專利名稱：從花椒葉中提取抗氧化活性植物多酚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從花椒葉中提取抗氧化活性植物多酚的方法，屬于化學化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前有研究表明，人體組織內(nèi)氧化性損傷的増加和衰老性疾病如組織老化、癌癥、糖尿病、冠心病的發(fā)生密切相關(guān)?？梢酝ㄟ^對體內(nèi)自由基的清除而達到防御及治療疾病的目的。目前，人工合成的抗氧化劑因其具有潛在毒性和致癌作用而受到人們的排斥，而天然抗氧化劑具有安全、低毒等優(yōu)點，符合人們對綠色健康的需求，因此，從天然食材中篩選天然抗氧化物質(zhì)一直是國際研究的熱點。
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花椒葉又名椒葉，為蕓香科植物花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)或青椒(Zanthoxylum schinifolium Zucc.)的葉。我國花椒種植面積約21萬平方米,主要分布于陜西、甘肅、山東、四川等地，花椒葉產(chǎn)量巨大?！吨袊幍洹酚涊d其性味辛、熱、無毒，歸脾、胃經(jīng)，溫中散寒；燥濕健脾；殺蟲解毒?！度杖A子本草》中記載花椒葉可治奔豚、霍亂、轉(zhuǎn)筋等疾病。此外，花椒葉是我國的傳統(tǒng)蔬菜和香料，可做調(diào)料食用或制作椒茶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種從從花椒葉中提取抗氧化活性植物多酚的方法，其特點是從紅花椒葉中分離植物多酚類物質(zhì)，其中包含八種主要活性化合物，即槲皮素-3- β -D-葡萄糖苷、異槲皮苷、蘆丁、茴香苷、山奈酚-7- β -D-葡萄糖苷、槲皮苷、山奈酚-3-β-D-半乳糖苷和阿福豆苷。這些混合物和分子可以用于預防和治療體內(nèi)自由基過多引起的衰老性疾病。本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說明外，均為重量份數(shù)。從從花椒葉中提取抗氧化活性植物多酚的方法包括以下步驟(I)將干紅花椒葉粉碎，平均粒度為300 500μπι，按料液比Ig : 10 30ml，優(yōu)選為Ig 15 25ml加入濃度50 100%，優(yōu)選為60 80%的甲醇作為提取劑，在室溫下震蕩24 48h，分離上清液，并將上清液濃縮干燥后獲得甲醇浸膏，得率為5 10% ；(2)將上述甲醇浸膏分散于蒸餾水中，料液比為Ig 20 40ml，優(yōu)選為Ig 25 30ml，然后按體積比I : 2 5加入正己烷震蕩萃取2 3次，收集水相萃取物；(3)將上述水相萃余物按體積比I : 2 5加入氯仿，震蕩萃取2 3次，收集水相萃余物；(4)將上述步驟(3)中的水相萃余物按體積比I : 2 5加入こ酸こ酷，震蕩萃取2 3次，收集こ酸こ酯相萃取物，濃縮干燥后得到紅花椒葉中主要的植物多酚類組分，得率為4 10%ο從花椒葉中提取抗氧化活性植物多酚的方法制備得到的抗氧化活性植物多酚。
抗氧化活性植物多酚用于清除活性氧自由基，激活細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，預防和治療體內(nèi)自由基過多引起的衰老性疾病。性能測試通過高效液相色譜及高效液相色譜質(zhì)譜儀聯(lián)用對上述步驟(4)中乙酸乙酯萃取物進行成分分析及標準品的比對，結(jié)果詳見表I所示。結(jié)果表明上述步驟(4)中乙酸乙酯萃取物中主要活性植物多酚成分包含槲皮素-3-β -D-葡萄糖苷、異槲皮苷、蘆丁、茴香苷、山奈酚-7-β -D-葡萄糖苷、槲皮苷、山奈酚-3-β -D-半乳糖苷和阿福豆苷，高效液相色譜以及質(zhì)譜的條件如下

(I)高效液相色譜分析條件0DS-2色譜柱(04. 6 X 150mm, 5 μ m);流速，O. 5ml/min ;柱溫，25°C ;檢測波長，280nm ;梯度洗脫液0min時，5%甲醇(含O. 1%甲酸)；IOmin時，25%甲醇(含O. 1%甲酸);20min時,30%甲醇(含O. 1%甲酸);30_50min，35%甲醇(含O. 1%甲酸)；60min 時,50% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；70min 時,60% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；80-90min, 100%甲醇(含O. 1%甲酸)。(2)質(zhì)譜分析條件電噴霧離子源(ESI)，正(負)離子電離；噴霧電壓5500V;結(jié)束電壓350 V ;干燥氣流速10 L/min，干燥溫度400°C ;氮氣壓力60psi ;掃描范圍100 800 m/ Z0本發(fā)明具有如下優(yōu)點(I)上述的花椒葉乙酸乙酯提取物在制備植物多酚中的應用，具有工藝簡單、操作方便等優(yōu)點；(2)抗氧化活性強。實驗證明，利用本發(fā)明提供的制備方法所獲得的有效組分顯示了很強的抗氧化活性，在濃度為4 μ g/ml時，對2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力就達到59. 9%，IC50=2. 47Pg/ml。


圖I:花椒葉乙酸乙酯提取物的高效液相色譜分析。分析條件如下0DS_2色譜柱(04. 6 X 150mm, 5 μ m);流速，O. 5ml/min ;柱溫,25。。;檢測波長，280nm ;梯度洗脫液0min時，5%甲醇(含O. 1%甲酸)；IOmin時，25%甲醇(含O. 1%甲酸)；20min時，30%甲醇(含O. 1%甲酸)；30-50min，35% 甲醇(含 O. 1% 甲酸);60min 時,50% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；70min 時,60%甲醇(含O. 1%甲酸)；80-90min, 100%甲醇(含O. 1%甲酸)。槲皮素_3_β -D-葡萄糖苷(保留時間為50. lmin)、異槲皮苷(保留時間為52. lmin)、蘆丁(保留時間為52. lmin)、茴香苷(保留時間為57. 9min)、山奈酚_7_β -D-葡萄糖苷(保留時間為61. 5min)、槲皮苷(保留時間為62. 7min)、山奈酚_3_β -D-半乳糖苷(保留時間為63. 4min)和阿福豆苷(保留時間為68.5min)。圖2:花椒葉乙酸乙酯提取物的高效液相色譜質(zhì)譜儀聯(lián)用分析圖譜。高效液相色譜分析條件如下0DS-2色譜柱(04. 6 X 150mm, 5 μ m);流速,0. 5ml/min ;柱溫，25°C ;檢測波長，280nm ;梯度洗脫液=Omin時，5%甲醇(含O. 1%甲酸);IOmin時,25%甲醇(含O. 1%甲酸)；20min 時,30% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；30-50min, 35% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；60min 時,50% 甲醇(含O. 1%甲酸);70min時,60%甲醇(含O. 1%甲酸);80_90min，100%甲醇(含O. 1%甲酸)。質(zhì)譜分析條件如下電噴霧離子源(ESI)，正離子電離；噴霧電壓5500V;結(jié)束電壓350 V ;干燥氣流速10 L/min，干燥溫度400°C ;氮氣壓力60psi ;掃描范圍100 800 m/z。槲皮素-3-β -D-葡萄糖苷(離子峰時間為53. 8min)、異槲皮苷(離子峰時間為55. 6min)、蘆丁(離子峰時間為55. 6min)、茴香苷(離子峰時間為59. 2min)、山奈酚_7_β -D-葡萄糖苷(離子峰時間為61. 9min)、槲皮苷(離子峰時間為62. 9min)、山奈酚-3-β-D-半乳糖苷(離子峰時間為67. 2min)和阿福豆苷(離子峰時間為68. 3min)。圖3:花椒葉こ酸こ酯提取物的高效液相色譜質(zhì)譜儀聯(lián)用分析圖譜。高效液相色譜分析條件如下0DS-2色譜柱(04. 6 X 150mm, 5 μ m);流速,O. 5ml/min ;柱溫,25°C ;檢測波長，280nm ;梯度洗脫液=Omin吋，5%甲醇(含O. 1%甲酸);IOmin吋,25%甲醇(含O. 1%甲酸)；20min 吋,30% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；30-50min, 35% 甲醇(含 O. 1% 甲酸)；60min 吋,50% 甲醇(含O. 1%甲酸);70min吋,60%甲醇(含O. 1%甲酸);80_90min，100%甲醇(含O. 1%甲酸)。質(zhì)譜分析條件如下電噴霧離子源(ESI)，負離子電離；噴霧電壓5500V ;結(jié)束電壓350 V ;干燥氣流速10 L/min，干燥溫度400°C ;氮氣壓力60psi ;掃描范圍100 800 m/z。槲皮素-3-β -D-葡萄糖苷(離子峰時間為53. 8min)、異槲皮苷(離子峰時間為55. 6min)、蘆丁(離子峰時間為55. 6min)、茴香苷(離子峰時間為59. 2min)、山奈酚_7_β -D-葡萄糖苷(離子峰時間為61. 9min)、槲皮苷(離子峰時間為62. 9min)、山奈酚-3-β-D-半乳糖苷(離子峰時間為67. 2min)和阿福豆苷(離子峰時間為68. 3min)。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進行進ー步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)發(fā)明的內(nèi)容作出ー些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。實施例I :
(I)將干花椒葉IOg粉碎后，然后用50%甲醇IOOml作為提取劑，在室溫下震蕩24h，分離上清液，并將上清液濃縮干燥后獲得甲醇浸膏O. 63g ；(2)將上述甲醇浸膏分散于30ml蒸餾水中，然后用60ml正己烷振蕩萃取2次，將萃取液和水相萃取物分離；(3)將上述水相萃余物部分用60ml氯仿振蕩萃取2次，將萃取液和水相萃取物分離；(4)將上述水相萃余物部分用60mlこ酸こ酯振蕩萃取2次，將萃取液和水相萃取物分離得到こ酸こ酯萃取物，將其濃縮并干燥，即可獲得14. 4mg具有很強抗氧化活性的黃色粉狀紅花椒葉提取物。實施例2 (I)將花椒葉IOg粉碎后，然后用80%甲醇300ml作為提取劑，在室溫下震蕩36h，分離上清液，并將上清液濃縮干燥后獲得甲醇浸膏O. 54 g ;(2)將上述甲醇浸膏分散于30ml蒸餾水中，然后用60ml正己烷震蕩萃取3次，將萃取液和水相萃取物分離；(3)將上述水相萃余物部分用60ml氯仿振蕩萃取3次，將萃取液和水相萃取物分離；(4)將上述水相萃余物部分用60mlこ酸こ酯振蕩萃取3次，將萃取液和水相萃取物分離得到乙酸乙酯萃取物，將其濃縮并干燥，即可獲得27. Img具有很強抗氧化活性的黃色粉狀紅花椒葉提取物。實施例3 (I)將花椒葉IOg粉碎后，然后用100%甲醇200ml作為提取劑，在室溫下震蕩48h，分離上清液，并將上清液濃縮干燥后獲得甲醇浸膏O. 59 g ;(2)將上述甲醇浸膏分散于30ml蒸餾水中，然后用60ml正己烷震蕩萃取2次，將萃取液和水相萃取物分離；(3)將上述水相萃余物部分用60ml氯仿振蕩萃取2次，將萃取液和水相萃取物分離。
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(4)將上述水相萃余物部分用60ml乙酸乙酯振蕩萃取2次，將萃取液和水相萃取物分離得到乙酸乙酯萃取物，將其濃縮并干燥，即可獲得23. 7mg具有很強抗氧化活性的黃色粉狀紅花椒葉提取物。由上述實施例中獲得的花椒葉乙酸乙酯提取物的高效液相色譜分析結(jié)果如圖I所示。為了考察由上述實施例中獲得的花椒葉乙酸乙酯提取物的抗氧化能力，本發(fā)明將實施例中獲得乙酸乙酯提取物進行了抗氧化試驗，具體的方法及結(jié)果如下應用實例II. ABTS自由基清除實驗取19 ml的ABTS自由基溶液中加入3. 3 mg的過硫酸鉀，混合均勻，在室溫、避光條件下靜置過夜。使用前將儲備液加水稀釋使其在734 nm波長下吸光度為O. 70±0. 02，形成ABTS工作液。將樣品用純水配制成一系列濃度，取30 μ I的受試物加入2. 97 ml ABTS自由基工作液，混合均勻，避光放置30 min后，在734 nm處測定吸光度。每份樣品重復操作3次。以Trolox (6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃_2_羧酸)為參照物做陽性對照，ABTS自由基清除率(S%)計算公式如下:S%=(A0 - A)/A。，其中Atl為ABTS自由基溶液與純水混合的吸光度，A為加受試物后的吸光度。測試結(jié)果詳見表2所示。應用實例22. I, I- 二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除實驗配制一定濃度的樣品溶液，根據(jù)濃度需要取不同體積的待測溶液，加相應溶劑至
2.O ml，再加入DPPH試劑I. O ml，強裂振蕩后避光靜置30 min，利用DPPH甲醇溶液在517nm波長處有特征吸收峰測定各濃度待測試樣吸光度值?？瞻讓φ諡? ml不同濃度受試物的甲醇溶液加上I. O ml的甲醇，陰性對照為2 ml的甲醇加上I ml (O. 3 mM)的DPPH甲醇溶液。維生素C作為陽性對照。每個處理試樣均做三個平行試驗，清除效果以半數(shù)清除率濃度(IC50)來表示。按下式計算對DPPH自由基的清除率(%)。DPPH自由基清除率(%) = [ (A1-Atl) /A1] X 100，其中A1表示DPPH與甲醇混合后所測的吸光度，A0表示加入受試物后所測的吸光度。測試結(jié)果詳表3所示。表I乙酸乙酯提取物主要多酚成分HPLC-DAD-MS分析
權(quán)利要求
1.從花椒葉中提取抗氧化活性植物多酚的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 (1)將干紅花椒葉粉碎，平均粒度為300 500μ m,按料液比Ig : 10 30ml加入濃度50 100%的甲醇作為提取劑，在室溫下震蕩24 48h，分離上清液，并將上清液濃縮干燥后獲得甲醇浸膏，得率為5 10 % ； (2)將上述甲醇浸膏分散于蒸餾水中，料液比為Ig 20 40ml，然后按體積比I : 2 5加入正己烷震蕩萃取2 3次，收集水相萃取物； (3)將上述水相萃余物按體積比I: 2 5加入氯仿，震蕩萃取2 3次，收集水相萃余物； (4)將上述步驟(3)中的水相萃余物按體積比I: 2 5加入乙酸乙酯，震蕩萃取2 3次，收集乙酸乙酯相萃取物，濃縮干燥后得到紅花椒葉中主要的植物多酚類組分，得率為4 10%。
2.如權(quán)利要求I所述從花椒葉中提取抗氧化活性植物多酚的方法制備得到的抗氧化活性植物多酚。
3.如權(quán)利要求2所述從花椒葉中提取抗氧化活性植物多酚用于清除活性氧自由基，激活細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，預防和治療體內(nèi)自由基過多引起的衰老性疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開了從花椒葉中提取抗氧化活性植物多酚的方法，其特點是將紅花椒葉粉碎，平均粒度為300～500μm，按料液比1g∶10～30ml加入濃度50～100%的甲醇作為提取劑，在室溫下震蕩24～48h，分離上清液，并將上清液濃縮干燥后獲得甲醇浸膏，得率為5～10%；將甲醇浸膏分散于蒸餾水中，料液比為1g∶20～40ml，然后按體積比1∶2～5加入正己烷震蕩萃取2～3次，收集水相萃取物； 再將水相萃余物按體積比1∶2～5加入氯仿，震蕩萃取2～3次，收集水相萃余物；然后將水相萃余物按體積比1∶2～5加入乙酸乙酯，震蕩萃取2～3次，收集乙酸乙酯相萃取物，濃縮干燥后得到抗氧化活性植物多酚，得率為4～10%。
文檔編號A61P39/06GK102836260SQ20121033003
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者鐘凱, 黃毅娜, 高鴻 申請人:四川大學