專利名稱：旋毛蟲與乳腺癌相關抗原基因ts498抗體制備方法
技術領域：
本發(fā)明提供了旋毛蟲與MCF-7乳腺癌相關抗原基因TS498蛋白抗體及其制備方法，本發(fā)明還提供了該蛋白抗體的醫(yī)用用途，屬于生物制藥領域。
背景技術：
旋毛蟲是一種重要的人獸共患寄生蟲，在對其長期研究過程中發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲的感染具有增加宿主抵抗腫瘤的能力。有研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲活蟲、旋毛蟲致弱蟲、旋毛蟲全抗原、旋毛蟲可溶性抗原和旋毛蟲ES抗原等均具多重抗腫瘤作用。目前發(fā)現(xiàn)旋毛蟲與腫瘤相關抗原具有抗腫瘤作用，因而旋毛蟲與腫瘤相關抗原蛋白抗體也具有抗腫瘤作用。目前未見旋毛蟲與MCF-7乳腺癌相關抗原基因蛋白抗體抗腫瘤的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了旋毛蟲與腫瘤細胞相關蛋白基因TS498，為一種新的蛋白基因物質(zhì)，其抗體具有抗腫瘤生物活性。本發(fā)明還提供了該相關基因蛋白抗體的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明進一步公開了該蛋白抗體的醫(yī)用用途，用于制備治療腫瘤的藥物。本發(fā)明公開的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關蛋白，其DNA序列如SEQ No. I所示。本發(fā)明相關蛋白抗體的制備方法如下
分別制備旋毛蟲和MCF-7乳腺癌細胞的抗血清，然后分別利用間接ELISA方法確定腫瘤細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細胞陽性血清間是否存在相關抗原；利用western blotting方法確定與旋毛蟲相關的MCF-7細胞抗原的分子量大小,并分離相關蛋白，制備相關蛋白的抗血清。然后利用制備的抗血清對旋毛蟲cDNA表達文庫進行篩選，得到與MCF-7相關的旋毛蟲蛋白基因?？寺〔⒃吮磉_相關蛋白，純化復性其原核表達蛋白作為免疫原免疫小鼠，獲得相關基因蛋白的抗體。本發(fā)明所述的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關蛋白制備方法，其特征在于引物序列為 SEQ No. 2
上游5’ -CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3’，
下游5’-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC-3’。本發(fā)明所述的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關蛋白制備方法，利用含特定酶切位點的特異性引物擴增TS98基因，引物序列為SEQ No. 3
上游5’ -TCCGAATTCATGCAGGGCTATCGCAGTCC-3，,
下游5’ - GCACTCGAGTCATCTCTTCTGACCAGCCGG 3’。本發(fā)明所述的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關蛋白在制備治療乳腺癌藥物中的應用。 本發(fā)明的積極效果在于
旋毛蟲與腫瘤細胞相關抗原蛋白抗體能對腫瘤產(chǎn)生強的抑制作用，同時旋毛蟲與腫瘤細胞相關抗原TS498基因蛋白抗體易于制備和工業(yè)化。


圖I、旋毛蟲高免血清和MCF-7乳腺癌細胞粗抗原的交叉反應及其分子量；
圖2、TS498基因PCR擴增產(chǎn)物電泳 圖3、重組克隆質(zhì)粒pMD18T-TS498的雙酶切鑒定(EcoR I/XhoI)；
圖4、重組表達質(zhì)粒pET-28a-TS498的雙酶切鑒定(EcoR I/Xho I )；
圖5、TS498的原核表達產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot分析。具體實施方法
實施例I
I.旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關蛋白確定
首先制備旋毛蟲可溶性抗原和MCF-7乳腺癌細胞抗原并分別免疫家兔和BalB/C小鼠制備兩種抗原的陽性血清。用MCF-7可溶性蛋白和旋毛蟲可溶性粗抗原作為包被抗原，用兔抗旋毛蟲高免血清和鼠抗MCF-7細胞高免血清作為被檢抗體，通過建立間接ELISA方法檢測旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞間的交叉抗原情況。結果表明，旋毛蟲抗原與MCF-7乳腺癌細胞抗血清之間及旋毛蟲抗血清與MCF-7乳腺癌細胞蛋白間均存在一定的交叉免疫反應，同時，兩種蛋白不與兔和小鼠的健康血清反應。經(jīng)反復摸索，得到最佳的抗體效價分別為抗旋毛蟲高免血清為1:3200，抗1 ^-7乳腺癌細胞高免血清為1:6400，同時兩種抗原都不與健康小鼠血清反應。2.旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關抗原蛋白的western bloting分子量的檢測 以PBS為陰性對照，對MCF-7乳腺癌細胞抗原蛋白進行SDS-PAGE，然后進行western
blotting蛋白免疫雜交法對相關抗原的分子量鑒定。免疫雜交法以兔抗旋毛蟲高免血清作為一抗，以MCF-7乳腺癌細胞可溶性抗原作為待檢抗原，檢測與旋毛蟲可溶性抗原相關的MCF-7乳腺癌細胞相關蛋白的分子量大小。Western-blotting免疫雜交的結果用同一張NC膜用ECL發(fā)光和DAB顯色兩者同時顯色。結果經(jīng)對比，相同，顯示相關蛋白分子量約存在于18 kDa，29 kDa，32 kDa，56 kDa，60kDa。3.旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關抗原蛋白的免疫篩選
將與旋毛蟲相關的MCF-7乳腺細胞抗原進行分離，并制備相關抗原的抗體。采用與X-Blue株大腸桿菌裂解液共孵育的方法從制備的抗血清中除去與大腸桿菌交叉反應的抗體，利用抗MCF-7乳腺癌細胞的高免血清對旋毛蟲cDNA表達文庫進行交叉免疫篩選，獲得旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關抗原的陽性克隆。分離陽性克隆噬菌斑并進行3次復篩，直至得到一致的免疫陽性重組噬菌體。4.陽性克隆的PCR擴增和序列測序
將陽性噬菌斑分離，用200 μ L SM buffer將噬菌斑重懸，50 μ L煮沸裂解噬菌體，提取噬菌體DNA，以噬菌體通用弓丨物擴增。通用引物序列為
上游5’ -CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3’，
下游5’-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC-3’。反應體系為，上下游引物(10 ρΜ)各I μ L, DNA模板I μ L, 2X Master Mix 10 μ L, ddH20 7 μ L,總體積為 20 μ L。反應參數(shù)為，94°C 5 min, 94°C 30s，55°C 30 s，72°C I min，72°C延伸10 min，共運行30個循環(huán)。將擴增的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定。將得到的PCR產(chǎn)物克隆入pMD-18T載體中，送至生物公司測序。得到目的蛋白的核苷酸序列。含有一個498bp的開放閱讀框。其蛋白分子量約為18. 9KDa, PI約為6. 31，共由165個氨基酸組成。5.蛋白基因的原核表達和抗體的制備
利用含特定酶切位點的特異性引物擴增TS98基因，引物序列為
上游5’ -TCCGAATTCATGCAGGGCTATCGCAGTCC-3> (下劃線部分為&oR I 酶切位點)， 下游5’ - GCACTCGAGTCATCTCTTCTGACCAGCCGG 3’(下劃線部分為通ο I 酶切位點)。
擴增片段大小498 bp。引物由上海生物工程有限公司合成。以cDNA為模板，PCR擴增TS498，反應體系分別為上下游引物(10 pmol/L)各I μ 1，模板DNA 3 μ l,2XTaqPCR Master Mix 10 μ I, ddH20 5 μ I。反應條件為95°C 5 min ；94°C 30 s,62. 4°C 30s，72V 30 s，共30個循環(huán)；72°C 10 min。將鑒定正確的PCR產(chǎn)物亞克隆至pET_28a (+)載體中，構建pET-28a-TS498重組質(zhì)粒。將獲得的pET_28a_TS498轉化至萬.coli BL21CDE3)中，利用終濃度為ImM的IPTG對TS498進行誘導表達，經(jīng)驗證原核表達菌種在37°C 4h的誘導條件下獲得最佳表達效果，表達產(chǎn)物以包涵體的形式存在。利用鎳柱法對表達獲得的蛋白進行分離和純化，并對純化蛋白進行梯度復性。以復性的蛋白為免疫抗原，免疫小鼠，每次每只100 μ g，免疫三次，尾靜脈采血用ELISA測定效價，效價，效價達到1:12400以上者為TS498抗原的高免血清。摘眼球采血，分離血清，_80°C保存?zhèn)溆?。下述的藥理實驗證實了本發(fā)明基因蛋白的抗體具有顯著的抑制腫瘤生長的作用，可以作為制備抗腫瘤藥物被應用。旋毛蟲與腫瘤相關蛋白抗體抗腫瘤效果
將4周齡18 22 g雌性BABL/c裸鼠隨機分為旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關基因TS498抗血清、MCF-7抗血清、旋毛蟲抗血清治療組和生理鹽水對照組。治療組每組設置三個抗體濃度梯度，分別為25，50，100 μ g，背部皮下注射進行治療。小鼠在接種MCF-7腫瘤細胞2周后，在接種部位可見大小均一的可觸摸實體瘤，然后開始用不同劑量的MCF-7抗血清，TS498抗血清和生理鹽水對小鼠進行治療，治療I個月后，剖殺小鼠，分離腫瘤。對小鼠的體重和腫瘤的重量和體積進行測量。用游標卡尺測量腫瘤的三個相互垂直的直徑(A，B，C,單位為cm),利用公式V= ABC ^ 1/6 (V為體積，單位為cm3)計算剝離的腫瘤的體積。腫瘤的重量和體積等數(shù)據(jù)都將作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)來評價相關抗原抗血清的體內(nèi)抑瘤效果。抑瘤率的計算公式為抑瘤率=(1-T/C) X 100%。其中T代表實驗組平均瘤重(或平均體積)，單位為g (cm3), C代表對照組平均瘤重(平均體積)，單位為g (cm3)。所有結果數(shù)據(jù)均利用SPSS 14.0 for Windows軟件進行分析，檢驗差異顯著性?？鼓[瘤試驗結果
結果表明
TS498原核表達蛋白抗體不同濃度的治療組，MCF-7細胞抗原抗體治療組，和旋毛蟲全抗原抗體治療組與對照組相比具有顯著差異，LSD法檢測體內(nèi)抑瘤率隨著治療血清劑量的增加而增加。三種抗血清的最高劑量治療效果最好，分別為36. 12%，38. 99%，31. 50%?？贵w治療組的瘤重顯著低于空白對照組(P〈0. 05)，各組抗體的抗腫瘤情況見附表I。方差分析結果表明各組瘤重有顯著差異。表I抗血清對各組小鼠體內(nèi)腫瘤體積和重量
權利要求
1.一種旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關蛋白基因TS498，其特征在于 其DNA序列如SEQ No. I所示。
2.根據(jù)權利要求I所述的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關抗原基因TS498蛋白的抗體制備方法，其特征在于 分別制備旋毛蟲和MCF-7乳腺癌細胞的抗血清，然后分別利用間接ELISA方法確定腫瘤細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細胞陽性血清間是否存在相關抗原；利用western blotting方法確定與旋毛蟲相關的MCF-7細胞抗原的分子量大小,并分離相關蛋白，制備相關蛋白的抗血清； 然后利用制備的抗血清對旋毛蟲cDNA表達文庫進行篩選，得到與MCF-7相關的旋毛蟲蛋白基因； 克隆并原核表達相關蛋白，純化復性其原核表達蛋白作為免疫原免疫小鼠，獲得相關基因蛋白的抗體； 根據(jù)權利要求I所述的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關蛋白制備方法，其特征在于引物序列為 上游5’ -CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3’， 下游5’-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC-3’。
3.根據(jù)權利要求I所述的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關蛋白制備方法，其特征在利用含特定酶切位點的特異性引物擴增TS98基因，引物序列為 上游5’ -TCCGAATTCATGCAGGGCTATCGCAGTCC-3，, 下游5’ - GCACTCGAGTCATCTCTTCTGACCAGCCGG 3’。
4.根據(jù)權利要求I所述的旋毛蟲與MCF-7乳腺癌細胞相關抗原基因蛋白在制備治療乳腺癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了旋毛蟲與MCF-7乳腺癌相關抗原基因TS498抗體制備方法，分別制備旋毛蟲和MCF-7乳腺癌細胞的抗血清，利用間接ELISA方法確定腫瘤細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與腫瘤細胞陽性血清間是否存在相關抗原；利用westernblotting方法確定與旋毛蟲相關的MCF-7細胞抗原的分子量大小，并分離相關蛋白，制備相關蛋白的抗血清，得到與MCF-7相關的旋毛蟲蛋白基因?？寺〔⒃吮磉_相關蛋白，純化復性其原核表達蛋白作為免疫原免疫小鼠，獲得相關基因蛋白的抗體。旋毛蟲與腫瘤細胞相關抗原蛋白抗體能對腫瘤產(chǎn)生強的抑制作用，同時旋毛蟲與腫瘤細胞相關抗原TS498基因蛋白抗體易于制備和工業(yè)化。
文檔編號A61P35/00GK102719441SQ20121020491
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權日2012年6月20日
發(fā)明者任保彥, 宮鵬濤, 左紹志, 張國才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李 赫, 楊舉, 陳玉江 申請人:吉林大學