專利名稱：炎性疾病的治療的制作方法
炎性疾病的治療
本申請是申請?zhí)枮?00780034467. 6、發(fā)明名稱為“炎性疾病的治療”的申請的分案申請，該母案申請是2007年8月17日提交的PCT申請PCT/US2007/018331進(jìn)入中國國家階段的申請。
發(fā)明背景
本申請要求2006年8月17日提交的美國臨時(shí)專利申請序列號(hào)No. 60/838，222的權(quán)益，其全部公開內(nèi)容通過參考并入本文中。本發(fā)明得到了由美國國立衛(wèi)生研究院提供的編號(hào)為NS049014-02的政府資助。政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。
A.技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明一般性涉及外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎性疾病的領(lǐng)域。更具體地，它涉及通過調(diào)節(jié)鞘氨醇-I-磷酸受體活性來治療外周神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病的方法。
B.相關(guān)領(lǐng)域描述
外周神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system, PNS)是常見的免疫攻擊祀標(biāo)。慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, CIDP)有時(shí)可看作是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)的PNS對應(yīng)疾病，這是由于所述兩種疾病在病程(復(fù)發(fā)性相對于進(jìn)行性)、局灶性脫髓鞘的存在和不同程度的軸突喪失(axonal loss)以及免疫介導(dǎo)的病理生理異常方面具有相似性。CIDP的神經(jīng)中的炎性浸潤主要由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成，這提示T細(xì)胞介導(dǎo)的針對髓磷脂抗原的反應(yīng)可能是CIDP中組織損傷的原因。針對CIDP的可用療法(如靜脈內(nèi)丙種球蛋白、血漿去除術(shù)和類固醇)在三分之二的患者中是有效的，但可引起并發(fā)癥或者不能誘導(dǎo)持久的緩解(Ropper，2003)。為此，亟需開發(fā)可單獨(dú)使用或與現(xiàn)有治療方式聯(lián)合使用的新的治療方法和藥劑。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了針對炎性疾病和自身免疫病的療法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病的對象的方法，所述方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了減輕對象中外周神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫病癥狀的方法，所述方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了延長對象中外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病的復(fù)發(fā)時(shí)間的方法，所述方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患肌肉自身免疫病的對象的方法，所述方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑，其中外周神經(jīng)系統(tǒng)的所述自身免疫病得到治療。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了減輕對象中肌肉自身免疫病的癥狀的方法，所述方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了延長對象中肌肉自身免疫病的復(fù)發(fā)時(shí)間的方法，所述方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患神經(jīng)肌肉接頭自身免疫病的患者的方法，所述方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑，其中所述神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫病得到治療。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了減輕對象中神經(jīng)肌肉接頭自身免疫病的癥狀的方法，所述方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了延長對象中神經(jīng)肌肉接頭自身免疫病的復(fù)發(fā)時(shí)間的方法，所述方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑用于治療外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病。 在某些方面，所述外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括吉-巴綜合征(Guillain-Barr6syndrome, GBS)、 慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)、抗體介導(dǎo)的神經(jīng)病或血管炎性神經(jīng)病。在某些實(shí)施方案中，鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑用于治療影響肌肉自身免疫病癥(例如，肌炎)或影響神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫病癥(例如，肌無力)。
外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎性疾病或自身免疫病的癥狀包括例如麻刺感或麻木(通常在趾和指開始)、臂無力(weakness of the arms)、腿無力(weakness of the legs)、深部腱反射消失(反射消失)、疲勞以及感覺異常(abnormal sensation)。肌肉的炎性疾病或自身免疫病的癥狀包括例如肌無力、肌肉萎縮、肌肉疼痛、全身性疲勞以及吞咽困難。神經(jīng)肌肉接頭的炎性疾病或自身免疫病的癥狀包括例如肌無力、不對稱性上瞼下垂(一個(gè)或兩個(gè)眼瞼下垂)、由控制眼運(yùn)動(dòng)的肌肉無力導(dǎo)致的復(fù)視(雙視)、步態(tài)不穩(wěn)或鴨步、臂無力、手無力、指無力、腿無力和頸無力、面部表情改變、吞咽困難、呼吸急促以及構(gòu)音困難(講話障礙)。這些癥狀中的一個(gè)或多個(gè)可通過本發(fā)明的方法來減輕。表述“減輕外周神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病的癥狀”意指該癥狀嚴(yán)重程度降低或更易忍受。
在本發(fā)明的某些方面，所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑是FTY720、FTY720-P、 AAL(R)^AFD(R)或SEW2871。在本發(fā)明的某些方面中，所述鞘氨醇_1_磷酸受體調(diào)節(jié)劑是鞘氨醇-I-磷酸受體的下調(diào)劑。在本發(fā)明的另一些方面中，所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑是鞘氨醇-I-磷酸受體的激動(dòng)劑。所述鞘氨醇-I-磷酸受體可以是例如S1P1、S1P2、S1P3、 S1P4和/或S1P5受體。
所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑可在外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病癥狀發(fā)作前對對象施用，或者可在外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病癥狀出現(xiàn)后對對象施用。在本發(fā)明的某些方面中，所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑在外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病癥狀緩解期間對對象施用。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑在所述自身免疫病的癥狀出現(xiàn)之前和之后對對象施用?？赏ㄟ^本領(lǐng)域的已知任何途徑施用所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。在某些實(shí)施方案中，通過口服或注射施用所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。對于口服施用來說，所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑可以在適于口服施用的任何藥物組合物中提供，例如液體劑、膠囊劑或片劑。對注射來說，所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑可以在適于注射的任何藥物組合物中提供，例如以可注射的液體形式。所述注射可以是例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下。
在本發(fā)明的某些方面中，所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑以每天一次、每天兩次或每天三次進(jìn)行施用。在某些實(shí)施方案中，約每隔4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、 48小時(shí)或72小時(shí)施用所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。在本發(fā)明的某些方面中，對人對象施用的所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑的每日劑量為約0. Img 20mg、0. 5mg 10mg、 0. 5mg 5mg、Img 5mg、I. 25mg 5mg、I. 5mg 3mg、0. Img Img 或其中的任意范圍。在本發(fā)明的某些方面中，所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑每隔一天、每隔兩天、每隔三天、每隔四天、每周或每月進(jìn)行施用。負(fù)責(zé)施用本發(fā)明組合物的醫(yī)務(wù)人員將能夠通過評(píng)估對象的身體和生理因素(例如體重、性別、癥狀嚴(yán)重程度以及既往或當(dāng)前的治療干預(yù))來確定合適的劑量、施用途徑和施用頻率。
還應(yīng)考慮的是，所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑可以與另一治療劑聯(lián)合施用。例如，所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑可以與以下藥劑聯(lián)合施用免疫抑制劑(例如，環(huán)孢菌素A、環(huán)孢菌素G、FK-506、ABT-281、ASM981、雷帕霉素、40_0_(羥基)乙基-雷帕霉素、皮質(zhì)類固醇、環(huán)磷酰胺、咪唑硫嘌呤、氨甲蝶呤、來氟米特(Ieflunomide)、 咪唑立賓(mizoribine)、霉酹酸酯(mycophenolate mofetil)或15-去氧精胍菌素 (15-deoxyspergualine))、類固醇(例如，強(qiáng)的松或皮質(zhì)醇)、免疫球蛋白或I型干擾素。所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑和所述另一藥劑可以同時(shí)或相繼施用。當(dāng)所述鞘氨醇-I-磷酸受體調(diào)節(jié)劑和所述另一藥劑同時(shí)施用時(shí)，可以將它們配制成單一組合物或者配制成分開的組合物。
還應(yīng)考慮的是，本文所述的任何方法或組合物可以參考本文所述的任何其它方法或組合物來實(shí)施。
權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“或(或者)”用于指“和/或”，除非明確表明僅指其中一個(gè)選項(xiàng)或者各選項(xiàng)相互之間是排斥的，盡管本公開內(nèi)容支持僅表示其中一個(gè)選項(xiàng)的定義也支持“和/或”的定義。
在本申請全文中，術(shù)語“約”用于表示數(shù)值，其包括用于確定該數(shù)值的設(shè)備或方法的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
遵循一直以來的專利法，在權(quán)利要求書或說明書中與表述“包含(包括)” 一同出現(xiàn)的名詞表示一個(gè)(種)或多個(gè)(種)，除非另有特別指示。
根據(jù)以下詳述，本發(fā)明的另外的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，該詳細(xì)描述和具體實(shí)施例盡管表示本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是其僅以舉例方式給出， 這是因?yàn)楦鶕?jù)該詳述本發(fā)明的宗旨和范圍內(nèi)的多種變化和改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯而易見。


以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分并進(jìn)一步表明本發(fā)明的某些方面。通過參考這些附圖中的一幅或多幅再結(jié)合本文所述具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述可以更好地理解本發(fā)明。
圖1.FTY720和相關(guān)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖I提供了鞘氨醇、鞘氨醇_1_磷酸、 FTY720, FTY720-P, AAL(R), AFD (R)和 SEW2871 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖2.復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(compound muscle action potential, CAMP)。圖 2提供了野生型和B7-2+N0D小鼠中坐骨神經(jīng)刺激的CMAP的實(shí)例。
圖3.坐骨神經(jīng)的纖維切取制備物。纖維切取制備物顯示，與野生型NOD小鼠相比， 在B7-2+N0D小鼠中呈現(xiàn)節(jié)段性脫髓鞘和結(jié)間縮短以及髓鞘不規(guī)則增厚。
圖4.施萬細(xì)胞(Schwann cell, SC)中由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的神經(jīng)酰胺累積。TNF-a 和IFN-Y在永生化SC中通過誘導(dǎo)NOS和神經(jīng)酰胺累積協(xié)同作用從而降低細(xì)胞生存力。圖 4 顯示用 TNF- a (100g/ml) +IFN- y (200U/ml)、L-NAME (N0S 抑制劑)或者 TNF- a (100g/ ml)+IFN-y (200U/ml)+L-NAME誘導(dǎo)的SC中表示為對照百分比的神經(jīng)酰胺水平。細(xì)胞因子誘導(dǎo)24小時(shí)。星號(hào)(☆)表明p < 0. 0001。
圖5A和5B.在B7-2缺陷NOD小鼠中FTY720對臨床評(píng)分以及握力的影響。將動(dòng)物分為 3 組(I)水(n = 11) ； (2) 0. 3mg/kg 的 FTY720 (n = 5)；以及(3) I. Omg/kg 的 FTY720 (n = 10)。從7月齡開始進(jìn)行每日處理并持續(xù)4周。圖5A顯示施用載體(水)、0.3mg/kg的 FTY720或I. Omg/kg的FTY720的B7-2缺陷NOD小鼠在第7月(處理前)和第8月(處理后)的臨床評(píng)分。星號(hào)(* * )表明P < 0. 0007。相反，用FTY720(lmg/kg)處理的小鼠的臨床評(píng)分并未變更差。在4周處理結(jié)束時(shí),用握力計(jì)(Columbus Instruments)來測量后肢和前肢的握力。圖5B顯示施用載體(水)、0. 3mg/kg的FTY720或I. Omg/kg的FTY720的小鼠的后肢和前肢握力測量的結(jié)果。星號(hào)(* )表明P < 0. 01。誤差棒(error bar)表示標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。
圖6A和6B. FTY720對B7-2缺陷NOD小鼠中坐骨神經(jīng)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位的遠(yuǎn)端潛伏期、傳導(dǎo)速度和振幅的影響。進(jìn)行電生理研究以評(píng)估用I. Omg/kg的FTY720或載體(水) 處理的小鼠的坐骨神經(jīng)功能。對遠(yuǎn)端潛伏期(distal latency,DL)、傳導(dǎo)速度(conduction velocity, CV)和坐骨神經(jīng)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(CMAP)進(jìn)行了評(píng)估。該圖顯示，與用載體處理的小鼠相比，用I. Omg/kg的FTY720處理的小鼠表現(xiàn)出提高的DL和CV，但未表現(xiàn)出提高的坐骨神經(jīng)CMAP振幅。圖6A顯示坐骨神經(jīng)CMAP的實(shí)例。圖6B顯示對收集自用載體處理之小鼠的12條神經(jīng)和用I. Omg/kg的FTY720處理之小鼠的14條神經(jīng)的數(shù)據(jù)的總結(jié)。星號(hào) (* )表明P < 0. 02 ;雙星號(hào)(* * )表明p < 0. 01。
圖7. FTY720對B7_2缺陷NOD小鼠的坐骨神經(jīng)切片中炎性細(xì)胞浸潤的影響。對用載體(水，n = 6)或I. Omg/kg的FTY720 (n = 7)處理的B7-2缺陷NOD小鼠進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。通過定量法以及半定量法測量炎性細(xì)胞浸潤。該圖表明，與來自用載體處理的小鼠相比，來自用FTY720處理的小鼠的坐骨神經(jīng)切片中炎性細(xì)胞浸潤被降低。星號(hào)(* )表明p<0. 02。雙星號(hào)(* * )表明 p < 0. 003。
圖8. FTY720對B7-2缺陷NOD小鼠中脫髓鞘和有髓纖維損失的影響。對來自用載體(水，n = 6)或I. Omg/kg的FTY720(n = 7)B7~2缺陷NOD小鼠的環(huán)氧樹脂切片進(jìn)行分析。通過定量法測量有髓纖維的損失，通過半定量法測量脫髓鞘。該圖表明，與用載體處理的小鼠相比，用FTY720處理的小鼠中脫髓鞘和有髓纖維損失被減弱。星號(hào)(* )表明p<0. 015。
示例性實(shí)施方式
A.慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病的發(fā)病機(jī)理
慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病是一種外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的炎性疾病。其病程可復(fù)發(fā)或呈現(xiàn)進(jìn)行性，并且其特征在于存在局灶性脫髓鞘、不同程度的軸突喪失以及免疫介導(dǎo)的病理生理異常。CIDP神經(jīng)中的炎性浸潤主要由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成，這提示T細(xì)胞介導(dǎo)的針對髓磷脂抗原的反應(yīng)可能是CIDP中組織損傷的原因。然而，異常T細(xì)胞應(yīng)答的抗原靶標(biāo)尚未鑒定出來。目前對CIDP的治療包括皮質(zhì)類固醇(如強(qiáng)的松)，其可單獨(dú)使用或者與免疫抑制藥、血漿去除術(shù)以及靜脈內(nèi)免疫球蛋白聯(lián)合使用。物理治療可增強(qiáng)肌肉力量、功能和靈活性，并使肌肉和腱的萎縮以及關(guān)節(jié)變形最小化。
T細(xì)胞的完全活化，除了需要經(jīng)由T細(xì)胞受體的抗原特異性信號(hào)傳導(dǎo)之外，還需要經(jīng)由共刺激分子(B7-1和B7-2)的信號(hào)傳導(dǎo)。在B7-1存在時(shí)抗原呈遞使T細(xì)胞分化為表達(dá)白介素-2、IFN-y和TNF-a的Thl表型，而在B7-2存在時(shí)抗原呈遞誘導(dǎo)主要表達(dá)IL-4 的Th2表型(Karandikar等，1998 ；Kuchroo等，1995)。與上述理論一致的是,在CIDP神經(jīng)中B7-1優(yōu)先上調(diào)(Kiefer等，2000)。對⑶28敲除小鼠的研究表明⑶28是發(fā)生實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性神經(jīng)炎(experimental allergic neuritis, EAN)所必需的,所述EAN是吉-巴綜合征 (GBS)的動(dòng)物模型(Zhu等，2001b)。在NOD小鼠中，可通過用抗B7-2抗體處理或者通過消除 B7-2表達(dá)來預(yù)防糖尿病，但是這些操作卻誘發(fā)了自發(fā)性自身免疫性多發(fā)性神經(jīng)病(SAP)， 所述SAP在臨床、組織學(xué)和電生理學(xué)方面與CIDP類似(Salomon等，2001)。該模型中的進(jìn)行性病程與EAN中的截然不同，其通常為單相的并且除極少數(shù)例外均自發(fā)地恢復(fù)。在EAN 中，用外周髓鞘或純化的髓鞘蛋白(如P0、P2、PMP22或MAG)來免疫動(dòng)物(Constantinescu 等，1996 ；Kim 等，1994 ；Stoll 等，1993 ；Zhu 等，2001b)。
活化的淋巴細(xì)胞遷移穿過血-神經(jīng)屏障(blood nerve barrier, BNB),其依賴于淋巴細(xì)胞上的分子與內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附分子之間的相互作用。一旦有足夠的單核細(xì)胞浸潤，外周神經(jīng)損傷和脫髓鞘可通過多種機(jī)制發(fā)生。除了釋放細(xì)胞毒性化合物和細(xì)胞因子(如TNF-a)之外，巨噬細(xì)胞似乎還可以穿透完整的髓鞘并將髓鞘從軸突表面剝落下來 (Prineas和McLeod, 1976)。Thl細(xì)胞因子(如TNF- a和IFN- y )借助誘導(dǎo)iNOS和神經(jīng)酰胺累積進(jìn)行協(xié)同作用從而降低施萬細(xì)胞(Schwann cell, SC)活力(Nagano等,2001)。另一些人已發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子抑制SC增殖并下調(diào)髓鞘相關(guān)糖蛋白的表達(dá)(Chandross等，1996 ； Schneider-Schaulies 等，1991)。
施萬細(xì)胞在炎性神經(jīng)病中扮演著多功能的角色，其作為抗原呈遞細(xì)胞、免疫攻擊的靶標(biāo)以及神經(jīng)營養(yǎng)因子的來源起作用。這些細(xì)胞表達(dá)S1P2和S1P3受體；后者被腺苷酸環(huán)化酶活化劑福斯高林(forskolin)上調(diào)(Bermingham等，2001 ;Weiner等,2001)。提高 cAMP水平的藥劑對EAN具有保護(hù)作用并且降低SC對細(xì)胞因子所誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的敏感性 (Kim等，1994 ；Nagano等,2001)。cAMP的保護(hù)作用可能部分地通過調(diào)節(jié)SC上SlP受體的表達(dá)來介導(dǎo)，鞘脂信號(hào)傳導(dǎo)可能對SC存活以及分化起重要作用。導(dǎo)致免疫應(yīng)答終止或持續(xù)進(jìn)行的因子尚不完全清楚。表達(dá)FasL的施萬細(xì)胞可促使自身反應(yīng)性T細(xì)胞的消除(Wohlleben 等，2000)。癥狀緩解通常與IL-4、IL-10和TGF-P的產(chǎn)生增加有關(guān)。
B.淋巴細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中的鞘脂信號(hào)傳導(dǎo)
在許多細(xì)胞類型中，已顯示生長因子和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)那些參與控制所謂“神經(jīng)酰胺/SlP變阻器(rheostat)”(細(xì)胞后果的關(guān)鍵性決定因素)的酶的活性(Cuvillier等， 1996 ;Spiegel和Milstien，2003)。促炎癥細(xì)胞因子(如TNF-a和白介素-I)活化鞘磷脂酶，而不活化神經(jīng)酰胺酶，這導(dǎo)致神經(jīng)酰胺的累積，而TOGF和FGF除了上調(diào)鞘磷脂酶以外還上調(diào)了神經(jīng)酰胺酶，這導(dǎo)致神經(jīng)酰胺的降低以及鞘氨醇的升高，所述鞘氨醇之后可轉(zhuǎn)化為鞘氨醇-I-憐酸(SIP) (Coroneos 等，1995)。
已知活化的血小板、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌S1P，這導(dǎo)致其在血漿中的濃度到達(dá) PM水平(Murata等，2000 ;Spiegel和Milstien，1995)。因此，SlP可潛在地作為細(xì)胞內(nèi)信使或者作為G蛋白偶聯(lián)受體S1P1-S1P5(之前分別叫作Edgl、Edg5、Edg3、Edg6和Edg8)的細(xì)胞外配體來起作用。SlP受體與多種G蛋白偶聯(lián)。例如，SlPl與Gi/o以及Gi家族另外的成員(除Gs、Gq、G12或G13以外)偶聯(lián)。SlPl的活化刺激促分裂原活化蛋白激酶(MAPK) 發(fā)生磷酸化，抑制腺苷酸環(huán)化酶并激活磷脂酶C，這導(dǎo)致增殖性或遷移性的應(yīng)答(Windh等，1999 Jondag等，1998)。在內(nèi)皮細(xì)胞中，其中首先鑒定了 SlPl和S1P3基因，SlP刺激DNA 合成和細(xì)胞遷移并促進(jìn)內(nèi)皮屏障的完整(Liu等，2001 ；Schaphorst等，2003)。許多細(xì)胞類型表達(dá)SlP受體，但是一種細(xì)胞類型與另一細(xì)胞類型表達(dá)的主要受體亞型是不同的，其中
存在一些重疊。在由T淋巴細(xì)胞表達(dá)的SlP受體中，SlPl和S1P4受體是主要的，但是它們的表達(dá)受到TCR依賴性活化的抑制。低濃度(彡0.1 μ M)的SlP引起T細(xì)胞趨化性，而高濃度的 SlP是抑制性的(Graeler等，200 。最初對轉(zhuǎn)染子的研究表明，SlPl受體是SlP所誘導(dǎo)趨化性的轉(zhuǎn)導(dǎo)物，然而隨后的研究卻顯示在外源SlP不存在時(shí)在Jurkat T細(xì)胞中過表達(dá)S1P4 足以誘導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)(Graler等，2003)。體外研究表明，SlP抑制多克隆T細(xì)胞增殖，但是其對細(xì)胞因子分泌的影響尚無定論。SlP增強(qiáng)人T細(xì)胞的IL-2和IFN-γ分泌，但降低鼠⑶4+T 細(xì)胞的IFN- γ和IL-4分泌而不影響IL-2 (Dorsam等，2003 Jin等，2003)。除了淋巴細(xì)胞以外，小鼠巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞也表達(dá)SlP受體(S1P1、S1P2、S1P3和S1P5)。用SlP處理成熟的樹突細(xì)胞與Th2免疫應(yīng)答的出現(xiàn)有關(guān)(Idzko等，2002 ；Lee等，2002)。為此，SlP在體內(nèi)對免疫應(yīng)答極化的作用(Thl對TM)的凈結(jié)果尚有待闡明。SlP受體在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。已顯示外源性SlP在少突膠質(zhì)細(xì)胞(OLG)中激活ERK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)并調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)(Hida等，1998)。SlP在星形細(xì)胞中誘導(dǎo)生長因子(如膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子)的表達(dá)(&ito等，1999 ；Yamagata等，2003)。OLG譜系的細(xì)胞主要表達(dá)S1P1、S1P5以及可能表達(dá)S1P2，而施萬細(xì)胞表達(dá)S1P2和S1P3受體(Bermingham等， 2001 ；Im 等，2000 ；McGiffert 和 Chun，2002 ；Terai 等，2003 ；Weiner 等，2001)。已顯示，作用于另一些Edg受體的溶血磷脂酸促進(jìn)SC的存活和分化以及調(diào)節(jié)它們的形態(tài)和粘附(Li 等，2003 ；Weiner 等，2001)。C.鞘氨醇-1-磷酸受體的調(diào)節(jié)劑鞘氨醇-1-磷酸(SlP)受體參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞運(yùn)輸(trafficking)。SlP受體在若干涉及外周神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病發(fā)病的細(xì)胞類型中表達(dá)，例如膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和施萬細(xì)胞。本發(fā)明提供了用于通過調(diào)節(jié)患者中SlP受體的活性來治療炎性疾病(例如外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎性疾病)的方法。 1￥720(2-氨基-2-[2-(4_辛基苯基)乙基]_1，3_丙二醇)是免疫調(diào)節(jié)劑，其已顯示在移植模型中是有效的。它通過將淋巴細(xì)胞隔離在淋巴器官中來起作用，并伴隨外周血淋巴細(xì)胞減少以及T細(xì)胞向靶組織遷移減少(Chiki等，1998 ；Pinschewer等，2000 ；Xie 等，2003)。FTY720與鞘氨醇具有結(jié)構(gòu)相似性，這提示其借助SlP受體來起作用(Brinkmarm 等，2002 ；Suzuki等，1996)。盡管FTY720本身缺乏T細(xì)胞趨化活性，但是其磷酸化形式 (FTY720-P)是SlP (除S1P2以外)的強(qiáng)激動(dòng)劑，這通過對表達(dá)單一 SlP受體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行 [y35-S]GTPyS 結(jié)合測定來檢測(Brinkmann 等，2002 ；Mandala 等，2002)。在體內(nèi)，F(xiàn)TY720 大量轉(zhuǎn)化為 FTY720-P (Brinkmann 等，2002)。FTY720或其磷酸化形式對SlPl表達(dá)的下調(diào)或失活可解釋淋巴細(xì)胞的隔離，這類似于在S1P1缺陷小鼠中觀察到的(Mat 1 oub ian等，2004)。另一提出的模型是FTY720借助SlPl激動(dòng)劑活性而阻斷淋巴細(xì)胞退出(lymphocyte exit) (Brinkmann等，2002 ；Mandala 等，2002)。在濃度大于3μ M時(shí)，F(xiàn)TY720引發(fā)淋巴細(xì)胞凋亡(Matsuda等，1998 ;0yama等， 1998)。已顯示，當(dāng)在用牛脊髓或MBP免疫當(dāng)天開始進(jìn)行處理時(shí)，F(xiàn)TY720對實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性CN 102526736 A
腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)是有效的(Brinkmann^ 2002 ；Fuj ino等，200 。目前正在對FTY治療多發(fā)性硬化(MQ進(jìn)行評(píng)估，所述MS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的炎性和神經(jīng)退行性疾病(“FTY720，a novel once-daily oral medication, shows promising results in treatment of multiple sclerosis,，，Novaritis Media Release,[在線]從以下萬維網(wǎng)網(wǎng)址獲得:novartispharma. at/download/presse/ international/FTY720% 20-% 20ENGLISH% 20% 20FINAL. pdf. 2006 年 6 月 28 日訪問)。 然而，在CNS疾病中的成功治療未必一定可轉(zhuǎn)化為PNS疾病中的成功治療。例如，干擾素 β (IFN-β)有效地降低了 MS攻擊頻率，但是其對于治療CIDP及其它炎性神經(jīng)病的效用還存在爭論。在4個(gè)研究中有2個(gè)報(bào)道了接受IFN-β的CIDP患者的病情改善(Choudhary 等，1995 ；Vallat 等，2003 ；Kuntzer 等，1999 ；Hadden 等，1999)。AAL(R)是FTY720的手性甲基類似物，AFD(R)是FTY720的磷酸酯(Kiuchi等， 2000)。AFD(R)作為四種 SlP 受體(S1P1、S1P3、S1P4 和 S1P5)的激動(dòng)劑起作用(Brinkmann 等，2002)。最近，已證實(shí)AAL(R)誘導(dǎo)髓質(zhì)胸腺細(xì)胞(medullary thymocyte)中的快速表型變化，導(dǎo)致CD69在2小時(shí)內(nèi)下調(diào)(Rosen等，2003)。SEW^871作為SlPl的激動(dòng)劑起作用。 這些結(jié)果表明，F(xiàn)TY720及其相關(guān)化合物對免疫系統(tǒng)起多效作用。鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸、 FTY720, FTY720-P, AAL(R), AFD(R)和 SEW^871 的結(jié)構(gòu)示于圖 1 中。D.藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物包含溶于或分散于可藥用載體中的有效量的一種或多種SlP 受體活性調(diào)節(jié)劑。短語“可藥用的”是指當(dāng)按照需要施用于動(dòng)物(例如人)時(shí)不會(huì)產(chǎn)生不良的、變應(yīng)性的或其它不利的反應(yīng)之分子實(shí)體和組合物。對包含至少一種SlP受體活性調(diào)節(jié)劑的藥物組合物的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開內(nèi)容已知的，并示例于“Remington: The Science and Practice of Pharmacy，” 第 21 版，2005，其通過參考并入本文中。另夕卜，對于人類施用來說，應(yīng)當(dāng)理解，制備還應(yīng)滿足FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)辦公室(FDA Office of Biological Standards)所要求的對無菌性、熱原性、整體安全性以及純度的標(biāo)準(zhǔn)。本文使用的“可藥用載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、抗氧化劑、鹽、包衣、表面活性劑、防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸、抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、溶液阻滯劑(例如石蠟)、吸附劑(例如，高嶺土、膨潤土)、藥物穩(wěn)定劑(例如，十二烷基硫酸鈉)、凝膠、粘合劑(例如，糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃芪膠、聚乙烯吡咯烷酮、 羧甲基纖維素、藻酸鹽)、賦形劑(例如，乳糖(lactose)、乳糖(milk sugar)、聚乙二醇)、 崩解劑(例如瓊脂、淀粉、乳糖、磷酸鈣、碳酸鈣、海藻酸、山梨醇、甘氨酸)、潤濕劑(例如， 十六烷醇、單硬脂酸甘油酯)、潤滑劑、吸收促進(jìn)劑(例如，季銨鹽)、可食用油(例如，杏仁油、椰油、油性酯(oily ester)或丙二醇)、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、填充劑(例如，淀粉、 乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、硅酸)、壓片潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、淀粉、葡萄糖、乳糖、米花 (rice flower)、白堊)、吸入用載體(例如，烴拋射劑)、緩沖劑或諸如此類的物質(zhì)及其組合,如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所了解地(參見例如，“Remington :The Science and Practice of Wiarmacy，”第21版，200幻。將任何除了與所述活性成分不相容的常規(guī)載體以外的常規(guī)載體用于所述治療性或藥物組合物也在考慮范圍內(nèi)。在任何情形中，所述組合物可包含多種抗氧化劑以阻滯一種或多種組分的氧化。 抗氧化劑的實(shí)例包括抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、抗壞血CN 102526736 A
酸棕櫚酸酯、丁羥甲苯、丁羥茴醚、卵磷脂、沒食子酸丙酯和生育酚。另外，防止微生物作用可通過使用防腐劑來實(shí)現(xiàn)，所述防腐劑例如多種抗菌劑和抗真菌劑，其包括但不限于對羥基苯甲酸酯類(例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其組合。可藥用的鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質(zhì)組分的游離氨基形成的鹽或者與無機(jī)酸 (例如，鹽酸、氫溴酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、苯甲酸、乳酸、膦酸、檸檬酸、馬來酸、富馬酸、琥珀酸、萘磺酸(napsylic)、克拉維酸、硬脂酸或杏仁酸)形成的鹽。 與游離羧基形成的鹽還可衍生自無機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、 氫氧化鎂或氫氧化鐵)或者有機(jī)堿(例如，異丙胺、三甲胺、組氨酸或普魯卡因)。在所述組合物為液體形式的一些實(shí)施方案中，載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、液體(例如，甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)及其組合。可維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如通過使用包衣(如卵磷脂)來實(shí)現(xiàn)；通過分散于載體(例如，液體多元醇或脂類)中而維持所需粒徑來實(shí)現(xiàn)；通過使用表面活性劑(例如，羥丙基纖維素)來實(shí)現(xiàn)；或者這些方法的組合。在許多情形中，優(yōu)選包含等滲劑(例如，糖、氯化鈉或其組合)。本發(fā)明可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)方法進(jìn)行施用(參見例如， Remington :The Science and Practice of Pharmacy，”H 21 片反，2005) 。白勺Il 用途徑包括例如口服、皮內(nèi)、皮下、局部、通過注射、輸注、連續(xù)輸注、局部灌注、直接浸浴靶細(xì)胞(bathing target cells directly)、經(jīng)由導(dǎo)管、經(jīng)由灌洗器，或者通過前述的組合來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)口服施用時(shí)，所述SlP受體活性調(diào)節(jié)劑可采用以下形式片劑、膠囊、小袋 (sachet)、小瓶、粉劑、顆粒劑、錠劑、可重構(gòu)的粉劑或液體制備物。根據(jù)需要，通過將所需量的所述活性化合物摻入含有多種上述其它成分的合適溶劑中來制備無菌注射用溶液，然后進(jìn)行過濾除菌。通常，通過將多種無菌活性成分摻入含有基本分散介質(zhì)和/或所述其它成分的無菌載體中來制備分散體系。在用于制備無菌注射用溶液、混懸液或乳劑的無菌粉劑的情形中，優(yōu)選的制備方法為真空干燥或冷凍干燥技術(shù)，所述技術(shù)從先前過濾除菌的液體介質(zhì)中產(chǎn)生活性成分加任何其它所需成分的粉末。必要時(shí)，所述液體介質(zhì)應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)緩沖， 并且在注射前用足夠的鹽水或葡萄糖首先使液體稀釋劑等滲。制備用于直接注射的高度濃縮組合物也在考慮范圍內(nèi)，其中可以想到使用DMSO作為溶劑會(huì)導(dǎo)致極其快速的滲透、將高濃度的活性藥劑遞送至小的區(qū)域。對患者施用本發(fā)明組合物的實(shí)際劑量可根據(jù)以下身體和生理因素來確定體重、 性別、癥狀嚴(yán)重程度、所治療疾病的類型、先前或當(dāng)前的治療干預(yù)、患者的未知病因疾病 (idiopathy)、施用時(shí)間、具體化合物的排泄率以及施用途徑。在任何情況下，將由負(fù)責(zé)施用的醫(yī)務(wù)人員確定組合物中活性成分的濃度以及用于個(gè)體對象的合適劑量。在一些具體的實(shí)施方案中，可通過在所述組合物中使用延遲吸收的藥劑(例如， 單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來實(shí)現(xiàn)注射用組合物的延長吸收。
E.實(shí)施例以下實(shí)施例用以說明本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，以下實(shí)施例中公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人公開的在本發(fā)明實(shí)踐中實(shí)施良好的技術(shù)，因此可認(rèn)為其構(gòu)成優(yōu)選實(shí)施方式。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可對這些公開的具體實(shí)施方案進(jìn)行多種修改，并仍可獲得相同或類似的結(jié)果而不脫離本發(fā)明的主旨和范圍。實(shí)施例1B7. 2缺陷NOD小鼠中的自發(fā)性自身免疫性多發(fā)性神經(jīng)病(SAP)在嘗試研究共刺激信號(hào)在NOD小鼠中作用的過程中，發(fā)現(xiàn)消除B7-2的表達(dá)防止了這些小鼠中發(fā)生高血糖。然而，這些小鼠在M周齡時(shí)開始發(fā)生對稱性后肢輕癱(Mlomon 等，2001)。在體內(nèi)對坐骨神經(jīng)進(jìn)行的神經(jīng)傳導(dǎo)研究表明遠(yuǎn)端潛伏期延長、傳導(dǎo)速度顯著減慢以及復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(CMAP)散亂(dispersion)，如圖2所示。野生型NOD中的遠(yuǎn)端運(yùn)動(dòng)潛伏期為 1. 1 士0. Ims (n = 8)，Β7. 2+N0D 小鼠中為 2. 7士0. 4ms (ρ < 0. 005)。野生型 NOD 中的傳導(dǎo)速度為 50. 5士3. 8m/s，B7. 2+N0D 小鼠中為 17. 9士3. 2m/s (ρ < 0. 00001)。野生型 NOD 中的 CMAP 振幅為 10. 8士 1. 5mV,B7. 2+N0D 小鼠中為 3. 0士0. 6mV(p < 0. 005)。部分傳導(dǎo)阻斷(定義為近端刺激相對遠(yuǎn)端刺激的振幅下降30% )在某些(并非所有的)動(dòng)物中觀察到，這可能與所研究神經(jīng)的數(shù)目有限有關(guān)。這些電生理學(xué)發(fā)現(xiàn)是典型的脫髓鞘過程附帶軸突喪失。組織學(xué)評(píng)估表明在B7-2+N0D小鼠的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)和坐骨神經(jīng)中出現(xiàn)炎性浸潤，但CNS中卻沒發(fā)現(xiàn)。大直徑軸突顯著喪失，并且坐骨神經(jīng)切片上存在具有薄髓鞘的有髓纖維。纖維切取制備物顯示節(jié)段性脫髓鞘和伴隨髓鞘不規(guī)則增厚的結(jié)間縮短，這些與正在進(jìn)行髓鞘修復(fù)相一致(圖3)。該部分再髓鞘化(remyelination)的發(fā)生表明該過程可能是可逆的。利用從患病動(dòng)物中分離的CD4+T細(xì)胞在NOD-SCID中誘導(dǎo)了自發(fā)性自身免疫性多發(fā)性神經(jīng)病(SAP)，但是在被動(dòng)轉(zhuǎn)移研究(passive transfer study) 中使用來自患病動(dòng)物的血清卻未能實(shí)現(xiàn)該誘導(dǎo)。這些研究表明，B7-2缺陷NOD小鼠構(gòu)成了模擬人疾病CIDP的自發(fā)性自身免疫性神經(jīng)病的首個(gè)模型；并且易患自身免疫病的個(gè)體具有免疫功能障礙，根據(jù)共刺激環(huán)境其可表現(xiàn)為不同的疾病形式。實(shí)施例2促炎癥細(xì)胞因子對SC和背根神經(jīng)節(jié)(DRG) -SC共培養(yǎng)物的協(xié)同效應(yīng)TNF- α和IFN- y (稱作細(xì)胞因子)在永生化SC細(xì)胞中通過誘導(dǎo)NOS和神經(jīng)酰胺累積協(xié)同作用從而降低細(xì)胞生存力(圖4) (Nagano等，2001)。這兩種細(xì)胞因子均不能單獨(dú)地誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。這些細(xì)胞因子還對新生兒DRG-SC共培養(yǎng)物的髓鞘形成行使協(xié)同抑制作用，其在處理3天后表現(xiàn)得很明顯。使用50 300U/ml的IFN-γ或低濃度的TNF-α (lOng/ ml)時(shí)未觀察到對髓鞘形成的作用，而在使用lOOng/ml的TNF-α?xí)r觀察到輕微的抑制作用。在處理了 7天的共培養(yǎng)物中觀察到細(xì)胞因子誘導(dǎo)了影響SC和神經(jīng)元的細(xì)胞死亡。實(shí)施例3FTY720對B7-2缺陷NOD小鼠中SAP嚴(yán)重程度的影響已顯示FTY720抑制淋巴細(xì)胞從淋巴器官遷移出去，并且已顯示出其磷酸化形式是四種 SlP 受體的強(qiáng)激動(dòng)劑(Brinkmann 等，2002 ；Graler 和 Goetzl，2004 ；Matloubian 等， 2004)。最近的研究提示，這些藥物在體內(nèi)的作用可能是由于FTY720或其磷酸化形式下調(diào) SlP 受體所致(Brinkmann 等，2002 ；Graler 和 Goetzl，2004 ；Matloubian 等，2004)。這些藥劑所導(dǎo)致的主要后果是將淋巴細(xì)胞隔離于次級(jí)淋巴器官中，盡管在較高濃度時(shí)觀察到了凋亡(Brinkmann 等，2002 ；Mandala 等，2002 ；Nagahara 等，2000)。在免疫時(shí)口 服施用 FTY720 阻止了 EAE的發(fā)生(Brinkmarm等，2002 ；Fujino等，2003)。然而，先前并不清楚在疾病發(fā)作后施用FTY720或其手性類似物AAL(R)是否有效。由于類似于CIDP，所述B7-2缺陷NOD小鼠提供了研究可停止疾病進(jìn)程或者增強(qiáng)自身免疫性神經(jīng)病康復(fù)之藥劑的特有的機(jī)會(huì)。在該自發(fā)性自身免疫性神經(jīng)病的模型中，癥狀發(fā)作在M 觀周發(fā)生。若不進(jìn)行處理，則小鼠將在32周前惡化為四肢輕癱的程度。使用雌性B7-2缺陷NOD小鼠，這是因?yàn)樗鼈儽绕湫坌詡€(gè)體更易發(fā)生SAP (Salomon 等，如上)。在研究開始時(shí)所述小鼠為7月齡。通過口服管飼法對動(dòng)物施用劑量為OJmg/ kg或lmg/kg的FTY720 (水溶液)或僅施用載體，每天一次，共1個(gè)月。該濃度的選擇是基于有關(guān)外周淋巴細(xì)胞去除的劑量響應(yīng)研究以及來自大鼠EAE研究的數(shù)據(jù)(Brinkmarm等， 2002 ；Fujino 等，2003)。為了確定FTY720對B7_2缺陷NOD小鼠的臨床評(píng)分和握力的影響，由不知情的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行定性和定量的評(píng)估。對于定性評(píng)估來說，使用了由另外的研究人員所描述的標(biāo)度(nominal scale) (0為正常，5為死亡)(Zhu等，2001a)。對于定量評(píng)估來說，使用握力計(jì) (Columbus Instruments)測量后肢和前肢的力量。與用載體處理(n = 11)或僅用0. 3mg/ kg FTY720 (η = 5)處理的動(dòng)物相比，用lmg/kg FTY720 (η = 10)處理1個(gè)月的動(dòng)物在定性評(píng)估中表現(xiàn)為無力癥狀較輕，在定量評(píng)估中表現(xiàn)為握力較大(圖5A和5B)。用水處理的小鼠在第7個(gè)月和第8個(gè)月之間的臨床評(píng)分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，其ρ值小于0. 0007(圖5a)。 同樣地，用0. 3mg/kg FTY720處理的小鼠在第7個(gè)月和第8個(gè)月之間的臨床評(píng)分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，其P值小于0.03(圖如)。與用載體處理的小鼠和用0. 3mg/kg FTY720處理的小鼠相反的是，用1. 0mg/kgFTY720處理的小鼠的臨床評(píng)分在第7個(gè)月和第8個(gè)月之間沒有提高。當(dāng)使用定量評(píng)估前肢和后肢力量時(shí)也觀察到類似的結(jié)果。與用載體處理的小鼠或用 0. 3mg/kg FTY720處理的小鼠相比，用1.0mg/kg FTY720處理的小鼠表現(xiàn)出握力增加(圖 5B)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)TY720即使在癥狀發(fā)作后給藥也可以是有益的。還通過誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞減少來監(jiān)測FTY720的有效性。FTY720 (0. 3mg/kg) 處理的小鼠(η = 4)的外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降至用載體處理的小鼠中的50 60%，用 FTY720(1. 0mg/kg)處理的小鼠(n = 3)中降至用載體處理的小鼠中的25 30%。進(jìn)行電生理研究以評(píng)估FTY720在所述研究動(dòng)物的亞群中對坐骨神經(jīng)功能的體內(nèi)影響。與用水處理的對照小鼠相比，用1.0mg/kg FTY720處理的小鼠表現(xiàn)出改善的遠(yuǎn)端潛伏期(DL)和傳導(dǎo)速度(CV)，但并未表現(xiàn)出改善的坐骨神經(jīng)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(CMAP)的振幅(表1)。圖6相似地顯示出FTY720處理改善了 DL和CV (圖6B，顯示對來自6只用水處理之小鼠的12條神經(jīng)以及來自7只用FTY720處理之小鼠的14條神經(jīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié))，但并未改善坐骨神經(jīng)CMAP的振幅(圖6A)。表 1CN 102526736 A
載體FTY720 (1 me/kEl JL * tjk r am Kt 1 Jl saa ^iJ (* p<0.02; **p<0.01)遠(yuǎn)端游伏期 (ms>2.59 ±0.3t.58±0.3*傳導(dǎo)速度 (m/s)14,7 ±3.0 -2 o**振幅(■￥)3.75 ±1.83.8 ±0.7為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)FTY720對B7_2缺陷NOD小鼠的作用，進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估以評(píng)價(jià)炎性細(xì)胞浸潤。使用定量或半定量的方法，與用水處理的小鼠(n = 6)相比用1. 0mg/kgFTY720 處理的小鼠(n = 7)表現(xiàn)出降低的炎性細(xì)胞浸潤(圖7)。這些觀察到的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的，當(dāng)使用定量方法將用水處理的小鼠與用FTY720處理的小鼠進(jìn)行比較時(shí)ρ值小于0. 02， 當(dāng)使用半定量方法進(jìn)行比較時(shí)P值小于0. 003。對于定量方法來說，利用圖像分析來測量組織區(qū)域，并以20倍的放大倍數(shù)對炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)算該結(jié)果的平均值并表示為每平方毫米組織切片的細(xì)胞數(shù)。對于半定量方法來說，將炎癥評(píng)級(jí)為1——在神經(jīng)束膜下常有少數(shù)分散的單核炎性細(xì)胞；2——單核炎性細(xì)胞形成小靜脈血管套(perivenular cuffing)( 一個(gè)或兩個(gè)病灶)；3——大量多病灶小靜脈血管套以及廣布的神經(jīng)內(nèi)膜炎癥。FTY720處理還阻止脫髓鞘和有髓纖維損失。從用載體處理的小鼠(n = 6)以及用1. Omg/kg FTY720處理的小鼠(n = 6)制備環(huán)氧樹脂切片。用FTY720處理的小鼠表現(xiàn)出有髓細(xì)胞損失百分?jǐn)?shù)以及脫髓鞘評(píng)分的降低(圖8)。這些差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其ρ值小于0.015。由不知情的觀察者使用網(wǎng)格來評(píng)估環(huán)氧樹脂切片中有髓纖維損失的百分?jǐn)?shù)。脫髓鞘評(píng)級(jí)如下1——位于血管周或分散的孤立脫髓鞘軸突；2——多個(gè)血管周脫髓鞘病灶； 3——位于血管周并且匯合的大量脫髓鞘。實(shí)施例4研究FTY720對血管神經(jīng)屏障通透性的影響進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)將確定在疾病發(fā)作后給藥時(shí)FTY720及其相關(guān)化合物(如SlPl激動(dòng)劑SEW^71)可否減弱對血管神經(jīng)屏障(BNB)的破壞。為了研究FTY720對BNB通透性的影響，在處死前1小時(shí)將埃文斯藍(lán)(Evans blue)靜脈注射進(jìn)B7-2缺陷NOD小鼠中。將用載體處理的小鼠與在第1天用FTY720處理以及在第3天用FTY720處理的小鼠進(jìn)行比較。使用類似的條件(例如，同樣的透鏡、激光功率、針孔大小等)拍攝縱向坐骨神經(jīng)切片的DIC 成像的EBA共聚焦圖像。如果FTY720減弱了神經(jīng)組織中的EBA滲漏，則該結(jié)果表明FTY720 的治療效果至少部分地通過減弱BNB破壞來介導(dǎo)。陰性結(jié)果(即對EBA穿過BNB的能力沒有影響)將暗示FTY720能夠降低SAP小鼠中坐骨神經(jīng)切片中的炎性浸潤是由于減少了淋巴細(xì)胞遷移至靶器官而非主要對表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞的SlPl和/或S1P3受體起作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)還將確定在該小鼠模型中FTY720及其相關(guān)化合物是否改變脾細(xì)胞對推定抗原的免疫反應(yīng)性。脾細(xì)胞將從用載體、FTY720或FTY720相關(guān)化合物處理過的SAP 小鼠中分離得到。通過摻入胸苷(例如3H-胸苷測定)來監(jiān)測脾細(xì)胞增殖。還將評(píng)估響應(yīng)于 PO 蛋白肽(180-199) (10-20 μ g/ml)、P2 蛋白肽(57-81) (10-20 μ g/ml)、純化的 PNS 鞘磷脂(100yg/ml)和SC裂解物(100yg/ml)的細(xì)胞因子產(chǎn)生。脾細(xì)胞增殖的降低以及細(xì)胞因子產(chǎn)生的降低將表明T細(xì)胞的活化響應(yīng)于FTY720及其相關(guān)化合物而減弱。該結(jié)果表明，這些化合物可在疾病早期(引發(fā))和晚期(效應(yīng)物)起作用。實(shí)施例5研究施萬細(xì)胞(SC)中SlP受體的作用在含有或不含F(xiàn)TY720-P (0. 01-1 μ Μ)的無血清條件下，用TNF- α (100ng/ml)和 IFN-y (200U/ml)處理來自新生大鼠坐骨神經(jīng)的純化SC 48 72小時(shí)。所述TNF-α和 IFN-Y劑量基于先前的研究(Nagano等，2001)。為了確定FTY720-P可否降低SC死亡，利用碘化丙錠對細(xì)胞核染色和臺(tái)盼藍(lán)測定來測定細(xì)胞凋亡程度。如果FTY720-P降低SC死亡， 則使用siRNA法來確定哪種SlP亞型介導(dǎo)該作用。還可使用該方法來確定FTY720-P以外的SlP激動(dòng)劑(如SlP或SEW2871)是否可以抑制SC死亡。在FTY720-P或其它SlP受體激動(dòng)劑抑制SC死亡的情況下，進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)來檢測FTY720-P及另一些SlP受體激動(dòng)劑對ERK1/2和Akt磷酸化(它們是與細(xì)胞生存和增殖相關(guān)的信號(hào)分子)的作用。如果未觀察到對存活、增殖和磷酸化測定的影響，則該結(jié)果將暗示SlP受體對SC的存活、分化或髓鞘形成不是關(guān)鍵的。上述研究的陽性結(jié)果將表明SlP受體可作為膠質(zhì)細(xì)胞保護(hù)劑(glioprotective agent)的潛在靶標(biāo)。本發(fā)明還具體涉及下述實(shí)施方案1. 一種治療患有外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病的對象的方法，該方法包括對該對象施用有效量的鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑，其中所述外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病得到治療。2.根據(jù)1的方法，其中所述鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑是FTY720。3.根據(jù)1的方法，其中所述鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑是FTY720-P。4.根據(jù)1的方法，其中所述鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑是AAL (R)。5.根據(jù)1的方法，其中所述鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑是AFD (R)。6.根據(jù)1的方法，其中所述鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑是SEW^71。7.根據(jù)1的方法，其中所述外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病是吉-巴綜合征(GBS)、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病^IDP)、抗體介導(dǎo)的神經(jīng)病或血管炎性神經(jīng)病。8.根據(jù)1的方法，其中所述外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病是慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)。9.根據(jù)1的方法，其中在所述外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病的癥狀發(fā)作前對所述對象施用所述鞘氨醇-ι-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。10.根據(jù)1的方法，其中在所述外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病的癥狀發(fā)作后對所述對象施用所述鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑。11.根據(jù)1的方法，其中所述鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑口服施用。12.根據(jù)1的方法，所述方法還包括對所述對象施用有效量的免疫抑制劑。13.根據(jù)1的方法，所述方法還包括對所述對象施用有效量的皮質(zhì)類固醇。14.根據(jù)1的方法，所述方法還包括對所述對象施用有效量的免疫球蛋白。15. 一種減輕對象中外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病癥狀的方法，該方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑，其中所述外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病的癥狀得以減輕。16.根據(jù)15的方法，其中所述鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑是FTY720、FTY720-P、AAL (R)或 AFD (R)。17.根據(jù)15的方法，其中所述外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病是慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)。18. 一種延長對象中外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病的復(fù)發(fā)時(shí)間的方法，所述方法包括對所述對象施用有效量的鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑，其中所述外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病的復(fù)發(fā)時(shí)間得以延長。19.根據(jù)18的方法，其中所述鞘氨醇-1-磷酸受體調(diào)節(jié)劑是FTY720、FTY720-P、 AAL (R)或 AFD (R)。20.根據(jù)18的方法，其中所述外周神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫病是慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)。根據(jù)本公開內(nèi)容，可無需過多實(shí)驗(yàn)便可實(shí)現(xiàn)和實(shí)施本文公開和要求保護(hù)的所有組合物和方法。盡管已以優(yōu)選實(shí)施方案的方式對本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了描述，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的構(gòu)思、主旨和范圍的前提下對所述組合物和方法以及對本文所述方法的步驟或所述步驟的順序進(jìn)行改動(dòng)是顯而易見的。更具體地，當(dāng)可達(dá)到同樣地或類似的結(jié)果時(shí)，可將本文所述藥劑替換為與其在化學(xué)上和生理上相關(guān)的某些藥劑是顯而易見的。所有這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的相似替代物或改動(dòng)被視為在由所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的主旨、范圍和構(gòu)思內(nèi)。參考文獻(xiàn)以下參考文獻(xiàn)，就其提供補(bǔ)充本文所述內(nèi)容的示例性程序或其它細(xì)節(jié)來說，通過參考具體并入本文中。Bermingham et al. , J. 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權(quán)利要求
1.鞘氨醇-I-磷酸受體激動(dòng)劑在制備用于治療對象中選自以下的病癥的藥物中的用途吉-巴綜合征(GBS)、抗體介導(dǎo)的神經(jīng)病、血管炎性神經(jīng)病、影響肌肉或神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫病癥、以及PNS的炎性或自身免疫病癥。
2.權(quán)利要求I的用途，其中所述影響肌肉的自身免疫病癥是肌炎、肌無力、肌肉萎縮、 肌肉疼痛或吞咽困難。
3.權(quán)利要求I的用途，其中所述影響神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫病癥是肌無力、不對稱性上瞼下垂、復(fù)視或構(gòu)音困難。
4.權(quán)利要求I的用途，其中所述PNS的炎性或自身免疫病癥是麻刺感、麻木、臂無力、腿無力、反射消失、疲勞。
5.權(quán)利要求I的用途，其中所述鞘氨醇-I-磷酸受體激動(dòng)劑是FTY720、FTY720-P、 AAL (R)、AFD (R)或 SEW2871。
6.權(quán)利要求I的用途，其中所述藥物用于在所述病癥的癥狀出現(xiàn)之前施用。
7.權(quán)利要求I的用途，其中所述藥物用于在所述病癥的癥狀出現(xiàn)之后施用。
8.權(quán)利要求I的用途，其中所述藥物用于口服施用。
9.權(quán)利要求I的用途，其中所述對象還被施用有效量的皮質(zhì)類固醇的免疫抑制劑和/ 或免疫球蛋白。
10.鞘氨醇-I-磷酸受體激動(dòng)劑在制備用于減輕對象中選自以下的病癥之癥狀的藥物中的用途吉-巴綜合征(GBS)、抗體介導(dǎo)的神經(jīng)病、血管炎性神經(jīng)病、影響肌肉或神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫病癥、以及PNS的炎性或自身免疫病癥。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述影響肌肉的自身免疫病癥是肌炎、肌無力、肌肉萎縮、肌肉疼痛或吞咽困難。
12.權(quán)利要求10的用途，其中所述影響神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫病癥是肌無力、不對稱性上瞼下垂、復(fù)視或構(gòu)音困難。
13.權(quán)利要求10的用途，其中所述PNS的炎性或自身免疫病癥是麻刺感、麻木、臂無力、 腿無力、反射消失、疲勞。
14.權(quán)利要求10的用途，其中所述鞘氨醇-I-磷酸受體激動(dòng)劑是FTY720、FTY720-P、 AAL (R)、AFD (R)或 SEW2871。
15.鞘氨醇-I-磷酸受體激動(dòng)劑在制備用于延長對象中選自以下的病癥的復(fù)發(fā)時(shí)間的藥物中的用途吉-巴綜合征(GBS)、抗體介導(dǎo)的神經(jīng)病、血管炎性神經(jīng)病、影響肌肉或神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫病癥、以及PNS的炎性或自身免疫病癥。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述影響肌肉的自身免疫病癥是肌炎、肌無力、肌肉萎縮、肌肉疼痛或吞咽困難。
17.權(quán)利要求15的用途，其中所述影響神經(jīng)肌肉接頭的自身免疫病癥是肌無力、不對稱性上瞼下垂、復(fù)視或構(gòu)音困難。
18.權(quán)利要求15的用途，其中所述PNS的炎性或自身免疫病癥是麻刺感、麻木、臂無力、 腿無力、反射消失、疲勞。
19.權(quán)利要求15的用途，其中所述鞘氨醇-I-磷酸受體激動(dòng)劑是FTY720、FTY720-P、 AAL(R)、AFD(R)或 SEW2871。
全文摘要
本發(fā)明一般性涉及外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎性疾病領(lǐng)域。更具體地，它涉及通過調(diào)節(jié)鞘氨醇-1-磷酸受體活性來治療外周神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)或另一些自身免疫性神經(jīng)病的對象的方法，其包括對所述對象施用有效量的FTY720。
文檔編號(hào)A61P21/00GK102526736SQ20121002406
公開日2012年7月4日 申請日期2007年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月17日
發(fā)明者貝蒂·C·索利文 申請人:芝加哥大學(xué)