10%蔗糖LB半固體培養(yǎng)基平板上，利用pDMK上sacB基因可反向篩選獲得發(fā)生第二次同源重組的菌株。以引物Pl和P4通過PCR驗證獲得了 asdB缺失突變菌株,命名為WED A asdB。
(二)無抗回補質(zhì)粒的構(gòu)建利用引物asdB-F (CCGCTCGAGCTCGAGAGGAGTGCATATGAAAA, SEQ ID NO: 11),asdB-R(CCCAAGCTTCTAGAGCAGCAGCCTCAGCATACGG, SEQ ID NO: 12)從遲鈍愛德華氏菌 EIB202 基因組上擴增得到SD-asdB片段(SEQ ID NO: 2),做TA克隆，從E.coli ToplO中抽提T載體測序并酶切，如前所述回收 SD-asdB 片段。使用 pUT-For (CCGCTCGAGACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGA, SEQ ID NO: 13)、pUT-Res (GAAGATCTTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCAT, SEQ ID NO: 14)引物以質(zhì)粒pUTt為模板擴增得到該質(zhì)粒的無Amp質(zhì)粒片段。將SD-asdB片段與pUTt的無Amp質(zhì)粒片段進行連接，然后轉(zhuǎn)化到E.coliAasd中進行陽性克隆篩選，獲得重組質(zhì)粒pUTta?？紤]到過高的回補基因表達會對細 菌的生長代謝產(chǎn)生負擔(dān)，我們對該無抗表達系統(tǒng)進行了優(yōu)化，將野生型的SD序列由AGGA改變?yōu)锳AGA，并將asdB基因的起始密碼子由ATG改為 GTG。用 asdB-F’ (5’ -CCGCTCGAGCTCGAGAAGAGTGCATGTGAAAAAC-3’ , SEQ ID NO: 19)和 asdB-R(CCCAAGCTTCTAGAGCAGCAGCCTCAGCATACGG, SEQ ID NO: 12)從遲鈍愛德華氏菌 EIB202基因組上擴增得到優(yōu)化的SD-asdB片段(SEQ ID NO: 3)。然后如前所述，將該優(yōu)化SD-asdB片段與pUTt的無Amp質(zhì)粒片段進行連接,獲得無抗回補質(zhì)粒pUTta4。(三)無抗的多效價減毒活疫苗WEDA asdB/pUTta4DGap的構(gòu)建首先構(gòu)建嗜水氣單胞菌LSA34的甘油醛三磷酸脫氫酶(簡稱gapA34)的表達質(zhì)粒。使用下列引物:dps-F(CGGAATTCACGCCGCATCAGCGCTGAAAA), SEQ ID NO: 15dps-R(ATACCTACTTTGATAGTCATTCTGCATGCTCTCCTTGGATG)，SEQ ID NO: 16gapA34-F(ATGACTATCAAAGTAGGTAT)，SEQ ID NO:17gapA34-R(AACTGCAGTTACTTAGAGATGTGAGCGATCAGG), SEQ ID NO: 18以dps-F/dps-R從遲鈍愛德華氏菌EIB202基因組擴增獲得鐵誘導(dǎo)性啟動子dps片段(SEQ ID N0:6)，以gapA34-F / gapA34_R從嗜水氣單胞菌LSA34基因組擴增獲得gapA34片段(SEQ ID NO:5),回收目標片段后采用Over-1ap的方式獲得片段dps-gapA34連接片段。將獲得的dps-gapA34片段與無抗回補質(zhì)粒pUTta4用EcoRI和PstI酶切后，用T4DNA連接酶16°C連接過夜。然后用重組無抗回補質(zhì)粒pUTta4轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli A asd驗證陽性的樣品，測序驗證，得到的gapA34表達質(zhì)粒命名為pUTta4DGap,見圖3。2)將獲得的gapA34表達質(zhì)粒pUTta4DGap電轉(zhuǎn)到前文構(gòu)建的缺失株WED A asdB中，使用PCR、酶切的方法進行驗證，獲得陽性克隆，即WED AasdB/pUTta4DGap，命名為遲鈍愛德華氏菌EIB AVMl，于2012年09月12日于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC N0:M2012341o(四)無抗多效價減毒活疫苗(WEDA asdB/pUTta4DGap)制劑的配制取一接種環(huán)保存于LB斜面培養(yǎng)基上的減毒疫苗株種子WED A asdB/pUTta4DGap,接種于裝有IOOml液體LB種子培養(yǎng)基的500ml搖瓶，在30°C下振蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘)。12小時后，取5ml生長旺盛的菌液(0.D=4.0左右)接種于IOOml新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)12小時。用無菌生理鹽水洗滌3次，離心收獲菌體(2000g，15min, 15°C )，無菌生理鹽水稀釋成一定濃度懸液(IO2 - 109CFU/ml)，保藏于15°C備用。實施例2:以斑馬魚為試驗動物的半致死量LD50測定:試驗用魚先置于SPF(Specific Pathogen Free)實驗室適應(yīng)養(yǎng)殖I周，以剔出不正常個體。在感染試驗前，再將SPF試驗用魚放養(yǎng)于感染實驗室(Challenge Lab)中IOL感染試驗水槽,繼續(xù)喂養(yǎng)I周,每槽放養(yǎng)10條(平均體長11 - 12cm,體重30g)。試驗水槽每天使用無菌陳海水替換2/3體積養(yǎng)殖水，水溫16°C，上下波動2°C。將試驗用魚隨機分組，每組2個水槽平行試驗。在感染試驗中，每組試驗魚用一定梯度劑量(IO2 - 109CFU/ml)的遲鈍愛德華氏菌野生毒株、減毒疫苗株和回補株通過尾部肌肉注射進行人工感染。記錄10天內(nèi)，每組每個感染劑量下每天的死亡尾數(shù)，并計算累計死亡率，，用Reed-Muench法計算各菌株的半致死劑量(LD5tl)，根據(jù)實驗動物體重換算成CFU/g體重(見表I)。其計算公式如下:LD50=10[&-1(Sp-oS]其中:Xm:最大劑量的對數(shù)值1:相鄰兩組劑量對數(shù)值之差P:各組動物死亡率,用小數(shù)表示(如:死亡率為80%則寫成0.8)E P:各組動物死亡率之總和表I遲鈍愛德華氏菌疫苗株和回補株對斑馬魚的LD5tl
權(quán)利要求
1.一種遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株，其特征在于，所述遲鈍愛德華氏菌基因組缺失天冬氨酸半縮醒合成酶基因asdB,并含有回補質(zhì)粒,所述回補質(zhì)粒含有SD-asdB片段和異源免疫原編碼序列，所述SD-asdB片段由操作性相連的SD序列和遲鈍愛德華氏菌天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列構(gòu)成，所述回補質(zhì)粒不含抗生素標記，所述異源免疫原編碼序列與調(diào)控序列操作性相連從而能夠在遲鈍愛德華氏菌中表達。
2.如權(quán)利要求1所述的活疫苗株，所述回補質(zhì)粒中天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列編碼SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，較好的是，所述編碼序列的起始密碼子為GTG。
3.如權(quán)利要求1所述的活疫苗株，所述SD-asdB片段中的SD序列是AAGA。
4.如權(quán)利要求1所述的活疫苗株，所述SD-asdB片段的序列選自SEQID NO:2所示和SEQ ID NO:3 所示。
5.如權(quán)利要求1所述的活疫苗株，所述異源免疫原是嗜水氣單胞菌的甘油醛三磷酸脫氫酶即GAPDH，例如氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示的GAPDH，較好的是，所述GAPDH的編碼序列如SEQ ID NO:5中所示。
6.如權(quán)利要求1所述的活疫苗株，所述回補質(zhì)粒含有與所述異源免疫原操作性相連的遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動子Pdps。
7.如權(quán)利要求6所述的活疫苗株,所述鐵誘導(dǎo)性啟動子Pdps序列如SEQID NO: 6所示。
8.如權(quán)利要求1所述的活疫苗株，其中，以保藏號為CCTCCN0:M2010278的遲鈍愛德華氏菌WED為出發(fā)菌株構(gòu)建而得。
9.如權(quán)利要求1所述的活疫苗株，所述回補質(zhì)粒以PUTt質(zhì)粒為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建而成。
10.如權(quán)利要求1所述 的活疫苗株，是保藏號為CCTCCN0:M2012341的遲鈍愛德華氏菌EIB AVMl0
11.制造權(quán)利要求1所述遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株方法，包括: 敲除遲鈍愛德華氏菌出發(fā)菌株的基因組天冬氨酸半縮醛合成酶基因asdB，制得asdB缺失菌株， 獲取回補質(zhì)粒，所述回補質(zhì)粒含有SD-asdB片段和異源免疫原編碼序列，所述SD-asdB片段由操作性相連的SD序列和遲鈍愛德華氏菌天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列構(gòu)成，所述回補質(zhì)粒不含抗生素標記，所述異源免疫原編碼序列與調(diào)控序列操作性相連從而能夠在遲鈍愛德華氏菌中表達， 用所述回補質(zhì)粒轉(zhuǎn)化所述asdB缺失菌株，得到所述遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，所述遲鈍愛德華氏菌出發(fā)菌株是保藏號為CCTCCNO:M2010278的遲鈍愛德華氏菌WED。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，所述回補質(zhì)粒以pUTt質(zhì)粒為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建而成。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，所述回補質(zhì)粒中天冬氨酸半縮醛合成酶編碼序列編碼SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，較好的是，所述編碼序列的起始密碼子是GTG。
15.如權(quán)利要求11所述的方法,所述SD-asdB片段中的SD序列是AAGA。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，所述SD-asdB片段的序列選自SEQID N0:2所示和SEQID NO:3 所示。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，所述異源免疫原是嗜水氣單胞菌的GAPDH，例如氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的GAPDH，較好的是，所述GAPDH的編碼序列如SEQ ID NO: 5中所示。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，所述回補質(zhì)粒含有與所述異源免疫原操作性相連的遲鈍愛德華氏菌鐵誘導(dǎo)性啟動子Pdps。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，所述鐵誘導(dǎo)性啟動子Pdps序列如SEQID NO:6所示。
20.權(quán)利要求1所述遲鈍愛德華氏菌多效價載體活疫苗株用于制造魚用藥物的用途，所述藥物用于防治遲鈍愛德華氏菌和/或嗜水氣單胞菌感染。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無抗多效價遲鈍愛德華氏菌載體活疫苗、其制備及其應(yīng)用。所述遲鈍愛德華氏菌基因組缺失天冬氨酸半縮醛合成酶基因asdB，并含有回補質(zhì)粒，所述回補質(zhì)粒含有SD-asdB片段和異源免疫原編碼序列，所述回補質(zhì)粒不含抗生素標記。
文檔編號A61P31/04GK103146627SQ20131006423
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者劉琴, 張元興, 王啟要, 吳海珍, 肖婧凡, 閆一劍 申請人:華東理工大學(xué)