專利名稱：靶向HIV-1特異siRNA生物納米粒及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有Hiv-I特異基因沉默作用的SiRNA生物納米粒，本發(fā)明還涉及所述生物納米粒的制備方法，以及在制備防治艾滋病藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是當(dāng)前艾滋病治療的新方法。RNA干擾(RNA interference, RNAi)又稱為依賴于RNA的基因沉默機(jī)制，是通過雙鏈RNA (double-strand RNA, dsRNA)特異性地抑制與其序列同源的靶基因mRNA表達(dá)的現(xiàn)象。即在胞質(zhì)中，雙鏈RNA引發(fā)了同源mRNA的降解，故也被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(post-transcriptional gene-silencing, PTGS)。RNAi治療AIDS的研究現(xiàn)狀
siRNAs或miRNAs可以特異地結(jié)合靶mRNA，弓I起靶mRNA降解或翻譯抑制，最終導(dǎo)致基因特異性沉默。RNAi技術(shù)很可能為抗HIV治療的研究打開突破口。基因沉默靶點(diǎn)的確立HIV-I基因組編碼區(qū)由9個(gè)開放讀框組成，包括3個(gè)結(jié)構(gòu)基因(gag、pol、env),2個(gè)調(diào)節(jié)基因(tat、rev)和4個(gè)輔助基因(vif、vpr、vpu、nef )。非結(jié)構(gòu)基因曾被認(rèn)為不是HIV-I病毒復(fù)制所必需的“非必需基因”，但是近年來越來越多的研究表明HIV-I的非結(jié)構(gòu)基因在病毒的致病機(jī)理、感染性、潛伏上都有著重要的作用，因此本發(fā)明將非結(jié)構(gòu)基因作為抗病毒治療的靶點(diǎn)。HIV-ITat蛋白不僅參與反式激活病毒的表達(dá)，還參與AIDS相關(guān)疾病的病理機(jī)理，如神經(jīng)毒性作用、致癌原性、免疫抑制原性等，在HIV-I的病毒復(fù)制及致病中都起了重要的作用。Rev蛋白可以與Rev應(yīng)答元件(Rev response element, RRE)結(jié)合,介導(dǎo)未拼接和不完全拼接的mRNA從胞核向胞漿內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)病毒結(jié)構(gòu)蛋白和酶的合成，引發(fā)HIV基因表達(dá)由早期向晚期的轉(zhuǎn)換。Vpr可以在病毒復(fù)制的早期，反式激活HIV-1LTR，促進(jìn)病毒基因的表達(dá)；介導(dǎo)和增強(qiáng)整合前復(fù)合體的核轉(zhuǎn)運(yùn)；改變細(xì)胞基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯及細(xì)胞凋亡。病毒感染因子(Viral Infectivity Factor,Vif)可以抵抗載脂蛋白 B mRNA 編輯酶催化多妝樣蛋白 3G(human protein apoliproteinB mRNA-editingenzyme-catalytic polypeptide-1 ike~3G, AP0BEC3G)的抗病毒活性，增強(qiáng) HIV-1 毒粒的感染力。研究顯示，HIV的gag和nef基因均可以通過RNAi進(jìn)行沉默，RNAi方法治療艾滋病已經(jīng)成為艾滋病治療研究的熱點(diǎn)，研究顯示通過RNAi方法可以阻止HIV感染及抑制HIV復(fù)制。但其技術(shù)本身仍存siRNA穩(wěn)定性差、容易降解、無靶向性等問題。以重組病毒載體方式導(dǎo)入的siRNA雖然穩(wěn)定性較高，但是又帶來導(dǎo)入效率及載體基因整合等問題。人間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)具有多向分化潛能，自身免疫原性低，取材方便。目前美國(guó)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)其用于自身免疫疾病及基因治療載體等多個(gè)方面的臨床試驗(yàn)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選出針對(duì)HIV-I非結(jié)構(gòu)基因vpr，tat, vif, rev具有基因沉默作用的siRNAs序列，并將這些siRNAs序列構(gòu)建到慢病毒載體，在干細(xì)胞及其他傳代細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，制備一種含有對(duì)HIV特異性沉默的SiRNA的生物顆粒，以用于制備預(yù)防和治療艾滋病的藥物。本發(fā)明提供了一種靶向Hiv-I特異性SiRNA慢病毒為載體間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的siRNA生物納米粒，經(jīng)體外HIV活病毒攻擊實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可用于艾滋病毒的感染者和艾滋病患者的治療。本發(fā)明有如下創(chuàng)新點(diǎn)其一，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了可使HIV-I非結(jié)構(gòu)基因vpr，tat, vif, rev基因沉默的6個(gè)siRNAs序列本發(fā)明人針對(duì)HIV-I病毒基因組的vpr, tat, rev, vif基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了 14條干擾RNA序列，經(jīng)實(shí)驗(yàn)篩選，發(fā)現(xiàn)其中以下6條siRNA序列可以特異地靶向HIV-lvpr， tat, vif,rev
靶向siRXAs序列名稱卬列兮序列
vprVpr—sh4SEQ ID MO: I gagtgaagc t gt tagacat
tatTat-1x4SEQ II) NO;2 gtgttgctttcattgccaa
Tal、rev tat and rev-1x6 SEQ ID NO:3 gacicaicaagcticicia
revrev-Ixl ISKQ ID XO:4 ggtggaatctcctacagta
￥ifvilMSEQ ID NO:5 tatcaagcaggacataaca
VifVif-2SEQ ID NO:6 agagactggcatttgggtc其二，本發(fā)明構(gòu)建了含有HIV env基因的重組慢病毒載體，篩選到能夠穩(wěn)定表達(dá)HIV跨膜蛋白gpl20和gp41的hMSC-env細(xì)胞系。該細(xì)胞系的名稱為XXXX，已于年月日保藏于XXXX，保藏號(hào)為XXXX所述細(xì)胞系可用于制備siRNA的生物納米粒。由于gpl20蛋白對(duì)⑶4分子具有親和性，使制備的siRNA生物納米粒具有靶向性。其三，本發(fā)明制備了一種含有HIV特異性siRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞生物納米粒該生物納米粒載有上述靶向HIV-I特異性siRNA，所述siRNA的序列如上表所示的SEQID NO:I SEQ ID NO:6。該生物納米粒還具有以下特征I)大小在 10_500nm 之間；2)具有人間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Mesenchymal Stem Cells, hMSC)外膜；3)鑲嵌病毒的膜蛋白gpl20。本發(fā)明在人CD4+T淋巴細(xì)胞和人造血干細(xì)胞(Human Hematopoietic StemCell, hHSC)中檢測(cè)了獲得的生物納米粒對(duì)HIV活病毒的抑制效率。經(jīng)此實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該生物納米?？勺鳛樗幬镏苯佑糜谥委熀皖A(yù)防艾滋病。其五，本發(fā)明提供了上述含有HIV特異性siRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞生物納米粒的制備方法
方法是將含有上述siRNA序列(I 6個(gè))的雙鏈DNA構(gòu)建到永久性表達(dá)目的基因的重組慢病毒載體中，在293T細(xì)胞中包裝出重組慢病毒；用收獲的重組病毒感染hMSC，加入嘌呤霉素篩選出表達(dá)siRNA的hMSC細(xì)胞系，經(jīng)篩選表達(dá)siRNA的hMSC細(xì)胞系可以持續(xù)高效的表達(dá)siRNA ;體外連續(xù)收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，超速離心濃縮，獲得含有siRNA的生物納米粒。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明結(jié)合siRNA的高效性和hMSC的低免疫原性，在提高siRNA的穩(wěn)定性的同時(shí)避免載體整合帶來的安全性問題。具體而言，選用針對(duì)HIV特異性的siRNA，以攜帶特異性的siRNA重組慢病毒將其導(dǎo)入到永生化的間充質(zhì)細(xì)胞中，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄復(fù)制，以吐胞的形式將帶有永生化間充質(zhì)細(xì)胞膜的siRNA生物納米粒分泌到細(xì)胞外，經(jīng)過濃縮純化后，用于HIV-I的基因治療。本發(fā)明方法提供的含有HIV特異性siRNA的生物顆粒具有以下優(yōu)點(diǎn)
I、提高了穩(wěn)定性利用生物膜包被的方式提高了 siRNA的穩(wěn)定性；2、提高了安全性，適用范圍廣本方法與現(xiàn)有技術(shù)的病毒載體導(dǎo)入方式相比又大大提高了安全性。其中間充質(zhì)干細(xì)胞制備的顆粒具有較為廣泛的組織親和性，同時(shí)免疫原性較低，從而適用范圍更加廣泛;3、更具有靶向性針對(duì)siRNA無靶向性的問題，本發(fā)明還構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)HIV-1gp 120蛋白的永生化的間充質(zhì)細(xì)胞株，由于gpl20蛋白對(duì)CD4分子具有親和性使得制備的siRNA生物顆粒具有靶向性。4、可抑制HIV活病毒本發(fā)明在人CD4+T淋巴細(xì)胞和人造血干細(xì)胞(Human Hematopoietic StemCell, hHSC)中檢測(cè)了獲得的生物納米粒對(duì)HIV活病毒的抑制效率，證實(shí)了其可直接作為防治艾滋病的藥物，以及在HIV基因治療方面具有的其它潛在價(jià)值。
圖I是siRNA/miRNA真核表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖；A: siRNA/miRNA 真核表達(dá)載體 pSR-GFP/Neo ；B siRNA/miRNA 真核表達(dá)載體 pcDNA6. 2Gff/EmGFP-miR)；圖2為倒置熒光顯微鏡下觀察vpr特異性siRNA對(duì)GFP-Vpr融合蛋白表達(dá)的抑制情況；圖3為流式細(xì)胞儀檢測(cè)vpr特異性siRNA對(duì)GFP-Vpr融合蛋白表達(dá)的抑制作用，圖中縱軸為抑制率(％)，橫軸為siRNA樣品編號(hào)；圖4為實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)vpr mRNA拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量；圖5為vpr特異性siRNA抑制假病毒在TZMBL細(xì)胞中的感染力(圖中點(diǎn)為藍(lán)斑)；圖6為倒置突光顯微鏡下觀察vpr特異性miRNA對(duì)Vpr_dsRed融合蛋白表達(dá)的抑制作用，圖中control中細(xì)胞發(fā)出紅色熒光；
圖7為倒置熒光顯微鏡下觀察tat特異性siRNA對(duì)Tat-dsRed融合蛋白表達(dá)的抑制作用，圖中亮點(diǎn)為細(xì)胞發(fā)出的紅色熒光；圖8為流式細(xì)胞儀檢測(cè)tat特異性siRNA對(duì)Tat-dsRed融合蛋白表達(dá)的抑制作用圖中縱軸為抑制率(％)，橫軸為siRNA樣品編號(hào)；圖9為Western Blot檢測(cè)tat特異性siRNA對(duì)Tat-dsRed融合蛋白表達(dá)的抑制作用，圖中上面條帶為tat-red融合蛋白(40KD)，下面條帶為GAPDH蛋白(39KD)；圖10為實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)tatmRNA拷貝數(shù)進(jìn)行相對(duì)定量，圖中縱軸為抑制率(％)，橫軸為對(duì)照和siRNA樣品編號(hào)；圖11為tat特異性siRNA抑制假病毒在TZMBL細(xì)胞中的感染力，圖中縱軸為抑制率(％)，橫軸為tat-siRNA樣品編號(hào)，白色柱狀圖siRNA量為O. I μ g，灰色圖siRNA量為
O.2μ g ； 圖12為Western Blot檢測(cè)tat特異性miRNA對(duì)Tat-daRed融合蛋白表達(dá)的抑制作用；圖13為構(gòu)建的重組慢病毒plvx-shRNAl和plvx_shRNA2 ；圖14為建立的穩(wěn)定表達(dá)siRNA間充質(zhì)干細(xì)胞系；生物材料保藏信息保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏物名稱穩(wěn)定表達(dá)gpl20和gp41的間充質(zhì)干細(xì)胞系hMSC_env保藏編號(hào)CGMCCNO. 6707保藏日期2012-10_2具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所用的試劑、質(zhì)粒等來源如下
權(quán)利要求
1.一種生物納米粒，含有靶向Hiv-I特異性siRNA，所述SiRNA選自SEQ ID NO: I SEQ ID NO:6所示序列的I 6種。
2.權(quán)利要求I所述的生物納米粒，還具有以下特征 1)大小在10-500nm之間； 2)具有人間充質(zhì)干細(xì)胞(HumanMesenchymal Stem Cells, hMSC)外膜； 3)鑲嵌病毒的膜蛋白gpl20。
3.權(quán)利要求I或2所述的生物納米粒使HIV-I非結(jié)構(gòu)基因沉默的功能，所述非結(jié)構(gòu)基因選自vpr, tat, vif或rev中的一種或多種。
4.權(quán)利要求I或2所述的生物納米粒在制備治療和預(yù)防艾滋病藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I所述的生物納米粒的制備方法，將含有SEQID NO: I SEQ ID N0:6所示序列的I 6種的雙鏈DNA構(gòu)建到永久性表達(dá)目的基因的重組慢病毒載體中，在293T細(xì)胞中包裝出重組慢病毒；用收獲的重組病毒感染hMSC，加入嘌呤霉素篩選出表達(dá)siRNA的hMSC細(xì)胞系，經(jīng)篩選表達(dá)siRNA的hMSC細(xì)胞系可以持續(xù)高效的表達(dá)siRNA ;體外連續(xù)收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，超速離心濃縮，獲得含有siRNA的生物納米粒。
6.SEQ ID NO: I SEQ ID NO:6 所示序列的 siRNAs。
7.權(quán)利要求6所述siRNAs的功能，是使HIV-I非結(jié)構(gòu)基因沉默，每個(gè)siRNA針對(duì)的靶向HIV-I非結(jié)構(gòu)基因如下所示
8.一種可表達(dá)HIV-I跨膜蛋白gpl20hMSC-env細(xì)胞系，名稱為hMSC-env，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 6707。
9.權(quán)利要求8所述細(xì)胞系在制備siRNA的生物納米粒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明獲得了一種含有靶向HIV-1特異性siRNA的生物納米粒，該生物納米粒具有HIV-1特異基因沉默作用。所述siRNA選自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6所示序列的1～6種。本發(fā)明在人CD4+T淋巴細(xì)胞和人造血干細(xì)胞(Human Hematopoietic Stem Cell,hHSC)中檢測(cè)了獲得的生物納米粒對(duì)HIV活病毒的抑制效率，證實(shí)了其可直接作為防治艾滋病的藥物。
文檔編號(hào)A61P31/18GK102895675SQ20121041050
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者滕智平, 馬晶, 郝彥哲, 楊怡姝, 孫曉梅, 曾毅 申請(qǐng)人:曾毅, 滕智平, 楊怡姝