用于腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥和腎上腺脊髓神經病的基因治療載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了包含逆轉錄病毒載體、轉導細胞的組合物，以及使用其進行基因治療的方法。具體地，本發(fā)明涉及慢病毒載體和用這些載體轉導的細胞，以向患有腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥和/或腎上腺脊髓神經病的個體提供基因治療。
【專利說明】用于腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥和腎上腺脊髓神經病的基因治療載體
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)本申請要求2011年6月10日遞交的第61/495，857號美國臨時申請的權益，其通過引用全部并入本文。
[0003]關于序列表的申明
[0004]伴隨本申請的序列表以文本格式提供以替代紙件副本，其通過引用并入本說明書中。含有所述序列表的文本名為BLBD_003_01W0_ST25.txt。創(chuàng)建于2012年6月8日的該文本文件為8KB，在遞交本說明書的同時通過EFS-Web進行了電子提交。
[0005]背景
【技術領域】
[0006]本發(fā)明總體涉及基因治療載體。具體地，本發(fā)明涉及提供用于腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥和腎上腺脊髓神經病基因治療的慢病毒載體。
[0007] 相關技術描述
[0008]幼年的大腦腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥(CCALD)極為稀少，有時快速惡化，在男孩中未治療的X-連鎖的遺傳神經障礙(發(fā)病的中間年齡為7歲；范圍為3-15歲)在診斷后平均5年內導致植物人狀態(tài)，最終導致死亡。
[0009]CCALD最初通常表現(xiàn)為阿狄森氏癥(Addison’s disease),但其診斷通常基于注意力、思維力、專心力和其他大腦功能的“突然”下降，伴隨著磁共振成像(MRI)上大腦髓鞘脫失的驗證性發(fā)現(xiàn)。在髓鞘脫失以前，患者大腦的MRI是正常的，沒有神經發(fā)育的異常。臨床過程開始可能是“緩慢的”，但隨著腦部髓磷脂丟失的擴散會變得快速惡化和不可逆轉。術語“緩慢的”和“突然”相對而言是指髓鞘脫失期間并不真正被知道，但快速降低的認知力和運動能力會在任何時候發(fā)生且由于未知的原因。的確，MRI改變先于癥狀，且當很少有該疾病的臨床表現(xiàn)的時候可能隨著大范圍髓鞘脫失而極為異常。X-連鎖的腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥(ALD)在美國的發(fā)病率為約1:21，000男性出生人數(shù)，其中35%為發(fā)展中的CCALD ;每年約35-40個男孩被診斷為CCALD。該疾病的原因是ATP結合盒，D亞家族(ALD)，成員I (ABCDl)基因的突變，導致腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥蛋白(ALDP)基因產物的機能失調或缺失。ALDP位于細胞的過氧化物酶體，其參與從很長鏈的脂肪酸(VLCFA)(鏈長>20個碳)到較短脂肪酸的降解，所述脂肪酸用于維持細胞的結構和功能。
[0010]CCALD臨床表現(xiàn)的中樞神經系統(tǒng)(CNS)病理生理學還未得到充分了解，但髓鞘脫失是由于無法代謝的VLCFA局部累積而導致的，因為有缺陷的ALDP無法支持大腦小神經膠質細胞中的過程。該疾病的快速惡化期是由于炎癥導致，可能通過VLCFA由于細胞蛋白的?；瘜е拢浼铀倭怂枇字膩G失。CCALD的快速惡化期會導致男孩數(shù)月內從正常功能之嚴重殘疾的惡化。
[0011]唯一可提供的治療是進行同種異體造血干細胞移植(HCT)以支持產生功能性ALDP的細胞。由于大腦小神經膠質細胞源自骨髓，完全匹配的相關供體人干細胞移植，使用產生功能性ALDP的細胞，可潛在地或阻止髓鞘脫失的發(fā)展。然而，由于同種異體HCT要花費12-18個月時間來穩(wěn)定病情，且由于疾病發(fā)展的特性，疾病一經診斷發(fā)現(xiàn)就應該盡快進行移植。由于需要前置時間來發(fā)現(xiàn)相關的或不相關的匹配骨髓干細胞供體，常常使其成為問題。使用同種異體干細胞也會出現(xiàn)移植失敗和發(fā)展為急性或慢性移植物抗宿主疾病(GvHD)的風險。這些并發(fā)癥會導致死亡，且當使用不相關的供體作為同種異體造血干細胞來源時增加了發(fā)生率。
[0012]替代物的另一來源是使用匹配的，更通常為部分匹配的臍帶血細胞移植物。使用臍帶血干細胞(CBSCs)的問題是，移植失敗的風險和延長的移植時間需要延長的輸血支持。的確，所有形式的同種異體HCT均涉及10-15%的移植相關是死亡率，以及高達30%的慢性移植物抗宿主疾病發(fā)病率。
[0013]因此，本領域需要更加安全和有效的腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥治療。本發(fā)明提供了解決這些和其他問題的方案。
[0014]發(fā)明概述
[0015]因此，本說明書中各處出現(xiàn)的詞語“在一個實施方案中”或“在一實施方案中”不一定都是至同樣的實施方案。而且，在一個或多個實施方案中，具體特征、結構或特性可以任何合適的方式進行組合。
[0016]在各種實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，載體，其包括:左端(5，)逆轉錄LTR;中心聚嘌呤區(qū)/側翼DNA(cPPT/FLAP);逆轉錄輸出元件；在小神經膠質細胞中具有活性的啟動子，可操作地連接至編碼ATP結合盒、D亞家族、成員I (AB⑶I)多肽的多核苷酸；和右端(3’ )逆轉錄LTR ;其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0017]在具體實施方案中，所述載體為慢病毒載體。
[0018]在相關的實施方案中，所述慢病毒為HIV。
[0019]在更具體的的實施方案中，所述慢病毒為HIV-1。
[0020]在某些實施方案中，所述5’ LTR的啟動子被異源啟動子替換。
[0021]在其他實施方案中，所述異源啟動子為巨細胞病毒(CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子或猿猴病毒40(SV40)啟動子。
[0022]在其他具體實施方案中,所述異源啟動子為CMV啟動子。
[0023]在進一步的實施方案中，所述5’ LTR或3’ LTR為慢病毒LTR。
[0024]在其他實施方案中，所述5’ LTR和3’ LTR為慢病毒LTR。
[0025]在某些具體實施方案中，所述慢病毒為HIV-1。
[0026]在具體實施方案中，所述3’ LTR包含一個或多個修飾。
[0027]在某些具體實施方案中，所述3’ LTR包含一個或多個缺失。
[0028]在其他實施方案中，所述3’ LTR為自我失活的(SIN) LTR。
[0029]在一些實施方案中，所述逆轉錄輸出元件為Rev響應元件(RRE)。
[0030]在進一步的實施方案中，所述cPPT/FLAP來自HIV-1。
[0031]在某些實施方案中，所述啟動子包含骨髓瘤病毒增強子、陰性控制區(qū)缺失的，dl587rev引物結合位點取代的(MND)啟動子或其具有轉錄活性的片段。
[0032]在具體實施方案中，所述編碼AB⑶I多肽的多核苷酸為cDNA。
[0033]在相關的實施方案中，所述cDNA包含優(yōu)化的Kozak序列。[0034]在某些實施方案中，所述優(yōu)化的Kozak序列為(GCC) RCCATGG，其中R為嘌呤(A或G)。
[0035]在具體實施方案中，所述多核苷酸編碼人AB⑶I多肽.[0036]在各種實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，慢病毒載體，其包含:左端(5’) LTR ；cPPT/FLAP ;RRE;MND啟動子，可操作地連接至編碼人ABCDl多肽的多核苷酸；右端(3’)LTR;和聚腺苷酸化序列；其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0037]在具體實施方案中，所述慢病毒載體包含Psi(W)包裝信號。
[0038]在某些實施方案中，所述聚腺苷酸化序列為牛生長素聚腺苷酸化或信號兔β_球蛋白聚腺苷酸化序列。
[0039]在某些具體實施方案中，所述慢病毒載體包含HIV-1的5’ LTR或3’ LTR0
[0040]在其他實施方案中，所述3’ LTR為SIN LTR0
[0041]在各種實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，慢病毒載體，其包含:左端(5’)HIV-1LTR ；Psi (Ψ)包裝信號；cPPT/FLAP ；RRE ;MND啟動子，可操作地連接至編碼人ABCDl多肽的cDNA;右端(3’)自我失活的(SIN) HIV-1LTR ;和兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0042]在各種實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，哺乳動物細胞，其包含本文描述的前述載體中任何一種載體。
[0043]在具體實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，包裝細胞，其包含:編碼gag的第一多核苷酸，編碼pol的第二多核苷酸，編碼env的第三多核苷酸，以及本文描述的前述載體中任何一種載體。
[0044]在某些實施方案中，本`發(fā)明部分地預期了，生產細胞，其包含本文描述的前述載體中任何一種載體。
[0045]在其他實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，由所述生產細胞產生的載體顆粒。
[0046]在各種具體實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，載體，其包含至少一個LTR;中心聚嘌呤區(qū)/側翼DNA(cPPT/FLAP);逆轉錄輸出元件；和在小神經膠質細胞中具有活性的啟動子，可操作地連接至編碼ATP結合盒、D亞家族、成員I (AB⑶I)多肽的多核苷酸；其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0047]在各種確定的實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，載體，其包含至少一個LTR;cPPT/FLAP ；RRE ；MND啟動子，其可操作地連接至編碼人ABCDl多肽的多核苷酸；和聚腺苷酸化序列；其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0048]在各種其他實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，載體，其包含至少一個SINHIV-1LTR ;Psi(W)包裝信號；cPPT/FLAP ；RRE ;MND啟動子，可操作地連接至編碼人ABCDl多肽的cDNA ;和兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列；其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0049]在各種實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，用所述載體轉導的宿主細胞。在具體實施方案中，所述宿主細胞為胚胎干細胞、成體干細胞或祖細胞。
[0050]在某些實施方案中，所述細胞為造血干細胞。
[0051]在具體實施方案中，本發(fā)明還部分地預期了，本發(fā)明所述的病毒載體在基因治療中的用途。[0052]在優(yōu)選的實施方案中，所述基因治療治療或防止腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病。
[0053]在各種其他實施方案中，本發(fā)明部分地預期了，治療腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病的方法，其包括將用本發(fā)明所述的載體轉導的細胞給予到個體。
[0054]在具體實施方案中，所述為胚胎干細胞、成體干細胞或祖細胞。
[0055]在某些實施方案中，所述為造血干細胞。
[0056]序列標識符簡要說明
[0057]SEQ ID NO:1 為編碼人 ABCDl 的 cDNA 序列。
[0058]SEQ ID NO: 2 為編碼人 ABCDl 的 cDNA 序列。
[0059]SEQ ID NO:3為MND啟動子多核苷酸序列。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]圖1所示為用于臨床前和臨床研究的MND-ALD載體構建體的示意圖。在用于高水平表達的MND啟動子控制下，所有載體均具有人AB⑶-lcDNA。對于pLBPlOO和pLBP140的安全修飾包括:gag編碼區(qū)中的2個終止密碼子、HIV LTR右側的U3中的400bp缺失和兔β-球蛋白polyA (riigppA)信號。HIV LTR，人免疫缺陷I型病毒長末端重復；Ψ+，包裝信號；0--17；1^13口，中心聚嘌呤區(qū),1?1^,1^￥-響應元件；ppt,多嘌呤序列。通過引入突變(mut6)但具有功能的土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件(AWPRE)，PLBP140不同于pLBPlOO載體。
[0061]圖2所示為用pL BPlOO和pLBP140慢病毒載體進行轉導，以及實驗中的短期液體和甲基纖維素培養(yǎng)。
[0062]圖3所示為用pLBPlOO和pLBP140慢病毒載體進行轉導，然后進行短期液體和甲基纖維素培養(yǎng)或長期在輔助性MS5基質上培養(yǎng)。
[0063]圖4所示為轉導正常人⑶34+細胞后，骨髓祖細胞(CFU-GM;圖4A)和紅祖細胞(BFU-E;圖B)的數(shù)目。使用pLBPlOO (plOO)或pLBP140 (pl40)包括4個單獨實驗進行轉導。
[0064]圖5所示為LTC-1C頻率。有限稀釋后，5周基質共培養(yǎng)并轉入甲基纖維素培養(yǎng)計數(shù)次級CFC，用L-Calc?程序以95%的置信區(qū)間估計頻率。
[0065]圖6所示為短期祖細胞中的載體整合效率。(A)在液體培養(yǎng)中于7、14、28、31和35天細胞的載體拷貝數(shù)(VCN)。(B)第14天合并的CFC培養(yǎng)物的平均VCN。(C)百分比載體陽性骨髓細胞集落。顯示了分析的陽性和總集落數(shù)目。
[0066]圖7所示為在短期相對于長期(LTC-1C)祖細胞的載體整合效率。(A)第14天合并的CFC培養(yǎng)物的平均VCN。(B)百分比載體陽性骨髓細胞集落。顯示了分析的陽性和總集落數(shù)目。
[0067]圖8所示為通過流式細胞術計算的轉導細胞中的ALD蛋白(ALDP)表達。(Al和A2)直方圖顯示了來自不同實驗針對模擬物、pLBPlOO和pLBP140轉導細胞的PE熒光性。(B)于 7 天(expts.072010 和 091410)、14 天(實驗 081010)和 28 天(實驗 080610)的百分比ALDP陽性細胞。(C)超過模擬物對照的MFI比率，顯示在ALDP+細胞中ALDP表達的相對水平。
[0068]圖9所不為MND-ALD載體構建體的不意圖。所述載體具有在用于聞水平表達的MND啟動子控制下的人AB⑶-1cDNA。HIV LTR，人免疫缺陷I型病毒長末端重復；Ψ+，包裝信號；cPPT/flap，中心聚嘌呤區(qū)，RRE，Rev-響應元件；ppt，多嘌呤序列。所述載體不含WPRE序列。
[0069]圖10所示為在不同MOI下用plOO和pl40轉導的4496細胞中，模擬物相對于VCN的VLCFA校正比率。
[0070]發(fā)明詳述
[0071]A.概述
[0072]本發(fā)明總體上涉及用于腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥和腎上腺脊髓神經病的更安全和有效的病毒載體和轉導細胞治療。不受任何具體理論的束縛， 申請人:考慮了患有ALD男孩的造血干細胞另外為正常的，因為小神經膠質細胞源自骨髓，在患者個體的造血干細胞中對于有缺陷的AB⑶I基因添加正常AB⑶I cDNA能夠使得在腦部小神經膠質細胞中的ALDP水平正常化。因此，使用本發(fā)明載體將正常AB⑶IcDNA的體內基因轉移至自體⑶34+造血干細胞，然后在骨髓消融后進行移植可導致CNS功能的穩(wěn)定和與ALD致死效應相關的血漿VLCFA水平下降。
[0073]因此，本發(fā)明的組合物和方法能代表在治療患有ALD的男孩方面巨大的醫(yī)療進步，因為其允許以大大降低的造血細胞移植失敗風險和消除急性和慢性GvHD的方式進行快速治療。由于快速 CNS惡化的可能和在疾病穩(wěn)定而允許HCT以前的12-18個月等候，在該人群中時間是極為關鍵的因素。
[0074]除非另有具體說明，本發(fā)明的實施將在本領域技術內使用常規(guī)的分子生物學方法和重組DNA技術，為了說明目的其中的許多在以下進行了描述。這類技術在文獻中被充分描述。參見例如，Sambrook, et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2ndEdition, 1989);Maniatis et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);DNACloning: A Practical Approach, vol.1&II (D.Glover, ed.) ; Oligo 核苷酸 Synthesis (N.Gait,ed., 1984) ;Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds., 1985);轉錄 and Translation(B.Hames&S.Higgins, eds., 1984);Animal Cell Culture(R.Freshney, ed., 1986);A Practical Guide to MolecularCloning(B.Perbal, ed., 1984).[0075]本文引用的所有出版物、專利和專利申請均通過引用全部并入本文。
[0076]B.定義
[0077]除非另有說明，本文所用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所述【技術領域】的普通技術人員通常所理解的同樣的含義。為本發(fā)明的目的，對下列術語作如下定義。
[0078]如本文所用，術語“逆轉錄病毒”是指將其基因組RNA逆轉錄為線性雙鏈DNA拷貝，隨后將其基因組DNA共價整合值宿主基因組內的RNA病毒。逆轉錄病毒屬于逆轉錄病毒科(Retroviridae)，其由多個非二十面體的包膜病毒組成，該病毒包括2個拷貝的具有短二聚化區(qū)的單鏈RNA基因組。逆轉錄病毒為用于基因遞送的常用工具(Miller, 2000, Nature.357:455-460)。一旦病毒被整合至宿主基因組內，其被稱為“前病毒”。所述前病毒作為RNA聚合酶II的模板，并指導編碼結構蛋白和產生新病毒粒子所需的酶的RNA分子的表達。
[0079]示例性逆轉錄病毒包括，但不限于:莫洛尼小鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼小鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈維小鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、小鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓科動物白血病病毒(FLV)、泡沫病毒屬、Friend小鼠白血病病毒、小鼠干細胞病毒(MSCV)和勞斯肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒。[0080]如本文所用，術語“慢病毒”是指一組(或屬)的復合的逆轉錄病毒。示例性逆轉錄病毒包括，但不限于:HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIVl型和HIV2型)、韋斯那-梅迪(visna-maedi)病毒(VMV)病毒、山羊關節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、貓科動物免疫缺陷病毒(FIV)、?？苿游锩庖呷毕莶《?BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一個實施方案中，優(yōu)選基于HIV的載體骨架(即HIV順式作用序列元件)。
[0081]逆轉錄病毒載體且更具體地慢病毒載體可用于實施本發(fā)明。因此，術語“逆轉錄病毒”或“逆轉錄病毒載體”，如本文所用，旨在分別包括“慢病毒”和“慢病毒載體”。
[0082]本文所用術語“載體”是指能夠轉移或運輸另一種核酸分子的核酸分子。被轉移的核酸通常連接至，例如，插入至所述載體核酸分子。載體包括可指導細胞中自主復制的序列，或可包括足以允許整合至宿主細胞DNA的序列。有用的載體包括例如，質粒(例如，DNA質粒或RNA質粒)、粘粒、細菌人工染色體和病毒載體。有用的病毒載體包括例如，復制缺陷性逆轉錄病毒和慢病毒。
[0083]對本領域技術人員來說很顯然的是，術語“病毒載體”廣泛用于指包含通常促進核酸分子轉移或整合至細胞基因組內的病毒來源核酸元件的核酸分子(例如，轉移質粒)，或者指介導核酸轉移的病毒粒子。病毒粒子通常包括除核酸外的各種病毒組件且有時還有宿主細胞組件。
[0084]術語病毒載體可指能夠將核酸轉移至細胞內的病毒或病毒粒子，或者可指被轉移的核酸本身。病毒載體和轉移質粒包含主要源自病毒的結構和/或功能性基因元件。術語“逆轉錄病毒載體”是指包含主要源自逆轉錄病毒的結構和功能性基因元件的病毒載體或質粒。術語“慢病毒載體”是指包含結構和功能性基因元件(包括主要源自慢病毒的LTR)的病毒載體或質粒。術語“雜合子”是指包含逆轉錄病毒如慢病毒序列和非慢病毒序列的載體、LTR或其他核酸。在一個實施方案中，雜合載體是指載體或轉移質粒，其包含用于逆轉錄、復制、整合和/或包裝的逆轉錄病毒如慢病毒的序列和甲病毒亞基因組啟動子序列、非結構蛋白和/或聚合酶是被位點。
[0085]在具體實施方案中，術語“慢病毒載體”、“慢病毒表達載體”可用于指慢病毒轉移質粒和/或感染性慢病毒粒子。當本文提到諸如克隆位點、啟動子、調控元件、異源核酸等元件時，應理解，這些元件的序列是在本發(fā)明的慢病毒粒子中以RNA形式存在，且在本發(fā)明的DNA質粒中以DNA形式存在。
[0086]在前病毒的每個末端是稱為“長末端重復”或“LTRs”的結構。術語“長末端重復(LTR) ”是指位于逆轉錄病毒DNA末端的堿基對結構域，在其天然序列中為正向重復并含有U3、R和U5區(qū)。LTRs通常提供作為逆轉錄病毒基因表達(例如，基因轉錄的促進、啟動和聚腺苷酸化)和病毒復制基礎的功能。LTR含有許多調控信號，包括轉錄控制元件、聚腺苷酸化信號和用于病毒基因組復制和整合所需的序列。所述病毒LTR分為3個區(qū)，稱為U3、R和U5。U3區(qū)包含增強子和啟動子元件。U5區(qū)是位于引物結合位點和R區(qū)之間的序列，其包含聚腺苷酸化序列。R(重復)區(qū)側接有U3和U5區(qū)。LTR由U3、R和U5區(qū)組成，其在病毒基因組的5’和3’端均出現(xiàn)。鄰近5’LTR的是基因組逆轉錄所需的序列(tRNA引物結合位點)和將病毒RNA有效包裝到粒子內所需的序列(Psi位點)。
[0087]如本文所用，術語“包裝信號”或“包裝序列”是指位于逆轉錄病毒基因組內的序列，其為將病毒RNA插入至病毒衣殼或粒子內所需的序列，參見例如，Clever et al.，1995.J.0f Virology，Vol.69，N0.4;ρρ.2101-2109。一些逆轉錄病毒載體使用病毒基因組衣殼化所需的最小包裝信號(也稱為psi[W]序列)。因此，如本文所用，術語“包裝序列”、“包裝信號”、“psi”和符號“ Ψ ”均用于指病毒粒子形成過程中逆轉錄病毒RNA鏈衣殼化所需的非編碼序列。
[0088]在各種實施方案中，載體包括修飾的5’LTR和/或3’LTR。通常通過使病毒為復制缺陷型來對3’ LTR進行修飾以提高慢病毒或逆轉錄病毒系統(tǒng)的安全性。如本文所用，術語“復制缺陷型”是指不能完整和有效復制的病毒，從而沒有產生感染性病毒(例如，復制缺陷型慢病毒子代)。術語“復制型”是指能夠復制的野生型病毒或突變的病毒，從而病毒復制能夠產生感染性病毒粒子(例如，復制型慢病毒子代)。
[0089]“自失活” (SIN)載體是指復制缺陷型載體，例如，逆轉錄病毒或慢病毒載體，其中已知為U3區(qū)的右側(3’)LTR增強子-啟動子區(qū)被修飾(例如，通過缺失或取代)，以阻止病毒進行超過第一輪病毒復制以外的轉錄。這是因為在病毒復制期間右側(3’)LTR U3區(qū)被用作左側(5’)LTR U3區(qū)的模板，因此，沒有U3增強子-啟動子，所述病毒轉錄無法進行。在本發(fā)明又一個實施方案中，所述3’LTR被修飾，從而U5區(qū)被取代，例如，用理想的poly (A)序列。應指出，對LTRs進行修飾，從而對3’ LTR, 5' LTR或者3’和5’ LTRs 二者的修飾均包括在本發(fā)明內。
[0090]通過用異源啟動子取代5’ LTR的U3區(qū)，以在產生病毒粒子期間啟動病毒基因組的轉錄，另外提供了提高的安全性?？墒褂玫漠愒磫幼訉嵗ɡ纾《拘栽澈锊《?0(SV40)(例如，早期或晚期的)、巨細胞病毒(CMV)(例如，即刻早期的)、莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)和單純皰疹病毒(HSV)(胸苷激酶)啟動子。典型的啟動子能夠以非Tat依賴性的方式啟動高水平的轉錄。該取代降低了重組以產生復制型病毒的可能性，因為在病毒 廣生系統(tǒng)中沒有完整的U3序列。
[0091]在一些實施方案中，病毒載體包含TAR元件。術語“TAR”是指位于慢病毒(例如，HIV)LTRs的R區(qū)的“反式激活響應”基因元件。該元件與慢病毒反式激活蛋白(tat)基因元件相互作用以促進病毒復制。然而，在其中5’ LTR的U3區(qū)被異源啟動子取代的實施方案中，不需要該元件。
[0092]“R區(qū)”是指逆轉錄病毒LTR內的區(qū)，其開始于封端基團的起始(即轉錄的起始)，并隨即結束于poly A位點的起始之前。R區(qū)也定義為側接有U3和U5區(qū)。R區(qū)在逆轉錄期間的作用是使新復制的DNA從基因組的一端轉移至另一端。
[0093]如本文所用，術語“FLAP元件”是指其序列包括逆轉錄病毒例如，HIV-1或HIV-2的中心聚嘌呤區(qū)和中央終止序列(cPPT和CTS)的核酸。合適的FLAP元件描述于美國專利第6，682，907 號和 Zennou, et al.，2000，Cell, 101:173。在 HIV-1 逆轉錄期間，正鏈 DNA 在中心聚嘌呤區(qū)(cPPT)的中央起始和在中央終止序列(CTS)的中央終止導致形成3鏈DNA結構:HIV-1中央DNA側翼。盡管不希望受到任何理論的束縛，所述側翼DNA可作為慢病毒基因組核輸入的順式作用決定子和/或可增加所述病毒的滴度。在具體實施方案中，所述逆轉錄病毒或慢病毒載體骨架包括在載體中的目標異源基因上游或下游的一個或多個FLAP元件。例如，在具體的實施方案中，轉移質粒包括FLAP元件。在一個實施方案中,本發(fā)明的載體包括分離自HIV-1的FLAP元件。[0094]在一個實施方案中，逆轉錄病毒或慢病毒轉移載體包括一個或多個輸出元件。術語“輸出元件”是指順式作用轉錄后調控元件，其調控將RNA轉錄物從細胞核運輸至細胞質中。RNA輸出元件的實例包括但不限于，人免疫缺陷病毒(HIV)Rev響應元件(RRE)(參見例如，Cullen et al.，1991.J.Virol.65:1053 ;以及 Cullen et al.，1991.Cell58:423)，和 B型肝炎病毒轉錄后調控元件(HPRE)。通常，RNA輸出元件位于基因的3’UTR內，可作為一個或多個拷貝被插入。
[0095]在具體實施方案中，通過將轉錄后調控元件和有效的聚腺苷酸化位點以及任選的轉錄終止信號整合至所述載體，增加了病毒載體中異源序列的表達。多種轉錄后調控元件能夠增加異源核酸在蛋白上的表達，例如，土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件(WPRE; Zufferey et al., 1999, J.Virol., 73:2886);存在于 B 型肝炎病毒(HPRE)中的轉錄后調控兀件(Huanget al., Mol.Cell.Biol., 5:3864);等等(Liu et al., 1995, GenesDev.，9:1766)。所述轉錄后調控元件通常位于異源核酸序列的3’端。該結構導致了 mRNA轉錄物的合成，其5’部分包括所述異源核酸編碼序列，而其3’部分包括所述轉錄后調控元件序列。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的載體缺少或不包括轉錄后調控元件如WPRE或HPRE，因為在一些情況下這些元件增加了細胞轉化的風險和/或不能實質上或明顯地增加mRNA轉錄物的量或增加mRNA的穩(wěn)定性。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的載體缺少或不包括WPRE或HPRE作為附加的安全措施。
[0096]指導異源核酸轉錄物的有效終止和聚腺苷酸化的元件，增加了異源基因表達。轉錄終止信號通常發(fā)現(xiàn)于聚腺苷酸化信號的下游。術語“polyA位點”或“polyA序列”如本文所用，是指通過RNA聚合酶11來指導新的RNA轉錄物的終止和聚腺苷酸化的DNA序列。重組轉錄物的有效聚腺苷酸化是可取的，因為缺少poly A尾的轉錄物不穩(wěn)定且會快速降解。可用于本發(fā)明的載體中的polyA信號的示例性實例包括，理想的polyA序列(例如，AATAAA、ATTAAA AGTAAA)、牛生長素polyA序列(BGHpA)、兔β -球蛋白polyA序列(r β gpA)，或本領域已知的其他合適的異源或內源polyA序列。
[0097]在某些實施方案中，逆轉錄病毒或慢病毒載體還包括絕緣子(insulatorelement)。絕緣子有助于保護慢病毒-表`達的序列如治療性多肽免于整合位點效應，其可由基因組DNA中存在的順式作用元件介導，并導致被轉移序列的去調控表達(即位置效應，參見例如，Burgess-Beusse et al., 2002, Proc.Natl.Acad.Sc1., USA, 99:16433;andZhan et al.，2001，Hum.Genet.，109:471)。在一些實施方案中，轉移載體包括在一個或兩個LTR中或其他地方如整合至細胞基因組的載體的區(qū)內的絕緣子。用于本發(fā)明的合適絕緣子包括但不限于，雞β _球蛋白絕緣子(參見Chung et al., 1993.Cell74:505;Chung etal.，1997.PNAS94:575;以及 Bell et al.，1999.Cell98:387，其通過引用并入本文)。絕緣子的實例包括但不限于，來自球蛋白位點如雞HS4的絕緣子。
[0098]根據(jù)本發(fā)明某些具體實施方案，大多數(shù)或所有的病毒載體骨架序列均源自慢病毒，例如HIV-1。然而，應理解，許多不同來源的慢病毒序列均可使用，在一些慢病毒序列中許多取代和改變可被接納而不損害轉移載體發(fā)揮本文所描述的功能的能力。而且，許多慢病毒載體為本領域所知，參見 Naldini et al., (1996a, 1996b,和 1998) ; Zufferey etal.，(1997) ;Dull et al.，1998，美國專利第 6，013，516 號和第 5，994，136 號，其中任何一個均可適用于制備本發(fā)明的病毒載體或轉移質粒。[0099]如本文所用，術語“多核苷酸”或“核酸”是指信使RNA (mRNA)、RNA、基因組RNA (gRNA)、正鏈 RNA (RNA (+))、負鏈 RNA (RNA (_))、基因組 DNA (gDNA)、互補 DNA (cDNA)或DNA。多核苷酸包括單鏈和雙鏈的多核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸包括與本文所描述序列中任一序列具有至少約 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的多核苷酸或變異體(參見例如，序列表)，通常其中所述變異體保留所述參考序列的至少一個生物學活性。在各種示例性實施方案中，本發(fā)明部分地預期了病毒載體和轉移質粒多核苷酸序列以及含有其的組合物。在具體實施方案中，本發(fā)明提供了編碼治療性多肽的多核苷酸。
[0100]如本文所用，術語“多核苷酸變異體”和“變異體”等是指表現(xiàn)出與參考多核苷酸序列或多核苷酸具有大量序列同一性的多核苷酸，其在下文定義的嚴格條件下與參考序列雜交。這些術語包括，相比參考的多核苷酸，其中一個或多個核苷酸已被增加或缺失或者用不同核苷酸取代的核苷酸。就此而言，本領域熟知可對參考多核苷酸進行一些包括突變、增加、缺失和取代的改變，由此改變的多核苷酸保留參考多核苷酸的生物學功能或活性。
[0101]如本文所用，術語“分離的”是指基本上或實質上脫離在天然狀態(tài)下伴隨其的組分的物質。如本文所用，例如“分離的多核苷酸”是指已經由天然狀態(tài)下連接于其側面的序列進行了純化的多核苷酸，例如，已經從正常地鄰近該片段的序列上脫離的DNA片段。
[0102]描述多核苷酸方向的術語包括:5’ (通常為具有游離磷酸基的多核苷酸末端)和3’(通常為具有游離羥基(OH)的多核苷酸末端)。多核苷酸序列可解釋為在5’至3’方向，或3’至5’方向。
[0103]術語“互補的”和“互補性”是指通過堿基配對原則相關聯(lián)的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，DNA序列5’ A G T C A T G3’的互補鏈為3’ T C A G T A C5’。后者的序列通常寫為5’端在左側而3’端在右側的反向互補序列，5’C A T G A C T3’。等于其反向互補序列的序列被稱為回文結構序列?；パa性可為“部分的”其中僅一些核酸的堿基根據(jù)堿基配對原則匹配?；蛘撸怂嶂g也可有“完全的”或“全部的”互補性。
[0104]如本文所用，術語“核酸盒”是指載體中可表達RNA和隨后產生蛋白的基因序列。所述核酸盒含有目的基因。所述核酸盒在載體內按位置和順序取向，從而所述盒中的核酸在必要時可被轉錄為RNA，翻譯為蛋白或多肽，經過針對轉化細胞中所需活性的適當轉錄后修飾，然后通過靶向合適的胞內空間或分泌至胞外空間而被移位至用于生物活性的合適空間。優(yōu)選地，所述盒具有適應易于插入至載體內的3’和5’端，例如，其在每端均具有限制性內切酶位點。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸盒含有用于治療腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病的治療基因的序列。所述盒可作為單個單位移除而插入至質?；虿《据d體。
[0105]多核苷酸包括目標多核苷酸。如本文所用，術語“目標多核苷酸”是指插入至期望被表達的表達載體中的多核苷酸，例如編碼多肽(即目標多肽)的多核苷酸。在某些實施方案中，所述目標多核苷酸編碼在治療或預防疾病或失調中提供治療效果的多肽，其可稱為“治療性多肽，”例如，ATP結合盒，D亞家族(ALD)，成員I (AB⑶I)基因。目標多核苷酸和由其編碼的多肽包括編碼野生型多肽的多核苷酸及其功能變異體和片段。在具體實施方案中，功能變異體與對應的野生型參考多核苷酸或多肽序列具有至少80%、至少90%、至少95%或至少99%的同一性。在某些實施方案中，功能變異體或其片段具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%對應野生型多肽的生物活性。適用于本發(fā)明的代表性多核苷酸序列包括但不限于，在SEQ ID NOs:l-2中陳述的人ACBDlcDNA。
[0106]無論編碼序列本身的長度，本發(fā)明的多核苷酸均可與其他DNA序列組合，如啟動子和/或增強子、非翻譯區(qū)(UTRs)、Kozak序列、聚腺苷酸化信號、另外iad限制酶位點、多個克隆位點、內部核糖體進入位點(IRES)、重組酶識別位點(例如，LoxP、FRT和Att位點)、終止密碼子、轉錄終止信號和編碼自切割多肽的多核苷酸、表位標記，如本文其他地方所公開的或本領域已知的，從而它們的總長度可很大地變化。因此，預期了可使用幾乎任何長度的多核苷酸片段，優(yōu)選其總長度限于在計劃中的重組DNA草案中易于制備和使用。
[0107]如本文所用，術語“啟動子”是指RNA聚合酶結合的多核苷酸(DNA或RNA)的識別位點。術語“增強子”是指含有能夠提供增強轉錄的序列的DNA片段，在一些情況下能不依賴于其相對于另一控制序列的方向而起作用。增強子能夠與啟動子和/或其他增強子元件合作地或附加地發(fā)揮作用。術語“啟動子/增強子”是指含有能夠提供啟動子和增強子功能的序列的DNA片段。在一個實施方案中，本發(fā)明的載體包括骨髓瘤病毒增強子，陰性控制區(qū)缺失的dl587rev引物結合位點取代的(MND)啟動子(Challita et al.，JVirol.69 (2):748-55(1995);SEQ ID NO:3)。
[0108]在具體實施方案中，本發(fā)明非載體包括外源、內源或異源控制序列如啟動子和/或增強子。“內源”控制序列是天然連接至基因組內給定基因的序列?！巴庠础笨刂菩蛄惺峭ㄟ^基因操作(即分子生物技術)而與基因并列的序列，從而所述基因的轉錄由連接的增強子/啟動子指導。“異源”控制序列是來自與接受遺傳操作的細胞不同物種的外源序列。
[0109]術語“可操作地連接的”是指并列連接，其中所描述元件的關系為允許它們以期望的方式發(fā)揮功能。在一個實施方案中，所述術語是指核酸表達控制序列(如啟動子和/或增強子)和第二多核苷酸序列如目標多核苷酸之間的功能性連接，其中所述表達控制序列指導對應于所述第二序列的核酸的轉錄。
[0110]如本文所用，術語“組成型啟動子”是指不斷地或連續(xù)地允許可操作地連接的序列轉錄的啟動子。組成型啟動子可為允許在眾多類型的細胞和組織中表達的“廣譜表達型啟動子”，或允許在限制的細胞和組織種類中表達的“組織特異性啟動子”。示例性廣譜表達型啟動子包括但不限于，巨細胞病毒(CMV)即刻早期啟動子、病毒性猿猴病毒40 (SV40)(例如，早期或晚期)、莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)LTR啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)LTR、單純皰疹病毒(HSV)(胸苷激酶)啟動子、H5、P7.5，以及來自牛痘病毒的Pll啟動子、延長因子l-α (EFla)啟動子、早期生長響應I (EGRl)、鐵蛋白H(FerH)、鐵蛋白L(FerL)、3_磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、真核生物翻譯起始因子4Α1 (EIF4A1)、熱休克70kDa蛋白5 (HSPA5)、熱休克蛋白90kDa-13、成員1(HSP90B1)、熱休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驅動蛋白(β -KIN),人 R0SA26 位點(Irions et al., Nature Biotechnology25, 1477-1482 (2007))、泛激素 C 啟動子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1 (PGK)啟動子、巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白(CAG)啟動子和肌動蛋白啟動子。
[0111]在具體實施方案中，可取的是使用組織特異性啟動子以獲得期望的多核苷酸序列的細胞類型特異性、種系特異性或組織特異性表達(例如，在細胞類型或組織的亞群中或在發(fā)育的特定階段中，表達編碼多肽的具體核酸)。組織特異性啟動子的示例性實例包括但不限于:Β29啟動子(B細胞表達)、runt轉錄因子(CBFa2)啟動子(干細胞特異性表達)、⑶14啟動子(單細胞表達)、⑶43啟動子(白血球和血小板表達)、⑶45啟動子(造血細胞表達)、CD68啟動子(巨噬細胞表達)、CYP4503A4啟動子(肝細胞表達)、肌間線蛋白啟動子(肌肉表達)、彈性蛋白酶I啟動子(胰腺腺泡細胞表達)、內皮素啟動子(內皮細胞表達)、成纖維細胞特異性蛋白I啟動子(FSPl)啟動子(成纖維細胞表達)、纖連蛋白啟動子(成纖維細胞表達)、fms-相關的酪氨酸激酶I (FLTl)啟動子(內皮細胞表達)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子(星形細胞表達)、胰島素啟動子(胰腺β細胞表達)、整合蛋白、a-2b(ITGA2B)啟動子(巨核細胞)、細胞間粘附分子2 (ICAM-2)啟動子(內皮細胞)、干擾素β (IFN-β)啟動子(造血細胞)、角蛋白5啟動子(角化細胞表達)、肌紅蛋白(MB)啟動子(肌肉表達)、成肌分化I (MYODl)啟動子(肌肉表達)、腎病蛋白(nephrin)啟動子(足細胞表達)、骨Y-羧基谷氨酸蛋白2(0G-2)啟動子(成骨細胞表達)、3_酮酸CoA轉移酶2B(0xct2B)啟動子，(單倍體精子細胞表達)、表面活性蛋白B(SP-B)啟動子(肺部表達)、突觸蛋白啟動子(神經細胞表達)、WiSkott-Aldrich綜合征蛋白(WASP)啟動子(造血細胞表達)。
[0112]在一個實施方案中，本發(fā)明的載體包括在小神經膠質細胞中表達期望的多肽，例如AB⑶I的組織特異性啟動子和/或增強子，例如MND啟動子(SEQ ID NO: 3)。
[0113]如本文所用，“條件表達”可指任何類型的條件表達，包括但不限于，可誘導的表達、可抑制的表達、在具有特定生理學的、生物學的或疾病狀態(tài)等的細胞或組織中的表達。該定義并非旨在排除細胞或組織特異性表達。本發(fā)明某些實施方案提供目標多核苷酸的條件表達，例如，通過使細胞、組織、器官等接受處理或者導致多核苷酸被表達或導致由目標多核苷酸編碼的多核苷酸表達增加或降低的條件，來控制表達。
[0114]可誘導的啟動子/系統(tǒng)的示例性實例，包括但不限于，類固醇-可誘導的啟動子如編碼糖皮質激素或雌激素受體基因的啟動子(可通過用相應激素處理誘導)、金屬硫蛋白啟動子(可通過用各種重金屬處理誘導)、MX-1啟動子(可通過干擾素誘導)、“基因開關(GeneSwitch) ” 米非司酮-調控系統(tǒng)(Sirin et al.，2003，Gene, 323:67)、Cumate 誘導的基因開關(W02002/088346)、四環(huán)素依賴性調控系統(tǒng)，等等。
[0115]條件表達也可通過使用位點特異性DNA重組酶來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，所述載體包括至少一個(通常為兩個)位點，其用于通過位點特異性重組酶來介導重組。如本文所用，術語“重組酶”或“位點特異性重組酶”包括分割的或整合的蛋白、酶、輔助因子或相關蛋白，所述蛋白涉及一個或多個重組位點(例如，2、3、4、5、7、10、
15、20、30、50個等)的重組反應，其可為野生型蛋白(see Landy, Current Opinion inBi0techn0l0gy3:699-707 (1993))，或者其突變體蛋白或衍生物(例如，含有重組蛋白序列或其片段的融合蛋白)、其片段和突變體。適用于本發(fā)明的具體實施方案的重組酶的示例性實例，包括但不限于:Cre> Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、C>C31、Cin、Tn3 解離酶、TndX、XerC、XerD, TnpX, Hjc, Gin、SpCCEl 和 ParA。
[0116]所述載體可包括針對眾多位點特異性重組酶中任一種的一個或多個重組位點。應理解，針對位點特異性重組酶的祀位點不包含于載體整合所需的任何位點，例如逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。如本文所用，術語“重組序列”、“重組位點”或“位點特異性重組位點”是指重組酶識別并與之結合的特定核酸序列。
[0117]例如，重組酶的一個重組位點是ΙοχΡ，其為34個堿基對序列，包括兩個13個堿基對反向重復序列(作為重組酶結合位點)側接于8個堿基對的核心序列(參見，Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology5:521-527 (1994)的圖1)。其他不例性 1xP位點包括但不限于:lox511 (Hoess et al., 1996;Bethke and Sauer, 1997) > lox5171 (Leeand Saito, 1998)、lox2272 (Lee and Saito, 1998)、m2(Langer et al.，2002)、lox71 (Albert et al., 1995)和 lox66 (Albert et al., 1995)。
[0118]針對FLP重組酶的合適識別位點包括但不限于:FRT(McLeod, et al.，1996)、F1、F2、F3 (Schlake and Bode, 1994)、F4、F5 (Schlake and Bode, 1994)>FRT(LE)(Senecoff etal., 1988)、FRT(RE)(Senecoff et al., 1988)。
[0119]識別序列的其他實例為attB、attP、attL和attR序列，其通過重組酶λ整合酶例如ph1-c31被識別。供C3 I SSR僅在異型位點attB (長度34bp)和attP (長度39bp)之間介導重組(Groth et al., 2000) ? attB和attP分別以針對噬菌體整合酶在細菌和噬菌體基因組上的結合位點來命名，二者均含有易于被0C31同源二聚體結合的不完整反向重復序列(Groth et al.，2000)。產物位點attL和R有效地對于進一步識C31 -介導的重組無活性(Belteki et al.，2003),使該反應不可逆。對于催化插入已發(fā)現(xiàn),相比attP位點插入之基因組attB位點，帶有attB的DNA更易于插入至基因組attP位點(Thyagarajan etal.，2001; Belteki et al.，2003)。因此，通過同源重組將帶有attP的“接合位點”結合至指定位點的典型策略位置，然后其伴隨用于插入的帶有attB的輸入序列。
[0120]如本文所用，“內部核糖體進入位點”或“ IRES ”是指促進內部核糖體直接進入至起始密碼子如順反子(蛋白編碼區(qū))的ATG的元件，從而導致基因的不依賴于帽結構的翻譯。參見例如，Jackson et al., 1990.Trends Biochem Scil5 (12):477-83),以及 Jackson andKaminsk1.1995.RNAl (10):985_1000。在具體實施方案中，本發(fā)明預期的所述載體包括編碼一個或多個多肽的一個或多個目標多核苷酸。為了實現(xiàn)多個多肽中每個的有效翻譯，所述多核苷酸序列可被一個或多個IRES序列或編碼自我切割多肽的多核苷酸序列分離。
[0121]如本文所用，術語“Kozak序列”是指大大促進mRNA起始結合至核糖體小亞基上并增加翻譯的短核苷酸序列。保守Kozak序列為(GCC) RCCATGG,其中R為嘌呤(A 或 G) (Kozak, 1986.Cell.44(2):283-92，以及 Kozak, 1987.Nucleic AcidsRes.15(20):8125-48)。在具體實施方案中，本發(fā)明預期的所述載體包括具有保守Kozak序列且編碼期望的多肽例如AB⑶I的多核苷酸。
[0122]在具體實施方案中，載體包括編碼待表達多肽的多核苷酸的聚腺苷酸化序列3'端。聚腺苷酸化序列通過將polyA尾加入至編碼序列的3'端可促進mRNA的穩(wěn)定性，因此有助于增加翻譯效率。識別的聚腺苷酸化位點包括理想的PolyA序列(例如，AATAAA、ATTAAAAGTAAA)、牛生長素polyA序列(BGHpA)、兔β -球蛋白polyA序列(r β gpA),或本領域已知的其他合適的異源或內源polyA序列。
[0123]在某些實施方案中，載體包括選擇基因，也稱為可選擇標記。典型的選擇基因編碼如下蛋白:(a)賦予對抗生素或其他毒素的抗性，例如氨芐青霉素、新霉素、潮霉素、氨甲喋呤、博萊霉素、殺稻瘟菌素或四環(huán)素，(b)補足營養(yǎng)缺陷型的缺陷，或(c)提供不能自復合培養(yǎng)基獲得的必需營養(yǎng)物，例如用于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。任何數(shù)目的選擇系統(tǒng)均可用于恢復轉化的細胞系。這些包括但不限于，單純皰疹病毒胸苷激酶(ffigler et al., 1977.Cellll: 223-232)和腺嘌呤轉磷酸核糖基酶(Lowy et al., 1990.Cell22:817-823)基因，其可分別用于tk_或aprt-細胞。
[0124]“宿主細胞”包括在體內或體外用本發(fā)明的載體或多核苷酸轉染或感染的細胞。宿主細胞可包括包裝細胞、生產細胞和用病毒載體感染的細胞。在具體實施方案中，將用本發(fā)明病毒載體感染的宿主細胞給予至有治療需要的個體。
[0125]大規(guī)模病毒粒子制備通常需要達到合理的病毒滴度。病毒粒子的制備是通過將轉移載體轉染至包含病毒結構和/或附件基因例如，gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpX或nef基因或其他逆轉錄病毒基因的包裝細胞系。
[0126]如本文所用，術語“包裝載體”是指表達載體或病毒載體，其缺少包裝信號且包含編碼1、2、3、4或更多個病毒結構和/或附件基因的多核苷酸。通常，所述包裝載體被包含于包裝細胞，且通過轉染、轉導或感染被引入至所述細胞。轉染、轉導或感染的方法為本領域技術人員所熟知。可通過轉染、轉導或感染將本發(fā)明的逆轉錄病毒/慢病毒轉移載體引入至包裝細胞系，以產生生產細胞或細胞系。通過標準方法可將本發(fā)明的包裝載體引入至人細胞或細胞系，包括例如，磷酸鈣轉染、脂質轉染或電穿孔。在一些實施方案中，將所述包裝載體和顯性選擇標記如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素、博萊霉素、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA—起引入至所述細胞，然后在合適的藥物存在下選擇并分離克隆。通過包裝載體，例如通過IRES或自我切割病毒肽，選擇標記基因可物理連接至編碼基因。
[0127]病毒包膜蛋白(env)決定宿主細胞的范圍，其最終被所述細胞系產生的重組逆轉錄病毒感染或轉化。在慢病毒的情況下，如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和env蛋白包括gp41和gpl20。優(yōu)選地，本發(fā)明包裝細胞表達的所述病毒env蛋白編碼于來自病毒的gag和pol基因的單獨載體,如此前所描述。
[0128]可用于本發(fā)明的源自逆轉錄病毒的env基因示例性實例，包括但不限于:MLV包膜、IOAl包膜、BAEV, FeLV-B, RDl 14、SSAV、埃博拉病毒、仙臺病毒、FPV (禽疫病毒)和流感病毒包膜。類似地，也可使用來自RNA病毒(例如，RNA病毒家族的小RNA病毒科、杯狀病毒科、星狀病毒科、披蓋病毒科、黃病毒科、冠狀病毒科、副黏液病毒科、彈狀病毒科、絲狀病毒科、正粘病毒科，布尼亞病毒科、`沙粒病毒科、呼腸病毒科、雙核糖核酸病毒科，逆轉錄病毒科)以及來自DNA病毒(肝病毒科、環(huán)病毒科、小DNA病毒、乳多空病毒科、腺病毒科、皰疹病毒科、痘病毒科和虹彩病毒科)的基因編碼包膜。代表性實例包括，F(xiàn)eLV, VEE, HFVff,WDSV、SFV、Rabies、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10、EIAV。
[0129]在其他實施方案中，用于對本發(fā)明的病毒假型化的包膜蛋白包括但不限于下述任一種病毒:流感A如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1 (禽流感)、流感B、流感C病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒、輪狀病毒、諾瓦克病毒組的任何病毒、腸道腺病毒、細小病毒、登革熱病毒、猴痘病毒、單股反鏈病毒、狂犬病毒屬如狂犬病毒、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒、杜文海格病毒、歐洲蝙蝠病毒1&2和澳大利亞蝙蝠病毒、流行熱病毒、水泡病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、皰疫病毒如單純皰疫病毒I型和2型、水痘帶狀皰疹、巨細胞病毒、Epstein-Bar病毒(EBV)、人皰疹病毒(HHV)、人皰疹病毒6型和8型、人免疫缺陷病毒(HIV)、乳突瘤病毒、鼠Y皰疹病毒、沙粒病毒如阿根廷出血熱病毒、玻利維亞出血熱病毒、薩比亞(Sabia)相關的出血熱病毒、委內瑞拉出血熱病毒、拉沙熱病毒、馬秋博病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、布尼亞科病毒如克里米亞-剛果出血熱病毒、漢坦病毒、腎綜合征出血熱病毒、里夫特裂谷熱病毒、絲狀病毒科(絲狀病毒)包括埃博拉出血熱和馬爾堡出血熱、黃病毒科包括科薩努爾森林病病毒、鄂木斯克出血熱病毒、森林腦炎病毒和副黏液病毒科如亨德拉病毒和尼帕病毒、重型天花和輕型天花(痘瘡)、甲病毒如委內瑞拉馬腦炎病毒、東部馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒、SARS-相關的冠狀病毒(SARS-CoV)、西尼羅河病毒、任何導致腦炎的病毒。
[0130]在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包裝細胞，其產生重組的逆轉錄病毒，例如用VSV-G glyco蛋白假型化的慢病毒。
[0131]如本文所用，術語“假型”或“假型化”是指其病毒包膜蛋白已經用另一種具有可取特征的病毒的包膜蛋白取代的病毒。例如，HIV可用皰疹性口炎病毒G-蛋白(VSV-G)包膜蛋白來假型化，所述包膜蛋白允許HIV感染眾多類型細胞，因為HIV包膜蛋白(由env基因編碼)通常使病毒靶向CD4+呈遞細胞。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，用VSV-G來使慢病毒包膜蛋白假型化。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包裝細胞，其產生重組的逆轉錄病毒例如用VSV-G包膜糖蛋白假型化的慢病毒。
[0132]如本文所用，術語“包裝細胞系”是指不含包裝信號但能穩(wěn)定或瞬時表達正確包裝病毒粒子所需的病毒結構蛋白和復制酶(例如，gag、pol和env)的細胞系。任何合適的細胞系均可用于制備本發(fā)明的包裝細胞。通常，所述細胞為哺乳動物細胞。在具體實施方案中，用于制備所述包裝細胞系的細胞為人細胞?？墒褂玫暮线m細胞系包括例如，CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H10T1/2細胞、FLY細胞、Psi_2細胞、B0SC23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSCl細胞、BSC40細胞、BMTlO細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080 細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞和211A細胞。在優(yōu)選的實施方案中，所述包裝細胞為293細胞、293T細胞或A549細胞。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述細胞為A549細胞。
[0133]如本文所用，術語“生產細胞系”是指能產生重組逆轉錄病毒粒子的細胞系，包括包裝細胞系和包含包裝信號的轉移載體構建體?？墒褂贸Ｒ?guī)技術制備感染性病毒粒子和病毒母液。制備病毒母液的方法為本領域所熟知，描述于例如，Y.Soneoka et al.(1995)Nucl.Acids Res.23:628-633，以及 N.R.Landau et al.(1992) J.Virol.66:5110-5113?？墒褂贸Ｒ?guī)技術從包裝細胞收集感染性病毒粒子。例如，如本領域所知，可通過細胞溶解來收集感染性病毒粒子，或收集細胞培養(yǎng)物上清液。任選地，如需要可將收集的病毒粒子純化。合適的純化技術為本領域技術人員所熟知。
[0134]使用逆轉錄病毒或慢病毒載體通過病毒感染而非轉染來遞送基因或其他多核苷酸序列稱為“轉導”。在一個實施方案中，通過感染和前病毒整合將逆轉錄病毒載體轉導至細胞。在某些實施方案中，如果細胞包含使用病毒或逆轉錄病毒載體通過感染遞送至其中的基因或其他多核苷酸序列，則所述細胞被轉導。在具體實施方案中，轉導細胞在其細胞基因組內包括通過逆轉錄病毒或慢病毒載體遞送的基因或其他多核苷酸序列。
[0135]在具體實施方案中，將用本發(fā)明病毒載體轉導的表達治療性多肽例如ABCDl多肽的宿主細胞給予至個體，以治療和/或預防疾病、障礙或病癥，例如腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病?？捎糜诒景l(fā)明某些實施方案的其他有關使用病毒載體進行基因治療的方法，可參見例如，Kay, Μ.A.(1997)Chestlll (6Supp.): 138S-142S;Ferry, N.and Heard, J.M.(1998)Hum.Gene Ther.9:1975-81; Shiratory, Y.et al.(1999)Liverl9:265-74;0ka,K.et al.(2000)Curr.0pin.Lipidol.11:179-86;Thule, P.M.and Liu, J.M.(2000) Gene Ther.7: 1744-52 ; Yang, N.S.(1992) Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56; Alt, M.(1995) J.Hepatol.23:746-58 ; Brody, S.L.and Crystal, R.G.(1994) Ann.N.Y.Acad.Sc1.716:90-101; Strayer, D.S.(1999) Expert Opin.1nvestig.Drugs8: 2159-2172 ; Smith-Arica, J.R.and Bartlett, J.S.(2001) Curr.Cardiol.Rep.3:43-49;以及 Lee, H.C.et al.(2000) Nature408:483-8。
[0136]如本文所用，除非上下文中另有清楚的說明，“治療”和類似詞語如“被治療”、“進行治療”等，是指用于獲得益處或期望的結果包括或優(yōu)選臨床結果的途徑。治療可任選地涉及減輕或緩解疾病或病癥的癥狀，或者延遲所述疾病或病癥的進展。
[0137]如本文所用，除非上下文中另有清楚的說明，“預防”和“被預防”、“進行預防”等，是指用于預防、抑制或降低疾病或病癥發(fā)生或復發(fā)可能性的途徑。其也指延遲疾病或病癥發(fā)作或復發(fā)，或者疾病或病癥癥狀發(fā)生或復發(fā)。如本文所用，“預防(prevention)”和類似詞語也包括在疾病或病癥癥狀發(fā)作或復發(fā)前，降低疾病或病癥的強度、效應、癥狀和/或負擔。
[0138]如本文所用，“有效量”或“治療上有效量”轉導的宿主細胞或物質是指足以影響期望的生物學效應如包括臨床結果的有益結果的用量。
[0139]如本文所用，“藥學上可接受的載體”包括任何和所有生理學上相容的溶劑、分散介質、涂料、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸附劑等，包括藥學上可接受的細胞培養(yǎng)基。在一個實施方案中，所述載體適于腸胃外給予。所述載體可適于血管內(例如，靜脈內或動脈注射)、腹膜內或肌肉內給予。藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于即時制備無菌注射溶液和分散液的無菌粉。將這些介質和藥劑用作藥用活性物質為本領域熟知。除了目前為止與所述轉導細胞不相容的，預期了任何常規(guī)媒介和藥劑均可用于本發(fā)明藥物組合物。
[0140]本文所用的冠 詞“一(a/an) ”和“所述(the) ”是指一個或多于一個(即，至少一個)的所述冠詞的語法客體。舉例來說?！?a) —元件”是指一個或多于一個的元件。
[0141]使用可選擇的/或者(alternative)(例如，“或”)應理解為指一個、兩個或替代物的任何組合。如本文所用，術語“包括(include) ”和“包含(comprise) ”作為同義詞使用。
[0142]如本文所用，術語“約(about) ”或“大約(approximately) ”是指,相對于參考的數(shù)量、水平、數(shù)值、數(shù)目、頻率、百分比、容積、大小、用量、重量或長度，數(shù)量、水平、數(shù)值、數(shù)目、頻率、百分比、容積、大小、用量、重量或長度變化的幅度為15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在一個實施方案中，術語“約”或“大約”是指數(shù)量、水平、數(shù)值、數(shù)目、頻率、百分比、容積、大小、用量、重量或長度的范圍，約為參考數(shù)量、水平、數(shù)值、數(shù)目、頻率、百分比、容積、大小、用量、重量或長度的 ±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2% 或 ±1%。
[0143]在整個說明書中，除非上下文另有說明，“包括/包含(comprise /comprises/comprising) ”應理解為指包含所指的步驟或成分(element)或者步驟或成分的組,但不排除任何其他步驟或成分或者步驟或成分的組。“由…組成(consisting of) ”是指包括且限于所列的物質。因此，詞語“由…組成”是指所列的成分是必需的或必要的，且不存在其他成分?！盎旧嫌伞M成”是指包括所列的成分，且限于不干擾或有助于本文針對所列成分指定的活性或作用的其他成分。因此，詞語“基本上由…組成”表示所列成分是必須的或必要的，但沒有其他任選的成分，而根據(jù)它們是否影響所列成分的活性或作用可以存在或不存在。
[0144]整個本說明書中所提到的“一個實施方案”或“一實施方案”是指與所述實施方案關聯(lián)描述的具體特征、結構或特性被包含于至少一個本發(fā)明的實施方案中。因此，在整個本說明書各處中出現(xiàn)的詞語“在一個實施方案中”或“在一實施方案中”不一定均指同樣的實施方案。而且，所述具體特征、結構或特性可以合適方式組合到一個或多個實施方案中。
[0145]在以下描述中，陳述了一些具體細節(jié)以提供對本發(fā)明實施方案的充分理解。然而，本領域技術人員應理解，本發(fā)明可在沒有這些細節(jié)下實施。此外，應理解本申請公開的來自本文描述的結構和替代物的各種組合的單個載體或載體的組，其程度同樣為如同每個載體或載體的組被單獨地陳述。因此，具體載體或具體替代物的選擇處在本公開的范圍內。
[0146]C.病毒載體
[0147]已經檢測了逆轉錄病毒和慢病毒載體，并發(fā)現(xiàn)其為用于將目的基因穩(wěn)定地導入至眾多類型靶細胞的基因組內合適的遞送載體。通過包含F(xiàn)LAP、RRE和HPRE或WPRE序列，許多載體設計已經被優(yōu)化為最大的轉導效率和轉基因表達。具體地，本領域技術人員通常通過包含轉錄后調控序列來增加轉基因表達。出人意料的是，本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)，包含WPRE序列沒有明顯增加表達或
[0148]該結構(configuration)導致合成mRNA轉錄物,其5’部分包含異源核酸編碼序列且其3’部分包含轉錄后調控元件序列。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的載體缺少或不包含轉錄后調控元件如WPRE或HPRE，因為在一些情況下這些元件增加了細胞轉化的風險和/或沒有實質上或明顯地增加mRNA轉錄物的量或增加mRNA的穩(wěn)定性。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的載體缺少或不包括WPR`E或HPRE作為附加的安全措施。
[0149]本發(fā)明還提供了轉移載體，其可用于實施本發(fā)明的方法。
[0150]盡管本領域技術人員應理解，可使用各種不同病毒載體來制備這類轉移載體，在具體實施方案中，所述轉移載體為逆轉錄病毒載體或慢病毒載體，部分由于慢病毒載體能夠提供在體外和體內將轉基因有效地遞送、整合和長期表達至非分裂態(tài)的細胞中。各種慢病毒載體為本領域所熟知，參見 Naldini et al., (1996a, 1996b, andl998) ; Zufferey etal.，(1997) ;Dull et al.，1998，美國專利第 6，013，516 號和第 5，994，136 號，其中任一種均可適于制備本發(fā)明的轉移載體。通常，這些載體為基于質粒的或基于病毒的載體，且被構建為攜帶有用于將編碼治療性多肽的核酸轉移至宿主細胞的基本序列。
[0151]所述慢病毒基因組和前病毒DNA包括在逆轉錄病毒中發(fā)現(xiàn)的3個基因:gag、pol和env,其側接有兩個長末端重復(LTR)序列。Gag基因編碼gene內部結構(基質、衣殼和核衣殼)蛋白；pol基因編碼RNA-指導的DNA聚合酶(逆轉錄酶)，一種蛋白酶和整合酶；env基因編碼病毒包膜糖蛋白。5’和3’ LTR’s作用為分別促進病毒粒RNA的轉錄和聚腺苷酸化。慢病毒具有的其他基因包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。鄰近5’LTR的是逆轉錄基因組(tRNA引物結合位點)和病毒有效衣殼化所需的序列。RNA進入粒子(Psi位點)。[0152]在進一步的實施方案中，所述慢病毒載體為HIV載體。因此，所述載體可源自人免疫缺陷-1 (HIV-1)、人免疫缺陷-2(HIV-2)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓科動物免疫缺陷病毒(FIV)、?？苿游锩庖呷毕莶《?BIV)、Jembrana病病毒(JDV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)、山羊關節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)等?；贖IV的載體骨架(即HIV順式作用序列元件和HIV gag、pol和rev基因)通常優(yōu)選與本發(fā)明的大多數(shù)方面相關在于，基于HIV的構建體在轉導人細胞中最有效。[0153]在各種實施方案中，本發(fā)明的載體包括在小神經膠質細胞中可操作地連接至編碼多肽的基因的啟動子，所述多肽提供腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥和/或腎上腺脊髓神經病治療。所述載體可具有一個或多個LTR，其中每個LTR包含一個或多個修飾，如一個或多個核苷酸取代、添加或缺失。所述載體還可包括多個附加元件中的一個以增加轉導效率(例如，cPPT/FLAP)、病毒包裝(例如，Psi (Ψ)包裝信號，RRE)和/或增加治療基因表達的其他元件(例如，poly (A)序列)，除了本發(fā)明的載體不包含WPRE或HPRE以外。
[0154]在具體實施方案中，本發(fā)明的轉移載體包括左端(5，)逆轉錄LTR;中心聚嘌呤區(qū)/側翼DNA(cPPT/FLAP);逆轉錄輸出元件；在小神經膠質細胞中具有活性的啟動子，可操作地連接至編碼ATP結合盒、D亞家族、成員I(ABCDl)多肽的多核苷酸；以及右端(3’ )逆轉錄LTR ;其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0155]在具體實施方案中，本發(fā)明的轉移載體包括左端(5，)逆轉錄LTR ;逆轉錄輸出元件；在小神經膠質細胞中具有活性的啟動子，可操作地連接至編碼ATP結合盒、D亞家族、成員I(ABCDl)多肽的多核苷酸；右端(3’ )逆轉錄LTR;以及poly㈧序列，其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了慢病毒載體，其包括:左端(5’)LTR ；cPPT/FLAP ；RRE ；MND啟動子，其可操作地連接至編碼人ABCDl多肽的多核苷酸(例如，SEQ ID NO: 1-2);右端(3’)LTR ;以及聚腺苷酸化序列；其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0156]在某些實施方案中，本發(fā)明提供了慢病毒載體，其包括:左端(5’)HIV_1LTR;Psi (Ψ)包裝信號；cPPT/FLAP ；RRE ;MND啟動子，可操作地連接至編碼人AB⑶I多肽的cDNA ;右端(3’)自我失活的(SIN)HIV-1LTR ;以及兔β -球蛋白聚腺苷酸化序列；其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0157]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了載體，其包括:至少一個LTR;中心聚嘌呤區(qū)/側翼DNA(cPPT/FLAP);逆轉錄輸出元件；以及在小神經膠質細胞中具有活性的啟動子，可操作地連接至編碼ATP結合盒、D亞家族、成員I (AB⑶I)多肽的多核苷酸；其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0158]在具體的實施方案中，本發(fā)明提供了載體，其包括:至少一個LTR; cPPT/FLAP ；RRE ；MND啟動子，其可操作地連接至編碼人AB⑶I多肽的多核苷酸；以及聚腺苷酸化序列；其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0159]在某些實施方案中，本發(fā)明提供了至少一個SIN HIV-1LTR5Psi(W)包裝信號；cPPT/FLAP ；RRE ；MND啟動子，可操作地連接至編碼人AB⑶I多肽的cDNA ；以及兔β -球蛋白聚腺苷酸化序列，其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
[0160]本領域技術人員應理解，由本發(fā)明現(xiàn)有的實施方案可生成許多其他實施方案，從而所述治療性轉基因在小神經膠質細胞中的缺少WPRE或HPRE元件的逆轉錄病毒載體內表達。
[0161]D.組合物和制劑
[0162]本發(fā)明還包括藥物組合物，其包括根據(jù)本文描述的方法制備的轉導細胞和藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，所述載體適于腸胃外給予。所述載體可適于靜脈內、腹膜內或肌肉內給予。藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于即時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉。將這些介質和藥劑用作藥用活性物質為本領域熟知。
[0163]本發(fā)明的組合物可包括一個或多個多肽、多核苷酸、包含其的載體、轉導細胞等，如本文所述，配制成藥學上可接受的或生理學上可接受的溶液用于單獨地或組合一種或多種其他形式的治療來給予至細胞或動物。還應理解，如需要，本發(fā)明的組合物可與其他藥劑一起給予，例如，其他蛋白、多肽、小分子或各種藥用活性劑。對于也可包含于所述組合物中的其他組分沒有實質上的限制，只要所添加的藥劑對于將組合物遞送至期望的基因治療的能力不產生不良影響。
[0164]在本發(fā)明的藥物組合物中，藥學上可接受的賦形劑和載體溶液的配制為本領域技術人員所熟知，作為合適的配給劑量和質量方案的發(fā)展，將本文描述的特定組合物用于各種治療方案，包括例如，經口、腸胃外、靜脈內、鼻內和肌肉內給和配制。
[0165]在某些情況下，可取的是將本發(fā)明公開的組合物經腸胃外、靜脈內、肌肉內或甚至腹膜內給予，如例如美國專利第5，543，158號、第5，641，515號和第5，399，363號(其各自明確地通過引用全部 并入本文)?？赏ㄟ^在水中恰當?shù)嘏c表面活性劑如羥丙基纖維素混合，制備作為游離堿或藥學上可接受的鹽的活性化合物溶液。也可在甘油、液體聚乙二醇和其混合物中以及在油類中制備分散劑。在存儲和使用的正常條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物的生長。
[0166]適于注射使用的藥物劑型包括無菌水溶液或分散液和用于即時制備注射用溶液或分散液的無菌粉劑(美國專利第5，466，468號，其通過引用明確地全部并入本文)。在所有情況下，該形式應為無菌的且達到易于注射程度存在。其應該在生產和儲存條件下是穩(wěn)定的，且被保存為抗微生物如細菌和真菌的感染作用。所述載體可為溶劑或分散介質，其含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和/或植物油。應維持合適的流動性，例如，通過使用包衣如卵磷脂，通過維持在分散時所需的粒徑，以及通過使用表面活性劑。通過各種抗菌劑和抗真菌劑例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等，可有助于防止微生物作用。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑例如，糖或氯化鈉。通過在所述組合物中使用延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可制備延遲吸收的可注射組合物。
[0167]對于在水溶液中經腸胃外給予，例如，如需要應對該溶液進行適當緩沖，首先與足夠的鹽或葡萄糖一起等滲地補充液體稀釋劑。這些特定的水溶液尤其適于經靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內給予。就此而言，鑒于本文的公開，本領域技術人員應了解可使用無菌水介質。例如，可將一劑量溶解于Iml等滲的NaCl溶液，加入至1000ml的皮下輸注液或者在建議的輸注位置進行注射(參見例如，Remington:The Science and Practice ofPharmacy, 20th Edition.Baltimore, MD:Lippincott ffilliams&ffilkins, 2000) ? 根據(jù)受治療個體的狀況，劑量上需要發(fā)生一些變化。無論如何，負責給藥的人應確定針對單個個體的合適劑量。而且，針對人給藥，制劑應滿足無菌、產熱原性，以及FDA的制劑標準所要求的通用安全性和純度標準。
[0168]無菌注射溶液的制備，可按照要求通過以所需量將活性化合物摻入至含有上述所列的各種其他成分的合適溶劑中，然后過濾除菌。通常，分散液的制備為，通過將各種無菌活性成分摻入至含有基本分散介質和所需的上述所列的其他成分的無菌載體中，以制備分散液。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉劑的情況下，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥技術，其產生活性成分加上任何其他來自此前的其無菌過濾溶液的所需成分的粉劑。
[0169]本文公開的組合物可配制為中性或鹽的形式。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白的游離氨基形成的)，且其與無機酸如鹽酸或磷酸或者有機酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。與游離羧基形成的鹽衍生自無機堿如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機堿如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。配制時溶液應以與劑型相容的形式且以治療上有效的量來給予。所述制劑易于以各種劑型如注射溶液、藥物釋放膠囊等給予。
[0170]如本文所用，“載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質、賦形劑、包衣料、稀釋劑、抗細菌和抗真菌劑、等滲和延遲吸收劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體等。將這類介質和藥劑用于藥物活性物質為本領域所熟知。除了與所述活性成分不相容的任何常規(guī)介質和藥齊?，預期了將其應用于所述治療組合物。也可將補充性活性成分摻入至所述組合物。
[0171]詞語“藥學上可接受的”是指當給予至人體時不產生過敏反應或類似不良反應的分子實體和組合物。制備包含蛋白作為活性成分的含水組合物為本領域所熟知。通常，這類組合物被制備為可注射的溶液機票懸浮液；也可制備適于在注射前溶解或懸浮于液體中的固體形式。所述制劑也可被乳化。
[0172]在某些實施方案中，所述組合物可通過鼻內噴灑、吸入和/或其他氣霧劑遞送載體來遞送。通過鼻噴氣霧劑直接將基因、多核苷酸和肽組合物遞送至肺部的方法，描述于例如，美國專利第5，756，353號和第5，804，212號(其各自通過引用明確地全部并入本文)。Likewise, the delivery of drugs using intranasal microparticle resins 同樣，使用鼻內微粒樹脂(Takenaga et al.，1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美國專利第5，725，871，其通過引用明確地全部并入本文)遞送藥物也為藥學領域所熟知。同樣，以聚四氟乙烯承載基質形式的轉化粘液質藥物遞送描述于美國專利第5，780, 045 (其通過引用明確地全部并入本文)。
[0173]在某些實施方案中，可通過使用脂質體、納米膠囊、微粒子、微球體、脂質粒子、囊泡任選地與CPP多肽等混合來進行遞送，以將本發(fā)明的組合物引入至合適的宿主細胞。具體地，本發(fā)明的組合物可配制為用于包封在脂質粒子、脂質體、囊泡、納米球、納米顆粒等內進行遞送?？墒褂贸Ｒ?guī)技術來進行這類遞送載體的配制和使用。本發(fā)明的制劑和組合物可包括一種或多種抑制劑和/或激活劑，其包含任何數(shù)目多肽、多核苷酸和小分子的組合的，如本文所述，配制為藥學上可接受的或生理學上可接受的溶液(例如，培養(yǎng)基)用于給予至細胞或動物，單獨給予或者與一種或多種其他治療形式組合給予。還應理解，如需要，本發(fā)明的組合物可與其他藥劑例如細胞、其他蛋白或多肽或各種藥用活性劑組合來給予。
[0174]在具體實施方案中，本發(fā)明的制劑或組合物包括與任何數(shù)目多肽、多核苷酸和小分子的組合接觸的細胞，如本文所述。
[0175]在某些方面，本發(fā)明提供了適于遞送病毒載體系統(tǒng)(即病毒介導的轉導)包括但不限于，逆轉錄病毒(例如，慢病毒)載體的制劑或組合物。
[0176]用于間接體內遞送的示例性制劑也可報考使用本領域已知的轉染劑，如磷酸鈣、電穿孔、熱休克和各種脂質體制劑(即脂質介導的轉染)。如下面進一步詳細描述，脂質體為包裹著一部分含水流體的脂雙層。DNA自動附著于陽離子脂質體(由于其電荷)的外表面，且這些脂質體將與細胞相互作用。
[0177]在某些方面，本發(fā)明提供了藥學上可接受的組合物，其包括治療有效量的一種或多種多核苷酸或多肽，如本文所述，與一種或多種藥學上可接受的載體(添加劑)和/或稀釋劑(例如，藥學上可接受的細胞培養(yǎng)基)一起配制。
[0178]本發(fā)明的具體實施方案可包括其他制劑如藥學領域熟知的制劑，其描述于 例如 Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition.Baltimore, MD:Lippincott ffilliams&ffilkins, 2000。
[0179]E.基因治療方法
[0180]所述逆轉錄病毒載體提供改善的腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥和腎上腺脊髓神經病基因治療的方法。如本文所用，術語“基因治療”是指將基因引入至細胞基因組。在各種實施方案中，本發(fā)明的病毒載體包括表達編碼多肽的治療性轉基因的啟動子，所述多肽為診斷或懷疑患有腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病的個體提供有療效的、預防性的或改善性的益處。所述病毒能在體內、間接體內或體外感染和轉導細胞。在間接體內和在體外的實施方案中，所述轉導細胞可給予至需要治療的個體。本發(fā)明預期了本發(fā)明的載體系統(tǒng)、病毒粒子和轉導細胞可用于治療、預防和/或緩解患者個體的腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病。
[0181]在各種實施方案中，所述逆轉錄病毒載體通過直接注射給予至需要體內基因治療的個體的細胞、組織或器官 。在各種其他實施方案中，用本發(fā)明的載體在體外或間接體內轉導細胞。然后將所述轉導細胞給予至患有腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病的個體。
[0182]適于在本發(fā)明的基因治療方法中用于轉導和給予的細胞，包括但不限于，干細胞、祖細胞和分化的細胞。在某些實施方案中，所述轉導細胞為骨髓干細胞、臍帶干細胞或間充質干細胞。
[0183]在各種實施方案中，優(yōu)選使用干細胞，因為當給予至體內特定的生態(tài)位它們具有分化為合適的細胞類型的能力。術語“干細胞”是指未分化的細胞，其能夠(I)長期自我更新，或具有產生至少一個拷貝相同的原代細胞的能力，(2)在單個細胞水平分化為多個細胞，且在一些情況下僅為一種特化的細胞類型，以及(3)在體內功能性再生組織。根據(jù)其發(fā)展?jié)摿⒏杉毎M一步分為全能干細胞、多能干細胞(pluripotent)、專能干細胞(multipotent)和寡/單能噶細胞。“自我更新”是指具有產生未改變的子細胞和產生特定細胞類型(潛力)的獨特能力的細胞。可以兩種方式實現(xiàn)自我更新。不對稱的細胞分裂產生一個與親本細胞相同的子細胞，和一個不同于親本細胞的子細胞，其為祖細胞或分化的細胞。不對稱的細胞分裂不增加細胞的數(shù)目。對稱的細胞分裂產生兩個相同的子細胞。細胞的“增殖”或“擴增”是指對稱的細胞分裂。
[0184]如本文所用，術語“多能性”是指形成身體或體細胞(即胚體)的所有譜系的細胞的能力。例如，胚胎干細胞是一種能夠從三個胚層即外胚層、中皮層和內皮層形成細胞的多能干細胞。如本文所用，術語“專能干細胞”是指成體干細胞形成一種譜系的多個細胞類型的能力。例如，造血干細胞能夠形成血細胞譜系的所有細胞例如，淋巴性能和骨髓細胞。
[0185]如本文所用，術語“祖細胞(progenitor) ”或“源祖細胞(progenitor cell)”是指具有自我更新和分化為多個成熟細胞的能力的細胞。許多祖細胞沿著單個譜系分化，但可具有非常廣泛的增殖能力。 [0186]造血干細胞(HSCs)產生定向造血祖細胞(HPCs)，其能夠在生物體的整個壽命期中產生全部類型的成熟血細胞。術語“造血干細胞”或“HSC”是指產生生物體的全部血細胞類型的專能干細胞，所述血細胞類型包括骨髓細胞(例如，單核細胞和巨噬細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、紅細胞、巨核細胞/血小板、樹狀細胞)和淋巴細胞譜系(例如，T-細胞、B-細胞、NK-細胞)和其他本領域已知的細胞(參見Fei，R.，et al.,美國專利第 5，635，387 號；McGlave, et al.，美國專利第 5，460，964 號；Simmons, P.，et al.，美國專利第 5, 677, 136 號；Tsukamoto, et al.,美國專利第 5, 750, 397 號；Schwartz, et al.,美國專利第 5, 759, 793 號；DiGuisto, et al.,美國專利第 5, 681, 599 號；Tsukamoto, etal.,美國專利第5，716，827號)。當被植入至受到致命輻照的動物或人，造血干細胞和祖細胞能夠再生紅細胞、中性粒細胞-巨噬細胞、巨核細胞和淋巴造血細胞庫。
[0187]在優(yōu)選的實施方案中，所述轉導細胞為分離自骨髓、臍帶血或末梢循環(huán)的造血干細胞和/或祖細胞。在具體的優(yōu)選實施方案中，所述轉導細胞為分離自骨髓、臍帶血或末梢循環(huán)的造血干細胞。
[0188]本發(fā)明的細胞可為自體的/自體同源的(“自身”)或非自體的(“非自身”例如，同種異體的、同基因的或異基因的)。如本文所用，“自體的”是指來自相同個體的細胞。如本文所用，“同種異體的”是指相同物種的細胞，其遺傳上與相比的細胞不同。如本文所用，“同基因的”是指不同個體的細胞，其遺傳上與相比的細胞相同。如本文所用，“異基因的”是指與相比的細胞為不同物種的細胞。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的細胞為同種異體的。
[0189]如本文所用，“個體”包括任何表現(xiàn)出腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病癥狀的任何動物，其可用本發(fā)明其他地方公開的基因治療載體、基于細胞的治療法和方法進行治療。合適的個體(例如，患者)包括實驗動物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、農場動物和家畜或寵物(如貓或狗)。包括非-人靈長類和優(yōu)選地，人患者。典型的個體包括表現(xiàn)出異常量(比“正?！被颉敖】怠眰€體更低或更高的量)的一種或多種生理活性的動物，所述生理活性可通過基因治療進行調控。
[0190]如本文所用，“治療”或“進行治療”包括對疾病或病理學狀況的癥狀或病理學的任何有益或期望的效果，且甚至可包括處于治療中的疾病或病癥的一個或多個可測量標記上的最小減少。治療可任選地涉及減輕或緩解疾病或病癥的癥狀，或者延遲所述疾病或病癥的進展。治療可任選地包括減少或緩解疾病或病癥的癥狀，或者延緩所述疾病或病癥的進展?！爸委煛辈灰欢ū硎就耆蛑斡膊』虿“Y或其相關癥狀。
[0191]如本文所用，“預防”和類似詞語如“被預防”、“進行預防”等，是指用于預防、抑制或降低疾病或病癥發(fā)生或復發(fā)可能性的途徑。其也指延遲疾病或病癥發(fā)作或復發(fā)，或者疾病或病癥癥狀發(fā)生或復發(fā)。如本文所用，“預防(prevention) ”和類似詞語也包括在疾病或病癥癥狀發(fā)作或復發(fā)前，降低疾病或病癥的強度、效應、癥狀和/或負擔。
[0192]術語“量”是指“有效用量”或“有效量”的病毒或轉導的治療細胞，以獲得有益或期望的預防性或治療性結果，包括臨床結果。
[0193]“預防上有效量”是指病毒或轉導的治療細胞的用量可有效地獲得期望的預防性結果。由于預防性劑量在疾病之前或早期應用于個體，通常而非必需地，所述預防上有效量少于治療上有效量。
[0194]“治療上有效量”的病毒或轉導的治療細胞可根據(jù)下述因素而改變:如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個體體重以及所述干細胞和祖細胞的能力，以在個體中產生期望的響應。治療上有效量也是病毒或轉導的治療細胞的治療性有益效果超過其任何毒性或有害作用的用量。術語“治療上有效量”包括對“治療”個體(例如，患者)有效的用量。
[0195]在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了具有發(fā)展為腦部小神經膠質細胞的潛力的轉導細胞。在具體實施方案中，用本發(fā)明的載體轉導造血干細胞并給予至需要治療腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病的個體。造血干細胞為腦部小神經膠質細胞的來源，因此是優(yōu)選的。
[0196]所述轉導細胞可作為骨髓移植中的一部分給予至經歷或沒有經歷骨髓消融治療的個體。在一個實施方案中，本發(fā)明的轉導細胞在骨髓移植中給予至經歷化學消融或放射消融骨髓治療的個體。在優(yōu)選的實施方案中，所述個體為年輕的男性。
[0197]在一個實施方案中，將一個劑量的轉導細胞通過靜脈注射遞送至個體。在優(yōu)選的實施方案中，將轉導的造血干細胞通過靜脈注射給予至個體。
[0198]在具體實施方案中，患者在單個靜脈注射劑量中接受一個劑量的轉導的造血干細胞，其為約I X IO5細胞/kg、約5 X IO5細胞/kg、約I X IO6細胞/kg、約2 X IO6細胞/kg、約3 X IO6 細胞 /kg、約 4 X IO6 細胞 /kg、約 5 X IO6 細胞 /kg、約 6 X IO6 細胞 /kg、約 7 X IO6 細胞/kg、約8 X IO6細胞/kg、約9 X IO6細胞/kg、約I X IO7細胞/kg、約5 X IO7細胞/kg、約I X IO8細胞/kg或更多。在某些實施方案中，患者接受一個劑量的轉導的造血干細胞，其為約I X IO5細胞/kg至約I X IO8細胞/kg，約I X IO6細胞/kg至約I X IO8細胞/kg，約I X IO6細胞/kg至約9 X IO6細胞/kg，約2 X IO6細胞/kg至約8 X IO6細胞/kg，約2 X IO6細胞/kg至約8 X IO6細胞/kg,約2 X IO6細胞/kg至約5 X IO6細胞/kg,約3 X IO6細胞/kg至約5 X IO6細胞/kg，約3 X IO6細胞/kg至約4 X IO8細胞/kg，，或任何中間劑量的細胞/kg。
[0199]可使用現(xiàn)有技術中的方法用細胞因子刺激轉導細胞以進行擴增。在各種實施方案中，根據(jù)需要患者個體在幾天、幾個月或幾年的時間內給予了 1、2、3、4、5或更多個劑量，以維持或增加治療。
[0200]在具體實施方案中，用包含在小神經膠質細胞中具有活性的啟動子例如MND啟動子的本發(fā)明的載體轉導了造血干細胞，所述啟動子可操作地連接至編碼多肽例如AB⑶I的基因，所述造血干細胞可用于治療、預防或緩解患者個體的腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥和/或腎上腺脊髓神經病。
[0201] 下面本發(fā)明通過以下實施例來更充分地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明可以不同的形式體現(xiàn)，且不應該解釋為僅限于本文所述的實施方案；而是，提供這些實施方案以便本公開充分而徹底，并充分地將本發(fā)明的范圍傳達給本領域技術人員。
實施例
[0202]實施例1[0203]比較用具有或沒有WPRE的AB⑶I慢病毒載體對正常的人造血干細胞進行的基因轉導
[0204]實駘概沭:
[0205]慢病毒載體包含可操作地連接至編碼人ACBDl的cDNA的MND啟動子，且WPRE元件(見圖1 ;CG1711MND-ALD)載體在商業(yè)發(fā)展上不可獲得。因此， 申請人:開展了載體研制項目以鑒定合適的慢病毒載體以用于將來的臨床試驗。作為載體研制項目的結果，制備了商業(yè)上可接受的載體，且沒有改變可操作地連接至MND啟動子的ABCD-1基因。出人意料的是，從所述載體中移除WPRE沒有改變人的造血細胞的轉導效率和轉基因表達。使用短期和長期祖細胞分析，針對造血細胞進行了下述系列實驗，以比較兩種MND-ALD載體，即pLBPlOO (見圖1和SEQ ID NO:1;移除了 WPRE)和pLBP140 (見圖1 ;具有功能性WPRE)，其針對WPRE的存在而不同。
[0206]慢病毒載體構律體
[0207]所有慢病毒載體在MND啟動子的控制下，含有正常的人ATP結合盒、D亞家族(ALD)、成員 I (ABCDl) cDNA。圖1 和表 I 概括了 CG1711、pLBPlOO 和 pLBP140MND_ALD 載體中的不同組件和它們的位置。
[0208]表1:載體概要`
【權利要求】
1.載體，其包括: (a)左端(5，)逆轉錄LTR; (b)中心聚嘌呤區(qū)/側翼DNA(cPPT/FLAP)； (c)逆轉錄輸出元件； (e)在小神經膠質細胞中具有活性的啟動子，其可操作地連接至編碼ATP結合盒、D亞家族、成員I(ABCDl)多肽的多核苷酸；和 (f)右端(3’)逆轉錄LTR; 其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
2.根據(jù)權利要求1所述的載體，其中所述載體為慢病毒載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的載體，其中所述慢病毒為HIV。
4.根據(jù)權利要求2所述的載體，其中所述慢病毒為HIV-1。
5.根據(jù)權利要求1所述的載體，其中所述5’LTR的啟動子被異源啟動子替換。
6.根據(jù)權利要求5所述的載體，其中所述異源啟動子為巨細胞病毒(CMV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子或猿猴病毒40(SV40)啟動子。
7.根據(jù)權利要求5所述的載體，其中所`述異源啟動子為CMV啟動子。
8.根據(jù)權利要求1所述的載體，其中所述5’LTR或3’ LTR為慢病毒LTR。
9.根據(jù)權利要求1所述的載體，其中所述5’LTR和3’ LTR為慢病毒LTR。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的載體，其中所述慢病毒為HIV-1。
11.根據(jù)權利要求10所述的載體，其中所述3’LTR包含一個或多個修飾。
12.根據(jù)權利要求10所述的載體，其中所述3’LTR包含一個或多個缺失。
13.根據(jù)權利要求10所述的載體，其中所述3’LTR為自我失活的(SIN) LTR。
14.根據(jù)權利要求1所述的載體，其中所述逆轉錄輸出元件為Rev響應元件(RRE)。
15.根據(jù)權利要求1所述的載體，其中所述cPPT/FLAP來自HIV-1。
16.根據(jù)權利要求1所述的載體，其中所述啟動子包括骨髓瘤病毒增強子、陰性控制區(qū)缺失的，dl587rev引物結合位點取代的(MND)啟動子或其具有轉錄活性的片段。
17.根據(jù)權利要求1所述的載體，其中所述編碼ABCDl多肽的多核苷酸為cDNA。
18.根據(jù)權利要求17所述的載體，其中所述cDNA包括優(yōu)化的Kozak序列。
19.根據(jù)權利要求18所述的載體，其中所述優(yōu)化的Kozak序列為(GCC)RCCATGG，其中R為嘌呤(A或G)。
20.根據(jù)權利要求1所述的載體，其中所述多核苷酸編碼人ABCDl多肽。
21.慢病毒載體，包含:
(a)左端(5，)LTR ；
(b)cPPT/FLAP；
(c)RRE; (d)MND啟動子，其可操作地連接至編碼人ABCDl多肽的多核苷酸； (e)右端(3’)LTR;和 (f)聚腺苷酸化序列； 其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
22.根據(jù)權利要求21所述的慢病毒載體，包含Psi(W)包裝信號。
23.根據(jù)權利要求21所述的慢病毒載體，其中所述聚腺苷酸化序列為牛生長素聚腺苷酸化或信號兔β_球蛋白聚腺苷酸化序列。
24.根據(jù)權利要求21所述的慢病毒載體，其中所述5’LTR或3’ LTR來自HIV-1。
25.根據(jù)權利要求21所述的慢病毒載體，其中所述3’LTR為SINLTR。
26.慢病毒載體,包含: (a)左端(5，)HIV-1LTR； (b)Psi(W)包裝信號；
(c)cPPT/FLAP；
(d)RRE ； (e)MND啟動子，其可操作地連接至編碼人AB⑶I多肽的cDNA； (f)右端(3’)自我失活的(SIN)HIV-1LTRjP (g)兔球蛋白聚腺苷酸化序列； 其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
27.哺乳動物細胞，包含根據(jù)權利要求1-26中任一項所述的載體。
28.包裝細胞,包含:編碼gag的第一多核苷酸,編碼pol的第二多核苷酸,編碼env的第三多核苷酸，以及根據(jù)權利要 求1-26中任一項所述的載體。
29.生產細胞，包含根據(jù)權利要求1-26中任一項所述的載體。
30.由權利要求29所述的生產細胞產生的載體顆粒。
31.載體，包含: (a)至少一個LTR； (b)中心聚嘌呤區(qū)/側翼DNA(cPPT/FLAP)； (c)逆轉錄輸出元件；和 (e)在小神經膠質細胞中具有活性的啟動子，其可操作地連接至編碼ATP結合盒、D亞家族、成員I(ABCDl)多肽的多核苷酸； 其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
32.載體，包含: (a)至少一個LTR；
(b)cPPT/FLAP；
(c)RRE ； (d)MND啟動子，其可操作地連接至編碼人ABCDl多肽的多核苷酸；和 (e)聚腺苷酸化序列； 其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
33.載體，包含: (a)至少一個SIN HIV-1LTR ； (b)Psi(W)包裝信號；
(c)cPPT/FLAP；
(d)RRE ； (e)MND啟動子，可操作地連接至編碼人AB⑶I多肽的cDNA;和 (f)兔球蛋白聚腺苷酸化序列；其中所述載體不包含土撥鼠轉錄后調控元件(WPRE)。
34.用根據(jù)權利要求31-33中任一項所述的載體轉導的宿主細胞。
35.根據(jù)權利要求34所述的轉導的宿主細胞，其中所述細胞為胚胎干細胞、成體干細胞或祖細胞。
36.根據(jù)權利要求35所述的轉導的宿主細胞，其中所述細胞為造血干細胞。
37.根據(jù)權利要求31-33中任一項所述的病毒載體在基因治療中的用途。
38.根據(jù)權利要求37所述的用途，其中所述基因治療治療或防止腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病。
39.治療腎上腺腦白質營養(yǎng)不良癥或腎上腺脊髓神經病的方法，包括將用根據(jù)權利要求31-33中任一項所述的載體轉導的細胞給予到個體。
40.根據(jù)權利要求39所述的方法，其中所述細胞為胚胎干細胞、成體干細胞或祖細胞。
41.根據(jù)權利要求39所述的方法，其中所述細胞為造血干細胞。
【文檔編號】A61K39/21GK103717240SQ201280038832
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年6月8日 優(yōu)先權日:2011年6月10日
【發(fā)明者】瑪利亞·瓊恩·德納羅, 米切爾·霍華德·菲尼爾, 加博爾·沃萊斯 申請人:藍鳥生物公司