重組多肽的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供可使用動物培養(yǎng)細胞以高生產(chǎn)量制造蛋白質(zhì)的方法，其包括培養(yǎng)表達APES（抗體產(chǎn)生增強序列），并且導入編碼希望得到的多肽的DNA的細胞，產(chǎn)生希望得到的多肽。APES含與NfkBia關(guān)聯(lián)的堿基序列，有降低細胞內(nèi)的NfkBia的表達的功能。
【專利說明】重組多肽的制造方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及重組多肽的制造方法，更具體而言，使用核因子KB抑制物α(NfkBia)的表達降低的動物細胞有效制造多肽的方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]使用基因重組技術(shù)，生產(chǎn)作為醫(yī)藥有用的蛋白質(zhì)之時，使用動物細胞，則由于原核細胞無法進行的復(fù)雜的翻譯后修飾或折疊變得可能，動物細胞多用作用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的宿主細胞。
[0003]近年、抗體或生理活性蛋白質(zhì)等的多種生物藥品輩出，在動物細胞中有效生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的技術(shù)關(guān)系到生物藥品的低成本化，從而約束向患者的穩(wěn)定的供給。
[0004]從而，期望生產(chǎn)效率更高的蛋白質(zhì)的制造方法。
[0005]NfkBia(IKBa、核因子κ B抑制物a )是B-細胞抑制物中κ多肽基因增強子的核因子，a的簡稱，與作為涉及細胞內(nèi)的信號傳遞的轉(zhuǎn)錄因子的NF-κ B的活化相關(guān)。NfkBia是NF- K B的失活因子之一。新生物合成的NfkBia通過在核內(nèi)誘導表達，負調(diào)節(jié)NF- κ B的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性(非專利文獻I)。另外，如NfkBia —樣抑制細胞增殖的一部分的基因表達在幾乎全部的小鼠或人腫瘤細胞中被抑制(非專利文獻2)。NF-κ B通常與如NfkBia一樣的失活因子結(jié)合著存在，但由各種刺激從失活因子游離活化，遷移到核內(nèi)，與在細胞因子、生長因子、粘接分子、細胞死亡控制因子其他各種各樣的目標基因的啟動子/增強子區(qū)域的特異性DNA序列(5’ -GGGACTTTCC-3’、稱為NF κ B結(jié)合序列、kB基序、NFkB應(yīng)答元件等(SEQ ID N0:35))結(jié)合，與轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)相關(guān)(非專利文獻3)。
[0006]另一方面，作為在動物`培養(yǎng)細胞內(nèi)的NfkBia的行為，不知與重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生能力的關(guān)系。
[0007]【現(xiàn)有技術(shù)文獻】
[0008]【非專利文獻】
[0009]非專利文獻 1:1nducible nuclear expression of newly synthesized I kappaB alpha negatively regulates DNA-binding and transcriptional activities ofNF-kappa BMo1.Cell.Biol.，051995，2689-2696，Voll5, N0.5
[0010]非專利文獻2:From mice to humans:1dentification of commonly deregulatedgenes in mammary cancer via comparative SAGE studies Hu Y., Sun H., DrakeJ., Kittrell F., Abba M.C., Deng L ,Gaddis S., Sahin A., Baggerly K., Medina D.andAldaz C.M.Cancer Research 200464:21 (7748-7755)
[0011]非專利文獻3:" New insights into the Role of Nuclear Factor-kappa B inCell Growth Regulation" American Journal of Pathology, 2001, Vol.159, N0.2:387-397
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】[0012]【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】
[0013]本發(fā)明旨在提供能以高的生產(chǎn)量制造天然型蛋白質(zhì)或重組蛋白質(zhì)的方法。
[0014]【解決課題的技術(shù)方案】
[0015]本發(fā)明人為了解決上述課題進行銳意努力，以有高的產(chǎn)生重組抗體的能力的培養(yǎng)細胞株(CH0細胞株)作為材料，對于在所述細胞株中表達顯著的基因進行檢查的結(jié)果，鑒定一種mRNA型非編碼RNA，其通過使用特定的小鼠序列作為探針而被識別。此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相當于NfkBia的mRNA的非翻譯區(qū)域的互補鏈。又發(fā)現(xiàn)，通過在重組培養(yǎng)細胞中表達由此轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的一部分的序列組成的核酸分子，顯著地升高所述培養(yǎng)細胞的重組多肽的產(chǎn)生能力。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在所述非編碼RNA的表達上調(diào)的高產(chǎn)生抗體的細胞中NfkBia的表達被抑制。再者，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，有高的重組抗體產(chǎn)生能力的培養(yǎng)細胞在細胞內(nèi)NfkBia的表達被抑制。從而認為，通過高表達控制培養(yǎng)細胞內(nèi)的NfkBia的表達的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可增加希望得到的多肽的生產(chǎn)量，從而完成本發(fā)明。
[0016]在本說明書中，將這樣的通過在培養(yǎng)細胞內(nèi)表達量增加，有升高重組抗體等的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生能力的功能的 RNA或DNA或它們的序列總稱而命名為APES (抗體產(chǎn)生增強序列)(根據(jù)情況，稱為PPES (多肽產(chǎn)生增強序列))。
[0017]本發(fā)明人推定，APES (或者PPES)通過控制培養(yǎng)細胞內(nèi)的NfkBia的表達，增強Nf- K B的活性，由此升高重組多肽產(chǎn)生能力。推定活性增強的NF- K B遷移到核內(nèi)，使免疫、炎癥、抗凋亡關(guān)聯(lián)基因(Bcl-2，Bcl-XL，IAPs (凋亡蛋白抑制物)等)的表達亢進，恭獻于細胞的增殖或生存率維持等。
[0018]還有，在通常的抗體等的重組蛋白質(zhì)或肽的表達基因的用質(zhì)粒的啟動子/增強子區(qū)域存在多個的NF- K B結(jié)合序列推定，遷移到核內(nèi)的NF- K B增強表達質(zhì)粒的啟動子活性，恭獻于進一步的抗體的高產(chǎn)生化。這樣的序列是，例如，在MCMV啟動子的情況，小鼠巨細胞病毒來源序列(DD434486)中存在8個位置、人巨細胞病毒來源序列(D1097553)中存在3個位置的NF- K B結(jié)合序列。
[0019]本發(fā)明的要旨如下。
[0020](I)多肽的制造方法，其包括培養(yǎng)表達APES、并且導入編碼希望得到的多肽的DNA的細胞，以及產(chǎn)生希望得到的多肽。
[0021](1-1) (I)的方法，其中細胞是強表達APES的細胞。
[0022](2) (I)的方法，其中APES是含通過堿基對形成結(jié)合于人、小鼠、大鼠或倉鼠來源的NfkBia的基因的DNA或mRNA，可抑制NfkBia的基因的表達的堿基序列的核酸分子。
[0023](3) (2)的方法，其中APES是含可通過堿基對形成結(jié)合于NfkBia的mRNA之一部分的19-25堿基長的序列的至30堿基長的低分子RNA。
[0024](4-1) (2)的方法，其中APES是含可通過堿基對形成結(jié)合于NfkBia的mRNA之一部分的19-25堿基長的序列的至561堿基長的mRNA型非編碼RNA。
[0025](4) (2)的方法，其中APES是含可通過堿基對形成結(jié)合于NfkBia的mRNA之一部分的19-25堿基長的序列的至500堿基長的mRNA型非編碼RNA。
[0026](5-1) (2)的方法，其中APES是含可通過堿基對形成結(jié)合于NfkBia的mRNA之一部分的19-25堿基長的序列的561-1579堿基長的mRNA型非編碼RNA。
[0027](5) (2)的方法，其中APES是含可通過堿基對形成結(jié)合于NfkBia的mRNA之一部分的19-25堿基長的序列的500-1000堿基長的mRNA型非編碼RNA。
[0028](6)(3)-(5)之任一項的方法，其中19-25堿基長的連續(xù)的序列是SEQ ID NO:2所示的堿基序列中任一個的部分序列。
[0029](7-1) (6)的方法，其中APES選自含以下的堿基序列的核酸分子:
[0030]Ca)由SEQ ID NO:1-16及29之任一個的堿基序列組成的DNA ；
[0031](b)含上述(a)的序列，是NfkBia基因的3’側(cè)非翻譯區(qū)域的部分序列的DNA ;
[0032](c)由與上述(a)或(b)的序列除I個或數(shù)個堿基外相同的堿基序列組成的DNA ；
[0033](d)是上述(a)、(b)或(c)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA;
[0034](e)由可通過堿基對形成結(jié)合于上述(a)的序列的序列組成的DNA或RNA。
[0035](7) (6)的方法，其中APES選自含以下的堿基序列的核酸分子:
[0036](a)由SEQ ID NO:4-16的堿基序列組成的DNA
[0037](b)是上述(a)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA
[0038](c)由與上述(a)的序列除I個堿基相同的堿基序列組成的DNA
[0039]Cd)是上述(C)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA
[0040](e)由可通過堿基 對形成結(jié)合于上述(a)的序列的序列組成的DNA或RNA。
[0041](8) (I)的方法，其中向細胞導入編碼希望得到的多肽的外來的DNA，并且人為地導入APES。
[0042](9) (8)的方法，其中人為地導入APES的細胞是轉(zhuǎn)染APES的細胞。
[0043](10) (8)的方法，其中人為地導入APES的細胞是內(nèi)源性APES的轉(zhuǎn)錄活化的細胞。
[0044](11) (8)的方法，其中向細胞再導入編碼?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白的DNA。
[0045](12) (8)的方法，其中向細胞再導入編碼半胱氨酸亞磺酸脫羧酶的DNA。
[0046](13) (8)的方法，其中向細胞再導入編碼丙氨酸轉(zhuǎn)移酶的DNA。
[0047](14) (I)的方法，其中多肽是抗體。
[0048](15) (I)的方法，其中細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
[0049](16)制造含有用上述之任一項所述的方法制造的多肽的藥品的方法。
[0050](17)含以下的堿基序列，有APES活性的核酸分子(APES或PPES)(但是除SEQ IDNO:1的核酸分子之外):
[0051]Ca)由SEQ ID NO:2-16及29之任一個的堿基序列組成的DNA ；
[0052](b)含上述(a)的序列，是NfkBia基因的3’側(cè)非翻譯區(qū)域的部分序列的DNA ;
[0053](c)由與SEQ ID NO:1-16及29或(b)的序列除I個或數(shù)個堿基外相同的堿基序列組成的DNA ；
[0054](d)是上述(a)、(b)或(b)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA ;
[0055]Ce)由可通過堿基對形成結(jié)合于上述(a)的序列的序列組成的DNA或RNA。
[0056](18)含上述(17)所述的核酸分子的載體。
[0057](19)人為地導入上述(17)所述的核酸分子或(18)所述的載體的細胞。
[0058]【發(fā)明效果】
[0059]由本發(fā)明可有效生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。
【【專利附圖】

【附圖說明】】[0060]【圖1】示鑒定的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的在序列及小鼠基因組的位置。
[0061]【圖2】示在CH0-DG44細胞中高表達Mabl(抗IL_6受體抗體)的產(chǎn)生抗體的細胞的在繼代培養(yǎng)第3天的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達強度。
[0062]【圖3】示在CHO-DXBlls細胞中高表達Mab2(抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體)的產(chǎn)生抗體的細胞的在繼代培養(yǎng)第3天的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達強度。
[0063]【圖4】示Mab2(抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體)產(chǎn)生細胞的在IL罐流加培養(yǎng)第3天的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達強度。
[0064]【圖5】示產(chǎn)生Mab2的細胞的在IL罐的流加培養(yǎng)后期第13天的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達強度的上調(diào)。
[0065]【圖6】示Mabl(抗IL-6受體抗體)產(chǎn)生潛力低的細胞的在IL罐流加培養(yǎng)第3天的AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達強度。
[0066]【圖7】是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015(437p)之一部分序列434bp的表達質(zhì)粒。
[0067]【圖8】是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015(437p)之一部分序列165bp的表達質(zhì)粒。
[0068]【圖9】是作為對照僅表達潮霉素抗性基因的質(zhì)粒。
[0069]【圖10】示由轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015(437p)之一部分序列的強表達產(chǎn)生Mabl的量增加。
[0070]【圖11】示在高產(chǎn)生抗體的細胞的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015的強表達和表達NfkBia的抑制。
`[0071]【圖12】示表達NfkBia的定量中使用的探針組。
[0072]【圖13】示在高產(chǎn)生抗體的細胞的表達NfkBia的抑制的定量結(jié)果。
[0073]【圖14】示小鼠MCMVIE2啟動子上(SEQ ID NO:23)的8個的NfkB結(jié)合部位(加下劃線部)。
[0074]【圖15】是microRNA表達的解析法的概略。
[0075]【圖16】示在高產(chǎn)生抗體的細胞高表達的microRNA來源的PCR產(chǎn)物。
[0076]【圖17】是在表達pHyg-TAUT的細胞中共表達轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI642048(437p)之一部分序列165bp的質(zhì)粒pPur_APES165及共表達ALTl的pPur-ALTl。
[0077]【圖18】是示由APES強表達的細胞高增殖、高產(chǎn)生抗體的效果的搖床流加培養(yǎng)的結(jié)果。
[0078]【圖19】是示由APES強表達的細胞高增殖、高產(chǎn)生抗體的效果的L-Jar流加培養(yǎng)的結(jié)果。
[0079]【圖20】示強表達APES165的宿主候選細胞(9株)的APES表達量與活細胞密度的相關(guān)。
[0080]【圖21】示由轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015(437p)之一部分序列APES165的更部分序列的強表達產(chǎn)生Mabl的量增加。
[0081]【圖22】示在圖21有高產(chǎn)生抗體的效果的APES165的再部分序列含Nfkbia互補序列。
[0082]【圖23】示AI462015是小鼠NfkbiamRNA的互補鏈。(實施例8)
[0083]【圖24】示AI462015的相同序列在CHO-Kl細胞基因組中存在。(實施例8)
[0084]【圖25a】示AI462015之一部分序列(自5'末端第7-91)跨種而保守。[0085]【圖25b】示AI462015之一部分序列(自Y末端第7-91)跨種而保守。
[0086]【圖25c】示AI462015之一部分序列(自Y末端第7-91)跨種而保守。
[0087]【圖25d】示AI462015之一部分序列(自Y末端第7-91)跨種而保守。
[0088]【圖25e】示AI462015之一部分序列(自Y末端第7-91)跨種而保守。
[0089]【實施方式】
[0090]以下，對于本發(fā)明的實施方式進行更詳細地說明。
[0091](I) APES(抗體產(chǎn)生增強序列)
[0092]本發(fā)明提供包括培養(yǎng)表達APES、并且導入編碼希望得到的多肽的DNA的細胞，以及產(chǎn)生希望得到的多肽的，多肽的制造方法。
[0093]如在后述的實施例中詳細地說明，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)CHO細胞與產(chǎn)生抗體的能相關(guān)而表達量升高的mRNA型非編碼RNA，鑒定為小鼠基因組中的437堿基(圖UGenBank登錄ID:AI462015、SEQ ID N0:1)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在AI462015的序列及小鼠基因組上的位置示于圖1。AI462015的序列在小鼠基因組中NfkBia (核因子κ B抑制物a )mRNA3’側(cè)的非翻譯區(qū)域近傍的互補鏈上存在。(注釋:由其后的GeneBank的信息更新明晰，作為AI462015的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的437堿基相當于小鼠NfkBia mRNA3’側(cè)非翻譯區(qū)域(513堿基)的互補鏈。(圖23))
[0094]再者，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過將有AI462015來源的一部分的序列的核酸分子導入宿主細胞表達，可增加希望得到 的多肽的生產(chǎn)量。
[0095]本發(fā)明人推定，這些的核酸分子通過控制培養(yǎng)細胞內(nèi)的NfkBia的表達，增強Nf-κΒ的活性，由此升高重組多肽產(chǎn)生能力。具體而言推定，活性增強的NF-κ B遷移到核內(nèi)，亢進免疫、炎癥、抗凋亡關(guān)聯(lián)基因(Bcl-2，Bcl-XL，IAPs (凋亡蛋白抑制物)等)的表達，恭獻于細胞的增殖或生存率維持等。
[0096]從而本發(fā)明人將有通過在培養(yǎng)細胞內(nèi)表達，或通過表達量增加，控制培養(yǎng)細胞內(nèi)的NfkBia的表達，由此增強Nf- κ B的活性，升高重組抗體等的希望得到的重組多肽的產(chǎn)生能力的功能，優(yōu)選不編碼蛋白質(zhì)的，RNA或DNA或它們的序列總稱而命名為APES (抗體產(chǎn)生增強序列)(根據(jù)情況，也稱為PPES (多肽產(chǎn)生增強序列))。
[0097]上述的ΑΙ462015來源的序列或其一部分的序列被認為是，不僅在小鼠、倉鼠等的嚙齒類，在人中也保守，在其他哺乳動物或魚類、昆蟲等的動物中保守性高的序列。從而，對應(yīng)于ΑΙ462015來源的序列或其一部分的序列的各種動物細胞的來源的NfkBia mRNA3’側(cè)非翻譯區(qū)域的部分序列或其互補序列也可作為本發(fā)明的APES的序列使用。
[0098]在一實施方式中，APES在序列之一部分含Nfkbia互補序列，或者是Nfkbia互補序列，由此在表達APES的細胞中Nfkbia表達被抑制，所以此抑制效果促進抗體等的高產(chǎn)生功能。
[0099]在一實施方式中，APES是對NfkBia mRNA進行RNA干涉的核酸分子，有在細胞內(nèi)與NfkBia的mRNA結(jié)合而負控制表達的功能，通過在細胞內(nèi)其表達量增加，抑制NfkBia的功能表達而增加抗體基因表達量、進一步高產(chǎn)生抗體等的重組多肽。
[0100]從而，APES可為含可通過堿基對形成結(jié)合于NfkBia的基因DNA或mRNA的序列的，作為雙鏈RNA (dsRNA)、或者短的dsRNA的siRNA、或者解離為單鏈的siRNA、或者shRNA、反義 DNA 或 RNA、microRNA (miRNA)或 mRNA 型非編碼 RNA。[0101]例如，作為APES的序列可為由含與作為靶標的NfkBia mRNA互補的一部分序列的序列組成的寡核苷酸。作為那樣的寡核苷酸的例，可舉出相當于NfkBia mRNA互補鏈的19~25堿基的序列、或者具有與所述序列除一堿基外相同序列，并且有抑制NfkBia的表達的效果的miRNA?；蛘撸珹PES是長鏈的mRNA型非編碼RNA也可，例如可為由含可通過堿基對形成結(jié)合于NfkBia的基因DNA或mRNA的序列的至長度561核苷酸長(561mer)或500核苷酸長(500mer)的序列組成，并且有抑制NfkBia的表達的效果。或者，APES是更長鏈(數(shù)百~數(shù)十萬核苷酸)的mRNA型非編碼RNA也可。例如，APES可為200-10萬核苷酸長、或者,300~30萬核苷酸長的核酸分子或序列。
[0102]可通過堿基對形成結(jié)合的序列是指，不限于完全地對合(B卩100%互補的)，在不對功能造成障礙的范圍內(nèi)也容許不對合堿基的存在。或者，根據(jù)APES的形態(tài)，部分互補性或許優(yōu)選的。從而，例如，與含NfkBia的非翻譯區(qū)域的基因DNA或mRNA至少70%、更優(yōu)選為80%、再優(yōu)選為90%、最優(yōu)選是95%相同的序列或其互補序列也包括在“可通過堿基對形成結(jié)合的序列”內(nèi)。例如，在對于561mer或500mer的mRNA型非編碼RNA至少90%相同的序列包含是含由堿基的插入、缺失、或者點突變的I~50個(或者561mer的情況是I~56個)的錯配堿基的變異序列，伴隨在其宿主細胞中的表達，抗體等的重組多肽的產(chǎn)生能力增大，或者，有抑制NfkBia的表達的功能。從而，例如有如70%以上的相同性一樣的，某程度的序列相似性，與宿主細胞不同的生物種來源的NfkBia直系同原物(異種間相同基因)來源的序列也能作為APES利用。
[0103]或者，可通過堿基對形成結(jié)合的序列包含可在如細胞內(nèi)一樣的條件下與NfkBia的mRNA結(jié)合的序列。那樣的序列含，例如，在作為高度嚴格的條件而本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的條件下雜交，并且有希望得到的功能的序列。高度嚴格的條件之一例是，將多核苷酸和其他多核苷酸在含6XSSPE或SSC、50%甲酰胺、5XDenhardt試劑、0.5%SDS、100 μ g/ml的片段化的變性鮭魚精子DNA的雜交緩沖液中，于42°C的雜交溫度溫育12~16小時(其中一方的多核苷酸附著于如膜一樣的固體表面也可)，繼而，使用含I X SSC、0.5%SDS的清洗緩沖液于42°C以上的最適溫度清洗數(shù)次。對于其他具體性的條件，可參照Sambrook等“MolecularCloning:A Laboratory Manual 第 3 版” Co Id Spring Harbor Laboratory Pr ,Ausubel等“分子生物學實驗流程”丸善等多數(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的實驗手冊。
[0104]有作為APES的活性的新穎的核酸分子或有與其互補的序列的核酸分子是本發(fā)明的重要的特征。
[0105]在一實施方式中，APES是有NfkBia的表達抑制或重組多肽的產(chǎn)生增大功能的核酸分子，是可通過堿基對形成結(jié)合于人、小鼠、大鼠或倉鼠來源的NfkBia的基因的DNA或mRNA的RNA或DNA。認為那樣的核酸分子含與編碼NfkBia的mRNA相同或互補的序列，可結(jié)合于NfkBia基因或mRNA抑制其表達。
[0106]在一實施方式中，APES是，含與NfkBia的mRNA之一部分互補的序列的19~25堿基長的低分子RNA、或者具有與所述序列除一喊基外相同的序列，有NfkBia的表達抑制或重組多肽的產(chǎn)生增大功能的低分子RNA。其中，低分子RNA是指小非編碼RNA (snRNA)，在snRNA 中包括 miRNA。
[0107]在一實施方式中，APES是含與NfkBia的mRNA之一部分互補的序列(例如，上述的低分子非編碼RNA序列)的至561堿基長，或者至500堿基長的mRNA型非編碼RNA。[0108]在一實施方式中，APES是含與NfkBia的mRNA之一部分互補的序列(例如，上述的低分子非編碼RNA序列)的，561-1579堿基長、或者500-1000堿基長的mRNA型非編碼RNA。
[0109]在CHO細胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的，APES之一的具體例有在小鼠AI462015來源之一部分的序列、或者那樣的部分序列中I-數(shù)個的堿基被取代、缺損或附加的序列。特別是，可舉出含由5’側(cè)第4的G-第168的C的堿基序列組成的165堿基的DNA序列(SEQ IDNO: 2、APES165)、或者其互補(反義)DNA序列或由這些的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA序列的序列、或者此序列中之任意的長度的部分序列?；蛘?，可舉出含由5’側(cè)第4的G-3’末端的T的堿基序列組成的434堿基的DNA序列(SEQ ID NO: 3、APES434)、或者其互補(反義)DNA序列或由這些的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA序列的序列、或者來源于此序列的任意的長度的部分序列。在含對應(yīng)于小鼠AI462015的序列的人、倉鼠、大鼠等的哺乳類來源的序列的序列或它們的部分序列、或者那樣的部分序列中含I-數(shù)個的堿基被取代、缺損或附加的堿基序列。
[0110]在一實施方式中，APES有AI462015中的5’側(cè)第4-第133堿基序列(SEQ IDN0:4、APES130)或此序列來源之一部分的序列。例如，可舉出5’側(cè)第4-第68 (SEQ IDN0:5、APES4-68)、或者第 69 -第 133 (SEQ ID NO:6、APES69_133)的 DNA 序列或其互補 DNA序列或從這些的DNA轉(zhuǎn)錄的序列。
[0111]在一實施方式中，APES有AI462015中的5’側(cè)第40-第9152堿基(SEQ ID N0:7)的序列、或者該52堿基在任意的位置被切斷之一部分序列來源的序列。例如，可舉出前半部分(APES40-68的29堿基、或者APES40-63的24堿基、或者APES40-61的22堿基)或后半部分(APES69-91的23堿基)的DNA序列或其互補DNA序列(各自相當于SEQ ID NO:8-
11)或從這些的DNA轉(zhuǎn)錄的序列。
[0112]上述的52堿基是除一堿基外與大鼠NfkBia基因的3’側(cè)非翻譯區(qū)域的互補鏈相同的序列。另外，其5’側(cè)的24``堿基(APES40-63、SEQ ID N0:9)是與人NfkBia基因的3’側(cè)非翻譯區(qū)域相同的序列。另外，5’側(cè)的22堿基(APES40-61、SEQ ID N0:10:AAGTACCAAAATAATTACCAAC)是與跨大鼠、恒河猴、狗、馬等種的NfkBia mRNA的3’側(cè)非翻譯區(qū)域的互補鏈相同的序列。將與NfkBia基因的3’側(cè)非翻譯區(qū)域互補的一部分的序列在宿主細胞中表達而期待RNAi效果。例如，有與上述52堿基中的19-25堿基互補的序列的RNA有通過作為microRNA (miRNA)作用于NfkBia的mRNA的非翻譯區(qū)域，翻譯被抑制的可能性。
[0113]或者，APES有AI462015中的5’側(cè)第7-第9185堿基(SEQ ID N0:29)的序列、或者該85堿基在任意的位置被切斷之一部分序列來源的序列。有與上述85堿基中的19-25喊基互補的序列的RNA有通過作為microRNA (miRNA)作用于NfkBia的mRNA的非翻譯區(qū)域，翻譯被抑制的可能性。
[0114]在一實施方式中，APES有用21堿基的siRNA檢索發(fā)現(xiàn)的序列。例如是含與AI462015 中的第 84 -第 104CSEQ ID NO: 12、APES84_104)、第 99 -第 119CSEQ ID NO: 13、APES99-119)、第 101 -第 121CSEQ ID NO: 14、APES101_121)的DNA序列互補的序列的miRNA序列。在基因芯片上定量上述的APES69-133中的第71-第112序列(SEQ ID NO: 16)，其實際上是高表達的區(qū)域，所以認為APES84-104作為miRNA發(fā)揮功能的可能性高。
[0115]另外，基于APES的結(jié)構(gòu)的或功能性特征，能新化學合成或從生物源單離有作為APES的活性的核酸分子。APES的結(jié)構(gòu)的特征是含與作為靶標的NfkBia mRNA之一部分互補的序列的核酸分子。核酸分子的形態(tài)是何形態(tài)均可，是DNA、DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、mRNA、cDNA，或是外來體RNA，或是化學合成單鏈RNA，或是化學合成雙鏈RNA等均可。功能的特征是，伴隨在其宿主細胞中的表達，抗體等的重組多肽的產(chǎn)生能力增大，或者，NfkBia的表達被抑制。
[0116]在從生物源單離APES時，何生物來源均可，不特別限定。具體而言，可舉出人、黑猩猩等的靈長類、小鼠、大鼠、倉鼠等的嚙齒類、牛、豬、山羊、等的家畜類、雞等的鳥類、斑馬魚等的魚類、蒼蠅等的昆蟲類、線蟲類等的動物來源的APES，優(yōu)選人、嚙齒類或與宿主細胞相同的種來源的APES，例如，在使強表達APES細胞是中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)時，人、小鼠或倉鼠來源的APES是優(yōu)選的。
[0117]這樣的核酸分子可由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。例如，由高產(chǎn)生抗體等的重組多肽的培養(yǎng)細胞制備全RNA，基于本發(fā)明的核酸序列(例如，SEQ ID NO: 2的APES165)合成寡核苷酸，將其作為引物使用進行PCR反應(yīng)，通過擴增有作為APES的特征的cDNA制備即可。另外，由高產(chǎn)生抗體等的重組多肽的培養(yǎng)細胞制備低分子RNA后，制備cDNA庫，基于克隆的cDNA的堿基序列，可得到含與NfkBia mRNA互補的部分序列的低分子RNA。cDNA庫也能在制備 microRNA (miRNA)等的低分子 RNA 后，由例如 Sambrook, J.et al.,MolecularCloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)所述的方法構(gòu)建。
[0118]另外，通過確定得到的cDNA的堿基序列，通過將得到的cDNA作為探針篩選基因組DNA庫，可單離APES表達的基因組DNA。
[0119]具體而言，如以下一樣即可。首先，從有表達本發(fā)明的APES的可能性的細胞、組織等，單離全RNA。mRNA的單離由公知的方法、例如,胍超離心法(Chirgwin, J.M.et al.,Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)、AGPC 法(Chomczynski, P.及 Sacchi, N.，Anal.Biochem.(1987) 162，156-159)等制備全 RNA 之后，使用 RNe asy Mini Kit (QIAGEN)等再純化全RNA。
[0120]從得到的全RNA使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。cDNA的合成也可使用SuperScript?II逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)等進行。另外,使用引物等,根據(jù)使用5' -Ampli FINDER RACEKit (Clontech 制)及聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction ;PCR)的 5' -RACE 法(Frohman, M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(1988) 85, 8998-9002 ；Belyavsky,A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989) 17，2919-2932)，可進行 cDNA 的合成及擴增。
[0121]從得到的PCR產(chǎn)物制備作為目的的DNA片段，與載體DNA連結(jié)。再者，由此制備重組載體，導入到大腸桿菌等而選擇集落制備希望得到的重組載體。作為目的的DNA的堿基序列可由公知的方法、例如，二脫氧核苷酸鏈終止法確認。
[0122]另外，得到的DNA可由市售的試劑盒或公知的方法改變。作為改變，可舉出例如，由定點誘變法的一堿基變異導入等。如此改變的序列，只要是有APES活性，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0123]在本說明書中，“有APES活性的”是指，通過抑制培養(yǎng)的宿主細胞內(nèi)的NfkBia的表達，活化Nf- κ B,由此有升高重組多肽產(chǎn)生能力的作用。另外，一般而言是指，通過在細胞內(nèi)表達有抑制NfkBia的表達的功能。
[0124]在本說明書中，有APES活性的核酸分子有時稱為本發(fā)明的核酸分子。
[0125](2) APES 的表達[0126]在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，通過使用表達APES的細胞、優(yōu)選為APES強表達的細胞，增加由所述細胞的多肽的產(chǎn)生量。
[0127]強表達APES是指，由載體等將APES人為地導入細胞的細胞、或者相比抗體基因?qū)肭暗脑镜募毎鳤PES的表達量增加。原本的細胞不特別限定，可舉出例如制造CHO細胞等重組蛋白質(zhì)之時作為宿主使用的細胞。作為具體例，根據(jù)后述的實施例說明，在使用AFFYMETRIX公司的寡核苷酸陣列(Affymetrix M0USE430_2)的基因芯片實驗中，抗體基因?qū)肭暗脑镜募毎茿I462015的信號值是2000以下的，與此比較APES的表達量增加是指，例如，AI462015的信號值到2倍以上。
[0128]強表達APES的細胞是在細胞內(nèi)含內(nèi)源性或外來的APES。作為強表達APES的細胞，可舉出例如，人為地導入APES的細胞。
[0129]人為地導入APES的細胞由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備是可能的，例如，通過將編碼APES的DNA序列整合入載體，將該載體轉(zhuǎn)化進細胞來制備是可能的。
[0130]再者，在本說明書中，由基因活化技術(shù)(參照例如，國際公開第W094/12650號單行本)內(nèi)源性APES被活化，結(jié)果，APES強表達的細胞也包括人為地導入APES的細胞。
[0131]內(nèi)源性APES的典型例是作為在宿主細胞的基因組上編碼的DNA序列的APES。另外，在本發(fā)明中也能利用，不由基因活化技術(shù)，抗體基因?qū)牒笠蚝畏N要因而內(nèi)源性APES的轉(zhuǎn)錄活化，強表達的細胞。
[0132]插入編碼APES的DNA序列的載體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的載體對于在宿主細胞內(nèi)或細胞外的本發(fā)明的核酸分子的保持，或表達本發(fā)明的核酸分子有用。另外，對于在宿主細胞中強表達APES有用。通過在宿主細胞中強表達APES，可增加由宿主細胞的希望得到的多肽的生產(chǎn)量。
[0133]作為載體，例如在 將大腸桿菌作為宿主時，為了將載體在大腸桿菌(例如，JM109、DH5a、HBlOU XLlBlue)等大量地擴增而大量制備，具有用于用大腸桿菌擴增的“ori”，再有轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的挑選基因(例如，可由任何的藥劑(氨芐西林或四環(huán)素、卡那霉素、氯霉素)判別的藥劑抗性基因)是優(yōu)選的。作為載體的例，可舉出M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，以cDNA的亞克隆、切出作為目的時，上述載體之外，可舉出例如，pGEM-T、pDIRECT、pT7 等。
[0134](3)表達載體
[0135]在本發(fā)明中，在以APES的強表達、及/或，生產(chǎn)多肽的目的使用載體時，特別是，表達載體是有用的。作為能在本發(fā)明中使用的表達載體，可舉出例如，哺乳動物來源的表達載體(例如，pcDNA3 (Invitrogen 公司制)或，pEGF-BOS (Nucleic Acids.Res.1990,18(17)，p5322)、pEF、pCDM8)、昆蟲細胞來源的表達載體(例如“Bac-to_BAC表達桿狀病毒的系統(tǒng)統(tǒng)”(GIBCO BRL公司制)、pBacPAK8)、植物來源的表達載體(例如pMHl、pMH2)、動物病毒來源的表達載體(例如，pHSV、pMV、pAdexLcw)、逆病毒來源的表達載體(例如，pZIpneo)、酵母來源的表達載體(例如，“Pichia Expression Kit”(Invitrogen公司制)、pNVll、SP-QOl)、枯草芽孢桿菌來源的表達載體(例如，pPL608、pKTH50)等。
[0136]用于表達外來的多肽的表達載體含能推進編碼該多肽的DNA及所述DNA的表達的表達控制序列。同樣地，用于表達APES的表達載體含能推進編碼APES的DNA及所述DNA的表達的表達控制序列。單一的載體構(gòu)建成表達多肽及APES的兩方也可。使用基因活化技術(shù)，例如將作為宿主基因組之一部分的APES或多肽基因活化時，導入有促進那樣的宿主細胞來源的DNA的表達的表達控制序列也可。
[0137]作為表達控制序列的例，有含適當?shù)膯幼?、增強子、轉(zhuǎn)錄終止子、編碼蛋白質(zhì)的基因中的起始密碼子(即ATG)的Kozak序列、用于內(nèi)含子的剪接信號、聚乙酰化部位、及終止密碼子等，載體的構(gòu)建可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適宜進行。
[0138]表達控制序列含能在使用的動物細胞中增大基因的轉(zhuǎn)錄量的啟動子/增強子區(qū)域是優(yōu)選的。與編碼希望得到的多肽的基因的表達相關(guān)的啟動子/增強子區(qū)域含NF-κ B結(jié)合序列也可。
[0139]在將CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等的在哺乳動物細胞的表達作為目的時，具有用于在細胞內(nèi)表達而言必要的啟動子、例如SV40啟動子(Mulligan等，Nature (1979)277，108)、MMLV-LTR 啟動子、EFl α 啟動子(Mizushima 等，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)、CMV啟動子等是優(yōu)選的。另外，有用于挑選向細胞的轉(zhuǎn)化的基因(例如，可由藥劑(新霉素、G418等)判別的藥劑抗性基因)是再優(yōu)選的。作為有這樣的特性的載體，可舉出例如，pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、p0P13 等。
[0140]再者，在以穩(wěn)定地表達基因，并且，在細胞內(nèi)的基因的拷貝數(shù)的擴增作為目的時，可舉出向缺損核酸合成途徑的CHO細胞導入有與其互補的DHFR基因的載體(例如，pCHOI等)，由甲氨蝶呤(MTX)擴增的方法，另外，在以基因的臨時的表達作為目的時，可舉出使用在染色體上具有表達SV40T抗原的基因的COS細胞用具有SV40的復(fù)制起點的載體(pcD等)轉(zhuǎn)化的方法。作為復(fù)制起始點，另外，使用多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的來源的也可。再者，為了在宿主細胞株中基因拷貝數(shù)擴增，表達載體，作為選擇標志物，可含氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸腺嘧啶激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等。
[0141](4)宿主細胞`
[0142]在本發(fā)明中使用的細胞是可產(chǎn)生希望得到的多肽的天然的細胞也可，是導入編碼希望得到的多肽的DNA的細胞也可，導入編碼希望得到的多肽的DNA的轉(zhuǎn)化細胞是優(yōu)選的。
[0143]導入編碼希望得到的多肽的DNA的轉(zhuǎn)化細胞之一例是，轉(zhuǎn)染有含至少編碼希望得到的多肽的DNA的表達載體，再強表達內(nèi)源性或外來的APES的宿主細胞。
[0144]再者，在本發(fā)明中，導入“DNA (或者基因)的”細胞包含轉(zhuǎn)染了外來性DNA的細胞之外、由基因活化技術(shù)(參照例如，國際公開第W094/12650號單行本)活化內(nèi)源性DNA，結(jié)果，對應(yīng)于所述DNA的蛋白質(zhì)的表達或所述DNA的轉(zhuǎn)錄開始或增加的細胞。
[0145]使用人為地導入APES的細胞制造希望得到的多肽時，APES和編碼希望得到的多肽的基因的導入的順序不特別限制，導入APES之后，導入編碼希望得到的多肽的基因也可，導入編碼希望得到的多肽的基因之后，導入APES也可。又、同時導入APES和編碼希望得到的多肽的基因也可。
[0146]使用載體時，APES及編碼希望得到的多肽的基因的導入由單一的載體同時導入也可，使用多個載體分別導入也可。
[0147]在本發(fā)明中使用的細胞不特別限定，是動物細胞、植物細胞、酵母等的真核細胞、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等的原核細胞等何的細胞也可，優(yōu)選為，昆蟲、魚、兩生類、爬蟲類、哺乳類來源的動物細胞，特別是哺乳動物細胞是優(yōu)選的。作為哺乳動物細胞的來源，可舉出人、黑猩猩等的靈長類、小鼠、大鼠、倉鼠等的嚙齒類、另外，人、嚙齒類是優(yōu)選的。再者，作為本發(fā)明的細胞，通常多肽的表達中常使用的，CHO細胞、COS細胞、3T3細胞、骨髓瘤細胞、BHK細胞、HeLa細胞、Vero細胞等的哺乳動物培養(yǎng)細胞是優(yōu)選的。在將希望得到的多肽的大量表達作為目的時，CHO細胞是特別優(yōu)選的。作為CHO細胞，特別是，可適宜地使用作為缺損DHFR 基因的 CHO 細胞的 dhfr-CHO (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1980) 77, 4216-4220)或CHO K-1 (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1968) 60,1275)。
[0148]作為上述的CHO細胞，特別是DG44株、DXB-1l株、K_l、CHO-S是優(yōu)選的，特別是DG44株及DXB-1l株是優(yōu)選的。
[0149]本發(fā)明的宿主細胞可作為例如，用于希望得到的多肽的制造或表達的產(chǎn)生系統(tǒng)使用。向強表達APES的宿主細胞導入編碼希望得到的多肽的DNA，則可高生產(chǎn)希望得到的多肽。在本發(fā)明的宿主細胞中再導入編碼牛磺酸轉(zhuǎn)運蛋白(TauT)或陰離子交換劑(AEl)的DNA (整合進載體也可)也可。在本發(fā)明的宿主細胞中再導入編碼半胱氨酸亞橫酸脫羧酶(Cystein Sulfinic Acid Decarboxylase:CSAD)或丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(Alanine Transferase:ALTl)的 DNA 也可。詳細參照，TO2007/119774、TO2008/114673、W02009/020144 以及 W02009/054433。
[0150]向宿主細胞導入外來性DNA (整合進載體也可)，能用例如，磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、使用陽離子核糖體DOTAP (Boehringer Mannheim公司制)的方法、電穿孔法、Nucleofection法(amaxa公司)、脂轉(zhuǎn)染等的方法進行。
[0151](5)希望得到的多肽
[0152]用本發(fā)明的方法 產(chǎn)生的多肽不特別限定，可為抗體(例如，抗IL-6受體抗體、抗IL-6抗體、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗體、抗⑶3抗體、抗⑶20抗體、抗GPIIb/IIIa抗體、抗TNF抗體、抗CD25抗體、抗EGFR抗體、抗Her2/neu抗體、抗RSV抗體、抗CD33抗體、抗⑶52抗體、抗IgE抗體、抗⑶IIa抗體、抗VEGF抗體、抗VLA4抗體等)或生理活性蛋白質(zhì)(粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細胞生成素、干擾素、IL-1或IL-6等的白細胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子、PTH等)等任何的多肽，特別優(yōu)選為抗體。抗體是天然抗體、Fab、scFv、sc (Fv) 2等的低分子化抗體、嵌合抗體、人源化抗體等的任何的抗體也可。
[0153](6)多肽的制造
[0154]通過培養(yǎng)上述的宿主細胞，產(chǎn)生希望得到的多肽，收集該多肽，可得到多肽。
[0155]在細胞的培養(yǎng)中，可使用通常的細胞(優(yōu)選為，動物細胞)培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基。在這些中通常、含氨基酸、維生素類、脂質(zhì)因子、能源、滲透壓調(diào)節(jié)劑、鐵源、pH緩沖劑。這些成分的含量是，通常、氨基酸是0.05-1500mg/L、維生素類是0.001-10mg/L、脂質(zhì)因子是0-200mg/L、能源是 l_20g/L、滲透壓調(diào)節(jié)劑是 0.l-10000mg/L、鐵源是 0.l_500mg/L、pH 緩沖劑是l-10000mg/L、微量金屬元素是0.00001_200mg/L、表面活性劑是0_5000mg/L、增殖輔助因子是0.05-10000 μ g/L及核苷是0.001-50mg/L的范圍是適當?shù)模幌抻谶@些，可由培養(yǎng)的細胞的種類、希望得到的多肽的種類等適宜決定。
[0156]除上述成分之外，添加例如，微量金屬元素、表面活性劑、增殖輔助因子、核苷等也可。
[0157]具體而言，可例示含例如，L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸等、優(yōu)選為L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸等的氨基酸類；i_肌醇、生物素、葉酸、硫辛酸、煙酰胺、煙酸、P-氨基安息香酸、泛酸鈣、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆素、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12、抗壞血酸等、優(yōu)選為生物素、葉酸、硫辛酸、煙酸酰胺、泛酸鈣、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12、抗壞血酸等的維生素類；氯化膽堿、酒石酸膽堿、亞油酸、油酸、膽留醇等、優(yōu)選為氯化膽堿等的脂質(zhì)因子；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等、優(yōu)選為葡萄糖等的能源；氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀等、優(yōu)選為氯化鈉等的滲透壓調(diào)節(jié)劑；EDTA鐵、檸檬酸鐵、氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硝酸鐵等、優(yōu)選為氯化鐵、EDTA鐵、檸檬酸鐵等的鐵源類；碳酸氫鈉、氯化鈣、磷酸二氫鈉、HEPES、MOPS等、優(yōu)選為碳酸氫鈉等的PH緩沖劑的培養(yǎng)基。
[0158]除上述成分之外，添加例如，硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鎳、氯化錫、氯化鎂、亞硅酸鈉等、優(yōu)選為硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鎂等的微量金屬元素；吐溫80、普流尼克F68等的表面活性劑；及重組型胰島素、重組型IGF-1、重組型EGF、重組型FGF、重組型TOGF、重組型TGF-α、鹽酸乙醇胺、亞硒酸鈉、視黃酸、鹽酸腐胺等、優(yōu)選為亞硒酸鈉、鹽酸乙醇胺、重組型IGF-1、鹽酸腐胺等的增殖輔助因子；脫氧腺苷、脫氧胞苷、脫氧鳥苷、腺苷、胞苷、鳥苷、尿苷等的核苷等也可。再有，在上述培養(yǎng)基的適宜例中，含鏈霉素、青霉素G鉀及慶大霉素等的抗生物質(zhì)或，酚紅等的PH指示劑也可。
[0159]培養(yǎng)基的pH根據(jù)培養(yǎng)的細胞不同，但一般而言pH6.8-7.6、多種情況pH7.0-
7.4是適當?shù)摹?br> [0160]培養(yǎng)基也可使用市售的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基、例如，D-MEM (Dulbeccc/ s改良的 Eagle 培養(yǎng)基)、D-MEM/F-121:1Mixture (Dulbecco ' s 改良的 Eagle 培養(yǎng)基:營養(yǎng)混合物 F-12)、RPMI1640 , CHO-S-SFM II (Invitrogen 公司)、CHO-SF (Sigma-Aldrich 公司)、EX_CELL301 (JRH biosciences 公司)、CD_CH0 (Invitrogen 公司)、IS CHO-V (IrvineScientific 公司)、PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich 公司)等的培養(yǎng)基。
[0161]而且，培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基也可。
[0162]宿主細胞是CHO細胞時，CHO細胞的培養(yǎng)可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行。例如，通常、能在氣相的CO2濃度是0-40%、優(yōu)選為，2-10%的氣氛下、30-39°C、優(yōu)選為37°C左
右培養(yǎng)。
[0163]為了產(chǎn)生希望得到的多肽而適當?shù)呐囵B(yǎng)期間通常是I天-3個月，優(yōu)選為I天-2個月、再優(yōu)選為I天-I個月。
[0164]另外，作為動物細胞培養(yǎng)用的各種的培養(yǎng)裝置，可使用例如發(fā)酵槽型箱培養(yǎng)裝置、氣升式型培養(yǎng)裝置、培養(yǎng)瓶型培養(yǎng)裝置、旋轉(zhuǎn)瓶型培養(yǎng)裝置、微載體型培養(yǎng)裝置、流動層型培養(yǎng)裝置、空心纖維型培養(yǎng)裝置、滾瓶型培養(yǎng)裝置、填充槽型培養(yǎng)裝置等進行培養(yǎng)。
[0165]培養(yǎng)可使用分批培養(yǎng)(batch culture)、流加培養(yǎng)(fed-batch culture)、連續(xù)培養(yǎng)(continuous culture)等之任一項的方法,流加培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)是優(yōu)選的，流加培養(yǎng)是更優(yōu)選的。[0166]產(chǎn)生的多肽可從宿主細胞內(nèi)或細胞外(培養(yǎng)基等)單離，純化為實質(zhì)上純粹且均一的多肽。多肽的分離、純化使用通常的多肽的純化中使用的分離、純化方法即可，無任何限定。例如，適宜選擇層析柱、濾器、超濾、鹽析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯酸類樹脂酰胺凝膠電泳、等電點電泳法、透析、再結(jié)晶等、組合則可分離、純化多肽。
[0167]作為層析，可舉出例如親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification 及 Characterization:A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al., Cold Spring HarborLaboratory Press, 1996)。這些的層析可使用液相層析、例如HPLC、FPLC等的液相層析進行。本發(fā)明也包含使用這些的純化方法，高度純化的多肽。
[0168]再有，通過將多肽純化前或純化后，向其作用適當?shù)亩嚯男揎椕?，加任意地修飾，或部分除去肽也可。作為多肽修飾酶，使用例如，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、賴氨酰端肽酶、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等?br> [0169](7)藥品
[0170]在由本發(fā)明的方法制造的多肽有作為醫(yī)藥利用可能的生物學活性時，通過將此多肽與藥學容許的載體或添加劑混合而制劑化，可制造藥品。
[0171]作為藥學容許的載體及添加劑的例，可舉出水、藥學容許的有機溶劑、膠原、聚乙烯基醇、聚乙烯基吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊月旨、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂基醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、作為醫(yī)藥添加物容許的表面活性劑等。
[0172]實際的添加物根據(jù)本發(fā)明治療劑的劑型從上述之中單獨或適宜組合選擇，當然不限于這些。例如，作為注射用制劑`使用時，可使用將純化的多肽溶解于溶劑、例如生理鹽水、緩沖液、葡萄糖溶液等，向其加吸附防止劑、例如吐溫80、吐溫20、明膠、人血清白蛋白等的?；蛘撸瑸榱俗鳛槭褂们叭芙庠贅?gòu)成的劑形而冷凍干燥的也可，作為用于冷凍干燥的賦形劑，可使用例如，甘露糖醇、葡萄糖等的糖醇或糖類。
[0173]多肽的有效施用量根據(jù)多肽的種類、作為治療或預(yù)防的對象的疾病的種類、患者的年齡、疾病的重度度等適宜選擇。例如，多肽是抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體的時，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗體的有效施用量是，第一次可選每Ikg體重0.0Olmg-IOOOmg的范圍?；蛘撸蛇x每患者當0.01-IOOOOOmg/身體的施用量。但是,不限于這些施用量。
[0174]多肽的施用方法可為經(jīng)口、非經(jīng)口施用之任何，優(yōu)選為非經(jīng)口施用，具體而言，可舉出注射(例如，由靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等的全身或局部施用)、經(jīng)鼻施用、經(jīng)肺施用、經(jīng)皮施用等。
[0175](8) NfkBia的表達的抑制
[0176]根據(jù)本發(fā)明，在培養(yǎng)導入編碼希望得到的多肽的DNA的動物細胞制造所述多肽的方法中，通過降低宿主細胞中核因子κ B抑制物a (NfkBia)的表達量，可增加所述希望得到的多肽的產(chǎn)生量。NfkBia基因是必須基因，抑制完全地表達，則至細胞死。從而，適度抑制所述NfkBia基因的表達在本發(fā)明的方法中被認為重要。
[0177]從而，在培養(yǎng)導入編碼希望得到的多肽的DNA的動物細胞制造所述多肽的方法中包括將所述細胞的NfkBia的表達量相比抗體基因?qū)肭暗挠H本細胞的表達量更降低的步驟，多肽的制造方法包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0178]作為降低NfkBia的表達的方法，由從NfkBia基因的轉(zhuǎn)錄的抑制、mRNA的分解、從mRNA的翻譯的抑制、或者翻譯產(chǎn)物的功能(結(jié)合)抑制,抑制NfkBia的表達是可能的。相比如此不實施降低NfkBia的表達的方法的情況，通過使NfkBia的表達量成為70%以下，優(yōu)選為60%以下，再優(yōu)選為50%以下，希望得到的多肽的產(chǎn)生量增大。換言之，作為對于不使細胞死必要的NfkBia基因的表達量，例如，20%以上、優(yōu)選為30%以上的表達量是必要的。
[0179]作為抑制NfkBia的表達的具體手段，考慮利用反義寡核苷酸、核酶、或者dsRNA、SiRNA、ShRNA、miRNA等的引起RNA干涉(RNAi)的核酸分子。另外，也能利用被稱為大基因間(或插入)長非編碼RNA (IincRNAsM^] mRNA型的非編碼RNA、其其他mRNA型非編碼RNA、誘餌寡體、適體。這些的核酸分子含與編碼NfkBia的mRNA相同或互補的序列，可結(jié)合于NfkBia基因或mRNA抑制其表達。APES (或者PPES)是這樣的核酸分子。
[0180]為了抑制NfkBia的表達利用可能的核酸分子的例是含與NfkBia的mRNA之一部分互補的序列的19~25堿基長的低分子RNA、或者具有與所述序列除一堿基外相同序列，有NfkBia的表達抑制功能的低分子RNA。
[0181]通過將抑制這樣的NfkBia的表達的低分子RNA在宿主細胞中表達，可降低核因子κ B抑制物a (NfkBia)的表達量。作為用于將抑制NfkBia的表達的低分子RNA在宿主細胞中表達的典型方法，可將含編碼那樣的低分子RNA的DNA的載體導入細胞而實施。
[0182]另外，通過將使對NfkBia mRNA或其部分序列的正義RNA和反義RNA互相結(jié)合而形成的dsRNA導入細胞內(nèi)，能抑制NfkBia的表達。
[0183]測定NfkBia表達量時，不得不確定能用成為對象的細胞表達的NfkBia mRNA的TaqMan法定量的序列。例如，本檢查中使用的NfkBia部分序列(SEQ ID NO: 19,28)TaqMan探針組(SEQ ID NO: 20_22)可示于圖12，此TaqMan探針的設(shè)計可由引物表達Caeffi
軟件(Applied Biosystems)等進行。上述的 NfkBia 部分序列(SEQ ID NO: 28)在 CHOKl細胞中也被確認為NF- κ -B抑制物α -樣序列，與我們的PCR克隆序列一致。其中終始密碼子TGA (907-909)的64堿基上游~132堿基上游的區(qū)域的表達定量是可能的。
[0184]作為典型測定機器，有Applied Biosystems (ABI)公司制的 7900HISequenceDetection System等，由于全部的試劑盒及試劑是購入可能的,可根據(jù)ABI公司推薦的流
不王疋里。
[0185]【實施例】
[0186]以下，根據(jù)實施例具體說明本發(fā)明。再有，這些的實施例僅于說明本發(fā)明，不限定本發(fā)明的范圍。
[0187]〔實施例1〕各種基因?qū)隒HO細胞的基因芯片解析實驗
[0188]基因芯片實驗使用AFFYMETRIX公司的寡核苷酸陣列(Affymetrix M0USE430_2)根據(jù)通常的順序。但是，倉鼠陣列由于未被商品化，使用小鼠基因組430 2.0陣列。由雜交條件的優(yōu)化，試驗3陣列上的小鼠基因16種的探針中，成用8種的探針得到Present Call,在與小鼠的堿基序列相同性為約90%以上的情況中，倉鼠轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達定量成為可能。
[0189]從強表達各種基因的細胞制備高純度總RNA之后，使用總RNA和含T7啟動子序列的寡 dT 引物(T7-(T)24)合成 cDNAo 接下來，由使用 Bio-llCTP,Bio-16UTP 和 MegascriptT7Kit (Ambion)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，從cDNA合成生物素標記cRNA。cRNA在柱純化后，將在電泳上確認相當于18s-28s rRNA的分子量的高品質(zhì)cRNA片段化，作為具有均一的尺寸的基因芯片樣品。至使用的基因芯片樣品加雜交樣品溶液而于_80°C冷凍保存。樣品溶液在使用前熱處理、離心、應(yīng)用于小鼠基因組4302.0陣列，旋轉(zhuǎn)著陣列在45°C的雜交專用烘箱中溫育16小時?；厥諛悠?、重復(fù)洗陣列而用鏈霉親和素R-藻紅蛋白染色后，掃描。
[0190]通過比較陣列上的轉(zhuǎn)錄物(約45，000)的基因芯片信號值，在IL罐流加培養(yǎng)第10天產(chǎn)生900mg/L以上的MAbl (抗IL-6R抗體；托珠單抗、商品名Actemra)的MAbl (抗IL-6R抗體)強表達TAUT強表達CSAD強表達DG44細胞的繼代培養(yǎng)細胞中，作為表達強度高并且表達上調(diào)顯著的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物鑒定小鼠基因組上的mRNA型非編碼RNA UG_GENE=AI462015(Affymetrix M0USE430_2,1420088_AT)(圖1:AI462015 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列)。
[0191]AI462015是437堿基的mRNA型非編碼RNA，其序列在小鼠基因組12的NfkBiamRNA3’側(cè)的非翻譯區(qū)域近傍(56590831-56590397)的互補鏈上存在?？紤]了 AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接作用于NfkBiamRNA的非翻譯區(qū)域而抑制翻譯的可能性、或者437堿基之一部分的序列作為低分子RNA發(fā)揮功能而分解NfkBia mRNA的可能性。
[0192]例如，含AI462015序列中的5’側(cè)第40A-第91A的52堿基的序列
[0193](AAGTACCAAAATAATTACCAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA:SEQ ID NO:7)與大鼠NfkBia mRNA3 ‘側(cè)的非翻譯區(qū)域(1478-1529，GENE ID:25493NfkBia)的互補鏈除一堿基(AI462015中的5’側(cè)第61A)外一致，還有含AI462015的第40A-第63A的24堿基的序列(AAGTACCAAAATAATTACCAACAA:SEQ ID NO: 9)也是人 NfkBia mRNA3 ‘側(cè)的非翻譯區(qū)域之一部分序列(TTGTTGGTAATTATTTTGGTACTT，1490-1513:SEQ ID NO:24)的互補鏈，所以預(yù)測作為52堿基之一部分的19-25堿基作為microRNA，或者一部分序列作為反義RNA作用于CHO細胞的NfkBia mRNA的可能性。
[0194]另外，根據(jù)更新信息(實施例8)，例如，含AI462015序列中的5’側(cè)第7T-第91A的85 堿基的序列(圖 23 和 24 之下線部、SEQ ID NO: 29) (TGTAAAAATCTGTTTAATAAATATACATCTTAGAAGTACCAAAATAATTAC CAACAAAATACAACATATACAACATTTACAAGAA)與大鼠 NfkBia mRNA3 ‘側(cè)的非翻譯區(qū)域(1478-1562，GENE ID:25493NfkBia、SEQ ID NO:31)的互補鏈除一堿基(AI462015中的5，側(cè)第70A)外一致(匹配=84/85、圖25b)、同樣地，在人(匹配=75/85、圖25a,SEQ ID NO: 30)、黑猩猩(匹配=75/85、圖 25c、SEQ ID NO: 32)、恒河猴(匹配=74/85、圖25d、SEQ ID N0:33)、牛(匹配=76/85、圖25e、SEQ ID NO:34)中也確認相同性。從而認為，作為此85堿基(保守序列7-91)之一部分的19-25堿基作為microRNA，或者一部分序列作為反義RNA跨種作用于動物細胞、或者哺乳動物細胞。從而預(yù)測，也作用于如動物培養(yǎng)細胞、優(yōu)選為CHO細胞一樣的哺乳動物細胞的NfkBia mRNA。
[0195]〔實施例2〕在高產(chǎn)生抗體的細胞中表達上調(diào)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的鑒定
[0196]在實施例1中，在高產(chǎn)生MAbl(抗IL-6R抗體；托珠單抗、商品名Actemra)的DG44細胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015的表達量上調(diào)(圖2)，在不同的宿主細胞(CHO-DXBlls)中高產(chǎn)生不同的抗體(MAb2:抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體；GC33 (參照W02006/006693))時也同樣地AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達上調(diào)(圖3)。
[0197]如圖2所示，在CH0-DG44細胞中強表達?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白(TauT)基因時，強表達半胱氨酸亞磺酸脫羧酶(CSAD)基因時(數(shù)據(jù)未顯示)、一同強表達TauT和CSAD時，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015的表達量均是同程度，在一同強表達TauT和CSAD的細胞中再強表達Mabl (抗IL-6受體抗體)時，見到AI462015的異常的上調(diào)(宿主細胞的7倍)，表達量也示異常高的基因芯片信號值(10，OOO以上)。對照的GAPDH表達強度在細胞間同水平，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015的表達上調(diào)特異于高產(chǎn)生Mabl抗體的細胞。圖3也同樣，在CHO-DXBlls細胞中強表達MAb2 (抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗體)基因時，AI462015序列的表達上調(diào)(TauT，CSAD，表達AEl強的細胞的平均值的13倍)特異于高產(chǎn)生MAb2抗體的細胞。
[0198]以上的結(jié)果示，在搖床繼代培養(yǎng)第3天穩(wěn)定增殖的高產(chǎn)生抗體的細胞異常高表達AI462015 序列。
[0199]另外,在IL罐培養(yǎng)第3天的生產(chǎn)培養(yǎng)條件下也見AI462015序列的異常的表達上調(diào)。如圖4所示，在IL罐流加培養(yǎng)的第10天產(chǎn)生約1200-1400mg/L的MAbl (抗IL-6R抗體)的2種的高產(chǎn)生抗體的細胞示5，000以上高的基因芯片信號值。從培養(yǎng)條件的不同，IL罐流加培養(yǎng)第3天的信號值是搖床培養(yǎng)的50%左右，在培養(yǎng)后期第13天，AI462015序列的表達強度上調(diào)至與搖床繼代培養(yǎng)同程度，示異常高的信號值(圖5)。另一方面，抗體產(chǎn)生量低的強表達MAbl的DXBIIs細胞(在水解物未添加的搖床培養(yǎng)第7天是300mg/L以下，在水解物添加也是500mg/L以下)，在添加恭獻于高產(chǎn)生化的水解物(Hy-Fish、豬源裂解揚)的條件下，也未見到IL罐培養(yǎng)第3天的AI462015序列的表達上調(diào)(圖6)。
[0200]基于在圖2示高的 信號值的MAbl強表達TauT強表達CSAD強表達DG44細胞的抗體產(chǎn)生量高(在水解物未添加的搖床培養(yǎng)第7天是640mg/L)、在圖3示高的信號值的強表達MAb2的DXBIIs細胞的抗體產(chǎn)生量高(在水解物未添加的搖床培養(yǎng)第7天是640mg/L)、在加圖6中恭獻于抗體高產(chǎn)生化的水解物時信號值也不上調(diào)的實驗結(jié)果，考慮“AI462015序列的表達量高的細胞產(chǎn)生抗體的潛力高的”。
[0201]〔實施例3〕由APES強表達的產(chǎn)生抗體的細胞的高產(chǎn)生化例
[0202]由于AI462015序列表達量的高度與產(chǎn)生抗體的潛力的高度示相關(guān)，向在圖6中產(chǎn)生抗體的潛力低的強表達MAbl的DXBlls細胞導入表達AI462015序列之一部分的質(zhì)粒，強表達而比較產(chǎn)生抗體的潛力。
[0203]將小鼠基因組來源的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物AI462015 (圖1、437堿基)序列之一部分(含Affymetrix基因芯片的AI462015探針序列)5’側(cè)第4G-3’末端的T命名為APES434、5’偵樵4G-第168C命名為APES165，制成2種表達單位(APES是指抗體產(chǎn)生增強序列的簡稱)。通過合成加Kozak序列的表達單位，構(gòu)建在CMV啟動子下高表達的pHyg-APES434 (圖7)、pHyg-APES165 (圖 8)、pHyg-空值(圖 9)。
[0204]由Amaxa公司(現(xiàn)、LONZA公司)基因?qū)胂到y(tǒng)Nucleofector,向圖6的產(chǎn)生抗體低的株的強表達MAbl的DXBlls細胞導入表達質(zhì)粒，在96孔板上挑選在含潮霉素(200 μ g/ml)的選擇培養(yǎng)基存在下高增殖的全細胞系統(tǒng)，24孔板擴大后，比較抗體產(chǎn)生量。挑選的株數(shù)分別是 pHyg_APES434 (N=38), pHyg-APES165 (N=60)、pHyg-空值(N=ll)，它們的株數(shù)期待由強表達APES的質(zhì)粒導入的陽性效果。在含ImL繼代培養(yǎng)基的24孔板的靜置培養(yǎng)是，在培養(yǎng)第13天見不到細胞增殖，所以測定抗體產(chǎn)生量及細胞數(shù)?？贵w產(chǎn)生量的平均值是 pHyg-APES434 (44.3mg/L)、pHyg_APES165 (41.2mg/L)、pHyg-空值(21.9mg/L)、細胞數(shù)(平均值)是 pHyg-APES434 (9.27X IO5 細胞 /mL)、pHyg_APES165 (11.39X IO5 細胞 /mL)、pHyg-空值(7.76X IO5 細胞 /mL)，pHyg_APES434、pHyg_APES165 導入細胞一同對于對照的PHyg-空值統(tǒng)計學顯著(t檢驗P〈0.001，圖10)。[0205]以上的結(jié)果示，強表達含AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’側(cè)165bp的核酸序列(例如作為SEQ ID NO:2的DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的APES165、或者作為SEQ ID NO:3的DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的APES434)，則細胞的產(chǎn)生抗體的潛力升高。
[0206]〔實施例4〕高產(chǎn)生抗體的CHO細胞中的NfkBia的表達抑制
[0207]如在實施例1所述，AI462015序列存在于小鼠基因組12的NfkBia基因的3’側(cè)的非翻譯區(qū)域近傍(3，側(cè)78bp)的互補鏈上，AI462015序列中含的22堿基(AAGTACCAAAATAATTACCAAC:SEQ ID NO: 10)是與人 NfkBia 基因的 3’ 側(cè)非翻譯區(qū)域(1492-1513)的互補鏈相同的序列，再者跨大鼠、恒河猴、狗、馬等種保守，從而有作為microRNA進行RNA干涉而分解NfkBia mRNA的可能性，或者從相當于可定量AI462015表達的AFFYMETRIX公司的寡核苷酸陣列(Affymetrix M0USE430_2)上的特異性探針序列區(qū)域(CATATACAACAITTACAAGAAGGCGACACAGACCTTAGTTGG:SEQ ID NO: 16) 42bp 之前半部分的5，側(cè)第 71C 的 21 堿基(CATATACAACATTTACAAGAA:SEQ ID NO: 15)是大鼠 NfkBia mRNA 的1478-1498堿基目的互補序列，從而考慮AI462015序列來源的核酸分子通過對于NfkBiamRNA進行RNA干涉，抑制表達來維持高產(chǎn)生抗體的CHO細胞的穩(wěn)態(tài)的可能性(敲除小鼠的致死率是出生后)。(注釋:其后判明，AI462015的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相當于小鼠NfkBia基因的3’側(cè)513堿基的非翻譯區(qū)域的互補鏈。參照實施例8。另外，在小鼠基因芯片上定量的AI462015的第71-第112序列(SEQ ID NO: 16)作為在CHO細胞的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物確認。)
[0208]從而，定量在產(chǎn)生抗體的潛力高的高表達AI462015的細胞中的NfkBia表達mRNA的量，確認其表達被抑制。
[0209]由于CHO細胞的NfkBia mRNA序列未知，從在小鼠和大鼠的氨基酸編碼區(qū)域(共942堿基:314氨基酸)保守的序列設(shè)計探針(5’ ACTTGGTGACTTTGGGTGCT、5，GCCTCCAAACACACAGTCAT) (SEQ ID NO: 17、18)而得到 325bp 的 PCR 產(chǎn)物。PCR 克隆的325bp從其序列相同性被認為是CHO細胞來源NfkBia mRNA之一部分序列(圖11)。
[0210]在小鼠基因組43 02.0陣列(實施例1)中，其探針序列用于相當于CHO細胞的種特異性序列，或無法定量NfkBia mRNA表達，但相比325bp PCR產(chǎn)物量，對于不產(chǎn)生抗體的表達基因強的細胞(泳道I，2 )，在AI462015序列的表達上調(diào)的高產(chǎn)生抗體的細胞(泳道3，4)中NfkBia mRNA表達被抑制。再者，設(shè)計能定量325bp之一部分的序列的TaqMan探針組(圖
12)，用RT-PCR法定量，則在高產(chǎn)生抗體的細胞中，NfkBia mRNA表達被抑制至不產(chǎn)生抗體的細胞的約50% (圖13)。
[0211]從以上認為，在高產(chǎn)生抗體的細胞中NfkBia mRNA的表達被抑制，結(jié)果，產(chǎn)生抗體的潛力升高。實際、我們從在抗體基因表達中使用的表達質(zhì)粒的啟動子/增強子區(qū)域中存在多個以上的NfkB結(jié)合部位(圖14:小鼠MCMV IE2啟動子上的NfkB結(jié)合部位)、它們的增強子區(qū)域是對于抗體基因的高表達必須的區(qū)域認為，由NfkBia表達抑制活化的NfkB遷移到核內(nèi)，啟動子活性增強是抗體高產(chǎn)生之一原因。
[0212]〔實施例5〕用高產(chǎn)生抗體的CHO細胞亢進的microRNA的解析
[0213]為了解析microRNA,如圖15所不使用 Mir-X? miRNA First-Strand Sythesis Kit(Clontech)，繼代培養(yǎng)中的高產(chǎn)生MAbl (抗IL-6R抗體)的DXBlls細胞和強表達高產(chǎn)生MAbl(抗IL-6R抗體)的TAUT的DXBlls細胞，再向從抗體基因?qū)肭暗腄XBlls宿主細胞制備的小RNA的3’側(cè)附加多聚(A)標簽之后，引發(fā)在3’側(cè)具有寡dT、在5’側(cè)具有PCR引物序列(mRQ3’引物)的適配體而合成第一次鎖cDNA。將得到的cDNA作為模板，使用mRQ3，弓丨物和預(yù)計的APES序列來源的microRNA-特異性引物(APES40-61 5’引物，或者APES71-915，引物)、再者陽性對照的U6snRNA5’引物進行qPCR反應(yīng)(95°C 5sec，60°C 20sec，30個循環(huán))。PCR反應(yīng)液，在純化后，用3%瓊脂糖凝膠電泳。如圖16所示，用由APES40-61 5’引物和U6snRNA5，引物的PCR反應(yīng)見到目的的大小的條帶。如泳道I, 2，3所示，APES40-61(AAGTACCAAAATAATTACCAAC:SEQ ID NO: 10) 22 堿基在高產(chǎn)生 MAbl (抗 IL-6R 抗體)的細胞中高表達。從陽性對照的U6snRNA (泳道4)的表達量在任何的細胞中也是同水平，另外確認不到 APES71-91 (CATATACAACATTTACAAGAA:SEQ ID NO: 15)的存在(數(shù)據(jù)未顯示)，考慮跨種序列保守的APES40-61 (22堿基)作為microRNA恭獻于抗體高產(chǎn)生化。
[0214]〔實施例6〕由APES強表達的抗體產(chǎn)生用宿主細胞的高增殖化例
[0215]從抗體產(chǎn)生用宿主細胞DXBl 1/TAUT，在IL罐流加培養(yǎng)第14天得到產(chǎn)生3.9g/L的MAbl (抗IL-6R抗體)的高產(chǎn)生抗體的細胞(DXBll/TAUT/MAbl)，由TAUT的生存率維持能力在培養(yǎng)第31天產(chǎn)生8.lg/L，但考慮實生產(chǎn)而為了在培養(yǎng)第14天高產(chǎn)生，有必要增加細胞最高到達密度(4.1xl0e6細胞/mL)。如果由APES強表達的Nfkbia mRNA的表達抑制(實施例4)促進Nfkb的活化，由于增殖關(guān)聯(lián)基因的表達被亢進，細胞最高到達密度有升高的可能性。將與APES同樣地恭獻于抗體高產(chǎn)生化的ALTl的共表達用質(zhì)粒各自(pPur-APES165，pPur-ALTl，圖17)導入上述高產(chǎn)生抗體的細胞DXBll/TAUT/MAbl (親本株)挑選高增殖的最好的各3株，進行搖床流加培養(yǎng)，則強表達APES165的細胞的細胞最高到達密度的平均值是(11.5±1.7)11(6細胞/11，得到高增殖至強表達411的細胞的(8.9± 1.8) xl0e6細胞/mL以上的細胞。再者搖床流加培養(yǎng)第14天的抗體產(chǎn)生量的平均值是，強表達APES的細胞:4.4±0.6g/L，強表達ALTl的細胞:4.0±0.6g/L，升高至導入前的DXBll/TAUT/MAbl細胞:3.4g/L以上，所以示強表達APES的效果獨立于強表達TAUT的效果而陽性地發(fā)揮作用(圖18)。由APES強表達的正的效果在IL-Jar流加培養(yǎng)中顯著，比較各自在搖床流加培養(yǎng)的高增殖細胞，則強表達APES的株最高增殖，在培養(yǎng)第12天是5.3g/L，相對于親本株的3.2g/L，強表達ALTl的株4.4g/L示短期間培養(yǎng)高產(chǎn)生的長處(圖19)?；谝陨系慕Y(jié)果，將抗體產(chǎn)生用宿主細胞DXB11/TAUT改變?yōu)楦咴鲋车乃拗骷毎?，制成強表達APES165的宿主DXB11/TAUT/APES。將pPur_APES165用電穿孔法基因?qū)隓XB11/TAUT宿主，對于藥劑挑選后生存率、增殖均良好的宿主候選的9株，將繼代培養(yǎng)時的APESsnRNA (小非編碼RNA)表達量定量。APES表達量高的DXB11/TAUT/APES宿主候選株培養(yǎng)時的活細胞密度高，示相關(guān)(R2=0.70)(圖 20)。
[0216]〔實施例7〕由APES強表達的產(chǎn)生抗體的細胞的高產(chǎn)生化例2
[0217]與實施例3同樣，向強表達MAbl的DXBlls細胞導入表達AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5’側(cè)的部分序列的質(zhì)粒，比較產(chǎn)生抗體的潛力。
[0218]APES4-168 (APES165)之外，再制成由其一部分序列組成的APES4-68 (SEQ IDN0:5)及APES69-133 (SEQ ID NO:6)的表達單位，檢查細胞的產(chǎn)生抗體的潛力。相對于空載體強表達(空值)成APES4-68以p〈0.05，APES69-133以p〈0.01的顯著差異抗體高產(chǎn)生(t 檢驗 P〈0.001、圖 21)。[0219]圖22示是否在實施例3及本實施例中鑒定的，有APES活性的部分序列分別相當于小鼠AI462015轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的何區(qū)域。示APES活性的部分序列含23堿基以上Nfkbia互補序列。
[0220]〔實施例8〕關(guān)于APES的基因解析
[0221]在實施例1中，基于申請時的基因信息，記述為“AI462015是437堿基的mRNA型非編碼RNA，但其序列存在于小鼠基因組的NfkBia基因的3’側(cè)的非翻譯區(qū)域近傍(56590831-56590397)的互補鏈上”，但是，由其后的GeneBank的信息更新，作為AI462015的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的437堿基明顯相當于小鼠NfkBia基因的3’側(cè)非翻譯區(qū)域(513堿基)的互補鏈(圖23)。如圖24所示，申請后，在公開的CHO-Kl細胞的基因組序列上存在AI462015的相同序列(SEQ ID NO: 25:AI462015 ；SEQ ID NO: 26-27:CH0_K1 基因組)、再者，從在抗體高產(chǎn)生的CHO細胞中見到Nfkbia的表達抑制(實施例4)認為，在CHO細胞中AI462015的相同序列高表達而發(fā)揮功能。
[0222]本發(fā)明能應(yīng)用于所有的抗體等的產(chǎn)生重組多肽的細胞。
[0223]直接參考本說明 書中引用的全部的刊行物、專利及專利申請并入本說明書。
【權(quán)利要求】
1.多肽的制造方法，其包括培養(yǎng)表達APES、并且導入編碼希望得到的多肽的DNA的細胞，以及產(chǎn)生希望得到的多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中APES是含通過堿基對形成結(jié)合于人、小鼠、大鼠或倉鼠來源的NfkBia的基因的DNA或mRNA，能抑制NfkBia的基因的表達的堿基序列的核酸分子。
3.權(quán)利要求2的方法，其中APES是含能通過堿基對形成結(jié)合于NfkBia的mRNA之一部分的19-25堿基長的序列的至30堿基長的低分子RNA。
4.權(quán)利要求2的方法，其中APES是含能通過堿基對形成結(jié)合于NfkBia的mRNA之一部分的19-25堿基長的序列的至561堿基長的mRNA型非編碼RNA。
5.權(quán)利要求2的方法，其中APES是含能通過堿基對形成結(jié)合于NfkBia的mRNA之一部分的19-25堿基長的序列的561-1579堿基長的mRNA型非編碼RNA。
6.權(quán)利要求3-5之任一項的方法，其中19-25堿基長的連續(xù)的序列是SEQID NO: 2所示的堿基序列中任一個的部分序列。
7.權(quán)利要求6的方法，其中APES選自含以下的堿基序列的核酸分子: Ca)由SEQ ID NO:1-16及29之任一個的堿基序列組成的DNA ； (b)含上述(a)的序列，是NfkBia基因的3’側(cè)非翻譯區(qū)域的部分序列的DNA； (c)由與上述(a)或(b)的序列除I個或數(shù)個堿基外相同的堿基序列組成的DNA； Cd)是上述(a)、(b)或(c)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA ;及 Ce)由能通過堿基對形成結(jié)合于上述(a)的序列的序列組成的DNA或RNA。
8.權(quán)利要求1的方法，其中細胞是強表達APES的細胞。
9.權(quán)利要求1的方法，其中向細胞導入編碼希望得到的多肽的外來的DNA，并且人為地導入APES。
10.權(quán)利要求9的方法，其中人為地導入APES的細胞是轉(zhuǎn)染APES的細胞。
11.權(quán)利要求9的方法，其中人為地導入APES的細胞是內(nèi)源性APES的轉(zhuǎn)錄活化的細胞。
12.權(quán)利要求9的方法，其中向細胞再導入編碼?；撬徂D(zhuǎn)運蛋白的DNA。
13.權(quán)利要求9的方法，其中向細胞再導入編碼半胱氨酸亞磺酸脫羧酶的DNA。
14.權(quán)利要求9的方法，其中向細胞再導入編碼丙氨酸轉(zhuǎn)移酶的DNA。
15.權(quán)利要求1的方法，其中多肽是抗體。
16.權(quán)利要求1的方法，其中細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
17.制造藥品的方法，所述藥品含有由權(quán)利要求1-16之任一項所述的方法制造的多肽。
18.含以下的堿基序列，有APES活性的核酸分子(但是除SEQIDΝΟ:1的核酸分子之外): Ca)由SEQ ID NO:2-16及29之任一個的堿基序列組成的DNA ； (b)含上述(a)的序列，是NfkBia基因的3’側(cè)非翻譯區(qū)域的部分序列的DNA; (c)由與SEQID NO:1-16及29或(b)的序列除I個或數(shù)個堿基外相同的堿基序列組成的DNA ； Cd)是上述(a)、(b)或(b)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA ;或 Ce)由能通過堿基對形成結(jié)合于上述(a)的序列的序列組成的DNA或RNA。
19.載體，其含權(quán)利要求18所述的核酸分子。
20.細胞 ，其被人為地導入權(quán)利要求18所述的核酸分子或權(quán)利要求19所述的載體。
【文檔編號】A61K39/395GK103459608SQ201280015594
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月1日
【發(fā)明者】田淵久大, 杉山朋也 申請人:中外制藥株式會社