專利名稱：一種傳染性喉氣管炎粘膜疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種傳染性喉氣管炎粘膜疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis, ILT)是由抱疫病毒科(Herpetoviridae)抱疫病毒屬(Herpesvirus)的傳染性喉氣管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitis virus, I LTV)引起的一種急性呼吸道傳染病,可引起雞死亡和產(chǎn)蛋下降，造成生產(chǎn)的嚴(yán)重?fù)p失。嚴(yán)重感染時病雞呼吸困難、喘氣、咳出血樣粘液，死亡率高。ILT是家禽的第一個研制出有效疫苗的主要病毒性疾病。目前，疫苗免疫接種仍是我國控制家禽ILT的主要措施。盡管弱毒疫苗存在散毒的危險，但是目前主要還是使用弱毒疫苗來預(yù)防ILT，所使用的弱毒疫苗是經(jīng)細(xì)胞傳代或雞胚傳代致弱的病毒以及經(jīng)選擇的地方流行的溫和型毒株，他們都能使易感雞產(chǎn)生堅強(qiáng)的免疫力，但弱毒疫苗存在毒力偏強(qiáng)、易于返祖、并且與強(qiáng)毒株一樣能形成潛伏感染等弊端。弱毒疫苗的接種方法主要有點(diǎn)眼、噴霧和飲水等方式。實(shí)際應(yīng)用中的弱毒疫苗的病毒毒力普遍偏強(qiáng)，接種后雞群發(fā)病率在5%左右，而進(jìn)一步致弱的疫苗株其免疫原性也下降，進(jìn)而導(dǎo)致免疫效果不佳。粘膜免疫和粘膜疫苗具有許多引人關(guān)注的特性，然而要真正通過抗原的粘膜免疫途徑刺激產(chǎn)生強(qiáng)大的粘膜免疫反應(yīng)(包括粘膜特異的SlgA和CTLs)和保護(hù)效應(yīng)并非那么容易。目前只有極少數(shù)幾種粘膜免疫途徑的疫苗用于臨床。有效的佐劑可以大大加強(qiáng)疫苗刺激機(jī)體有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答，而研發(fā)新型粘膜疫苗配方的一個最明顯的限制在于缺乏有效的佐劑。因此，篩選合適免疫佐劑，研制新型ILT疫苗，增強(qiáng)疫苗免疫效力，成為研制傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有佐劑效果差的問題，本發(fā)明提供一種傳染性喉氣管炎粘膜疫苗，該傳染性喉氣管炎粘膜疫苗使用鞭毛素作為佐劑。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種傳染性喉氣管炎粘膜疫苗，包含滅活的傳染性喉氣管炎病毒和鞭毛素。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述鞭毛素為大腸桿菌源鞭毛素。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述傳染性喉氣管炎病毒為傳染性喉氣管炎病毒疫苗株K317。一種傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法，包括以下步驟步驟1:將傳染性喉氣管炎病毒用10日齡SPF雞胚進(jìn)行培養(yǎng)和傳代；步驟2 :將傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行滅活；步驟3 :將大腸桿菌源鞭毛素在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，純化，去內(nèi)毒素；
步驟4 :將大腸桿菌源鞭毛素與滅活的傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行混合制成傳染性喉氣管炎粘膜疫苗。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟I中的傳染性喉氣管炎病毒為疫苗株K317。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟2中的滅活采用的是熱處理，樣品置65°C水浴或者65°C培養(yǎng)箱中放置2h滅活。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟2還包括病毒的活性檢測和細(xì)菌檢測。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟3中選用的鞭毛素來源于大腸桿菌。本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗在制備預(yù)防傳染性喉氣管炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的新型的傳染性喉氣管炎粘膜疫苗具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和效果。(I)傳染性喉氣管炎粘膜疫苗能引起機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)型應(yīng)答，免疫力強(qiáng)，持續(xù)時間長，可以作為預(yù)防傳染性喉氣管炎。(2)由于該新型疫苗的 抗原是滅活病毒，安全、不存在散毒的危險。(3)和一般的滅活疫苗比較，通過添加鞭毛素作為粘膜免疫佐劑，激發(fā)內(nèi)在免疫應(yīng)答，同時增強(qiáng)目標(biāo)靶點(diǎn)對疫苗抗原產(chǎn)生的抗體反應(yīng)，有效誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)，預(yù)防家禽傳染性喉氣管炎。


圖1滅活病毒接胚后活性檢測結(jié)果；第一泳道為DL2000 Marker ;第二和三泳道為陽性對照；第四和五泳道為檢測樣品。圖2重組蛋白的可溶性分析結(jié)果；第一泳道為pET-His-Flagellin誘導(dǎo)表達(dá)上清；第二泳道為pET-His-Flagellin誘導(dǎo)表達(dá)沉淀。圖3純化鞭毛素蛋白的SDS-PAGE圖；第一泳道為Marker，第二泳道為純化后的鞭毛素蛋白；圖4牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5 —免后16小時血清抗體ELISA值；圖6 —免后I周血清抗體ELISA值；圖7 —免后2周血清抗體ELISA值；圖8 二免后第2周血清抗體ELISA值；圖9 二免后第3周血清抗體ELISA值；圖10肺洗液早期炎性細(xì)胞因子IL-6 ELISA值；圖11肺洗液早期炎性細(xì)胞因子IFN Y ELISA值。
具體實(shí)施例方式通過下面給出的某些實(shí)驗的具體實(shí)施例子可以進(jìn)一步清楚地理解本發(fā)明。但下述實(shí)施例不是對本發(fā)明的限定。一種傳染性喉氣管炎粘膜疫苗，包含滅活的傳染性喉氣管炎病毒和鞭毛素。
作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的一種優(yōu)選實(shí)施方式,所述鞭毛素為大腸桿菌源鞭毛素。近年來，研究證明運(yùn)動性革藍(lán)氏陰性細(xì)菌的鞭毛素是一種具有潛力的免疫佐齊U，能有效誘發(fā)固有性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。傷寒桿菌(Salmonllena enteritidis)的鞭毛素作為鼻腔內(nèi)免疫佐劑能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)有效防御致死量鼠疫耶氏菌(Yersiniapestis)的呼吸道感染。創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)的鞭毛素作為鼻腔內(nèi)免疫佐劑與破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid,TT) 一起免疫小鼠能誘導(dǎo)有效的保護(hù)免疫效應(yīng)。更重要的是，體內(nèi)已產(chǎn)生存在的鞭毛素特有免疫性并不會削弱鞭毛素融合蛋白疫苗的有效性。作為一個細(xì)菌Toll樣受體(Toll-like rec印tor，TlR)激動劑，鞭毛素可激發(fā)內(nèi)在的免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生一個非特異性的免疫反應(yīng)。由鞭毛素激發(fā)的內(nèi)在免疫應(yīng)答可同時增強(qiáng)目標(biāo)靶點(diǎn)對疫苗抗原產(chǎn)生的抗體反應(yīng)，從而得到一個更為保護(hù)和持久的免疫作用。但是目前關(guān)于大腸桿菌來源的鞭毛素的研究較少。大腸桿菌來源的鞭毛素蛋白屬于腸道病原的大腸桿菌鞭毛素，能激發(fā)產(chǎn)生白細(xì)胞介素_8，作為佐劑效果更好。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis virus, ILTV)屬于皰疫病毒科(Herpetoviridae)皰疫病毒屬(Herpesvirus),為傳染性喉氣管炎病毒疫苗株K317,購自中國獸藥監(jiān)察所。一種傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法，包括以下步驟步驟1:將傳染性喉氣 管炎病毒用10日齡SPF雞胚進(jìn)行培養(yǎng)和傳代；步驟2 :將傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行滅活；步驟3 :將大腸桿菌源鞭毛素在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，純化，去內(nèi)毒素；步驟4 :將大腸桿菌源鞭毛素與滅活的傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行混合制成傳染性喉氣管炎粘膜疫苗。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟I中的傳染性喉氣管炎病毒為疫苗株K317。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟2中的滅活采用的是熱處理，取足量保存?zhèn)溆脴悠分?5°C水浴或者65°C培養(yǎng)箱中放置2h滅活，分裝到2ml滅菌離心管中。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟2還包括病毒的活性檢測和細(xì)菌檢測。作為本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟3中選用的鞭毛素來源于大腸桿菌。本發(fā)明傳染性喉氣管炎粘膜疫苗在制備預(yù)防傳染性喉氣管炎的藥物中的應(yīng)用。實(shí)施例1步驟I ILTV的培養(yǎng)和傳代傳染性喉氣管炎病毒為傳染性喉氣管炎病毒疫苗株K317，在-80°C保存。使用前取出，接種10日齡SPF雞胚，每枚雞胚接種量為0. 3ml/枚，連續(xù)傳四代。步驟2毒株滅活、活性檢測及菌檢滅活取足量保存?zhèn)溆脴悠分?5°C水浴或者65°C培養(yǎng)箱中放置2h即為滅活野毒株，樣品分裝到2ml滅菌離心管中?；钚詸z測滅活樣品接種10枚10日齡SPF雞胚，0.2ml/枚，37°C培養(yǎng)，棄去24小時內(nèi)死胚，144小時后凍胚，觀察尿囊膜病變情況并記錄，收集尿囊膜碾磨后反復(fù)凍融三次，2000rpm 4°C 5min取上清，上清PCR檢測，記錄結(jié)果。結(jié)果如圖1所示。第一泳道為DL2000Marker ;第二和三泳道為陽性對照；第四和五泳道為檢測樣品。接種的SPF雞胚無I枚死亡。接種5天后凍胚觀察無尿囊膜病變，無可見痘斑。收集尿囊膜做PCR檢測，均為陰性。菌檢滅活樣品接種取100 μ L涂到普通瓊脂平板,37°C放置I小時后翻板培養(yǎng)兩天，觀察細(xì)菌生長情況。兩天后觀察，無細(xì)菌生長。步驟3鞭毛素的表達(dá)和純化(I)目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將表達(dá)大腸桿菌(Escherichiacoli str. K-12 substr. MG1655)來源鞭毛素基因(Gene ID :949101,核酸長度為1497bp，具體序列如SEQ ID NO.1所示)的pET-His-E質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)中，并涂布于含氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取一個單菌落接種到4ml含lOOug/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，并置于37°C中，220rpm振蕩培養(yǎng)6h作為種子液。將種子液按1: 100的比例接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，370C，220rpm振蕩培養(yǎng)約2. 5h，檢測當(dāng)菌液0D600在O. 4-0. 6間時，加入IPTG至終濃度為1.0mM，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)4h，收集菌體。取2ml誘導(dǎo)前、后的菌液,室溫12000g離心Imin,棄上清,沉淀重懸于Iml I XPBS中，室溫12000g離心lmin，棄上清，重復(fù)洗滌一次后，菌體沉淀用lOOulPBS重懸，再加入25 μ I 5XLoading Buffer。混勻后，沸煮5min，以完全裂解菌體并使蛋白變性。室溫12000g離心5min，取5-10 μ I上樣，進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳檢測。將成功表達(dá)的融合蛋白，將菌液按照1: 100的比例接種到500ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在菌液0D600在O. 4-0. 6間時，加入IPTG至終濃度為1. OmM, 180r/min，18°C振蕩培養(yǎng)過夜；8000rpm，4°C，5min離心收集菌體；每50ml的菌液用5ml PBS洗滌沉淀，洗滌兩次后，稱重，約 每克菌體濕重加入5ml IXPBS進(jìn)行重懸；并用超聲波破碎的方法裂解菌體，然后8000rpm，4°C，離心lOmin，分別回收上清和沉淀。取一定量的上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性。重組蛋白的可溶性分析見圖2。泳道I是pET-His-Flagellin誘導(dǎo)表達(dá)上清；2 :pET-His_Flagellin誘導(dǎo)表達(dá)沉淀,可見鞭毛素蛋白是以可溶性的形式表達(dá)。(2)重組表達(dá)蛋白的純化由于pET-His載體上帶有6個組氨酸標(biāo)簽,于是使用GE公司的HisTrap FF crude進(jìn)行鎳離子親和層析的方法進(jìn)行純化。純化后的鞭毛素蛋白結(jié)果見圖3，大腸桿菌來源的鞭毛素蛋白大小為55kDa左右。(3)佐劑去內(nèi)毒素采用金斯瑞的ToxinEraser 去內(nèi)毒素試劑盒，它是一類高效內(nèi)毒素去除樹脂，以修飾過的多粘菌素B(PMB)為配體,進(jìn)行特異性的去除內(nèi)毒素。經(jīng)ToxinEraser endotoxinremoval resin純化,樣品最終的內(nèi)毒素水平可低于0. lEU/ml。鞭毛素蛋白含量的測定采用Bradford法測定樣品裂解液中的蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用分光光度計測定吸光值0D595nm，作標(biāo)準(zhǔn)曲線；將待測樣品適當(dāng)稀釋，測定吸光值0D595，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測樣品的蛋白濃度，每個樣品測三次，取平均值。具體做法是取純化的蛋白20 μ L加入980 μ L的考馬斯亮藍(lán)染色液，充分混勻，每孔200 μ L加入ELISA板中，3個重復(fù)樣品。630nm波長檢測，得到OD值，對照公式計算，X為蛋白含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。大腸桿菌鞭毛素蛋白濃度為6. 8mg/ml。步驟4將大腸桿菌源鞭毛素與滅活的傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行混合制成傳染性喉氣管炎粘膜疫苗ILTV滅活前的滴度至少為104_°EID5Q/0· 1ml，按30mL滅活I(lǐng)LTV+5mg鞭毛素蛋白的比例進(jìn)行混合。傳染性喉氣管炎粘膜疫苗效果驗證用未滅活的傳染性喉氣管炎病毒疫苗株K317、商品疫苗和沙門氏菌來源鞭毛素(沙門氏菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. LT2,GeneID : 1253480，具體序列如SEQ ID NO. 2所示)作對照。用21日齡雞接種各組疫苗，具體分組如表I。一免后16h先采血5只并收集血清，然后每組處死3只雞，用200 μ L細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗肺支氣管收集肺洗液用于早期炎性細(xì)胞因子IFNy及IL-6的檢測。早期炎性細(xì)胞因子IFNy及IL-6的檢測用檢測試劑盒按照說明書進(jìn)行操作，肺洗液1:100稀釋后加樣。一免后1、2周和二免后2、3周采血取樣,用ELISA實(shí)驗進(jìn)行1gG抗體水平檢測。表1免疫方案
權(quán)利要求
1.一種傳染性喉氣管炎粘膜疫苗，其特征在于，包含滅活的傳染性喉氣管炎病毒和鞭毛素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性喉氣管炎粘膜疫苗，其特征在于，所述鞭毛素為大腸桿菌源鞭毛素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性喉氣管炎粘膜疫苗，其特征在于，所述傳染性喉氣管炎病毒為傳染性喉氣管炎病毒疫苗株K317。
4.一種權(quán)利要求1所述的傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1:將傳染性喉氣管炎病毒用10日齡SPF雞胚進(jìn)行培養(yǎng)和傳代； 步驟2 :將傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行滅活； 步驟3 :將大腸桿菌源鞭毛素在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，純化，去內(nèi)毒素； 步驟4 :將大腸桿菌源鞭毛素與滅活的傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行混合制成傳染性喉氣管炎粘膜疫苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟I中的傳染性喉氣管炎病毒為疫苗株K317。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟2中的滅活采用的是熱處理，樣品置65°C水浴或者65°C培養(yǎng)箱中放置2h滅活。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟2還包括病毒的活性檢測和細(xì)菌檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的傳染性喉氣管炎粘膜疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟3中所述的鞭毛素來源于大腸桿菌。
9.權(quán)利要求1所述的傳染性喉氣管炎粘膜疫苗在制備預(yù)防傳染性喉氣管炎的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種傳染性喉氣管炎粘膜疫苗、制備方法及應(yīng)用，所述傳染性喉氣管炎粘膜疫苗包含滅活的傳染性喉氣管炎病毒和鞭毛素；所述鞭毛素為大腸桿菌源鞭毛素；所述傳染性喉氣管炎病毒為傳染性喉氣管炎病毒疫苗株K317。所述傳染性喉氣管炎粘膜疫苗通過添加鞭毛素作為粘膜免疫佐劑，有效誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)；安全性好、不存在散毒的危險；可直接應(yīng)用于預(yù)防家禽免于傳染性喉氣管炎病毒的感染及傳播。
文檔編號A61K39/245GK103055311SQ201210586649
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者曹永長, 薛春宜, 鄢慧民, 王林果 申請人:中山大學(xué)