專利名稱：一種血管平滑肌l型鈣離子通道免疫原性肽段及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術和醫(yī)藥領域，具體涉及一種血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段的制備，以及用該肽段制備的疫苗在治療原發(fā)性高血壓的應用。
背景技術：
高血壓是嚴重危害人類健康的世界性問題，中國高血壓患病率18. 8% (2002年)， 目前全國有近2億高血壓患者。高血壓是心腦血管病的主要危險因素，中國腦卒中發(fā)病率約250/10萬人，冠心病發(fā)病率約50/10萬人，積極控制高血壓是預防腦卒中和冠心病的重要措施。目前中國門診高血壓患者治療控制率30. 6 %，而中國高血壓治療總體控制率僅 6. I %。高血壓發(fā)病機制復雜，其中血管平滑肌細胞L型鈣離子通道的激活在高血壓的發(fā)病中有重要作用，鈣通道激活后導致細胞內鈣離子濃度升高，一方面使得平滑肌細胞收縮，尤其在小動脈和微動脈，使得血管阻力增加血壓升高，此外，細胞內鈣離子濃度升高亦可促進多種轉錄因子的表達，參與血管重構和血管炎癥等病變。導致血壓升高各種因素均參與鈣通道激活，導致血管收縮，因此，抑制血管平滑肌 L型鈣通道的鈣通道阻滯劑是目前高血壓治療的有效藥物，尤其是長效鈣通道阻滯劑如硝苯地平控釋片，氨氯地平等在高血壓治療中療效確切且安全有效，被廣泛使用。但是由于化學藥物需要每日定時服藥，患者治療依從性不佳，導致高血壓治療控制率低，免疫學的發(fā)展為高血壓治療提供新的途徑，迄今為止，用于高血壓治療的疫苗主要針對RAS系統(tǒng)，其中瑞士Cytos公司的CYT006-AngQP疫苗已經完成了 IIa期臨床實驗,有較好的降壓效果。目前國際上尚未有使用主動或被動免疫方法阻滯鈣離子通道，從而達到降低血壓的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在制備血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段，并將其與一種載體特別是病毒樣顆粒耦聯(lián)后制備成一種多肽-載體疫苗，將該疫苗用于治療原發(fā)性高血壓。此外，針對該肽段的抗體可以有效阻斷L型鈣離子通道。該發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)首先合成人血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段CGGPAEEDPS、CPAEEDPS、 PAEEDPSGGC、PAEEDPSC，該免疫原性肽段包含第一連接位點，至少能夠通過一個共價鍵與載體的第二連接位點結合。使用重組QP噬菌體顆粒蛋白、重組牛乳頭瘤病毒蛋白、重組乙型肝炎病毒蛋白、匙孔血藍素蛋白、破傷風類毒素作為載體，這些載體至少具有一個第二連接位點，優(yōu)選的第二連接位點包括氨基、羧基和巰基，選自賴氨酸殘基、精氨酸殘基、谷氨酸殘基、天冬氨酸殘基和半胱氨酸殘基，優(yōu)選賴氨酸殘基。使用異雙功能交聯(lián)劑將血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段與上述載體、優(yōu)選地與重組Qβ噬菌體顆粒蛋白耦聯(lián)結合， 以形成有序、重復的多肽-載體疫苗。免疫原性肽段多肽被重復并以一定密度展示排列在載體上或者表面，形成高抗原性的陣列展示，利于高效的特異性的抗人和大鼠血管平滑肌L 型鈣離子通道免疫原性肽段抗體的生成，可以有效阻斷L型鈣通道介導的細胞內鈣離子濃度升高以及后續(xù)級聯(lián)升壓效應，顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，可用于原發(fā)性高血壓的治療。本發(fā)明的優(yōu)點是I、合成的肽段可以在自發(fā)性高血壓大鼠體內引起特異性的免疫應答，產生針對肽段的特異性抗體。所產生的抗體能夠與L型鈣離子通道特異性結合，阻斷通道開發(fā)引起的血管收縮及血壓升高。2、使用的異雙功能交聯(lián)劑具有能夠同時連接兩種基團的特點，而且不同的基團可以通過兩步先后連接上去，這些基團是巰基、氨基、羧基和胍基，而這些異雙功能交聯(lián)劑是 SMCC、Sulfo-SMCC, LC-SMCC 等。3、本發(fā)明制備的多肽-載體疫苗主要用于治療原發(fā)性高血壓，能夠顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，此外，針對多肽的抗體可以有效阻斷L型鈣離子通道。


圖I :Q β Ca-OOl疫苗制備后鑒定。圖為病毒樣顆粒和短妝I禹聯(lián)后 Tricine-SDS-PAGE電泳結果，M為Marker，泳道2為病毒樣顆粒單體，泳道I為耦聯(lián)短肽后病毒樣顆粒圖2:免疫印跡法和細胞免疫熒光鑒定Anti-CN-8的特異性。Anti_CN_8為 Q^Ca-OOl疫苗免疫動物后的抗肽抗體，Con為陰性對照抗體。圖中A :免疫印跡法鑒定 Anti-CN-8的特異性。圖中B :細胞免疫熒光鑒定Anti_CN_8的特異性。圖3 :用激光共聚焦顯微鏡觀測Anti-CN-8抑制Bay K8644刺激引起的血管平滑肌細胞內鈣離子濃度升高。匕、Ffflax分別代表平衡后血管平滑肌細胞基礎和最大熒光強度。圖4 :用全細胞膜片鉗研究抗體對通道的作用，結果表明30nM Anti-CN-8可以有效抑制Ba2+電流，主要通過抑制L型鈣通道的激活實現(xiàn)，而對通道失活沒有明顯影響。圖5 :SHRs血壓變化趨勢圖。圖中A為SHRs收縮壓趨勢圖；圖中B為SHRs免疫后抗體滴度變化圖(標本按I : 1000稀釋)。分為兩組QPCa-OOl疫苗組和空白對照組， Q β Ca-OOl疫苗抗Ca-OOl短肽抗體Anti-CN-8滴度。
具體實施例方式以下結合說明書附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不是限制本發(fā)明。實施案例I Q β Ca-OOl疫苗的制備和鑒定短肽CPAEEDPS由上海吉爾生化有限公司直接合成，短肽純度95%。載體QP _2aa病毒樣顆粒由本實驗室構建表達并純化得到，純度90%以上(已申請國家發(fā)明專利，專利申請?zhí)?01010028904. 7)。其按以下方法制備I)將Q β噬菌體CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)閺娊K止密碼子TAA后，克隆至原核表達載體pET28a(+)中，得到編碼CP蛋白質粒pETQi3 -CP ；2)在QP噬菌體CP延伸蛋白基因中編碼免疫優(yōu)勢決定區(qū)位置，即QP噬菌體CP 延伸蛋白基因第72位至73位密碼子間，插入編碼賴氨酸和亮氨酸的核苷酸AAGCTT，并將 CP蛋白基因終止密碼子由TGA突變?yōu)镚GA后克隆至原核表達載體PGEX4T-2中，得到編碼 Al蛋白質粒pGEXQ0-Al ；
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3)突變后編碼Qβ噬菌體CP蛋白質粒與Al蛋白質粒共同轉化大腸桿菌，誘導后表達得到病毒樣顆粒蛋白QP _2aa。使用異雙功能交聯(lián)劑Sulfo-SMCC (Pierce，MSA)將短肽CPAEEDPS與載體QP病毒樣顆粒進行耦聯(lián)制備QP Ca-OOl疫苗，其步驟如下I)稱取Sulfo-SMCC試劑2mg，400 μ I純水完全溶解后加入至20mg Q β病毒樣顆粒(10mg/ml)中，混勻，室溫放置30分鐘；2)將活化的載體加入至IOOK的TFF濃縮柱(Mi 11 ipore，MSA)中，添加50mM PBS (含 ImM EDTA, pH 7. 2)，5，OOOg 離心 3 次，脫去游離的 Sulfo-SMCC ；3)稱取短肽約5mg，50mM PBS (含ImM EDTA, pH 7. 2) Iml充分溶解加入活化的載體中，室溫反應I小時，每隔20min輕輕振蕩一次；4)將疫苗混合物加入至100K的TFF濃縮柱，5，OOOg離心3次，脫除游離的未反應的該短肽；Tricine-SDS-PAGE和免疫電鏡鑒定Q β Ca-OOl疫苗(圖I)。圖中為病毒樣顆粒和短肽耦聯(lián)后Tricine-SDS-PAGE電泳結果，M為Marker，泳道2為病毒樣顆粒單體，泳道 I為耦聯(lián)短肽后病毒樣顆粒單體，電泳結果顯示QP _2aa噬菌體病毒樣顆粒的單體可以耦聯(lián)I 4個Ca-OOl短肽，一個單體上連得最多的是2個Ca-OOl半抗原，其次是3個。實施案例2抗Q β Ca-OOl疫苗短肽抗體的特異性提純Q β Ca-OOl疫苗抗肽抗體Anti_CN_8，應用免疫印跡法和細胞免疫熒光鑒定 Anti-CN-8抗體特異性。Anti-CN-8為Q β Ca-OOl疫苗免疫動物后的抗肽抗體，Con為陰性對照抗體。提取SD大鼠腸系膜三級動脈血管平滑肌細胞總蛋白，進行免疫印跡分析，結果顯示Ant i-CN-8能夠與該總蛋白提取物中約240kDa大小的蛋白結合，該蛋白與大鼠L型鈣通道a Ic亞單位分子量(約240kDa) —致(圖2A)。同時，通過細胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)，Anti_CN_8 可以和大鼠腸系膜三級動脈血管平滑肌細胞表面L型鈣通道結合，對照抗體和L型鈣通道基本無結合(圖2B)。實施案例3 Anti-CN-8抗體對鈣通道開放劑Bay K8644的刺激的影響用激光共聚焦顯微鏡觀測Anti-CN-8對開放劑Bay K8644刺激引起的血管平滑肌細胞內鈣離子濃度升高的影響。FpFmax分別代表平衡后血管平滑肌細胞基礎和最大熒光強度。將血管平滑肌細胞與Anti-CN-8和硝苯地平預孵育30分鐘后，再予以Bay K8644刺激。 結果顯示，Anti-CN-8可以顯著抑制Bay K8644刺激引起的血管平滑肌細胞內鈣離子濃度升高，而硝苯地平的抑制效果更為顯著(*代表Anti-CN-8組與Con-Ab組相比，P < O. 05 ； **代表Anti-CN-8組和硝苯地平組相比，P < O. 05)(圖3)。實施案例4 Anti-CN-8抗體對血管平滑肌L型鈣通道的影響使用全細胞膜片鉗技術研究抗體對血管平滑肌L型鈣通道的影響，將表達血管平滑肌細胞L型鈣通道α I、α 2 δ、β亞單位質粒共轉染到ΗΕΚ293細胞，分別記錄抗體組與對照組鈣通道IV曲線，激活曲線和失活曲線。結果在_40mV鉗制電壓下30nm/L Anti-CN-8 抗體作用約IOmin可以顯著抑制鈣離子電流，而在-SOmV鉗制電壓下相同濃度抗體對鈣電流沒用明顯抑制。激活曲線表面，Anti-CN-8抗體抑制鈣通道激活，使得IV曲線右移，對通道失活則無明顯影響(圖4)。實施案例5 Q β Ca-OOl疫苗降低SHRs的血壓的效果
雄性自發(fā)性高血壓大鼠來自上海斯萊克實驗動物中心，動物飼養(yǎng)于同濟醫(yī)學院 SPF動物實驗中心，采用12h/12h光照及非限制性普通飲食。具體分為2組Qi3 Ca-OOl疫苗免疫組和PBS對照SHR組，各組只數(shù)為9只。取等體積疫苗(不足以PBS補齊)和PBS， 于大鼠背部皮下3-4點注射，400 μ I/只，疫苗組疫苗劑量約300 μ g/只，于初次免疫后每隔兩周加強2次、隔四周各加強2次，共5次。于0、14、28、42、56、70、84天行割尾取血，ELISA 法測定抗肽抗體滴度，其趨勢見圖5A。第二次免疫后第三天Q β Ca-OOl疫苗抗肽抗體滴度大約為I : 4000，一個月時的抗肽抗體滴度升至為I : 8000，后續(xù)將免疫時間間隔延長后， 抗體滴度有所下降。于0、14、28、42、56、70、84天測量Q^Ca-OOl疫苗免疫組和陰性對照組SHRs的鼠尾血壓，每次測量8次，取其平均值，其血壓趨勢見圖5Β。QPCa-OOl疫苗組SHRs的血壓在免疫后兩周與陰性對照組相比即見輕微下降，至一月時達到高峰，下降8. 2mmHg，維持至約 7周時血壓下降幅度有所降低，在觀察終止時，只有輕微的血壓下降。
權利要求
1.一種血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段，其特征在于所述的免疫原性肽段具有如下的氨基酸序列CGGPAEEDPS、CPAEEDPS、PAEEDPSGGC 或 PAEEDPSC。
2.根據權利要求I所述的一種血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段，其特征在于 所述的免疫原性肽段具有如下的氨基酸序列CPAEEDPS。
3.應用權利要求I一種血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段制備的多肽-載體疫苗，其特征在于該血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段與一種或多種載體耦聯(lián)后制備成的多肽-載體疫苗。
4.根據權利要求3所述的一種血管平滑肌L型鈣離子通道多肽-載體疫苗，其特征在于所述的載體至少具有一個第二連接位點，第二連接位點可以是載體天然存在的，也可以是通過化學耦聯(lián)技術或者重組技術添加的。
5.根據權利要求3或4所述的一種血管平滑肌L型鈣離子通道多肽-載體疫苗，其特征在于所述的載體包含的第二連接位點包括氨基、羧基和巰基，選自賴氨酸殘基、精氨酸殘基、谷氨酸殘基、天冬氨酸殘基和半胱氨酸殘基。
6.根據權利要求3所述的一種血管平滑肌L型鈣離子通道多肽-載體疫苗，其特征在于所述的載體包括選自以下的重組蛋白或者片段重組QP噬菌體顆粒蛋白、重組牛乳頭瘤病毒蛋白、重組乙型肝炎病毒蛋白、匙孔血藍素蛋白、破傷風類毒素。
7.根據權利要求I所述的一種血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段，其在制備治療原發(fā)性高血壓的多肽-載體疫苗中的應用。
全文摘要
一種血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段及其用途，屬于生物技術和醫(yī)藥領域。所述的免疫原性肽段具有如下的氨基酸序列CGGPAEEDPS、CPAEEDPS、PAEEDPSGGC或PAEEDPSC，優(yōu)選CPAEEDPS。將包含第一連接位點的血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段與一種或多種載體、優(yōu)選地與重組Qβ-2aa噬菌體病毒樣顆粒蛋白耦聯(lián)結合，以形成有序、重復的多肽-載體疫苗。公開了該疫苗在治療原發(fā)性高血壓方面的應用，該疫苗能夠產生高效的特異性的抗血管平滑肌L型鈣離子通道免疫原性肽段的抗體，該抗體可以有效阻斷L型鈣離子通道，能夠顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓。
文檔編號A61K47/48GK102584943SQ201210021409
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月31日 優(yōu)先權日2012年1月31日
發(fā)明者丁丹, 周子華, 廖玉華, 楊仕俊, 林吉斌, 王敏, 邱志華, 陳芬, 陳霄 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院