抗腫瘤藥物復(fù)合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種協(xié)同的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的納米復(fù)合物包含與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗腫瘤藥物和凋亡素，其中，所述的抗腫瘤藥物和凋亡素的質(zhì)量比例為1:100-100:1，所述的蛋白質(zhì)、抗腫瘤藥物和凋亡素分別占復(fù)合物總質(zhì)量的10%-98%、0.01%-50%和0.01%-50%，條件是所述蛋白質(zhì)、抗腫瘤藥物和凋亡素的質(zhì)量之和為100%；所述的復(fù)合物粒徑為50-500nm。本發(fā)明的復(fù)合物可通過物理混合的方法制備得到。本發(fā)明的復(fù)合物可混懸在稀釋液中形成新的抗腫瘤復(fù)合物。該復(fù)合物不會因加入乳化劑和增溶劑而引起過敏反應(yīng)。另外，該復(fù)合物利用凋亡素和化療藥物不同的抗腫瘤機(jī)理，發(fā)揮強(qiáng)力的協(xié)同作用，可降低化療藥物的給藥劑量，從而降低其毒副作用。
【專利說明】抗腫瘤藥物復(fù)合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物復(fù)合物以及所述復(fù)合物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是人類最難對付的頑癥之一。近年來，腫瘤的發(fā)病率急劇上升，其治療難度大、死亡率高，己成為人類死亡的第二大病因。據(jù)報(bào)道，全世界每年約有600萬人死于惡性腫瘤；中國癌癥患者約450萬人,死亡率逾30%,已成為嚴(yán)重的社會問題。目前，臨床上常采用的治療惡性腫瘤的手段包括手術(shù)、化療及放療等。對于早期腫瘤，手術(shù)切除輔以其它療法往往可取得較好的治療效果；而對于晚期腫瘤，多以放、化療綜合治療以延緩病情的發(fā)展，但均伴隨嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)抑制或毒副作用，難以有效提高患者的生存率和生活質(zhì)量。因而，探尋療效好、不良反應(yīng)較小的治療手段或藥物一直是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)和努力方向。
[0003]在抗腫瘤領(lǐng)域，由于大多數(shù)藥物的溶解性較差，因此藥學(xué)研究者一直致力于通過制劑手段改善這一局面。通常現(xiàn)有的制劑手段是將該類藥物制成微乳、脂質(zhì)體、納米粒等新型劑型以改善藥物原有性質(zhì)。如美國專利6，046，230中提到將水不溶性藥物溶于有機(jī)溶劑(如乙醇等)和其它混合增溶劑(如PEG300和聚氧乙烯類表面活性劑的混合物)中，然后與生理鹽水混合形成納米乳劑以提高藥物的溶解性。如FDA批準(zhǔn)了阿霉素脂質(zhì)體用于卵巢癌治療，該制劑以PEG-STEALTH為載體制成包載阿霉素的脂質(zhì)體用于注射給藥，該遞藥系統(tǒng)能夠避開體內(nèi)免疫系統(tǒng)的吞噬，從而起到延長體內(nèi)循環(huán)時間，提高藥物生物利用度的作用，同時還可增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物蓄積濃度。
[0004]紫杉醇為抗腫瘤藥中最為經(jīng)典的藥物。它本是一種天然產(chǎn)物，是從紅豆杉樹皮或針葉中提取的一種四環(huán)二萜類化合物，具有穩(wěn)定微管并促進(jìn)其聚合和組裝的獨(dú)特抗腫瘤作用，被譽(yù)為20世紀(jì)抗腫瘤藥物研究的最大發(fā)現(xiàn)(J.Am.Chem.Soc.93:2325(1971))。由于水溶性低，口服生物利用度差，傳統(tǒng)的紫杉醇注射液采用聚氧乙烯蓖麻油-無水乙醇混合助溶劑進(jìn)行溶解，所得制劑商品名為泰素(Taxol)，是目前肺癌、乳腺癌、頭頸癌等的一線化療藥物。臨床上助溶劑的使用對化療治療可產(chǎn)生以下影響:①降低化療療效，由于溶劑在血液中形成的膠束包裹了紫杉醇，從而改變了紫杉醇的生物利用度，使其呈現(xiàn)非線性藥代動力學(xué)表現(xiàn)，同時這種膠束還會包裹合并的藥物，影響合用藥物的生物利用度從而影響藥效增加毒性反應(yīng)，溶劑本身會產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)及骨髓抑制作用，另外，有證據(jù)證明聚氧乙烯蓖麻油會引起神經(jīng)軸突變性和脫髓鞘反應(yīng)，從而使病人在化療前需要激素預(yù)處理以避免嚴(yán)重過敏反應(yīng)發(fā)生及治療中需要或增加生長因子支持，另外，這種溶劑延長了紫杉醇神經(jīng)病變持續(xù)的時間以及造成病人體液潴留；③泰素使用前需要抗組胺預(yù)處理，配制時需要稀釋到較大體積，且耗時較長，往往需要病人住院。而紫杉醇白蛋白納米粒無需預(yù)處理，30分鐘輸注完畢，門診即可完成。綜上，泰素在臨床應(yīng)用時存在過敏、中性粒細(xì)胞減少和神經(jīng)毒性等嚴(yán)重的不良反應(yīng)，使其安全性和有效性受到影響。
[0005]因此，以改善水溶性、增加靶向性、減少不良反應(yīng)為目標(biāo)的紫杉醇制劑研究備受關(guān)注。由美國生物科學(xué)公司(American BioScience Inc.)研發(fā)的紫杉醇-人血白蛋白納米微粒凍干粉針(Abraxane)現(xiàn)已在全球多個國家上市。III期臨床研究結(jié)果顯示,其過敏反應(yīng)發(fā)生率不到1%，較Taxol顯著降低，響應(yīng)率也明顯提高。
[0006]眾所周知，白蛋白是人體內(nèi)最常見的天然蛋白，是人體內(nèi)難溶于水的營養(yǎng)物質(zhì)、維生素和其他化合物的天然轉(zhuǎn)運(yùn)載體，白蛋白攜帶著大分子物質(zhì)穿梭于血管壁，從血循環(huán)中進(jìn)入血管壁另一側(cè)的組織中。這個天然生理過程，被稱為血管內(nèi)皮的胞膜窖轉(zhuǎn)運(yùn)功能。腫瘤組織通過高主動性對白蛋白的攝取獲取難溶于水的營養(yǎng)物質(zhì)保證腫瘤組織的生長。Abraxane就是利用了紫杉醇和白蛋白在高速剪切力的作用下形成由包被蛋白的水不溶性藥物納米顆粒和藥物分子所結(jié)合的游離蛋白組成的納米顆粒系統(tǒng)，該顆粒系統(tǒng)可以轉(zhuǎn)化為易再分散的注射用無菌干粉(國際專利申請W098/14174)。上述給藥系統(tǒng)能將紫杉醇主動轉(zhuǎn)運(yùn)到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度顯著升高，圖1數(shù)據(jù)顯示了放射性標(biāo)記的紫杉醇和白蛋白結(jié)合型紫杉醇在人類乳腺癌細(xì)胞株(代號MX-1)的裸鼠異體移植瘤中隨時間累積的曲線。在相同給藥劑量下，白蛋白結(jié)合紫杉醇組的AUC較紫杉醇組高33%。目前可能的解釋為:①腫瘤及周圍的基質(zhì)細(xì)胞會分泌白蛋白結(jié)合蛋白，使得與白蛋白結(jié)合的藥物富集于腫瘤(Kratz F.J Control Release.2008; 132[3]:171-183);②腫瘤細(xì)胞特異性的血管分化和高滲漏性血管，使得白蛋白結(jié)合型紫杉醇較游離紫杉醇更易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞(Gardner ER 等，Clin Cancer Res.2008; 14[13]:4200-4205);③白蛋白結(jié)合型紫杉醇的形式較游離紫杉醇具有更強(qiáng)的通過內(nèi)皮細(xì)胞能力(Desai等，Clin CancerRes.2006;12[4]:1317-1324)o
[0007]此外，中國專利申請03108361.7對該給藥系統(tǒng)的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，不但簡化了工藝流程，降低了生產(chǎn)成本，而且還提高了該給藥系統(tǒng)在可注射的生理溶液中的穩(wěn)定性。總之，應(yīng)用白蛋白結(jié)合技術(shù)最大的優(yōu)勢體現(xiàn)在避免了使用表面活性劑，降低過敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)率；但仍然存在總體療效有限，大劑量使用時，紫杉醇對全身副作用較大的問題。
[0008]近年來腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis inducingligand, TRAIL)作為腫瘤壞死因子超家族的一員，受到諸多研究者和制藥公司的關(guān)注?，F(xiàn)有技術(shù)公開了 TRAIL全分子由`281個氨基酸組成，分子量約為32000道爾頓，其N-末端第15~40位氨基酸為疏水區(qū)域形成的跨膜結(jié)構(gòu)，N-末端第95~281位或114~281位氨基酸組成的C-末端胞外區(qū)域?yàn)橛H水性區(qū)域。TRAIL的活性形式為胞外親水性區(qū)域與鋅離子絡(luò)合形成的同源三聚體。與其他腫瘤壞死因子或化療藥物相比，TRAIL可快速啟動細(xì)胞凋亡信號途徑，強(qiáng)力誘導(dǎo)腫瘤和轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡，對正常組織細(xì)胞則基本無影響。有研究顯示，隨著TRAIL濃度的增加，其對人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用明顯增強(qiáng)，對正常細(xì)胞基本無殺傷作用(參見 Henning Walczak 等，Nat Med, 2002，8:808_815)。TRAIL 的這一優(yōu)點(diǎn)使其在腫瘤治療方面有著廣闊的應(yīng)用前景。由美國Genetech和Immunex公司聯(lián)合研制開發(fā)的TRAIL已于2001年經(jīng)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入I期臨床研究；國內(nèi)恰爾生物技術(shù)有限公司研制的TRAIL注射劑目前已經(jīng)結(jié)束III期臨床研究，正處于揭盲階段?；赥RAIL的潛在應(yīng)用優(yōu)勢，國內(nèi)外已有研究者通過生物工程技術(shù)，利用工程菌重組表達(dá)產(chǎn)生TRAIL全分子N-末端第95~281位或第114~281位氨基酸所形成的親水性蛋白分子，稱之為重組人凋亡素2配體。
[0009]有文獻(xiàn)報(bào)道，凋亡素與化療藥物合用可增加其對腫瘤細(xì)胞的抑制和凋亡作用(參見 Naka T 等，Cancer Res,2002,62:5800-5906 ；Heather Wahl 等，GynecolOncol,2007,105:104-112 ；Thomas J等,Cancer Immunol Immun, 2006, 55:76-84),兩者具有協(xié)同的抗腫瘤效果。但是，仍存在以下缺陷:①TRAIL的生物半衰期較短(人體的T1/2〈0.6小時)，為維持其有效血藥濃度，用藥頻繁且給藥劑量大，而大劑量TRAIL具有發(fā)熱、乏力、白細(xì)胞降低及中性粒細(xì)胞降低等毒副作用TRAIL和化療藥物組織分布廣泛，對腫瘤細(xì)胞無專屬的靶向治療作用；③由于腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥特性，TRAIL與化療藥物合用的療效仍然有限，至今尚未取得令人矚目的進(jìn)展。利用納米遞藥系統(tǒng)克服上述缺陷是治療腫瘤的一種新思路。
[0010]中國專利申請201010263759.0提供了一種包載抗腫瘤藥物復(fù)合物的注射用脂質(zhì)體，利用脂質(zhì)體的保護(hù)作用和長循環(huán)效果，可顯著提高蛋白藥物TRAIL的穩(wěn)定性，延長TRAIL和化療藥物的體內(nèi)滯留時間；利用脂質(zhì)體對腫瘤的EPR效應(yīng)，使更多藥物濃集于腫瘤組織；利用TRAIL和化療藥物不同的抗腫瘤機(jī)理，產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用，有望顯著提高藥物的抗腫瘤效果，降低毒副作用。但是，因?yàn)門RAIL和化療藥物的理化性質(zhì)差異很大，難以包載在同一個脂質(zhì)體中，并且TRAIL的包封率和載藥量很低，很大程度上限制了該復(fù)合物脂質(zhì)體的進(jìn)一步生廣和臨床應(yīng)用。而TRAIL與白蛋白在聞壓均質(zhì)的作用下可行程穩(wěn)定的二硫鍵，很好的夠解決脂質(zhì)體的上述不足。且目前尚無專利提供由蛋白穩(wěn)定的活性腫瘤藥物和凋亡素組成的用于治療腫瘤的復(fù)合物專利和文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的一個目的是提供一種新型的供體內(nèi)輸送的抗腫瘤藥物復(fù)合物，特別是一種含有抗腫瘤藥物、凋亡素和蛋白質(zhì)結(jié)合的抗腫瘤藥物通過電荷作用或化學(xué)鍵結(jié)合形成的納米復(fù)合物。
[0012]本發(fā)明的另一個目的是提供所述納米復(fù)合物的制備方法，所述的制備方法簡便，對抗腫瘤藥物和凋亡素的包封率和載藥量都很高。
[0013]本發(fā)明的納米復(fù)合物利用納米系統(tǒng)的被動腫瘤靶向作用及凋亡素和抗腫瘤藥物不同抗腫瘤機(jī)理的協(xié)同作用，提高抗腫瘤效果，降低毒副作用。
[0014]本發(fā)明的目的是通過下列構(gòu)思來實(shí)現(xiàn)的:一種協(xié)同的納米復(fù)合物，它包含與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗腫瘤藥物和凋亡素，其中`，所述的抗腫瘤藥物和凋亡素的質(zhì)量比例為1:100-100:1,所述的蛋白質(zhì)、抗腫瘤藥物和凋亡素分別占復(fù)合物總質(zhì)量的10%-98%、
0.01%-50%和0.01%-50%，條件是所述蛋白質(zhì)、抗腫瘤藥物和凋亡素的質(zhì)量之和為100% ;所述的復(fù)合物粒徑為50-500nm。
[0015]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的抗腫瘤藥物和凋亡素的質(zhì)量比例為1:10-10:1，更好的是 1:8-8:1。
[0016]在另一個實(shí)施方案中，所述的復(fù)合物粒徑優(yōu)選為100_150nm。
[0017]本發(fā)明中的術(shù)語具有如下定義:
[0018]本文中使用的“凋亡素”指人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-relatedapoptosis inducing ligand, TRAIL)、重組人凋亡素 2 配體(Recombinant HumanApo-21igand，Apo2-L)和表達(dá) TRAIL 或 Apo2_L 的基因及相關(guān) TRAIL (PEG，PLGA)修飾產(chǎn)物。
[0019]所述的TRAIL全分子由281個氨基酸組成，分子量約為32000道爾頓，其N-末端第15~40位氨基酸為疏水區(qū)域形成的跨膜結(jié)構(gòu)，N-末端第95~281位或114~281位氨基酸組成的C-末端胞外區(qū)域?yàn)橛H水性區(qū)域。TRAIL的活性形式為胞外親水性區(qū)域與鋅離子絡(luò)合形成的同源三聚體。[0020]所述的Apo2-L是由工程菌重組表達(dá)產(chǎn)生的TRAIL全分子的N-末端第95~281位或第114~281位氨基酸所形成的親水性蛋白分子，也可以是N-末端第95與114位之間任何一位氨基酸到第281位氨基酸所形成的親水性蛋白分子。 [0021]所述的表達(dá)TRAIL或Apo2-L的基因可以通過工程菌表達(dá)TRAIL全分子或Apo2_L及相關(guān)TRAIL (PEG, PLGA)修飾產(chǎn)物。
[0022]所述的凋亡素每次的給藥劑量為10~5000 μ g/kg,優(yōu)選的每次給藥劑量為50~1000 μ g/kg ;給藥方案為每天給藥或間隔給藥，每一療程的給藥劑量為0.14~70mg/kg，優(yōu)選的每一療程的給藥劑量為0.7~14mg/kg。
[0023]本文中使用的“抗腫瘤藥物”或“化療藥物”選自阿霉素、鹽酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、卡氮芥、卡鉬、順鉬、環(huán)磷酰胺、放線菌素D、博來霉素、柔紅霉素、正定霉素、絲裂霉素、阿克拉霉素、干擾素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、龜臼乙叉甙、三苯氧胺、舒尼替尼、阿糖胞苷等。其中優(yōu)選的藥物為阿霉素、鹽酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、順鉬、卡鉬、放線菌素D、舒尼替尼、伊馬替尼、吉非替尼、厄羅替尼、索拉非尼和拉帕替尼。
[0024]在一個實(shí)施方案中，上述藥物的每一療程的給藥劑量分別為:所述的阿霉素和鹽酸阿霉素的給藥劑量為0.5~4.0mg/kg,優(yōu)選的給藥劑量為1.0~2.5mg/kg ;所述的紫杉醇和多烯紫杉醇的給藥劑量為2.0~10.0mg/kg，優(yōu)選的給藥劑量為3.0~6.0mg/kg ;所述的喜樹堿和羥基喜樹堿的給藥劑量為0.1~1.0mg/kg，優(yōu)選的給藥劑量為0.125~0.4mg/kg ;所述的長春堿的給藥劑量為0.05~0.4mg/kg,優(yōu)選的給藥劑量為0.1~0.2mg/kg ;所述的長春新堿的給藥劑量為5.0~100.0 μ g/kg，優(yōu)選的給藥劑量為20.0~60.0 μ g/kg ；所述的長春地辛的給藥劑量為0.05~0.4mg/kg，優(yōu)選的給藥劑量為0.06~0.2mg/kg ;所述的長春瑞濱的給藥劑量為0.2~2.0mg/kg,優(yōu)選的給藥劑量為0.5~1.5mg/kg ;所述的順鉬的給藥劑量為1.0~20.0mg/kg，優(yōu)選的給藥劑量為2.5~12.0mg/kg ;所述的卡鉬的給藥劑量為1.0~20.0mg/kg，優(yōu)選的給藥劑量為1.5~12.0mg/kg ;所述的放線菌素D的給藥劑量為1.0~10.0 μ g/kg，優(yōu)選的給藥劑量為2.0~7.0 μ g/kg ;所述的舒尼替尼的給藥劑量為1.0~10.0mg/kg，優(yōu)選的給藥劑量為2.0~5.0mg/kg ;所述的伊馬替尼的給藥劑量為1.0~10.0mg/kg，優(yōu)選的給藥劑量為2.5~6.8mg/kg ;所述的吉非替尼的給藥劑量為1.0~10.0mg/kg，優(yōu)選的給藥劑量為1.0~5.0mg/kg ;所述的厄羅替尼的給藥劑量為1.0~10.0mg/kg，優(yōu)選的給藥劑量為2.0~8.5mg/kg ;所述的索拉非尼的給藥劑量為1.0~10.0mg/kg，優(yōu)選的給藥劑量為2.0~7.6mg/kg ;所述的拉帕替尼的給藥劑量為
1.0~10.0mg/kg,優(yōu)選的給藥劑量為1.8~7.2mg/kg。
[0025]所述的作為載體計(jì)劃用于本發(fā)明的蛋白類包括白蛋白(含有35個半脫氨酸)、免疫球蛋白、酶蛋白、胰島素(含有6個半脫氨酸)、血紅蛋白(每一個α2β2單位有6個半胱氨酸殘基)、溶菌酶(含有8個半胱氨酸殘基)、免疫球蛋白、α -2-巨球蛋白、纖維連接素、玻璃連接素、纖維蛋白原、脂肪酶等。其中蛋白質(zhì)、肽、酶、抗體及其它們的混合物是本發(fā)明常規(guī)用的穩(wěn)定劑。
[0026]本發(fā)明也提供了一種制備所述抗腫瘤藥物納米復(fù)合物的方法，包括下列步驟:
[0027]( I)使抗腫瘤藥物溶于有機(jī)溶劑，生成疏水相；[0028](2)使凋亡素和蛋白質(zhì)溶于水性溶劑，形成親水相；
[0029](3)將步驟(1)得到的疏水相滴加到步驟(2)得到的親水相，形成所述的抗腫瘤藥物納米復(fù)合物。
[0030]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述步驟(1)中的有機(jī)溶劑選自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、四氫呋喃、二氯六環(huán)、乙腈、丙酮、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮或其混合物。
[0031]所述步驟(2)中的水性溶劑為pH=4.0-6.5的酸性水溶劑，選自鹽酸、醋酸、磷酸、
檸檬酸、檸檬酸二鈉或其混合物。
[0032]具體來說，本發(fā)明制備所述抗腫瘤藥物納米復(fù)合物方法的機(jī)理在于(以紫杉醇和白蛋白為例):①電荷作用。紫杉醇與白蛋白通過上述方法形成納米混懸劑后，其Zeta電位值-15mv左右，而凋亡素蛋白等電點(diǎn)9.21，在生理pH條件下帶正電荷，二者可通過靜電作用形成納米復(fù)合物。藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，納米復(fù)合物中凋亡素的體內(nèi)半衰期顯著延長。②高壓均質(zhì)過程形成二硫鍵交聯(lián)。人血白蛋白含有35個半胱氨酸，凋亡素含有一個半胱氨酸，同上制備紫杉醇白蛋白納米混懸劑的工藝，將一定量的凋亡素按比例加入到水相中，二者在高壓均質(zhì)過程可通過二硫鍵交聯(lián)?？尚纬砂椎鞍装碌幕熕幬锏募{米混懸劑，表面白蛋白通過二硫鍵鏈接一定數(shù)量的凋亡素。
[0033]本發(fā)明的納米復(fù)合物可為靜脈、皮下、肌內(nèi)、膜內(nèi)、腹膜內(nèi)或其它靜脈途徑給藥的形式。
[0034]本發(fā)明的抗腫瘤藥物復(fù)合物對于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌、胰腺導(dǎo)管癌、腸癌等有較好的治療效 果，療效均優(yōu)于抗腫瘤藥物單獨(dú)用藥。
[0035]本發(fā)明的納米復(fù)合物可混懸在適宜的可供體內(nèi)輸送的稀釋液中，形成新的抗腫瘤復(fù)合物。該復(fù)合物以未加修飾的形式遞送抗腫瘤藥物，因此不會因加入乳化劑和增溶劑而引起過敏反應(yīng)。另外，該復(fù)合物利用凋亡素和抗腫瘤藥物不同的抗腫瘤機(jī)理，發(fā)揮強(qiáng)力的協(xié)同作用，提高化療藥物對于腫瘤的治療效果，可降低化療藥物的給藥劑量，從而降低其毒副作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1顯示現(xiàn)有技術(shù)(W098/14174)中白蛋白結(jié)合型紫杉醇和游離紫杉醇給藥后在人類腫瘤異體移植瘤中藥時曲線，其中，腫瘤中白蛋白結(jié)合型紫杉醇的曲線下面積(AUC)是傳統(tǒng)紫杉醇的1.33倍(P〈0.0001),其中,]^13-?3(31；^3161表示一種白蛋白結(jié)合型紫衫醇；CrEL Paclitaxel表示溶于聚氧乙烯蓖麻油(cremephore)中的紫杉醇。
[0037]圖2是白蛋白結(jié)合型紫杉醇和TRAIL復(fù)合物(處方5)的電鏡照片。
[0038]圖3是白蛋白結(jié)合型長春瑞濱和TRAIL復(fù)合物(處方18)的粒徑測定圖。
[0039]圖4顯示了白蛋白結(jié)合型長春瑞濱和TRAIL復(fù)合物(處方18)的穩(wěn)定性情況。
[0040]圖5A為白蛋白結(jié)合型紫杉醇和TRAIL復(fù)合物(處方28)在肺癌模型中的藥效圖。[0041 ] 圖5B為白蛋白結(jié)合型紫杉醇和TRAIL復(fù)合物(處方28 )在乳腺癌模型中的藥效圖。
[0042]圖5C為白蛋白結(jié)合型紫杉醇和TRAIL復(fù)合物(處方28)在卵巢癌模型中的藥效圖。
[0043]圖6為包載凋亡素和化療藥物羥基喜樹堿復(fù)合物(處方7)的藥效學(xué)結(jié)果。
[0044]圖7為包載凋亡素和化療藥物索拉非尼復(fù)合物(處方45)的生存曲線圖。[0045]圖8是實(shí)施例8中白蛋白結(jié)合型多西紫杉醇和TRAIL復(fù)合物在乳腺癌裸鼠模型的藥時曲線。
[0046]圖9是實(shí)施例9中包載凋亡素和阿霉素復(fù)合物的劑量與藥效學(xué)的關(guān)系。
[0047]下面基于具體實(shí)施例對本發(fā)明作詳盡的闡述，這些實(shí)施例僅供闡述用，并非用來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0048]具體實(shí)施方法
[0049]實(shí)施例1:包載凋亡素和化療藥物復(fù)合物的微射流法制備和表征
[0050]將下表1處方1-12中的化療藥物溶于疏水相(或稱為有機(jī)溶劑)，生成油相；磁力攪拌或IKA高剪切力作用下，將溶解藥物的油相逐滴加入以pH7.4磷酸緩沖液(PBS)溶解的凋亡素和白蛋白溶液中，攪拌或剪切力作用一段時間后得粗乳。采用微攝流儀(超高壓微射流納米均質(zhì)機(jī)，美國必宜)高壓均質(zhì)，篩選均質(zhì)壓力，均質(zhì)后得較細(xì)的乳劑。40° C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15-30分鐘中除去有機(jī)溶劑即得到紫杉醇納米混懸劑。該制劑呈透明、有淡藍(lán)色乳光的溶液，凍干后形成粉末即可。
[0051]表1、包載凋亡素和化療藥物等復(fù)合物處方中各組分的比例(w/w%)
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種協(xié)同的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的納米復(fù)合物包含與蛋白質(zhì)結(jié)合的抗腫瘤藥物和凋亡素，其中，所述的抗腫瘤藥物和凋亡素的質(zhì)量比例為1:100-100:1，所述的蛋白質(zhì)、抗腫瘤藥物和凋亡素分別占復(fù)合物總質(zhì)量的10%-98%、0.01%-50%和0.01%-50%，條件是所述蛋白質(zhì)、抗腫瘤藥物和凋亡素的質(zhì)量之和為100% ;所述的復(fù)合物粒徑為50-500nm。
2.如權(quán)利要求1所述的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物和凋亡素的質(zhì)量比例為 1:10-10:1。
3.如權(quán)利要求2所述的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的抗腫瘤藥物和凋亡素的質(zhì)量比例為1:8-8:1。
4.如權(quán)利要求1所述的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的復(fù)合物粒徑為100-150nm。
5.如權(quán)利要求1所述的納米復(fù)合物，其特征在于，所述的凋亡素選自人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體、重組人凋亡素2配體、表達(dá)TRAIL或Apo2-L的基因及PEG或PLGA修飾的TRAIL產(chǎn)物； 所述的TRAIL全分子由281個氨基酸組成，分子量為32000道爾頓，其N-末端第15~40位氨基酸為疏水區(qū)域形成的跨膜結(jié)構(gòu)，N-末端第95~281位或114~281位氨基酸組成的C-末端胞外區(qū)域?yàn)橛H水性區(qū)域； 所述的Apo2-L是由工程菌重組表達(dá)產(chǎn)生的TRAIL全分子的N-末端第95~281位或第114~281位氨基酸所形成的親水性蛋白分子，也可以是N-末端第95與114位之間任何一位氨基酸到第281位氨基酸所形成的親水性蛋白分子； 所述的表達(dá)TRAIL或Apo2-L的基因可以通過工程菌表達(dá)TRAIL全分子或Apo2_L及相關(guān) TRAIL (PEG, PLGA)修飾產(chǎn)物； 所述的抗腫瘤藥物選自阿霉`素、鹽酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、卡氮芥、卡鉬、順鉬、環(huán)磷酰胺、放線菌素D、博來霉素、柔紅霉素、正定霉素、絲裂霉素、阿克拉霉素、干擾素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、龜臼乙叉甙、三苯氧胺、舒尼替尼、阿糖胞苷等。其中優(yōu)選的藥物為阿霉素、鹽酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春堿、長春新堿、長春地辛、長春瑞濱、順鉬、卡鉬、放線菌素D、舒尼替尼、伊馬替尼、吉非替尼、厄羅替尼、索拉非尼和拉帕替尼； 所述的蛋白質(zhì)選自白蛋白、免疫球蛋白、酶蛋白、胰島素、血紅蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纖維連接素、玻璃連接素、纖維蛋白原、脂肪酶。
6.如權(quán)利要求1一 4任一所述的納米復(fù)合物，其特征在于，它選自白蛋白結(jié)合型紫杉醇和TRAIL復(fù)合物、白蛋白結(jié)合型紫杉醇和TRAIL復(fù)合物、白蛋白結(jié)合型長春瑞濱和TRAIL復(fù)合物、白蛋白結(jié)合型長春瑞濱和TRAIL復(fù)合物、白蛋白結(jié)合型紫杉醇和TRAIL復(fù)合物、白蛋白結(jié)合型紫杉醇和TRAIL復(fù)合物、白蛋白結(jié)合型紫杉醇和TRAIL復(fù)合物和白蛋白結(jié)合型多西紫杉醇和TRAIL復(fù)合物。
7.如權(quán)利要求1-6任一所述的納米復(fù)合物，其特征在于，它為靜脈、皮下、肌內(nèi)、膜內(nèi)或腹膜內(nèi)注射給藥形式。
8.如權(quán)利要求1-6任一所述的抗腫瘤藥物納米復(fù)合物的制備方法，包括: (O使抗腫瘤藥物溶于有機(jī)溶劑，生成疏水相； (2)使凋亡素和蛋白質(zhì)溶于水性溶劑，形成親水相； (3)將步驟(1)得到的疏水相滴加到步驟(2)得到的親水相，形成所述的抗腫瘤藥物納米復(fù)合物， 其中，所述的抗腫瘤藥物、凋亡素或蛋白質(zhì)是如權(quán)利要求1-5任一所定義的物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的有機(jī)溶劑選自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、四氫呋喃、二氯六環(huán)、乙腈、丙酮、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮或其混合物； 所述步驟(2)中的水性溶劑為pH=4.0-6.5 的酸性水溶劑，選自鹽酸、醋酸、磷酸、檸檬酸、檸檬酸二鈉或其混合物。
10.如權(quán)利要求1-7任一所述的納米復(fù)合物在制備治療肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌、胰腺導(dǎo)管癌或腸癌的增效藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K47/42GK103656665SQ201210338847
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月13日
【發(fā)明者】曹師磊, 魏彥, 蔣新國, 龐志清, 謝月玲 申請人:上海睿逸生物科技有限公司