專利名稱：一種響應(yīng)面分析法在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種響應(yīng)面分析法在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
中醫(yī)治病用藥經(jīng)歷了從簡單到復(fù)雜、從低級到高級、從單方到復(fù)方的發(fā)展過程，中藥復(fù)方已經(jīng)成為中醫(yī)治病用藥最主要的形式之一。中藥藥理研究已從單味中藥轉(zhuǎn)向以復(fù)方為主的研究。對于經(jīng)方、古方的研究，也已從單純探討其藥效作用，開始向研究其作用機制、方劑組成、方劑配伍等多個方面發(fā)展，而研究中藥復(fù)方作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制正是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵。中藥復(fù)方的特點是多成分、多作用和多靶點，因此要求整體、離體、細胞和分子水平各層次的研究全面發(fā)展。中藥復(fù)方藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是其化學(xué)成分的總和。單味藥經(jīng)配伍組成復(fù)方，可能產(chǎn)生化學(xué)成分的變化，各化學(xué)成分在適宜的濃度范圍及相互比例下發(fā)揮作用。對中藥復(fù)方化學(xué)成分的研究，能夠從本質(zhì)上闡明其藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)、探索復(fù)方制劑過程中化學(xué)成分的變化規(guī)律以及揭示中藥方劑配伍的科學(xué)內(nèi)涵，起到優(yōu)化處方、改革劑型、建立科學(xué)制劑工藝的作用，從而有助于提高制劑質(zhì)量、發(fā)現(xiàn)新的有效藥物。以定量方法研究中藥配伍前后各化學(xué)成分的變化規(guī)律，探尋各成分之間的相互比例和各自的濃度范圍，結(jié)合藥理實驗的方法研究復(fù)方化學(xué)成分的療效以及配伍規(guī)律，然后進行有效成分的組合，進一步研究復(fù)方化學(xué)成分的配伍，從而科學(xué)地闡明中藥復(fù)方的作用原理及配伍規(guī)律，明確是否由于各個成分的協(xié)同作用而產(chǎn)生了藥效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是建立一種中藥復(fù)方的研究方法，采用響應(yīng)面分析法將復(fù)方中各組成成分作為輸入試驗變量，以適應(yīng)癥藥效檢測指標(biāo)為輸出響應(yīng)變量，以定量方法研究中藥配伍后對于療效和靶點的變化規(guī)律，探尋各成分之間的相互比例和各自的濃度范圍，結(jié)合藥理實驗的方法研究復(fù)方化學(xué)成分的療效以及配伍規(guī)律，然后進行有效成分的組合，進一步研究復(fù)方化學(xué)成分的配伍，從而科學(xué)地闡明中藥復(fù)方的作用原理及配伍規(guī)律，明確是否由于各個成分的協(xié)同作用而產(chǎn)生了藥效。建立一種中藥復(fù)方研究的新方法。具體實施方法，以Design_Expert7. O為數(shù)據(jù)分析軟件以及治療穩(wěn)定性冠心病心絞痛復(fù)方Y(jié)作為例子舉例說明如下
心血管疾病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見病和多發(fā)病，全球每年大約有2000萬人死于急性心血管事件，并且隨著人們生活水平的提高和人口的老齡化，本病的發(fā)病率和死亡率有逐年上升趨勢。動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是中老年人群心腦血管疾病高發(fā)的重要病理基礎(chǔ)，其發(fā)生發(fā)展貫穿冠心病病人整個病理過程。近年來，由于監(jiān)控和治療水平的提高，人們己對本病有一定的預(yù)防意識，但己患病或其他因素(如遺傳、女性絕經(jīng)等)造成的動脈粥樣硬化病人仍普遍存在。動脈粥樣硬化性心臟病(CHD)是以血管平滑肌細胞增生和脂質(zhì)在粥樣硬化斑塊沉積為特征的危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一。AS的發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前關(guān)于AS形成有三大學(xué)說，S卩脂質(zhì)學(xué)說、炎癥學(xué)說和感染學(xué)說，但仍沒有完全闡明動脈粥樣硬化的發(fā)生機制，因而對動脈粥樣硬化的防治缺乏有效的措施。脂質(zhì)與冠心病的關(guān)系已被證實，動脈粥樣硬化病變中脂質(zhì)源于血漿脂蛋白的浸潤，主要為膽固醇(TC)、膽固醇脂(CE)，其次為甘油三醋(TG)、磷脂和載脂蛋白。大量流行病學(xué)資料顯示，動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度隨血漿膽固醇水平的升高呈線性加重，血漿膽固醇的濃度與冠心病死亡率呈正相關(guān)關(guān)系。低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高是動脈粥樣硬化及由動脈粥樣硬化所引起的心血管疾病的最重要的危險因素，LDL-C在不同水平通過各種典型的和不典型的機制起作用。研究表明，LDL-C及氧化型LDL-C(Ox-LDL)的水平升高被認為是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟，循環(huán)中的ox-LDL獨立于其它因素與無癥狀的動脈粥樣硬化進展相關(guān)。動脈粥樣硬化中ox-LDL是導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的主要原因，它不僅損傷內(nèi)皮細胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)，而且可降低內(nèi)皮細胞的抗凝纖溶活性，損害內(nèi)皮依賴的舒張功能。而低HDL-c水平也是As的風(fēng)險因子之一，許多資料表明，HDL-C濃度與心血管疾病的發(fā)病率呈負相關(guān)，HDL-C濃度升高具有預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)生的作用。另外，HDL-C可通過抑制LDL-C的氧化，參與ox-LDL的逆向轉(zhuǎn)運，降低氧化型LDL-C引起的損傷；抑制單核細胞粘附和遷移到血管內(nèi)膜，刺激內(nèi)皮細胞修復(fù)和增殖抑制生長因子誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞的增生。大量干預(yù)實驗證明升高HDL-C濃度來降低心血管疾病的發(fā)病率和死亡率的有效方法因此，降低LDL-C和升高HDL-C是防治動脈粥樣硬化以至心腦血管病的重要目標(biāo)。炎癥假說認為AS是不斷發(fā)展的血管壁慢性炎癥，是對血管壁損害的反應(yīng)和修復(fù)過程。最初引起炎癥反應(yīng)的損傷或失衡還不清楚?？赡艿脑虬╫x-LDL、機械損傷、免疫損傷、高半膚氨酸和病毒，其過程是勃附分子表達增加引起對白細胞和血小板的勃附增加；通透性增加；表達一些活性分子如細胞因子和生長因子等。其結(jié)果是吸引單核細胞和T細胞進入內(nèi)皮，在此處單核細胞分化為巨噬細胞吞噬清除ox-LDL，當(dāng)吞噬的ox-LDL不能即使運送出內(nèi)膜時，就 積累在巨噬細胞內(nèi)致使泡沫細胞形成。當(dāng)這種刺激因素持續(xù)存在時，這些炎癥反應(yīng)會刺激平滑肌細胞進入內(nèi)膜，進入內(nèi)膜的平滑肌細胞從收縮型轉(zhuǎn)為分泌型，分泌膠原和其它活性分子。致使損傷部位增厚，血管重塑。當(dāng)刺激持續(xù)存在時，進入損傷部位的單核細胞、T細胞和平滑肌細胞進一步增多，分泌的成分更加復(fù)雜，斑塊體積增大，向管腔突出影響血流。大的不穩(wěn)定的斑塊可出血、壞死、脫落，引發(fā)急性心血管事件。在眾多反應(yīng)炎癥的指標(biāo)中，C反應(yīng)蛋白(C即)被越來越多地證實與AS的短期、長期預(yù)后都密切相關(guān)。wallen等發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定型心絞痛患者血清中粘附分子sICAM-1 (intercellular adhesionmolceules,sICAM-1)和 sVCAM-1 (vascular cellular adhesion molecules,sVCAM-1) 7jC平的升高程度與心源性死亡或心肌梗死發(fā)生率成正相關(guān)。這為粘附分子參與評估AS患者的預(yù)后提供了依據(jù)。一般認為，脂質(zhì)豐富的動脈粥樣硬化斑塊破裂處急性血栓形成是穩(wěn)定的或亞臨床動脈粥樣硬化性疾病向急性梗死、缺血性卒中或周圍動脈栓塞轉(zhuǎn)化的促發(fā)事件。與動脈血栓形成相關(guān)的纖溶系統(tǒng)的功能狀態(tài)和疾病的危險性有重要聯(lián)系，纖維蛋白溶解系統(tǒng)是人體最重要的抗凝系統(tǒng)，由4種主要部分組成纖溶酶原、纖溶酶原激活劑、纖溶酶、纖溶酶抑制物。它對保持血管壁的正常通透性、維持血液的流動狀態(tài)和組織修復(fù)起著重要作用。纖溶系統(tǒng)的抑制可在兩個水平上進行一是在纖溶酶水平，主要是&2-抗纖溶酶(a2_AP);另一個是在纖溶酶原激活物水平，即受纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)的調(diào)節(jié)。其中起主要作用的為纖溶酶原激活物抑制劑-l(PA1-l)。纖溶酶原激活物(PA)包括兩種類型，組織型價(t-PA)和尿激酶型(u-PA)。目前研究表明，PA1-1致As的主要機制為促進細胞外基質(zhì)積聚及血栓形成，調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖和遷移，能夠結(jié)合纖維蛋白而不失去中和t-PA的能力，由此導(dǎo)致血栓的形成。U-PA是調(diào)節(jié)細胞外蛋白溶解的關(guān)鍵物質(zhì)，與其細胞受體結(jié)合后可以將蛋白酶解限制在細胞周圍特定的部位，在粥樣斑塊的肩部發(fā)現(xiàn)有大量u-PA及其受體的聚集，因此極易造成斑塊的破裂乃至血栓形成。所以，它們之間的生理平衡對調(diào)節(jié)血流通暢，防止AS血栓形成起重要作用。AS的發(fā)生發(fā)展及其復(fù)雜，脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)以及血栓形成三者之間互相聯(lián)系和影響。在AS早期階段，多種刺激因素誘發(fā)動脈壁脂質(zhì)聚集部位的炎癥反應(yīng)，引起細胞粘附，生成脂質(zhì)斑塊，引起平滑肌增殖、遷移；炎癥還影響脂質(zhì)代謝，加速LDL的氧化修飾，并且降低脂質(zhì)斑塊的穩(wěn)定性，誘發(fā)斑塊破裂血栓形成。所以，現(xiàn)在人們越來越清醒地認識到理想的策略應(yīng)該是將藥物治療包括調(diào)脂、溶栓、抗凝以及抗炎等方法結(jié)合起來，發(fā)揮其協(xié)同作用，以達到最佳治療效果。但若找出三者之間的共同作用靶點，則將為治療提供捷徑。基于上述研究目的，復(fù)方Y(jié)組成為人參總皂苷，水蛭素，三七總皂苷，冰片 量效分析方法
前期針對人參總皂苷、水蛭素、三七總皂苷、冰片藥效學(xué)進行了預(yù)實驗試驗，結(jié)果表明本復(fù)方中人參總皂苷的日服用量20-60mg、水蛭素60-100mg、三七總皂苷20_60mg、冰片10-30mgo 分別以人參總阜苷 20mg、40mg、60mg,水蛭素 60mg、80mg、IOOmg,冰片 20mg、40mg、60mg所選因素對應(yīng)的三個水平，并以血脂指標(biāo)(高密度脂蛋白HDL-C、低密度脂蛋白LDL-C、血清TG)、血清炎性因子(血清ox-LDL、hs 一 CRP、siCAM 一 I及svCAM — I)、血漿纖溶指標(biāo)血漿PA1-l，t-PA水平為響應(yīng)值。做四因素三水平BBD優(yōu)化試驗。具體實施步驟見說明書附圖。藥理實驗方法如下
I動物模型的建立
健康雄性新西蘭大白兔75只，在適應(yīng)性飼養(yǎng)I周后，應(yīng)用球囊損傷腹主動脈+高膽固醇飼料(1%膽固醇，每只喂養(yǎng)飼料120 — 140g . (T)喂養(yǎng)，造模期為10周。10周末應(yīng)用高頻體表超聲，結(jié)合血脂檢測結(jié)果，驗證模型是否成立。2分組及給藥每十五只為一個動物組。造模成功后，每組以普通飼料+復(fù)方Y(jié)(根據(jù)BBD優(yōu)化試驗設(shè)計的給藥量)飼養(yǎng)4周。3血脂指標(biāo)(高密度脂蛋白HDL-C、低密度脂蛋白LDL-C、血清TG)、血清炎性因子(血清ox-LDL、hs-CRP、si CAM 一 I及sVCAM — I)、血漿纖溶指標(biāo)血漿PA1-1，t-PA檢測分別于實驗開始、10周末及18周末，禁食12h以上，經(jīng)耳緣靜脈采血，分裝于自凝、或含有構(gòu)椽酸納的抗凝試管，2000r/min，離心Ismin后分離出血清或血漿，80°C冰箱凍存?zhèn)溆?。?yīng)用全自動血生化分析儀測定血清TC、甘油三醋(triglyceride, TG)、LDL-C、HDL-C水平。4血清炎性因子的檢測
應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),按照說明書操作，檢測血清高敏 C 反應(yīng)蛋白(high sensitivity C-reactive protein, hs-CRP 即)、sVCAM-1、s I CAM-1 和 οχ-LDL 的水平。
5血漿纖溶酶原激活物等的檢測
應(yīng)用ELISA試劑盒，按照說明書操作，檢測血漿PA1-Ut-PA的水平。將上述測得的實驗檢測指標(biāo)輸入DeSign-EXpert7. O數(shù)據(jù)分析軟件，并根據(jù)上述量效分析方法中陳述的四因素三水平BBD優(yōu)化試驗設(shè)計，進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果
有上述試驗方法最后得到的最佳處方配比和最佳治療效果結(jié)果如下
人參總皂苷:60mg，水蛭素83. 87mg，三七總皂苷44. 27mg，冰片16. 40mg，可以使得治療效果最佳?？偨Y(jié)通過上述方法的研究，可有效的研究中藥配伍后對于療效和靶點的變化規(guī)律，探尋各成分之間的相互比例和各自的濃度范圍，復(fù)方化學(xué)成分的療效以及配伍規(guī)律，然后進行有效成分的組合，進一步研究復(fù)方化學(xué)成分的配伍，從而科學(xué)地闡明中藥復(fù)方的作用原理及配伍規(guī)律，明確是否由于各個成分的協(xié)同作用而產(chǎn)生了藥效。為中藥復(fù)方的研究開辟了一條新的途徑。


圖1是將復(fù)方組成作為影響因素輸入Box-Behnken Design實驗設(shè)計界面圖。圖2是將冠心病心絞痛檢測分子水平指標(biāo)為輸出因變量輸入試驗設(shè)計圖。圖3是生成各因素均為實際值的試驗設(shè)計表格圖。圖4是各因素的實際值轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a制的操作過程圖。圖5是按照試驗設(shè)計進行試驗，記錄每組因素組合的試驗結(jié)果，填在Response列圖。圖6是經(jīng)過軟件數(shù)據(jù)分析，由RSM預(yù)測最優(yōu)值的圖。
權(quán)利要求
1.一種響應(yīng)面分析法在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用方法，其特征在于將復(fù)方中各組成成分作為輸入試驗變量，以適應(yīng)癥藥效檢測指標(biāo)為輸出響應(yīng)變量，從而客觀有效的反應(yīng)各組分與適應(yīng)癥之間的量效關(guān)系，確定復(fù)方最佳配比以及作用靶點。
2.如權(quán)利要求1所述的響應(yīng)面分析法在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用方法，特征在于響應(yīng)面分析法涉及的所有試驗設(shè)計方法和分析軟件在此方法中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種響應(yīng)面分析法在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用方法。采用響應(yīng)面分析法將復(fù)方中各組成成分作為輸入試驗變量，以適應(yīng)癥藥效檢測指標(biāo)為輸出響應(yīng)變量，以定量方法研究中藥配伍后對于療效和靶點的變化規(guī)律，探尋各成分之間的相互比例和各自的濃度范圍，結(jié)合藥理實驗的方法研究復(fù)方化學(xué)成分的療效以及配伍規(guī)律，然后進行有效成分的組合，進一步研究復(fù)方化學(xué)成分的配伍，從而科學(xué)地闡明中藥復(fù)方的作用原理及配伍規(guī)律，明確是否由于各個成分的協(xié)同作用而產(chǎn)生了藥效。建立一種中藥復(fù)方研究的新方法。
文檔編號A61K38/58GK103049662SQ201210568958
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者粱大連, 張世亮 申請人:山東省醫(yī)藥工業(yè)研究所