專利名稱：堿性成纖維細胞生長因子在制備治療脊髓損傷藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術領域，，具體涉及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在制備治療脊髓損傷藥物中的應用，包括對各種因素導致的脊髓原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷的治療。
背景技術：
脊髓損傷(Spinal Cord Injury, SCI)是一種嚴重的神經系統(tǒng)創(chuàng)傷,通常可導致嚴重的神經功能障礙和殘疾，不僅影響患者個人生理及心理，而且對家庭及社會造成沉重的負擔。世界上脊髓損傷癱瘓病人有上萬，我國亦逾百萬，據統(tǒng)計美國每年新增I萬多傷病員，我國僅北京地區(qū)脊髓損傷發(fā)生率約800人/年，已成為高發(fā)傷病之一。 脊髓損傷可以分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。脊髓損傷發(fā)生后，其損傷鄰近部位的組織受損破壞，發(fā)生出血、壞死、為原發(fā)性損傷；隨后損傷區(qū)及鄰近部分發(fā)生缺血、再灌注損傷，脂質過氧化產生氧自由基損害，細胞內鈣離子超載，炎癥介質產生，興奮性神經遞質損害，細胞凋亡等一系列病理生理過程，稱為繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷是一種細胞和分子水平主動調節(jié)的過程，具有可逆性。繼發(fā)性損傷可加重原發(fā)性損傷，造成脊髓功能障礙，致使機體全癱或部分癱瘓。如果能阻斷此連鎖反應中的某一環(huán)節(jié)，則可明顯減輕繼發(fā)性損傷，促進脊髓功能的恢復。而對原發(fā)性脊髓損傷治療主要依靠外科手術，到目前為止尚無有效治療發(fā)現，故對繼發(fā)性損傷進行藥物控制治療，有可能為減輕脊髓損傷的有效途徑。研究表明，脊髓損傷繼發(fā)性與神經細胞凋亡有關，細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程。其受控于一系列基因順序表達而發(fā)現的主動的耗能的自殺性死亡，是維持機體細胞種類和數量動態(tài)平衡的重要機制，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。目前已知的三條主要信號轉導途徑來控制細胞凋亡1、線粒體通路；2、死亡受體通路；3、內質網通路。內質網通路機制是近年來發(fā)現的一條新的凋亡途徑，且很多動物實驗已被初步證明內質網通路參與了脊髓損傷的繼發(fā)性病理機制。內質網是真核細胞中重要的細胞器，參與蛋白質合成、折疊和寡聚化，還參與脂類代謝、類固醇代謝的合成以及Ca2+調節(jié)等。內質網非常敏感，葡糖糖/營養(yǎng)素的缺乏、蛋白質糖基化的抑制、二硫鍵形成的障礙、蛋白質運轉異常、Ca2+耗竭等刺激均可導致內質網功能失調，即內質網應激。內質網應激時內質網內蛋白質不能正確折疊而被大量滯留，導致未折疊蛋白反應，激發(fā)內質網和高爾基體、細胞核之間的信號轉導，抑制蛋白質合成并啟動內質網相關基因轉錄，一定程度的內質網應激可增強內質網的應激能力，促進內質網功能恢復。但是內質網應激持續(xù)存在或過強時將誘導內質網相關性蛋白細胞凋亡，造成組織損傷。脊髓損傷時，發(fā)生的缺血缺氧、酸中毒、ATP耗竭、鈣超載以及大量自由基生成等均可誘導內質網應激，從而使其在脊髓損傷發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。未折疊蛋白應答是一種對抗內質網應激的自身保護機制，有利于細胞內環(huán)境的穩(wěn)定。其由一個內質網分子伴侶GRP78和3個內質網應激感受蛋白所介導，分別是IRE-1、ATF6、PERK。無內質網應激時，IRE-1、ATF6、PERK分別與分子伴侶GRP78結合，處于無活性狀態(tài)。一旦內質網應激，GRP78從3種跨膜蛋白上解離，轉而去結合未折疊蛋白。解離后的感受蛋白被活化并啟動為折疊蛋白應答，降低未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網內的積累，通過IRE-1、ATF6、PERK三條信號途徑，恢復內質網的正常功能，是一個促生存相應。長時間或過量的應激，會損傷內質網，這三條通路同時也能誘導內質網應激介導的細胞凋亡信號通路，去除無功能細胞，其并非直接誘導凋亡，而是通過激活下游凋亡信號分子CaSpaSel2和GADD153/CH0P，激酶ASK1/JUK等誘導凋亡。Caspasel2和GADD153/CH0P是內質網應激特異性的轉錄因子，在死亡受體和線粒體通路中不被活化。目前對于脊髓損傷治療，在臨床上尚無特殊用藥，治療不甚理想。損傷早期多用糖皮質激素(地塞米松、甲基強的松龍等)來減輕炎癥反應。甲基強的松龍是目前應用最為廣泛且公認最有效的治療脊髓損傷的藥物。大劑量應用甲基強的松龍可通過多種機制阻止脊髓繼發(fā)性損傷的發(fā)生，但是其在臨床應用中會導致病人出現過敏、休克，誘導或加重潰瘍、糖尿病等相關并發(fā)癥，為治療脊髓損傷增加了一定的風險，也引起了臨床醫(yī)生的擔憂和警惕。故研發(fā)一種副作用少且療效和的脊髓損傷治療藥物已經成為目前研究是熱的和難點。
近來研究表明，脊髓損傷后給予外源性生長因子可以促進神經功能的恢復。神經營養(yǎng)因子還可與其他中和軸突生長抑制因子，共同起到促進軸突生長和補充的作用。自1939年Trowell等發(fā)現原代培養(yǎng)的成纖維細胞分裂增殖物成纖維細胞生長因子后，發(fā)現堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是18KD的陰離子多肽，具有廣泛生物學活性，它廣發(fā)存在于全身組織中，但以神經系統(tǒng)最為明顯，它能促進神經元的存活和突起生長，是神經膠質細胞、毛細血管內皮細胞的促有絲分裂原，并能拮抗興奮性氨基酸等對神經元的毒性作用而起到保護神經元的作用，且對神經外胚層和中胚層的多種細胞具有促增殖和分化的作用。體外實驗亦證明bFGF能促進神經元存活與生長，且效用與劑量有關。其機制已有證明bFGF在動物體內可改變一些神經遞質的合成，拮抗興奮性氨基酸對神經元的毒害作用，保護受損的神經元。FGF又是一種趨化因子，對皮內細胞，成纖維細胞，星型膠質細胞均有趨化作用，提示bFGF在局部缺血性損傷的修復方面具有廣泛的臨床應用價值，特別是對抑制脊髓損傷繼發(fā)性傷害具有重要的意義。另外bFGF能抑制疤痕疙瘩與正常成纖維細胞的膠質合成，并刺激膠原酶的表達。若再脊髓損傷中亦有此作用，可大大促進再生的神經纖維通過損傷區(qū)防止永久性疤痕及癱瘓的發(fā)生。當代醫(yī)學對脊髓損傷還缺少有效的治療和/或預防的藥物。本發(fā)明制備了一種含有成纖維細胞生長因子的新型生物膠原材料，并通過細胞實驗和動物實驗發(fā)現，在脊髓損傷前期，生物膠原可以通過減少的內質網應激來抑制細胞凋亡，從而對脊髓損傷有明顯的治療和/或預防作用。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供bFGF應用于制備治療和/或預防各種原因造成的原發(fā)性脊髓損傷或繼發(fā)性脊髓損傷。本發(fā)明的bFGF對各種原因造成的原發(fā)性脊髓損傷或繼發(fā)性脊髓損傷有明顯的治療和/或預防作用。
具體實施例方式實施例IbFGF對實驗性擠壓致脊髓損傷大鼠的治療作用動物模型和分組SD大鼠30只，體重220_250g，雌性。用以下方法制作脊髓損傷大鼠模型10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔麻醉。俯臥固定大鼠四肢，作背部后正中切口。切開皮膚以及皮下組織，顯露并咬除T8 TlO錐板和棘突。用15g動脈夾壓迫脊髓2min，麻醉清醒后雙下肢呈現弛緩性癱瘓。術后7日給予注射用頭孢唑林50mg/kg腹腔注射每日2次，并每日給予大鼠人工排泄大小便2次。將動物隨機分為3組(每組10只大鼠)假手術組只接受T8 T9椎板切除手術，下肢行動正常；對照組脊髓損傷后，不給予生物膠原材料，只給予相同劑量的生理鹽水；生物膠原治療組在脊髓損傷后在損傷脊髓面貼敷生物膠原海綿一片(IOOg)，其中含有 bFGF I. 5μ go檢測指標和結果BBB評分根據BBB評分標準，分別于術后1，3，7天進行評定，并遵循雙盲法觀察原則，通過計分來評價動物雙后肢功能狀況。通過BBB評分，結果發(fā)現皮下注射生物膠原治療組后肢恢復情況比對照組明顯好轉。各組損傷大鼠BBB評分結果見表I。HE染色于術后7天處死大鼠取材，石蠟包埋，切片(5 μ m)，通過蘇木精-伊紅染色，于鏡下觀察發(fā)現給予生物膠原材料后，大鼠脊髓組神經細胞凋亡明顯少于對照組，見附圖
I。免疫組化學染色于術后7天處死大鼠取材，石蠟包埋，切片(5 μ m)，DAB顯色，發(fā)現給予生物膠原材料后，大鼠脊髓損傷處神經元和神經膠質細胞GRP78，CHOP和Caspase-12蛋白表達明顯少于對照組,見附圖2。Western blot :于術后7天處死大鼠取材,用化學發(fā)光試劑盒曝光、顯影、定影,發(fā)現與對照組相比，生物膠原材料治療組GRP78，CHOP和Caspase-12表達明顯減少，見附圖3 ；而神經保護因子stathmin和GAP-43表達明顯增加,見附圖4。表I各組脊髓損傷大鼠不同時間點BBB評分比較(X土s)
權利要求
1.本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，特別涉及堿性成纖維細胞生長因子(bFG F)在制備治療脊髄損傷藥物中的應用，包括各種因素導致的脊髄原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷的治療。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術領域，具體涉及堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在制備治療脊髓損傷，包括各種因素導致的脊髓原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷中的應用。bFGF在制備治療脊髓損傷藥物中的應用，藥物的形式可以是粉針劑、水劑、脂質體等。bFGF可以抑制內質網應激，減少內質網引起的脊髓神經元凋亡，從而對脊髓損傷產生治療作用。
文檔編號A61P25/28GK102847139SQ201210327589
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月13日 優(yōu)先權日2012年8月13日
發(fā)明者肖健, 李校堃, 張宏宇, 張謝, 王周光, 王曉杰 申請人:溫州醫(yī)學院