專利名稱：荔枝核黃酮類化合物在制備抗腺病毒藥物上的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及荔枝核黃酮類化合物在制備抗腺病毒藥物上的用途，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腺病毒感染所導(dǎo)致的呼吸道傳染病——腺病毒肺炎，常發(fā)生在6個月至2歲的嬰幼兒，患兒出現(xiàn)高熱、呼吸困難、口周紫紺、抽風(fēng)、驚厥、昏迷等中毒癥狀，多因搶救不及時或不當(dāng)而死亡，病死率約為20% 50%，嚴重威脅嬰幼兒健康?，F(xiàn)在臨床上對于腺病毒肺炎的治療，主要應(yīng)用酚妥拉明、病毒唑、干擾素、聚肌胞注射液、左旋咪唑等，但均未獲得明顯效果。因此，研究和開發(fā)新的抗腺病毒藥物具有重要的現(xiàn)實意義和社會意義。蒸枝核是無患子科植物蒸枝(Litchi chinensis Sonn)的干燥成熟種子,又名蒸仁或荔核，味甘、微苦，我國古代藥典記載荔枝核性溫、歸肝、腎經(jīng)、能祛寒止痛和行氣散結(jié)； 荔枝核的化學(xué)成分有留類、皂苷、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、脂肪酸、聚合花色素、糖類、蛋白質(zhì)以及無機鹽。黃酮類化合物為荔枝核提取物中的主要成分，具有毒性低、副作用小等特點。荔枝核黃酮類化合物除具有降血糖、調(diào)血脂和抗氧化作用等多種功效外，還具有抗病毒作用，已有文獻報道其具有體外抗乙型肝炎病毒(HBV)、流感病毒(IFV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS病毒等多種病毒作用，但其對腺病毒的作用尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供荔枝核黃酮類化合物在制備抗腺病毒藥物上的用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)荔枝核黃酮類化合物能抑制腺病毒在細胞中的生物合成，臨床上可用于腺病毒感染引起的肺炎的治療。本發(fā)明采用的荔枝核黃酮類化合物的提取方法，其過程如下將荔枝核打碎成粉過40目篩，稱取荔枝核粉，加入乙醇溶液，采用微波預(yù)處理，恒溫提取并間歇震蕩，經(jīng)過兩次提取后，將提取液過濾，濃縮后加兩倍量的無水乙醇靜置一段時間后，充分沉淀后過濾除去蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)。減壓回收乙醇，濃縮后轉(zhuǎn)入水相，配制成用于樹脂吸附的荔枝核浸出液。在帶塞的磨口錐形瓶中加入預(yù)處理好的吸附樹脂和上述制備的荔枝核浸出液，于室溫下振蕩，調(diào)節(jié)上柱液PH= 5.0左右，室溫下以相應(yīng)流速吸附飽和；解吸時先用水淋洗，再用乙醇解吸，控制脫附劑流速和脫附劑的用量，然后收集所需成分，濃縮除去有機溶劑，最后獲得純度更高，活性更好的荔枝核黃酮類化合物。荔枝核黃酮類化合物在體外具有明顯抑制腺病毒的作用。具體體現(xiàn)在隨藥物濃度增高，典型AdV感染所致的細胞病變效應(yīng)(CPE)逐漸減弱、病毒抑制率逐漸增高、病毒滴度逐漸降低，并呈明顯的量效關(guān)系。本發(fā)明可從荔枝核中獲得含量更高、純度更高的黃酮類化合物。提取的黃酮類化合物能有效抑制腺病毒在細胞中的復(fù)制與增殖，可用于制備抗腺病毒藥物。


圖I.荔枝核黃酮類化合物對Hep-2細胞的毒性作用，A :正常 Hep-2 細胞；B 80mg · L-1 的 FLC 處理 Hep-2 細胞 24h(X400)。圖2.荔枝核黃酮類化合物在Hep-2細胞中對AdV_7致細胞病變作用的抑制效應(yīng)。 IOOTCId50腺病毒Adv-7感染!fep-2細胞，37°C吸附Ih后，棄病毒液，于培養(yǎng)孔中加入含不同濃度 FLC(40,20,10,5,2. 5,1. 25mg · Γ1) IOOul/孔，5% C02，37°C培養(yǎng)觀察。A AdV-7 感染的 Hep-2 細胞；B 10mg · L^1FLC 處理的 AdV_7 感染 H印-2 細胞；C 80mg · T1FLC處理的AdV-7感染H印-2細胞。
具體實施例方式實施例I :荔枝核黃酮類化合物的提取與純化將荔枝核打碎成粉過40目篩，稱取一定量的荔枝核粉，按照料液比I : 12加入相應(yīng)體積的濃度為60vol %乙醇溶液，在700W頻率微波下作用150S后，恒溫提取并間歇震蕩，經(jīng)過兩次提取后，將提取液過濾，濃縮后加兩倍體積量的無水乙醇靜置一段時間，充分沉淀后過濾除去蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)。減壓回收乙醇，濃縮后轉(zhuǎn)入水相，配制成用于樹脂吸附的荔枝核浸出液。在帶塞的磨口錐形瓶中加入600mg預(yù)處理好的X-5吸附樹脂和450ml 上述制備的荔枝核浸出液，并調(diào)整上樣液質(zhì)量濃度為O. 5mg/ml，于室溫25°C下振蕩(180r/ min) 24h,調(diào)節(jié)上柱液pH = 5. O,室溫下以流速2ml/min吸附飽和；解吸時先用水淋洗，再用 85vol%乙醇解吸，控制脫附劑流速為O. 5ml/min，脫附劑的用量為50ml/批，然后收集所需成分，濃縮除去有機溶劑。實施例2 :荔枝核提取物中黃酮的定性鑒定和含量測定I)首先取荔枝核提取物，溶于60vol%乙醇，與HCl-Mg，AlCl3, Pb (Ac)3反應(yīng)均為陽性，表明荔枝核提取物中含有黃酮類化合物。2)以60vol %乙醇為溶劑，以NaNO2-Al (NO3)3-NaOH作為顯色劑，分別作蘆丁標準品及荔枝核提取物的吸收曲線，二者均在508nm有一強吸收峰，故選擇508nm為測定波長。準確稱取蘆丁標準品5. OOmg,用50vol %乙醇溶解后定容至50ml容量瓶中，配制成蘆丁標準溶液(100 μ g/ml)。精確量取蘆丁標準溶液 O. 00、I. 00,2. 00,3. 00,4. 00,5. 0,6. O、 7. Oml分別置于25ml容量瓶中，各加入5wt%亞硝酸鈉溶液Iml搖勻，放置6min，加IOwt % 硝酸鋁溶液1ml，搖勻放置6min，加4wt%氫氧化鈉溶液10ml，然后用60vol%乙醇稀釋至刻度，搖勻放置15min，試劑為空白作參比，測定吸光度，顯色測定吸光度A，用最小二乘法得到回歸方程為=A = O. 0049C(y g/ml)+0. 0027。取荔枝核提取物Iml置于25ml容量瓶中，依次加入5wt%亞硝酸鈉溶液Iml,搖勻,放置6min,加IOwt%硝酸招溶液Iml,搖勻,放置6min,加4wt%氫氧化鈉溶液IOml,然后用60vol %乙醇定容,搖勻，放置15min,以不含荔枝核提取物的上述試劑作參比液，在508nm處測定吸光度，得到黃酮類化合物的濃度為 13. 33333mg · mL—1，從而推知荔枝核中黃酮類化合物含量為I. 98%。實施例3 :荔枝核黃酮類化合物體外抗腺病毒作用I、荔枝核黃酮類化合物對Hep-2細胞的細胞毒性Hep-2細胞經(jīng)胰酶消化后，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，加到96孔培養(yǎng)板中，每孔105/100 μ 1，待細胞長滿80%后每孔加入100μ I不同稀釋濃度的荔枝核黃酮類化合物(160，80，40，20，IOmg · Γ1)。每一藥物濃度均重復(fù)4孔，置培養(yǎng)箱中37°C 連續(xù)培養(yǎng)24小時后，MTT法測H印-2細胞的存活率。Hep-2細胞存活率=藥物組平均吸光度值(OD)/細胞對照組ODX 100%荔枝核黃酮類化合物對Hep-2細胞毒性作用表現(xiàn)為細胞粘連、變圓、壁厚、破碎脫落，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增加(見圖I)，折光性增強并且吸光值明顯下降。隨著荔枝核黃酮類化合物的濃度增加細胞存活率呈遞減趨勢，用SPSS 19. O的Probit回歸法計算、經(jīng)直線回歸分析，藥物濃度與細胞存活率之間存在直線相關(guān)關(guān)系(R2 = O. 99，P < O. 05)，荔枝核黃酮類化合物半數(shù)毒性濃度TC5tl為116. 83mg · L'荔枝核黃酮類化合物在80mg · I/1范圍內(nèi)均未見明顯的細胞毒性，從而確定該濃度為抗病毒實驗的最高允許濃度。結(jié)果見表I。表I.荔枝核黃酮類化合物對Hep-2細胞的毒性作用
權(quán)利要求
1.荔枝核黃酮類化合物在制備抗腺病毒藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了荔枝核黃酮類化合物在制備抗腺病毒(AdV)藥物中的應(yīng)用。荔枝核黃酮類化合物在體外具有顯著抑制AdV的作用，具體體現(xiàn)在隨藥物濃度增高，典型AdV感染所致的細胞病變效應(yīng)(CPE)逐漸減弱、病毒抑制率逐漸增高、病毒滴度逐漸降低，并呈明顯的量效關(guān)系。
文檔編號A61K36/77GK102579659SQ201210070589
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者侯煒, 彭璇, 朱丹, 李立, 楊艷, 羅凡 申請人:武漢大學(xué)