專利名稱：清開靈活性組分梔子提取物在制備抗多重耐藥菌的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及桅子的一種新的醫(yī)藥用途，具體地說是在桅子提取物制備抗多重耐藥菌藥物中的應用。
背景技術：
多重耐藥菌(multiple resistant bacteria)是指有多重耐藥性的病原菌,即一種微生物對三類(比如氨基糖苷類、紅霉素、B —內酰胺類)或三類以上抗生素同時耐藥。其中最為多見的是NDM-1、MDR-TB、MDR-MRSA以及常在I⑶中出現的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌。NDM-1 (NewDelhimetallo-β-lactamase-1,新德里金屬 β -內酸胺酶)，又名 NDM-1細菌，是一種耐碳青霉烯類的酶。NDM-1基因常由質粒攜帶，但也整合在細菌的染色體上，易于在不同的菌株間傳播和擴散，NDM-1編碼的蛋白單體分子量為28kDa，它的序列和其他MBL的序列相似性很低。NDM-1主要分布在腸桿菌科和鮑曼不動桿菌中，攜帶NDM-1的細菌 不但包括條件致病菌，也包括致病菌，如常見的志賀氏菌、霍亂、綠膿假單胞桿菌等。它具有高度耐藥性，幾乎可以水解臨床常用的一線抗菌藥物，包括β_內酰胺類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類、氨基糖苷等。長期以來，抗生素藥物的濫用，是催生多重耐藥菌的重要原因。目前，多重耐藥菌感染呈現出增長趨勢，但抗菌藥物選擇方案卻很少，因此重耐藥菌感染已成為全球性棘手問題。桅子(菌草科植物桅子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實)為清熱解毒復方中藥清開靈注射液的主要原料藥，具有護肝、利膽、降壓、鎮(zhèn)靜、止血、消腫等作用，在中醫(yī)臨床常用于治療黃疸型肝炎、扭挫傷、高血壓、糖尿病等癥，并且具有良好的效果。開發(fā)和研究桅子更多更好的醫(yī)藥功效，是許多中醫(yī)藥學領域的重要研究課題之一。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是要開發(fā)桅子提取物的新醫(yī)藥用途，同時為臨床提供一種可有效拮抗多重耐藥菌的藥物。本發(fā)明的發(fā)明人經長期研究發(fā)現桅子提取物對含NDM-1耐藥基因細菌具有顯著地抑制作用，且與藥物濃度成正比，從而發(fā)明了桅子提取物的一種新的醫(yī)藥用途，即完成了桅子提取物在制備抗多重耐藥菌藥物中的應用。本發(fā)明所述的桅子提取物可按照常規(guī)的中藥提取方法進行。本發(fā)明在此提供的方法如下(I)取桅子適量，加水煎煮兩次，，過濾，合并兩次濾液；(2)所得濾液減壓濃縮，放冷后在攪拌下加乙醇使含醇量達60%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇,加水稀釋,過濾；(3)將所得濾液上大孔吸附樹脂，依次用水、乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，得桅子提取物，冷藏。
其中，步驟(I)中，加水煎煮，第一次加8倍量的水，煮沸2小時，第二次加6倍量的水，煮沸I小時；步驟(2)中，加水稀釋至相對密度1. 05 1. 2 (60°C);步驟(3)中，洗脫劑水用量是5 7倍量柱體積、乙醇是8 10倍量柱體積的40%乙醇。本發(fā)明所述桅子提取物，可按照現有技術所述方法制備成顆粒、沖劑、射劑、膠囊等藥物制劑。本發(fā)明中所述的多重耐藥菌是指含有NMD-1基因的多重耐藥菌，包括乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii,A. baumannii)、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)或含 NDM-1 耐藥基因大腸桿菌(Escherichia coli)。
上述含NDM-1耐藥基因檢測菌株為革蘭氏陰性菌，具有較強的致病性和抗生素耐藥性。其中，乙酸鈣不動桿菌和鮑曼不動桿菌可引起肺部感染、傷口及皮膚感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染、菌血癥菌血癥、腦膜炎等，麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌能引起嚴重的呼吸系統(tǒng)感染等，含NDM-1耐藥基因大腸桿菌可引發(fā)對腸道感染且對抗生素具有抗藥性。更進一步地，本發(fā)明還提供了桅子提取物在制備抗乙酸鈣不動桿菌藥物中的應用，即桅子提取物在制備治療和/或預防乙酸鈣不動桿菌引起的疾病的藥物中的應用。更進一步地，本發(fā)明還提供了桅子提取物在制備抗鮑曼不動桿菌藥物中的應用，即桅子提取物在制備治療和/或預防鮑曼不動桿菌引起的疾病的藥物中的應用。更進一步地，本發(fā)明還提供了桅子提取物在制備抗嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌藥物中的應用，即桅子提取物在制備治療和/或預防嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌引起的疾病的藥物中的應用。更進一步地，本發(fā)明還提供了桅子提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因細菌藥物中的應用。更進一步地，本發(fā)明還提供了桅子提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因大腸桿菌藥物中的應用，即桅子提取物在制備治療和/或預防含NDM-1耐藥基因大腸桿菌引起的疾病的藥物中的應用。本發(fā)明所述桅子制劑可用于治療上述由含NDM-1耐藥基因多重耐藥細菌引發(fā)的疾病，如含NDM-1耐藥基因多重耐藥細菌引發(fā)的腸道感染、呼吸系統(tǒng)感染、傷口及皮膚感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染、菌血癥菌血癥、腦膜炎等，尤其是適用于治療由乙酸鈣不動桿菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌或含NDM-1耐藥基因大腸桿菌引發(fā)的疾病。本發(fā)明所述藥物制劑在作為本發(fā)明的用途使用時，其具體用量時可根據臨床實驗以及患者的具體情況確定。
具體實施方案以下通過實施例和試驗例來進一步闡述本發(fā)明所述藥物的有益效果。實施例1桅子提取物的制備方法(I)取桅子適量，加水煎煮兩次，第一次加8倍量的水，煮沸2小時，第二次加6倍量的水，煮沸I小時，過濾，合并兩次濾液；(2)所得濾液減壓濃縮至原藥材量1. 5 2倍體積時,放冷后在攪拌下加乙醇使含醇量達60%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇，加水稀釋到相對密度為1. 05 1. 2 (60°C )，過濾；(3)將所得濾液上大孔吸附樹脂，依次用5 7倍量柱體積的水、8 10倍量柱體積的40%乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，得桅子提取物，冷藏。藥效學試驗試驗例I桅子提取物對含NDM-1耐藥基因細菌的抑菌效果研究本藥效學試驗所采用的檢測菌株乙酸I丐不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus, A.calcoaceticus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii,A.baumannii)和嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia, S. maltophilia),均含有 blaNDM-Ι 耐藥基因；pGEX-4T-NDMl_DH5 α 是含 NDM-1 重組質粒的大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli) ；pGEX-4T-NDM-l-BL21 (在大腸桿菌 BL21 中表達NDM-1)是含NDM-1重組質粒的大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)，其質粒上帶有GST標簽。上述菌株均由中國人民解放軍疾病預防控制所提供。配制LB瓊脂培養(yǎng)基，高壓冷卻至60°C時，取桅子提取物，按1:9 (藥物LB，V/V)t匕例配制不同濃度藥物(O. lg/ml、0. 2g/ml、0. 3g/ml)平板,瓊脂厚度3_4mm,制備藥物平板，備用。研究梔子對含NDM-1耐藥基因細菌進行抑菌實驗將4株含NDM-1基因耐藥菌株乙酸鈣不動桿菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌及大腸桿菌PGEX-4T-NDM1-DH5 α分別接種于含16 μ g/ml亞胺培南的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)過夜，次日菌液用無菌PBS緩沖液稀釋10倍后，分別吸取2 μ I接種于藥物瓊脂平板表面或采用劃線法接種，平板置于37°C孵育24h左右，觀察各菌株生長狀況，得梔王提取物的抑菌性測定結果，見表I。采用瓊脂稀釋法對桅子提取物的最小抑菌濃度(MIC)進行測定，將耐藥菌株接種于不同藥物濃度的瓊脂平板上，37°C孵育24h左右，觀察各菌株生長狀況，抑制菌株不能生長的最小藥物濃度(MIC值)分別為乙酸鈣不動桿菌O. 3g/ml、鮑曼不動桿菌O. 3g/ml、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌 O. 2g/ml、pGEX-4T-NDM-l-BL21 O. 3g/ml。實驗結果表明桅子對耐藥菌株均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用明顯增強，說明桅子對含NDM-1耐藥基因耐藥菌都有抑制作用，且抑菌效果明顯；藥物對不同檢測菌株的抗菌能力不同，MIC也有所差異，具有較強的廣譜抗含NDM-1耐藥基因耐藥菌的能力。表I桅子提取物濃度對菌株的影響
權利要求
1.桅子提取物在制備抗多重耐藥菌的藥物中的應用。
2.桅子提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因細菌藥物中的應用。
3.桅子提取物在制備抗乙酸鈣不動桿菌藥物中的應用。
4.桅子提取物在制備抗鮑曼不動桿菌藥物中的應用。
5.桅子提取物在制備抗嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌藥物中的應用。
6.桅子提取物在制備抗含NDM-1耐藥基因大腸桿菌藥物中的應用。
7.根據權利要求1-6中任意一項所述應用，其特征在于，所述桅子提取物由桅子藥材，加水煎煮兩次，過濾，合并濾液，所得濾液減壓濃縮，放冷后在攪拌下加乙醇使含醇量達60%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇，加水稀釋到相對密度為1. 05 1. 2(60°C)，過濾，所得濾液上大孔吸附樹脂，依次用5 7倍量柱體積的水、8 10倍量柱體積的40%乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾，減壓回收乙醇至無醇味，即得。
全文摘要
本發(fā)明涉及清開靈活性組分梔子提取物對乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，A.baumannii)、嗜麥芽寡養(yǎng)窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)及含NDM-1耐藥基因大腸桿菌(Escherichia coli)具有抑制作用，因此它可用于抑制這些細菌病并治療和/或預防這些細菌引起的疾病。
文檔編號A61K36/744GK102988537SQ20121055017
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權日2012年12月17日
發(fā)明者劉軍鋒, 袁靜, 張狀年, 黃留玉, 李 東, 王雪松, 姜海 申請人:河北神威藥業(yè)有限公司