專(zhuān)利名稱：用于治療多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及其他自身免疫病癥的c1orf32的制作方法
用于治療多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及其他自身免疫病癥的C10RF32發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種新穎蛋白，以及其變體、片段以及融合蛋白，以及將其用于免疫療法和藥物開(kāi)發(fā)的方法。
發(fā)明背景
誘導(dǎo)免疫耐受性已經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間被認(rèn)為是自身免疫疾病療法的“圣杯”。免疫系統(tǒng)具有針對(duì)入侵病原體保護(hù)宿主，但同時(shí)防止對(duì)于自身抗原的不想要的反應(yīng)所導(dǎo)致的損害的彼此相反的任務(wù)。后一部分被稱為免疫耐受性并且通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的一組復(fù)雜的相互作用的并且互補(bǔ)的通路來(lái)進(jìn)行。T細(xì)胞具有與自身以及非自身的各種抗原起反應(yīng)的能力。因此，現(xiàn)存許多天然地存在以便消除潛在自身反應(yīng)性應(yīng)答的機(jī)制一這被稱為天然耐受性。消除潛在自身反應(yīng)性T細(xì)胞的主要機(jī)制在胸腺中出現(xiàn)并且被稱為中心耐受性。一些潛在自身反應(yīng)性 T細(xì)胞逃避中心耐受性，并且因此還存在多種周?chē)褪苄詸C(jī)制。盡管存在這些機(jī)制，一些自身反應(yīng)性T細(xì)胞可能‘逃避’并且以集合狀態(tài)(repertoire)存在；據(jù)信它們的活化可以導(dǎo)致自身免疫疾病。
對(duì)于治療耐受性的研究已經(jīng)嘗試誘導(dǎo)并且擴(kuò)大有效的生理性耐受機(jī)制以便消除或中和自身反應(yīng)性T細(xì)胞并且預(yù)防或治療自身免疫疾病。誘導(dǎo)耐受性的一種方法是通過(guò)操縱共刺激配體與抗原呈遞細(xì)胞(APC)以及淋巴細(xì)胞上的受體之間的相互作用。
CTLA-4是下調(diào)免疫應(yīng)答的最廣泛研究的共刺激分子。免疫抑制品質(zhì)以及能夠誘導(dǎo)耐受性的屬性使它被公認(rèn)為用于自身免疫介導(dǎo)的炎癥病癥的潛在免疫治療劑。阿巴西普(Abatacept ;商品名稱奧瑞希納(Orencia))是由與hlgGl的Fe片段融合的CTLA-4的 ECD (細(xì)胞外域)組成的融合蛋白。據(jù)信阿巴西普可通過(guò)有效地干擾炎癥級(jí)聯(lián)來(lái)誘導(dǎo)共刺激阻斷，它已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者。
用當(dāng)前療法來(lái)誘導(dǎo)疾病控制，隨后在重新建立免疫耐受性的同時(shí)逐漸撤藥，可能在未來(lái)成為用于自身免疫療法的有吸引力的方法。此外，由于它們的免疫特異性，在不存在整體免疫抑制的情況下，這類(lèi)療法對(duì)于長(zhǎng)期使用應(yīng)是安全的。
多發(fā)性硬化(MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的一種慢性、炎癥性、脫髓鞘性病癥，它涉及對(duì)于髓磷脂抗原的自身免疫應(yīng)答。它的特征在于CNS內(nèi)的病變并且脫髓鞘是這些病變的關(guān)鍵特征。自身反應(yīng)性T細(xì)胞被認(rèn)為引起針對(duì)CNS髓磷脂組分的自身免疫應(yīng)答。這些自身免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)被認(rèn)為是髓磷脂堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)以及髓磷脂少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE )，一種通過(guò)用佐劑中的髓磷脂組分進(jìn)行免疫接種來(lái)誘導(dǎo)的MS動(dòng)物模型，展示了可比較的神經(jīng)元病變 。不希望受單一假設(shè)限制，EAE中的研究提供了特異性針對(duì)自身抗原的T細(xì)胞介導(dǎo)這些疾病中的病變的令人信服的證據(jù)。
T輔助I型(Thl)細(xì)胞由IL-12誘導(dǎo)并且產(chǎn)生IFN- Y，而T輔助2型(Th2)細(xì)胞分泌 IL-4、IL-5以及IL-13。Thl細(xì)胞可以介導(dǎo)促炎癥性或細(xì)胞介導(dǎo)性免疫應(yīng)答，而Th2細(xì)胞主要促進(jìn)某些類(lèi)型的體液免疫。一些免疫相關(guān)疾病，例如自身免疫反應(yīng)、炎癥、慢性感染以及敗血癥的特征在于免疫系統(tǒng)的促炎癥性相對(duì)于抗炎癥性傾向的失調(diào)，連同Thl相對(duì)于Th2 細(xì)胞因子平衡的失衡。在炎癥期間，誘導(dǎo)從Thl到Th2的平衡轉(zhuǎn)變通過(guò)減少免疫系統(tǒng)的炎癥性傾向來(lái)保護(hù)有機(jī)體免受Thl/促炎癥性細(xì)胞因子的全身性‘過(guò)調(diào)節(jié)(overshooting)’。 與Thl到Th2免疫轉(zhuǎn)變相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)療法在多種Thl介導(dǎo)的自身免疫疾病，例如多發(fā)性硬化以及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中具有保護(hù)性作用。例如，在包括MS的若干自身免疫疾病的動(dòng)物模型中已經(jīng)證明了功效的拉喹莫德(Laquinimod)展示出通過(guò)Thl/Th2轉(zhuǎn)變實(shí)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)作用，并且不導(dǎo)致免疫抑制。乙酸格拉替雷(Glatiramer acetate ;克帕松(Copaxone)) 也誘導(dǎo)Thl/Th2轉(zhuǎn)變，同時(shí)減少促炎癥細(xì)胞因子的分泌，而增加抗炎癥細(xì)胞因子的分泌。此外，乙酸格拉替雷特異性Th2細(xì)胞能夠遷移越過(guò)血腦屏障并且引起自身攻擊性ThlT細(xì)胞的原位旁觀者抑制(bystander suppression)。
某些免疫細(xì)胞以及免疫細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是用于治療免疫病癥的新藥劑的有希望的靶點(diǎn)。例如Thl、Thl7、Th2以及調(diào)控T細(xì)胞(Treg)在調(diào)節(jié)自身免疫性以及炎癥中發(fā)揮重要作用。來(lái)自許多研究的越來(lái)越多的證據(jù)顯示，這些免疫細(xì)胞在多種病癥，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化、牛皮癬、紅斑狼瘡、I型糖尿病以及葡萄膜炎中的重要性。 大多數(shù)現(xiàn)有療法一次只靶向一個(gè)通路。
發(fā)明簡(jiǎn)要概述
背景技術(shù)未能提供靶向在自身免疫性以及炎癥中所涉及的多個(gè)細(xì)胞以及通路的療法，這些細(xì)胞例如Thl、Thl7、Th22、Th2、Treg或者分泌或影響其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞，這些炎癥分子例如細(xì)胞因子、金屬蛋白酶、趨化因子以及其他分子。
本發(fā)明關(guān)于新穎蛋白，以及其變體、片段以及融合蛋白，以及將其用于免疫療法和藥物開(kāi)發(fā)的方法，包括但不局限于治療免疫相關(guān)疾病的方法。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“免疫相關(guān)疾病”包括以下疾病的如下列出類(lèi)型以及亞型的任何一種多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病、牛皮癬、全身紅斑狼瘡、炎癥性腸病、葡萄膜炎或舍格倫氏綜合征(Djogren’ s syndrome)。
如在此使用，“多發(fā)性硬化”包括以下一種或多種多發(fā)性硬化、良性多發(fā)性硬化、 復(fù)發(fā)緩解性多發(fā)性硬化、繼發(fā)性進(jìn)行性多發(fā)性硬化、原發(fā)性進(jìn)行性多發(fā)性硬化、進(jìn)行性復(fù)發(fā)性多發(fā)性硬化、慢性進(jìn)行性多發(fā)性硬化、過(guò)渡性/進(jìn)行性多發(fā)性硬化、快速惡化性多發(fā)性硬化、臨床確診的多發(fā)性硬化、惡性多發(fā)性硬化(又稱為馬爾堡變種(Marburg’s Variant)), 以及急性多發(fā)性硬化。任選地，“與多發(fā)性硬化有關(guān)的病狀”包括例如德維克氏病(Devic’s disease)，又稱為視神經(jīng)脊髓炎；急性散播性腦脊髓炎、急性脫髓鞘性視神經(jīng)炎、脫髓鞘橫貫性脊髓炎、米勒_費(fèi)歇爾綜合征(Miller-Fisher syndrome)、腦脊髓神經(jīng)根神經(jīng)病變、急性脫髓鞘多神經(jīng)病、腫脹性多發(fā)性硬化以及Balo同心圓性硬化。
如在此使用，“類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”包括以下一種或多種類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)以及假性痛風(fēng)、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、幼年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、斯提耳氏病(Still’s disease)、 強(qiáng)直性脊柱炎、類(lèi)風(fēng)濕性脈管炎。任選地，與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的病狀包括例如骨關(guān) 節(jié)炎、肉狀瘤病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、膿毒性關(guān)節(jié)炎、血色病、肝炎、脈管炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)、萊姆氏病(Lyme disease)、家族性地中海熱、具有回歸熱的高免疫球蛋白血癥D、TNF受體相關(guān)周期性綜合征，以及與炎癥性腸病相關(guān)的腸病性關(guān)節(jié)炎。
如在此使用，“葡萄膜炎”包括以下一種或多種葡萄膜炎、前葡萄膜炎(或虹膜睫狀體炎)、中間葡萄膜炎(扁平部睫狀體炎)、后葡萄膜炎(或脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎)以及全葡萄膜炎形式。
如在此使用，“炎癥性腸病”包括以下一種或多種炎癥性腸病、克羅恩氏病 (Crohn’s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、膠原性結(jié)腸炎、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、改道性結(jié)腸炎、貝切特氏病(Behcet’s disease)、未確定的結(jié)腸炎。
如在 此使用，“牛皮癬”包括以下一種或多種牛皮癬；非膿皰性牛皮癬，包括尋常性牛皮癬以及牛皮癬性紅皮癥(紅皮性牛皮癬)；膿皰性牛皮癬，包括泛發(fā)性膿皰性牛皮癬 (宗布什膿皰性牛皮癖(pustular psoriasis ofvon Zumbusch))、掌妬膿皰病(永久性掌妬膿皰病、理發(fā)師類(lèi)型的膿皰性牛皮癖(pustular psoriasis of the Barber type)、四肢膿皰性牛皮癬)、環(huán)狀膿皰性牛皮癬、持續(xù)性肢端皮炎、皰疹樣膿皰病。任選地，與牛皮癬有關(guān)的病狀包括例如藥物誘導(dǎo)的牛皮癬、皮褶牛皮癬、尿布區(qū)牛皮癬、脂溢性皮炎樣牛皮癬、滴狀牛皮癬、指甲牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎。
如在此使用，“I型糖尿病”包括以下一種或多種1型糖尿病、胰島素依賴性糖尿病、特發(fā)性糖尿病、幼年I型糖尿病、青春晚期糖尿病、成人隱匿性自身免疫性糖尿病、妊娠糖尿病。與I型糖尿病有關(guān)的病狀包括神經(jīng)病變，包括多神經(jīng)病變、單神經(jīng)病變、周?chē)窠?jīng)病變以及自主神經(jīng)病變；眼睛并發(fā)癥青光眼、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病。
如在此使用，“舍格倫氏綜合征”包括以下一種或多種舍格倫氏綜合征、原發(fā)性舍格倫氏綜合征以及繼發(fā)性舍格倫氏綜合征，以及與舍格倫氏綜合征有關(guān)的病狀，包括結(jié)締組織疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡或硬皮病。其他并發(fā)癥包括肺炎，肺纖維化，間質(zhì)性腎炎，腎臟過(guò)濾器周?chē)M織的炎癥，腎小球性腎炎，腎小管性酸中毒，腕管綜合征，周?chē)窠?jīng)病變，顱神經(jīng)病變，原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)，肝硬化，食道、胃、胰腺以及肝臟的炎癥(包括肝炎)，多肌炎，雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud’s phenomenon),脈管炎，自身免疫甲狀腺問(wèn)題，淋巴瘤。
如在此使用，“全身性紅斑狼瘡”包括以下一種或多種全身性紅斑狼瘡、盤(pán)狀狼瘡、狼瘡性關(guān)節(jié)炎、狼瘡性肺炎、狼瘡性腎炎。與全身性紅斑狼瘡有關(guān)的病狀包括骨關(guān)節(jié)結(jié)核、抗磷脂抗體綜合征、心臟各個(gè)部分的炎癥(例如心包炎、心肌炎以及心內(nèi)膜炎)、肺以及胸膜炎癥、胸膜炎、胸膜腔積液、慢性彌散性間質(zhì)性肺病、肺動(dòng)脈高壓、肺栓塞、肺出血，以及肺萎縮綜合征、狼瘡性頭痛、格-巴二氏綜合征(Guillain-Barre syndrome)、無(wú)菌性腦膜炎、脫髓鞘性綜合征、單神經(jīng)病變、多發(fā)性單神經(jīng)炎、重癥肌無(wú)力、脊髓病變、顱神經(jīng)病變、多神經(jīng)病變、脈管炎。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是C10RF32多肽，任選地被提供為含有 C10RF32多肽的融合蛋白。C10RF32融合多肽任選地具有直接或間接地經(jīng)由肽連接物序列或化學(xué)連接物融合在一起的第一融合伴侶與第二融合伴侶該第一融合伴侶包括C10RF32 可溶性多肽的全部或一部分，或包括H19011_1_P8 (SEQ ID號(hào)4)、H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 號(hào)5)、H19011_1_P9 (SEQ ID 號(hào)6)或 H19011_1_P9_V1 (SEQ ID 號(hào)34)的細(xì)胞外域的全部或一部分的多肽或與它同源的序列，該第二融合伴侶由異源序列(對(duì)應(yīng)地非C10RF32) 組成。
根據(jù)至少一些實(shí)施方案，分離的多肽與包括H19011_1_P8 (SEQ ID號(hào)4)、H19011丄P8_V1 (SEQ ID 號(hào)5)、H19011_1_P9 (SEQ ID 號(hào)6)或 H19011_1_P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)的細(xì)胞外域的全部或一部分的多肽至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。 根據(jù)至少一些實(shí)施方案，與包括 H19011_1_P8 (SEQ ID 號(hào)4)、H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 號(hào)5)、H19011_1_P9 (SEQ ID 號(hào)6)或 H19011_1_P9_V1 (SEQ ID 號(hào)34)的細(xì)胞外域的全部或一部分的多肽至少80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源的分離的多肽具有如在此描述的(例如在實(shí)例I中)至少一種SNP變化。C10RF32多肽可為任何物種來(lái)源。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，C10RF32多肽為鼠科、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物或人類(lèi)來(lái)源。
不希望受單一假設(shè)限制，根據(jù)至少一些實(shí)施方案，C10RF32融合蛋白抑制Thl、 Thl7、Th22或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的炎癥活性，這些炎癥分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a ,TGF-β、IFN1、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。 再次不希望受單一假設(shè)限制，根據(jù)至少一些實(shí)施方案，C10RF32融合蛋白還可增加Treg的抑制能力或Th2細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性。C10RF32融合蛋白還可增加抗炎癥分子，例如細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生。
根據(jù)至少一些實(shí)施方案，C10RF32融合蛋白可任選地包括C10RF32的完全細(xì)胞外域(E⑶)或其片段或同源物。在一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32多肽為全長(zhǎng)C10RF32E⑶的可溶性片段。這類(lèi)片段任選地包括保持結(jié)合至其天然受體的能力并且合并有C10RF32多肽的細(xì)胞外域的部分或全部、并且缺乏細(xì)胞內(nèi)和/或跨膜域的部分或全部的那些片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32多肽片段包括C10RF32多肽的整個(gè)細(xì)胞外域。在其他實(shí)施方案中，C10RF32 多肽的可溶性片段是保持C10RF32生物活性的細(xì)胞外域的片段。
C10RF32多肽細(xì)胞外域可包括來(lái)自跨膜域的1、2、3、4、5或更多個(gè)連續(xù)氨基酸，和/ 或來(lái)自信號(hào)序列的1、2、3、4、5或更多個(gè)連續(xù)氨基酸?？商娲?，該細(xì)胞外域可有1、2、3、4、5、或更多個(gè)連續(xù)氨基酸被從C-末端、N-末端或這兩個(gè)末端去除。還可使用C10RF32多肽的生物活性變體和/或同源物及其片段。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是包括如在此描述的分離的C10RF32多肽的融合蛋白用于治療免疫相關(guān)病癥的用途，該融合蛋白任選地在包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體的藥用組合物中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32多肽可任選地被融合至Ig重鏈恒定區(qū)的一個(gè)或多個(gè)域，該恒定區(qū)優(yōu)選地具有與人免疫球蛋白Cy1、Cy2、Cy3*Cy4鏈的鉸鏈，CH2以及CH3 區(qū)或與鼠免疫球蛋白C Y 2a鏈的鉸鏈，CH2以及CH3區(qū)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。
這些融合蛋白可任選地二聚化或多聚化以便形成同源二聚體、異源二聚體、同源多聚體或異源多聚體。二聚/多聚伴侶可在平行或反平行方向上安排。任選地，融合蛋白具有在SEQ ID號(hào)8、22、23、38、29中的任何一個(gè)中闡明的序列。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是一種藥用組合物，該藥用組合物包括能夠抑制T細(xì)胞活化的一種分離的可溶性C10RF32多肽、或其片段或變體或同源物，或含有它們的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。任選地，該藥用組合物包括含有 H19011_1_ P8(SEQ ID 號(hào)4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID 號(hào)5)、H19011_1_P9(SEQ ID 號(hào):6) 或H19011_1_P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)的細(xì)胞外域的可溶性C10RF32多肽或其片段，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是一種藥用組合物， 該藥用組合物包括一種分離的可溶性C10RF32多肽、或片段或變體或同源物或含有它們的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，該藥用組合物被適配用于通過(guò)以下途徑中的任何一個(gè)或多個(gè)來(lái)治療炎癥抑制或減少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的分化；抑制或減少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的活性；抑制或減少Thl和/或Thl7通路；抑制或減少Thl和/或 Thl7通路，同時(shí)促進(jìn)Th2通路/活性/分化；抑制或減少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的炎癥分子產(chǎn)生和/或分泌；抑制或減少Thl、Thl7、 Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的增殖；與Treg相互作用；增強(qiáng) Treg活性；增強(qiáng)Treg的IL-10分泌;增力口 Treg數(shù)量;增力口 Treg的抑制能力；與Th2細(xì)胞相互作用；增強(qiáng)Th2活性，增強(qiáng)Th2細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力，增加Th2細(xì)胞數(shù)，增強(qiáng)Th2細(xì)胞的 IL-4、IL-5或IL-10產(chǎn)生；或其組合。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是一種藥用組合物，該藥用組合物包括一種分離的可溶性C10RF32多肽、片段、變體或同源物或含有它們的融合蛋白或偶聯(lián)物，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，該藥用組合物被適配用于治療免疫相關(guān)病癥。
在一個(gè)實(shí)施方案中但是不希望受單一假設(shè)限制，C10RF32多肽或含有它們的融合蛋白或藥用組合物增強(qiáng)Treg對(duì)于免疫系統(tǒng)的抑制活性。Treg可抑制通過(guò)Thl、Thl7、Th22 和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的分化、增殖、活性和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌。在一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32多肽或含有它們的融合蛋白或藥用組合物增強(qiáng) Treg對(duì)于初始T細(xì)胞的抑制活性以便抑制或減少初始T細(xì)胞分化成Thl、Thl7、Th22細(xì)胞并且從而減少受試者中的Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的數(shù)量，這些炎癥分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-a、TGF-β、IFN-Y、IL-17、IL-6、 IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。
在一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32多肽或含有它們的融合蛋白或藥用組合物增強(qiáng)Th2 免疫應(yīng)答活性或增加Th2細(xì)胞數(shù)。Th2細(xì)胞可調(diào)節(jié)Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的分化、增殖、活性和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌，從而導(dǎo)致Thl和/或Thl7應(yīng)答的抑制，以及經(jīng)由Thl/Th2轉(zhuǎn)變的免疫調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中， C10RF32多肽或含有它們的融合蛋白或藥用組合物增強(qiáng)Th2對(duì)于初始T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性以便抑制或減少初始T細(xì)胞分化成Thl、Thl7、Th22細(xì)胞并且從而減少受試者的Thl、 Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的數(shù)量，這些炎癥分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a ,TGF-β、IFN1、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。 在一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32多肽或含有它們的融合蛋白或藥用組合物促進(jìn)或增強(qiáng)Th2細(xì)胞的IL-4、IL-5或IL-10產(chǎn)生。任選地，該組合物是用于治療免疫相關(guān)病癥。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是以下各項(xiàng)的用途一種分離的可溶性 C10RF32多肽、或片段或變體或同源物或含有它們的融合蛋白或偶聯(lián)物，或包括H19011_l_ P8 (SEQ ID 號(hào)4)、H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 號(hào)5)、H19011_1_P9 (SEQ ID 號(hào)6)或 H19011_1_P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)的細(xì)胞外域的多肽、或其片段或變體或同源物或含有它們的融合蛋白或偶聯(lián)物，或含有前述任一種的藥用組合物，上述各項(xiàng)被適配用于治療免疫相關(guān)病癥。
任選地，該多肽包含與 以下各項(xiàng)具有至少95%序列一致性的氨基酸殘基的序列 與在SEQ ID號(hào)14中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P8 (SEQ ID號(hào)4)的氨基酸殘基21-186、或與在SEQ ID號(hào)35中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 號(hào):5)的殘基21-186、或與在SEQ ID號(hào)15中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9(SEQ ID號(hào)6)的殘基21-169、或與在SEQ ID號(hào)36中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9_ Vl (SEQ ID號(hào)34)的殘基21-169、或與在SEQ ID號(hào)37中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的序列 H19011_1_P8 (SEQ ID號(hào)4)的殘基1-184、或與在SEQ ID號(hào)19中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的序列H19011丄P8_V1 (SEQ ID號(hào)5)的殘基1-184、或與在SEQ ID號(hào)28中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9 (SEQ ID號(hào)6)的殘基1-169、或與在SEQ ID號(hào)30中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)的殘基1-169，或其片段或變體或同源物，這些序列被適配用于治療免疫相關(guān)病癥。任選地，該多肽附接至一個(gè)可檢測(cè)的或治療的部分上。
根據(jù)至少一個(gè)實(shí)施方案，提供的是通過(guò)向受試者給予有效量的一種可溶性 C10RF32多肽、其片段、變體、同源物、融合蛋白或偶聯(lián)物、或其藥用組合物來(lái)抑制或減少受試者中中中的表位擴(kuò)展的方法。進(jìn)一步的實(shí)施方案提供給予有效量的可溶性C10RF32多肽、其片段、變體、同源物、融合蛋白或偶聯(lián)物或其藥用組合物以便抑制或減少患有免疫相關(guān)病癥的患者的表位擴(kuò)展的方法。
C10RF32多肽、其片段、變體、同源物、融合蛋白和/或偶聯(lián)物可結(jié)合一種或多種另外治療劑來(lái)給予，這些另外治療劑包括但不局限于，針對(duì)其他淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記(例如 ⑶40、α -4整聯(lián)蛋白)或針對(duì)細(xì)胞因子的抗體；其他融合蛋白，例如CTLA4-lg( Orencia 、 貝拉西普(belatac印t))、TNFR-1i ( Lnbrel ) ; TNF- α阻斷劑，例如英利昔單抗 (Remicade)、賽妥珠單抗(Cimzia)以及阿達(dá)木單抗(Humira) ;Q)73_Ig ;環(huán)磷酰胺(CTX) (gp E.ndoxan' 、Cytoxan 、Neosar 、Procytox 、Rev immune );甲氨喋呤(MTX)(即 Rheumatrex 、Trexall );貝利木單抗(belimumab ；即 Benlysta );那他珠單抗(Tysabri)或其他免疫抑制藥物、抗增殖藥物、細(xì)胞毒性劑、或可有助于免疫抑制的其他化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該額外治療劑靶向免疫活化中涉及到的不同通路。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該另外治療劑是一種CTLA-4融合蛋白，例如CTLA-41 g (阿巴西普(abatacept))。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該額外治療劑是一種被稱為貝拉西普的 CTLA4-1g融合蛋白，它含有在體內(nèi)顯著地增加其對(duì)于CD86的親合力的兩個(gè)氨基酸取代 (L104E 以及 A29Y)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑是環(huán)磷酰胺(CTX)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白與CTX是以治療慢性自身免疫疾病或病癥，例如全身性紅斑狼瘡(SLE)的有效量共同給予的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑是甲氨喋呤(MTX)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白與MTX是以治療慢性自身免疫疾病或病癥，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的有效量共同給予的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑增加血清中的腺苷量。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第二治療劑為⑶73-1g、重組⑶73或增加⑶73表達(dá)的另一種藥劑(例如細(xì)胞因子或單克隆抗體或小分子)。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑是干擾素-β。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑是那他珠單抗或用于MS的另一種治療劑。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白與那他珠單抗輪轉(zhuǎn)使用或在藥物假期期間使用以便允許第二治療劑給藥的頻率更低并且減少例如PML的副作用的風(fēng)險(xiǎn)并防止對(duì)于第二治療劑的抗性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑是抑制或減少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的分化、增殖、活性和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌的一種小分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑是與Treg相互作用、增強(qiáng)Treg活性、促進(jìn)或增強(qiáng)Treg的IL-10分泌、增加Treg數(shù)量、增加Treg的抑制能力、或其組合的一種小分子。 在一個(gè)實(shí)施方案中，該小分子是視黃酸或其衍生物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑是與 Th2細(xì)胞相互作用、增強(qiáng)Th2活性、促進(jìn)或增強(qiáng)Th2細(xì)胞的IL-10、IL-4或IL-5產(chǎn)生、增加 Th2細(xì)胞數(shù)、增加Th2細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力、或其組合的一種小分子。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是如在此列舉的一種C10RF32可溶性多肽與有效于治療免疫相關(guān)病癥的一種已知治療劑的組合的用途。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是一種治療免疫相關(guān)病癥的方法，該方法包括向有需要的受試者給予一種藥用組合物，該藥用組合物包括一種具有C10RF32多肽的細(xì)胞外域的可溶性分子、或其片段或變體或同源物；或其融合蛋白或偶聯(lián)物；或包括以下各項(xiàng)的多肽與在SEQ ID號(hào)14中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P8 (SEQ ID 號(hào)4)的氨基酸殘基21-186、或與在SEQ ID號(hào)35中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_l_ P8_V1 (SEQ ID號(hào)5)的殘基21-186、或與在SEQ ID號(hào)15中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的 H19011丄P9 (SEQ ID號(hào):6)的殘基21-169、或與在SEQ ID號(hào)36中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9_V1 (SEQID號(hào)34)的殘基21-169、或與在SEQ ID號(hào)37中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的序列H19011_1_P8 (SEQ ID號(hào)4)的殘基1_184、或與在SEQ ID號(hào)19中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的序列H19011_1_P8_V1 (SEQ ID號(hào)5)的殘基1-184、或與在SEQ ID 號(hào)28中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9 (SEQ ID號(hào)6)的殘基1-169、或與在SEQ ID號(hào)30中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)的殘基1-169，或序列H19011_1_P8_V1 (SEQ ID號(hào)5)的殘基21-167，或其片段或變體或同源物。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是一種預(yù)防MS患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞的髓磷脂外層(myelin coat)損傷的方法，該方法包括向有需要的受試者給予一種藥用組合物，該藥用組合物包括一種具有C10RF32多肽的細(xì)胞外域的可溶性分子、或其片段、變體、同源物、融合蛋白或偶聯(lián)物；或包括以下各項(xiàng)的多肽與在SEQ ID號(hào)14中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P8 (SEQ ID號(hào)4)的氨基酸殘基21-186、或與在SEQ ID 號(hào)35中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011丄P8_V1 (SEQ ID號(hào)5)的殘基21-186、或與在 SEQ ID號(hào)15中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9 (SEQ ID號(hào)6)的殘基21-169、或與在SEQ ID號(hào)36中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)的殘基 21-169、或與在SEQ ID號(hào) 37中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的序列H19011_1_P8(SEQ ID號(hào):4) 的殘基1-184、或與在SEQ ID號(hào)19中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的序列H19011_1_P8_V1(SEQ ID號(hào)5)的殘基1-184、或與在SEQ ID號(hào)28中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9 (SEQ ID號(hào)6)的殘基1-169、或與在SEQ ID號(hào)30中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_l_ P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)的殘基1_169，或其片段或變體或同源物；任選地以藥用組合物形式提供。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是一種治療免疫相關(guān)病癥的方法，其中該治療不引起受試者的免疫系統(tǒng)的整體免疫抑制，該方法包括向有需要的受試者給予一種藥用組合物，該藥用組合物包括一種具有C10RF32多肽的細(xì)胞外域的可溶性分子、其片段、變體、同源物、融合蛋白或偶聯(lián)物；或包括以下各項(xiàng)的多肽與在SEQ ID號(hào)14中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P8(SEQ ID號(hào)4)的氨基酸殘基21-186、或與在SEQ ID號(hào)35 中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P8_V1 (SEQ ID號(hào)5)的殘基21-186、或與在SEQ ID號(hào)15中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9 (SEQ ID號(hào)6)的殘基21-169、或與在 SEQ ID號(hào)36中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9_V1(SEQID號(hào)34)的殘基21-169、 或與在SEQ ID號(hào)37中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的序列H19011_1_P8 (SEQ ID號(hào)4)的殘基1-184、或與在SEQ ID號(hào)19中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的序列H19011丄P8_V1 (SEQ ID 號(hào)5)的殘基1-184、或與在SEQ ID號(hào)28中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9 (SEQ ID號(hào)6)的殘基1-169、或與在SEQ ID號(hào)30中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)的殘基1-169，或其片段或變體或同源物；任選地以藥用組合物形式提供。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，提供的是一種分離的可溶性C10RF32多肽、其片段、變體或同源物；任選地為融合蛋白或偶聯(lián)物，其中所述多肽或所述融合蛋白或偶聯(lián)物是用于如在此描述的免疫相關(guān)病狀的抗免疫相關(guān)病狀免疫療法，任選地提供為藥用組合物。
任選地，治療包括預(yù)防、治愈、控制、逆轉(zhuǎn)、減弱、減輕、最小化、抑制、管理或阻止上述疾病的有害作用的這些項(xiàng)中的一個(gè)或多個(gè)。
任選地，管理包括降低疾病的嚴(yán)重度、減少疾病發(fā)作頻率、減少這類(lèi)發(fā)作的持續(xù)時(shí)間、或減少這類(lèi)發(fā)作的嚴(yán)重度、或其組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，這些C10RF32多肽、其片段或變體或同源物、包含它們的融合蛋白或偶聯(lián)物，或包含它們的藥用組合物可用于治療不對(duì)TNF阻斷劑起·反應(yīng)的患者。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明


圖1A示出H19011_1_P8 (SEQ ID號(hào)4)蛋白與已知蛋白Q71H61_人類(lèi)以及 NP_955383 (SEQ ID 號(hào):3)的比對(duì)。
圖1B示出H19011_1_P9 (SEQ ID號(hào)6)蛋白與已知蛋白Q71H61_人類(lèi)以及 NP_955383 (SEQ ID 號(hào):3)的比對(duì)。
圖2 示出 C10RF32_T8_P8_Vl_ECD_mFc (在此又稱為 C10RF32_ECD_mFc) DNA 序列 (1287bp) (SEQ ID號(hào)7)。ECD序列以粗體標(biāo)明，TEV裂解位點(diǎn)序列加下劃線，mFc序列為非粗斜體并且信號(hào)肽序列為粗斜體。
圖3 示出 C10RF32_T8_P8_Vl_ECD_mFc (在此又稱為 C10RF32_ECD_mFc)氨基酸序列(428aa) (SEQ ID號(hào)8)。ECD序列以粗體標(biāo)明，TEV裂解位點(diǎn)序列加下劃線并且由TEV 序列的N-末端上的GS連接物以及TEV序列的C-末端上的SG包圍，mFc序列為非粗斜體并且信號(hào)肽序列為粗斜體。
圖4不出從疾病誘導(dǎo)日開(kāi)始以兩種劑量(30和100微克/小鼠)以及兩種頻率(每天一次或每周3次)在預(yù)防模式下給予的C10RF32-P8-V1-E⑶-mFc (SEQ ID號(hào)8)的六次給予對(duì)于小鼠R-EAE模型的臨床癥狀的效果，展示為平均臨床計(jì)分(圖4A)、累積臨床計(jì)分(圖4B)以及復(fù)發(fā)頻率(圖4C)。在此項(xiàng)研究中，與給予連續(xù)6天的Ig對(duì)照(100微克/小鼠) 以及NM-抗-CD3 (50微克/小鼠)比較來(lái)研究C10RF32-P8-Vl-ECD-mFc (SEQ ID號(hào)8)的效果。
圖5示出疾病緩解發(fā)生時(shí)(第25天)以兩種劑量(30和100微克/小鼠)以及兩種頻率(每天一次或每周3次)在治療模式下給予的C10RF32-P8-V1-E⑶-mFc (SEQ ID號(hào)8) 的六次給予對(duì)于SJL小鼠中的PLP139-151-誘導(dǎo)R-EAE模型的臨床癥狀的效果，展示為平均臨床計(jì)分(圖5A)、累積臨床計(jì)分(圖5B)以及復(fù)發(fā)頻率(圖5C)。在此項(xiàng)研究中，與給予連續(xù)6天的Ig對(duì)照(100微克/小鼠)以及抗-CD80FaB比較來(lái)研究C10RF32-P8-Vl-ECD_mFc (SEQ ID號(hào):8)的效果。
圖6 示出與對(duì)照 Ig 以及 B7-H4-1g 比較，C10RF32-ECD_mFc (SEQ ID 號(hào)8)治療對(duì)于來(lái)源于SJL或BALB/c小鼠的T細(xì)胞增殖的效果。
圖7示出以可溶性或結(jié)合至板亦或珠粒形式呈現(xiàn)的C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID 號(hào)8)對(duì)于從SJL小鼠分離的初始CD4+T細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞因子分泌的體外效果。
圖8示出以可溶性或結(jié)合至板或珠粒形式呈現(xiàn)的C10RF32-E⑶-mFc(SEQ ID號(hào)8) 對(duì)于從BALB/c小鼠分離的初始CD4+T細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞因子分泌的體外效果。
圖9示出在以連同抗-⑶3以及抗-⑶28的珠粒結(jié)合形式呈現(xiàn)時(shí)，以及在以可溶性蛋白形式添加至經(jīng)過(guò)照射的從DO. 11小鼠分離的APC+0VA323_339時(shí)，C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID號(hào)8)對(duì)于在ThO、Thl、Th2以及Thl7促進(jìn)條件下的T細(xì)胞活化以及分化的效果。
圖 10 示出在 HEK-293 中產(chǎn)生的 C10RF32-ECD_mFc(SEQ ID 號(hào)8)在小鼠 R-EAE 模型中的效果。C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID號(hào)8)在疾病誘導(dǎo)后第0_5天經(jīng)由腹膜內(nèi)(1. ρ·) 注射在預(yù)防模式下給予。
圖 11 示出在 CHO 以及 HEK-293 中產(chǎn)生的 C10RF32-ECD_mFc (SEQ ID 號(hào)8)對(duì)于在ThO、ThU Th2以及Thl7衍生條件下的⑶4+T細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子產(chǎn)生的體外活性的比較。
圖12示出在治療模式下每周3次1. p.給予歷時(shí)兩周的C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID號(hào)8)在SJL小鼠的PLP139-151-誘導(dǎo)R-EAE中的效果。展示了對(duì)于以下各項(xiàng)的效果 平均臨床計(jì)分、累積臨床計(jì)分以及復(fù)發(fā)頻率(圖12A);免疫細(xì)胞到脾、淋巴結(jié)以及CNS的募集(圖12B);免疫細(xì)胞群對(duì)CNS的浸潤(rùn)(圖12C);經(jīng)由增殖實(shí)現(xiàn)的脾細(xì)胞對(duì)于起始以及擴(kuò)展表位的回憶應(yīng)答(圖12D);經(jīng)由細(xì)胞因子分泌實(shí)現(xiàn)的脾細(xì)胞對(duì)于起始以及擴(kuò)展表位的回憶應(yīng)答(圖12E);經(jīng)由增殖實(shí)現(xiàn)的頸部淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)于起始表位的回憶應(yīng)答(圖12F)。在此項(xiàng)研究中，與Ig對(duì)照(100微克/小鼠)以及抗-⑶80Fab (50微克/小鼠)比較來(lái)研究 C10RF32-P8-Vl-ECD-mFc (SEQ ID 號(hào)8)的效果。
圖13A 示出與 Ig 對(duì)照比較，C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID 號(hào)8)在 100、30 以及 10微克/小鼠下每周3次1. P.給予歷時(shí)2周在SJL小鼠的PLP139-151-誘導(dǎo)R-EAE中的治療性治療的劑量應(yīng)答效果。呈現(xiàn)了以平均臨床計(jì)分來(lái)表現(xiàn)的臨床療效(圖13A);還估計(jì)了如以上在100和30微克/小鼠下給予的C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID號(hào)8)對(duì)于以下各項(xiàng)的效果在R-EAE誘導(dǎo)之后第35天進(jìn)行的 對(duì)于誘導(dǎo)表位(PLP139-151)或擴(kuò)展表位(PLP178-191)的DTH應(yīng)答(圖13B)，在R-EAE誘導(dǎo)之后第35天的回憶應(yīng)答，表現(xiàn)為響應(yīng)誘導(dǎo)表位(PLP139-151)、擴(kuò)展表位(PLP178-191)以及抗CD3的淋巴結(jié)細(xì)胞(圖13C)或脾細(xì)胞(圖13D)的增殖；在R-EAE誘導(dǎo)后第65天進(jìn)行的對(duì)于擴(kuò)展表位(PLP178-191以及 MBP84-104)的DTH應(yīng)答(圖13E)，以及在R-EAE誘導(dǎo)之后第65天的回憶應(yīng)答，表現(xiàn)為響應(yīng)抗 CD3、0VA323-339、誘導(dǎo)表位(PLP139-151)以及擴(kuò)展表位(PLP178-191 以及 MBP84-104) 的脾細(xì)胞的增殖。
圖14示出在過(guò)繼轉(zhuǎn)移模型中在細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)給予時(shí)C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID 號(hào)8)或?qū)φ誌g治療對(duì)于R-EAE發(fā)展(圖14A)以及將總免疫細(xì)胞(圖14B)和自身反應(yīng)T 細(xì)胞(圖14C)募集到脾、淋巴結(jié)以及CNS的效果。
圖15和圖16示出C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID號(hào)8)對(duì)于來(lái)自不同人類(lèi)供體的人 T細(xì)胞活化的效果，這種活化表現(xiàn)為細(xì)胞增殖以及IFNy分泌。使用以C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID號(hào)8)、抗⑶3以及抗⑶28涂布的珠粒在一步法(圖15)或兩步法(圖16)中進(jìn)行活化。
圖17示出C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID號(hào)8)對(duì)于人T細(xì)胞增殖的效果的劑量依賴性。
圖18示出C10RF32-ECD-mFc(SEQ ID號(hào)8)以及對(duì)照Ig對(duì)于來(lái)自不同供體的純化的人T細(xì)胞的增殖的效果，這些T細(xì)胞由以抗-⑶3以及抗-⑶28抗體連同C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID號(hào)8)涂布的珠粒來(lái)活化。
圖19示出C10RF32-ECD-mFc (SEQ ID號(hào)8)以及對(duì)照Ig對(duì)于來(lái)自不同供體的純化的人T細(xì)胞的增殖的效果，這些T細(xì)胞由經(jīng)過(guò)照射的自體PBMC以及抗-⑶3和抗-⑶28 抗體來(lái)活化。
圖20示出每周3次以100或30微克/小鼠1. p.給予歷時(shí)10天的 C10RF32-E⑶-mFc (SEQ ID號(hào)8)在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型中的治療效果。測(cè)量的是臨床計(jì)分(A)、腳爪腫脹(B)以及患病腳爪數(shù)量(C)。益賽普(Enbrel) (TNF-R-1g, 100微克/小鼠)用作陽(yáng)性對(duì)照，而對(duì)照Ig (100微克/小鼠)用作陰性對(duì)照。
圖 21 示出1. 5 和 5mg/kg 下的 C10RF32-P8-Vl-ECD_mFc (SEQ IDEnbrel :8)在轉(zhuǎn)移體內(nèi)測(cè)定中對(duì)于DTH的效果，表現(xiàn)為與同種型對(duì)照(mlgG2a，5mg/kg)或媒介物(PBS)治療的小鼠比較的腳爪厚度的變化(Λ )，如圖中詳述。FK506在3和30mg/kg的劑量下用作陽(yáng)性對(duì)照。在注射從4個(gè)不同供體匯集的PBMC后獲得的結(jié)果在圖21A中示出，注射來(lái)自每個(gè)供體的PBMC時(shí)獲得的單獨(dú)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于圖21B和圖21C中。
圖22 示出 C10 RF32-P8-Vl-ECD-mFc (SEQ ID 號(hào)8)對(duì)于脾細(xì)胞的 IFN Y (A 和 B)、IL-2 (C和D)以及IL-4 (E和F)產(chǎn)生的效果，這些脾細(xì)胞在板結(jié)合抗-⑶3以及可溶性抗-⑶28的存在下被刺激24小時(shí)。FK506和B7-H4_Ig用作陽(yáng)性對(duì)照，mIgG2a用作陰性對(duì)照。對(duì)于每個(gè)細(xì)胞因子，提供兩個(gè)研究的結(jié)果，在圖上標(biāo)記為研究I和2。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明
本發(fā)明在至少一些實(shí)施方案中涉及以下各項(xiàng)中的任何一個(gè)被稱為C10RF32的蛋白、其片段、變體以及同源物以及含有它們的融合蛋白和偶聯(lián)物，以及包含它們的藥用組合物，以及編碼它們的核酸序列，以及其作為治療在此描述的免疫相關(guān)病癥的治療劑的用途， 包括但不局限于C10RF32蛋白的ECD (細(xì)胞外域)、其片段和/或變體和/或同源物(單獨(dú)或作為融合蛋白或偶聯(lián)物的一部分)的用途。
為了使本發(fā)明可更容易理解，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。額外的定義貫穿詳細(xì)說(shuō)明而闡明。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指處于與化合物天然地發(fā)生于其中的環(huán)境不同的環(huán)境中的所感興趣的化合物(例如多核苷酸或多肽)，例如，像通過(guò)將肽濃縮至它在天然狀態(tài)下不存在的濃度來(lái)從其天然環(huán)境中分離?！胺蛛x的”包括樣品內(nèi)基本上富含所感興趣的化合物和/或其中所感興趣的化合物是部分或基本上純化的化合物。
“免疫細(xì)胞”是指來(lái)自造血來(lái)源的任何細(xì)胞，包括但不局限于T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“多肽”是指具有任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，而無(wú)論是否修飾(例如， 磷酸化或糖基化)。
如在此使用，“共刺激多肽”或“共刺激分子”是在與T細(xì)胞上的細(xì)胞表面分子相互作用時(shí)調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答的一種多肽。
如在此使用，“共刺激信號(hào)傳導(dǎo)”是在抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答期間在抗原呈遞細(xì)胞上的共刺激多肽與其在T細(xì)胞上的受體之間的相互作用所產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)活性。不希望受單一假設(shè)限制，據(jù)信該抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答由兩種信號(hào)介導(dǎo)，即I) T細(xì)胞受體(TCR)與在 MHC背景下呈遞的抗原性肽的接合(信號(hào)1)，以及2)在不同的共刺激受體/配體對(duì)之間的接觸所遞送的第二個(gè)抗原非依賴性信號(hào)(信號(hào)2)。不希望受單一假設(shè)限制，此“第二信號(hào)” 在確定T細(xì)胞應(yīng)答類(lèi)型(活化與抑制)以及這種應(yīng)答的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間方面是關(guān)鍵性的，并且受來(lái)自例如B7蛋白家族的共刺激分子的正以及負(fù)信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“B7”多肽是指會(huì)共刺激T細(xì)胞的B7蛋白家族的成員，包括但不局限于 B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-S3 以及其生物活性片段和/或變體。代表性生物活性片段包括會(huì)共刺激T細(xì)胞的細(xì)胞外域或細(xì)胞外域片段。
如在此使用，“炎癥分子”是指誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答(直接或間接地)的分子，包括但不局限于細(xì)胞因子以及金屬蛋白酶，例如包括但不局限于IL-1 β、TNF-α、TGF-β、IFN-Y、 IL-17、IL-6、IL-23、IL-22, IL-21 以及 MMP。
如在此使用，“載體”是另一個(gè)DNA片段可插入其中以便引起所插入片段復(fù)制的復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒。在此描述的載體可為表達(dá)載體。如在此使用，“表達(dá)載體” 是包含一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序列的載體。
如在此使用，“表達(dá)控制序列”是控制并且調(diào)節(jié)另一個(gè)DNA序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的DNA序列。
“可操作地連接”是指其中所描述的部件經(jīng)過(guò)配置以便進(jìn)行其常用或預(yù)期功能的元件安排。因此，可操作連接在一起的兩個(gè)不同多肽在物理上連接在一起的同時(shí)保持其相應(yīng)的生物功能。
如在此使用，“效價(jià)”是指每個(gè)分子可利用的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量。
如在此使用，“變體”多肽與對(duì)應(yīng)野生型多肽的氨基酸序列相比含有至少一個(gè)氨基酸序列改變。
如在此使用，“保守”氨基酸取代是其中取代的氨基酸具有類(lèi)似結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性的取代。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指重組載體可引入其中的原核和真核細(xì)胞。
如在此使用，“轉(zhuǎn) 化的”以及“轉(zhuǎn)染的”包括通過(guò)在本領(lǐng)域中已知的許多技術(shù)將核酸(例如載體)引入細(xì)胞中。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“免疫性(immunologic)”、“免疫學(xué)(immunological)”或“免疫 (immune)”應(yīng)答是在接受患者體內(nèi)針對(duì)肽的有益的體液性(抗體介導(dǎo))和/或細(xì)胞性(由抗原特異性T細(xì)胞或其分泌產(chǎn)物介導(dǎo))應(yīng)答的發(fā)展。這種應(yīng)答可為通過(guò)給予免疫原來(lái)誘導(dǎo)的主動(dòng)應(yīng)答或通過(guò)給予抗體或致敏T-細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)的被動(dòng)應(yīng)答。不希望受單一假設(shè)限制，細(xì)胞免疫應(yīng)答通過(guò)結(jié)合I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子來(lái)呈遞多肽表位以便活化抗原特異性CD4+T輔助細(xì)胞和/或CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞來(lái)引起。該應(yīng)答還可涉及單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、星形細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的活化、嗜中性粒細(xì)胞或先天性免疫的其他組分的活化或募集。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的存在可通過(guò)增殖測(cè)定(CD4+T 細(xì)胞)或CTL (細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)測(cè)定來(lái)確定。體液和細(xì)胞應(yīng)答對(duì)于免疫原的保護(hù)或治療效果的相對(duì)貢獻(xiàn)可通過(guò)單獨(dú)地將抗體以及T-細(xì)胞從免疫接種的同系動(dòng)物中分離并且測(cè)量在第二受試者中的保護(hù)或治療效果來(lái)區(qū)分。
“免疫劑”或“免疫原”能夠在任選地結(jié)合佐劑來(lái)給予至哺乳動(dòng)物時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)本身的免疫應(yīng)答。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“C10RF32”是指由在此報(bào)告的H19011_1_T8 (SEQ ID號(hào)1)、 H19011_1_T9 (SEQ ID號(hào)2)轉(zhuǎn)錄物中的任何一個(gè)所編碼的蛋白，尤其指如在H19011_1_P8 (SEQ ID 號(hào)4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID 號(hào):5)、H19011_1_P9(SEQ ID 號(hào)6)或 H19011_l_ P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)中任何一個(gè)所闡明的蛋白、其變體及片段，這些蛋白對(duì)于免疫相關(guān)病癥可以具有治療效果。如在此使用，術(shù)語(yǔ)C10RF32片段和/或C10RF32變體和/或C10RF32 同源物是指包括具有抑制T細(xì)胞活化的生物活性的氨基酸序列的C10RF32部分。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“可溶性C10RF32”或“可溶性胞外域(E⑶)”或“胞外域”或“可溶性C10RF32蛋白/分子”是指包括C10RF32多肽的細(xì)胞外域的一部分或全部、并且缺乏細(xì)胞內(nèi)和/或跨膜域的一部分或全部的C10RF32片段，其中所述片段保持抑制T細(xì)胞活化的生物活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，可溶性C10RF32多肽片段包括C10RF32多肽的整個(gè)細(xì)胞外域。在其他實(shí)施方案中，C10RF32多肽的可溶性片段包括細(xì)胞外域的片段。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“可溶性C10RF32”或“可溶性胞外域(E⑶)”或“胞外域”或“可溶性C10RF32蛋白/分子”進(jìn)一步是指非細(xì)胞表面結(jié)合的(即循環(huán)的)C10RF32分子或C10RF32 分子的任何部分，包括但不局限于C10RF32多肽、其片段或融合蛋白；其中C10RF32的細(xì)胞外域融合至使得融合分子可溶的免疫球蛋白(Ig)部分的融合蛋白、或其片段及衍生物； C10RF32的細(xì)胞外域與例如乳頭狀瘤病毒E7基因產(chǎn)物、黑素瘤相關(guān)抗原p97或HIV包膜蛋白的生物活性或化學(xué)活性蛋白的一部分融合或連接的蛋白、或其片段及衍生物；例如 C10RF32多肽的雜合(嵌合)融合蛋白、其片段或融合蛋白，或其片段及衍生物。“可溶性 C10RF32蛋白/分子”還包括跨膜域被去除以便使得蛋白可溶的C10RF32分子、或其片段及衍生物；以及可溶性C10RF32突變分子。用于本發(fā)明方法中的可溶性C10RF32分子可包括或可不包括信號(hào)(前導(dǎo))肽序列。
術(shù)語(yǔ)C10RF32的“可溶性胞外域(E⑶)”或“胞外域”或“可溶性”形式還指編碼 C10RF32 “可溶性胞外域(E⑶)”或“胞外域”或 “可溶性C10RF32蛋白/分子”的對(duì)應(yīng)蛋白的核酸序列。任選地，C10RF32ECD是指以下多肽序列或其片段中的任何一個(gè)
>H19011_1_P8 (SEQ ID 號(hào)4)殘基 21 至 186，與以下 SEQ ID 號(hào)14 中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWD PYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEGSLGLL VLGRTGLLADLLPSFAVEIMPE ；
>H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 號(hào)5)殘基 21-186，與以下 SEQ ID 號(hào)35 中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng) LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNL EWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEDSVE LLVLGRTGLLADLLPSFAVEIMPE ；
>H19011_1_P9 (SEQ ID 號(hào)6)殘基 21 至 169，與以下 SEQ ID 號(hào)15 中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEWD PYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEGSLGLL VLEffV ；
>H19011_1_P9_V1 (SEQ ID 號(hào)34)殘基 21 至 169，與以下 SEQ ID 號(hào)36 中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)
LQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHF STS SHQPAVVQWKFKSYCQDRMGESLGMSSTRAQSLSKRNLEW DPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCIITTPDDLEGKNEDSVELL VLEffV ；
>H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 號(hào)5)殘基 I 至 184，與以下 SEQ ID 號(hào)19 中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)
MDRVLLRffISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQffKFKSYCQDRMGES LGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCI ITTPDDLEGKNEDSVELLVLGRTGLLADLLPSFAVEIM ；
>H19011_1_P8 (SEQ ID號(hào)4)殘基I至184，與以下SEQ ID號(hào)37中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)
MDRVLLRWISLFWLT·AMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQWKFKSYCQDRMGES LGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYYCI ITTPDDLEGKNEGSLGLLVLGRTGLLADLLPSFAVEIM ；
>H19011丄P9 (SEQ ID號(hào)6)殘基1-169，與以下SEQ ID號(hào):28中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)
MDRVLLRffISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQffKFKSYCQDRMGE SLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYY ClITTPDDLEGKNEGSLGLLVLEffV ；
H19011丄P9_V1 (SEQ ID 號(hào)34)殘基 1-169，與以下 SEQ ID 號(hào)30 中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)
MDRVLLRffISLFWLTAMVEGLQVTVPDKKKVAMLFQPTVLRCHFSTSSHQPAVVQffKFKSYCQDRMGE SLGMSSTRAQSLSKRNLEWDPYLDCLDSRRTVRVVASKQGSTVTLGDFYRGREITIVHDADLQIGKLMWGDSGLYY CIITTPDDLEGKNED SVELLVLEffV, <0}
以及其具有與其至少80%序列一致性、更優(yōu)選至少90%序列一致性并且甚至更優(yōu)選與其至少95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的變體。根據(jù)至少一些實(shí)施方案，與包含 H19011_1_P8(SEQ ID 號(hào)4)、H19011_1_P8_V1(SEQ ID 號(hào)5)、H19011_1_P9(SEQ ID 號(hào):6) 或H19011_1_P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)的細(xì)胞外域的全部或一部分的多肽至少80%、90%、95%、 96%、97%、98%或99%同源的分離的多肽具有如在實(shí)例I中在此描述的至少一種SNP變化。
C10RF32細(xì)胞外域可含有來(lái)自C10RF32的信號(hào)肽或假定跨膜域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在分泌期間，裂解的信號(hào)肽的氨基酸數(shù)量可取決于表達(dá)系統(tǒng)以及宿主而變化。另外或可替代地，失去C-末端或N-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的保持結(jié)合至C10RF32受體的能力的C10RF32細(xì)胞外域的片段可用作所披露融合蛋白的融合伴侶。
C10RF32多肽的變體
這類(lèi)C10RF32多肽的有用變體包括如在此描述的任何測(cè)定所指示增加生物活性， 或增加該蛋白的半衰期或穩(wěn)定性的那些變體?？扇苄訡10RF32多肽以及其具有C10RF32活性的C10RF32片段或融合物可經(jīng)過(guò)工程化以便增加生物活性。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，C10RF32多肽或融合蛋白是通過(guò)增加該分子與免疫細(xì)胞，例如T細(xì)胞的結(jié)合并且將一個(gè)抑制信號(hào)傳輸至該T細(xì)胞中的至少一種氨基酸取代、缺失或插入來(lái)修飾的。
其他任選的變體是經(jīng)過(guò)工程化以便相對(duì)于其他免疫細(xì)胞選擇性地結(jié)合至一種類(lèi)型T細(xì)胞的那些C10RF32多肽。例如，C10RF32多肽可經(jīng)過(guò)工程化以便任選地結(jié)合至Treg、 ThO、Thl、Thl7、Th2或Th22細(xì)胞。優(yōu)先結(jié)合是指對(duì)于一種類(lèi)型的細(xì)胞超過(guò)另一種類(lèi)型的細(xì)胞至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或更大的結(jié)合。
C10RF32的又其他變體可經(jīng)過(guò)工程化以便相對(duì)于野生型C10RF32具有降低的與免疫細(xì)胞的結(jié)合。這些變體可與具有更強(qiáng)的結(jié)合特性的變體組合使用以便以中度影響來(lái)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
還任選地，變體C10RF32多肽可經(jīng)過(guò)工程化以便相對(duì)于野生型具有增加的半衰期。這些變體通常經(jīng)過(guò)修飾以便抵抗酶性降解。示例性修飾包括抵抗酶性降解的修飾的氨基酸殘基以及修飾的肽鍵。實(shí)現(xiàn)這一目的的各種修飾是本領(lǐng)域中已知的。
融合蛋白
根據(jù)至少一些實(shí)施方案，C10RF32融合多肽具有包括C10RF32蛋白的全部或一部分的第一融合伴侶，該第一融合伴侶融合至第二多肽，融合是直接的或經(jīng)由適用于連接這兩種蛋白的連接物肽序列或化學(xué)連接物的。C10RF32多肽可任選地融合至第二多肽以便形成在此描述的融合蛋白。該第二多肽的存在可改變C10RF32融合多肽的溶解性、穩(wěn)定性、親和力和/或效價(jià)。如在此使用，“效價(jià)”是指每個(gè)分子可利用的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，該第二多肽是來(lái)自不同來(lái)源或不同蛋白的多肽。
根據(jù)至少一些實(shí)施方案，C10RF32蛋白或片段針對(duì)其在此描述的治療免疫相關(guān)病癥的活性來(lái)加以選擇。
在一個(gè)實(shí)施方案中，第二多肽含有一個(gè)免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的一個(gè)或多個(gè)域， 該恒定區(qū)優(yōu)選地具有與人免疫球蛋白Cy1、Cy2、Cy3*Cy4鏈的鉸鏈、CH2以及CH3區(qū)或與鼠免疫球蛋白C Y 2a鏈的鉸鏈、CH2以及CH3區(qū)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。SEQ ID號(hào)20提供人免疫 球蛋白C Y I的鉸鏈、CH2以及CH3區(qū)的示例性序列。
根據(jù)至少一些實(shí)施方案，該融合蛋白是一種二聚體融合蛋白。在一個(gè)任選的二聚體融合蛋白中，二聚體由兩個(gè)Ig重鏈的鉸鏈區(qū)中的Cys殘基的共價(jià)鍵結(jié)產(chǎn)生，這些Cys殘基是二聚化的正常Ig重鏈中以二硫鍵連接的相同Cys殘基。這類(lèi)蛋白被稱為C10RF32多肽、其片段或融合蛋白。
在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白恒定域可含有增強(qiáng)C10RF32多肽、其融合蛋白或片段的與具體細(xì)胞類(lèi)型的結(jié)合、增加其生物利用度或增加其穩(wěn)定性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、缺失或取代。適合的氨基酸取代包括如上所述的保守以及非保守取代。
這些融合蛋白 任選地含有起作用以便使兩個(gè)或更多個(gè)融合蛋白二聚化或多聚化的一個(gè)域。肽/多肽連接物域可為一個(gè)單獨(dú)的域，亦或可替代地可包含于融合蛋白的一個(gè)其他域(C10RF32多肽或第二多肽)中。同樣地，起作用以便使融合蛋白二聚化或多聚化的這個(gè)域可為一個(gè)單獨(dú)的域，亦或可替代地可包含于融合蛋白的一個(gè)其他域(C10RF32多肽、 第二多肽或肽/多肽連接物域)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，二聚化/多聚化域以及肽/多肽連接物域是相同的。二聚化/多聚化域以及連接物的進(jìn)一步的具體、說(shuō)明性以及非限制實(shí)例在下文給出。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案在此披露的融合蛋白具有化學(xué)式1: N-R1-R2-R3-C，其中“N”代表融合蛋白的N-末端，“C”代表融合蛋白的C-末端。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，“R1”是C10RF32多肽，“R2”是任選的肽/多肽或化學(xué)連接物域，并且“R3” 是第二多肽。可替代地，R3可為C10RF32多肽并且Rl可為第二多肽。
任選地，融合蛋白包含任選地通過(guò)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的連接物肽(例如GS)融合至一個(gè)或多個(gè)“半衰期延長(zhǎng)部分”的在此描述的C10RF32多肽片段?！鞍胨テ谘娱L(zhǎng)部分” 是在附接至蛋白上時(shí)延長(zhǎng)這種蛋白在受試者體內(nèi)(例如受試者血漿內(nèi))的體內(nèi)半衰期的任何部分，例如多肽、小分子或聚合物。例如，半衰期延長(zhǎng)部分在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中是聚乙二醇(PEG)、單甲氧基PEG (mPEG)或免疫球蛋白(Ig)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中， PEG是5、10、12、20、30、40或50kDa部分或更大或包含約12000個(gè)乙二醇單元(PEG12000)。
二聚化或多聚化可經(jīng)由二聚化或多聚化域在兩個(gè)或更多個(gè)融合蛋白之間發(fā)生。可替代地，融合蛋白的二聚化或多聚化可通過(guò)化學(xué)交聯(lián)來(lái)發(fā)生。形成的二聚體或多聚體可為同源二聚體/同源多聚體或異源二聚體/異源多聚體。C10RF32融合多肽中的第二多肽“伴侶”可包括一個(gè)或多個(gè)在此描述的其他蛋白、蛋白片段或肽，包括但不局限于任何免疫球蛋白(Ig)蛋白或其一部分，優(yōu)選地Fe區(qū)，或例如乳頭狀瘤病毒E7基因產(chǎn)物、黑素瘤相關(guān)抗原 P97、以及HIV包膜蛋白(gpl20)的生物學(xué)或化學(xué)活性蛋白的一部分?！鞍閭H”可任選地選擇以便提供可溶性二聚體/多聚體和/或針對(duì)在此描述的一種或多種其他生物活性加以選擇。
二聚化或多聚化可經(jīng)由 二聚化或多聚化域在兩個(gè)或更多個(gè)融合蛋白之間發(fā)生，這些二聚化或多聚化域包括如上所述的那些域?？商娲?，融合蛋白的二聚化或多聚化可通過(guò)化學(xué)交聯(lián)發(fā)生。融合蛋白二聚體可為同源二聚體或異源二聚體。融合蛋白多聚體可為同源多聚體或異源多聚體。如在此披露的融合蛋白二聚體具有化學(xué)式II
N-R1-R2-R3-C
N-R4-R5-R6-C或替代地具有化學(xué)式II1:
N-R1-R2-R3-C
C-R4-R5-R6-N，其中化學(xué)式II提供的二聚體的融合蛋白被定義為處于平行取向并且化學(xué)式III提供的二聚體的融合蛋白被定義為處于反平行取向。平行和反平行二聚體又分別稱為順式和反式二聚體。"N”和“C”分別代表融合蛋白的N-和C-末端。融合蛋白成分“R1”、“R2”以及“R3”如上文關(guān)于化學(xué)式I所定義。關(guān)于化學(xué)式II和化學(xué)式III而言， “R4”是C10RF32多肽或第二多肽，“R5”是任選的肽/多肽連接物域，并且“R6”是C10RF32 多肽或第二多肽，其中當(dāng)“R4”是第二多肽時(shí)，“R6”是C10RF32多肽，并且當(dāng)“R4”是C10RF32 多肽時(shí)，“R6”是第二多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，“R1”為C10RF32多肽，“R4”也為C10RF32 多肽，并且“R3”和“R6”均為第二多肽。
當(dāng)“Rl”= “R4”，“R2”= “R5”并且“R3”= “R6”時(shí)，具有化學(xué)式II的融合蛋白二聚體定義為同源二聚體。同樣地，當(dāng)“Rl”= “R6”、“R2”= “R5”并且“R3”= “R4”時(shí)，具有化學(xué)式III的融合蛋白二聚體定義為同源二聚體。當(dāng)出于任何原因不滿足這些條件時(shí)，融合蛋白二聚體被定義為異源二聚體。例如，異源二聚體可含有滿足這些條件(即，對(duì)于根據(jù)化學(xué)式II的二聚體而言，“R1”和“R4”均為C10RF32多肽，“R2”和“R5”均為肽/多肽連接物域并且“R3”和“R6”均為第二多肽)的域取向，然而這些域中的一個(gè)或多個(gè)域的種類(lèi)并不相同。例如，雖然“R3”和“R6”可均為C10RF32多肽，但是一種多肽可含有野生型C10RF32 氨基酸序列，而另一種多肽可為變體C10RF32多肽。示例性變體C10RF32多肽為經(jīng)過(guò)修飾而具有增加或減少的與靶細(xì)胞的結(jié)合、增加的對(duì)于免疫細(xì)胞的活性、增加或減少的半衰期或穩(wěn)定性的C10RF32多肽。含有一種免疫球蛋白的CHI或CL區(qū)作為多肽連接物域的一部分的融合蛋白二聚體優(yōu)選地形成這樣的異源二聚體，其中二聚體的一個(gè)融合蛋白含有CHI 區(qū)并且二聚體的另一個(gè)融合蛋白含有CL區(qū)。
融合蛋白也可用于形成多聚體。與二聚體一樣，多聚體可為平行多聚體，其中多聚體的所有融合蛋白以相對(duì)于其N(xiāo)-和C-末端的相同取向來(lái)對(duì)齊。多聚體可為反平行多聚體，其中多聚體的融合蛋白可替代地以相對(duì)于其N(xiāo)-和C-末端的相反取向來(lái)對(duì)齊。多聚體 (平行或反平行)可為同源多聚體或異源多聚體。融合蛋白任選地以二聚體形式產(chǎn)生；更優(yōu)選地，融合如下所述在基因水平來(lái)進(jìn)行，方法為連接與兩個(gè)(或更多個(gè))蛋白、蛋白部分和/ 或肽對(duì)應(yīng)的多核苷酸序列，以使得由細(xì)胞根據(jù)連接的多核苷酸序列來(lái)產(chǎn)生連接或融合的蛋白。制備這種融合蛋白的描述參照Linsley (林斯雷)等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，851，795來(lái)描述， 該專(zhuān)利只作為非限制性實(shí)例通過(guò)引用結(jié)合在此，其引用程度如同完全在此闡明一樣。
融合蛋白也可任選地通過(guò)化學(xué)合成方法來(lái)制備并且在合成或合成后期間以化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)“連接”?？扇芜x地使用交聯(lián)以及其他這類(lèi)方法(任選地還使用以上描述的基因水平融合方法)，如例如在Wallner (瓦爾納)等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，547，853中描述，該專(zhuān)利只作為非限制性實(shí)例通過(guò)引用結(jié)合在此，其引用程度如同完全在此闡明一樣。
根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白可用本發(fā)明的蛋白通過(guò)與包含一種免疫球蛋白的恒定區(qū)的免疫球蛋白的一部分融合來(lái)制備。更優(yōu)選地，該免疫球蛋白的該部分包含任選地并且更優(yōu)選地為人重鏈恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)。該重鏈恒定區(qū)最優(yōu)選地為IgG重鏈恒定區(qū)，并且任選地以 及最優(yōu)選地為Fe鏈，最優(yōu)選地為包含鉸鏈、CH2以及CH3域的IgG Fe片段。該Fe鏈可任選地為已知或“野生型"Fe鏈，或替代地可以是突變或截短的。融合蛋白的Fe部分可任選地按照同種型或子類(lèi)而不同，可以是嵌合體或雜合體，和/或可經(jīng)過(guò)修飾以便例如改進(jìn)效應(yīng)子功能、控制半衰期、組織可接近性、增進(jìn)生物物理特性例如穩(wěn)定性，并且改進(jìn)產(chǎn)生效率(并且成本更小)。適用于構(gòu)建所披露融合蛋白的許多修飾以及其制造方法是本領(lǐng)域中已知的， 參見(jiàn)例如 Mueller (穆勒)等人,分子免疫學(xué)(Mol. Tmmun. ) , 34(6) : 441-452 (1997), Swann(斯萬(wàn))等人，當(dāng)前免疫學(xué)觀點(diǎn)(Cur. Opin.1mmun. ) , 20:493-499 (2008)，以及Presta (帕斯塔)，當(dāng)前免疫學(xué)觀點(diǎn)(Cur. Opin.1mmun. ) 20:460-470 (2008)。在一些實(shí)施方案中，該Fe 區(qū)為原生IgGl、IgG2或IgG4Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，該Fe區(qū)是雜合體，例如由IgG2/ IgG4Fc恒定區(qū)組成的嵌合體。
該Fe區(qū)的修飾包括但不局限于IgG4被修飾以便防止與Fe Y受體以及補(bǔ)體的結(jié)合，IgGl被修飾以便改進(jìn)與一個(gè)或多個(gè)Fe Y受體的結(jié)合,IgGl被修飾以便最小化效應(yīng)子功能(氨基酸變化)，IgGl具有改變的聚糖/沒(méi)有聚糖(通常通過(guò)改變表達(dá)宿主)，并且IgGl具有改變的與FcRn的pH依賴性結(jié)合。該Fe區(qū)可包括整個(gè)鉸鏈區(qū)，或不足整個(gè)鉸鏈區(qū)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)e域可含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸插入、缺失或取代，這些插入、缺失或取代減少與低親和力抑制性Fe受體⑶32B (Fe Y RIIB)的結(jié)合并且保持野生型水平的與低親和力活化Fe受體⑶16A (Fe Y RIIIA)的結(jié)合或增強(qiáng)與之的結(jié)合。
另一個(gè)實(shí)施方案包括IgG2_4雜合體和IgG4突變體，它們具有降低的與FcR (Fe 受體)的結(jié)合，從而增加其半衰期。代表性IgG2-4雜合體和IgG4突變體描述于Angal (安蓋爾)，S.等人，分子免疫學(xué)(Molecular Immunology) , 30 (I) : 105-108 (1993) ；Mueller (穆勒)，J.等人，分子免疫學(xué)(Molecular Immunology), 34 (6) :441-452 (1997);以及 Wang (王)等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，982，323中。在一些實(shí)施方案中，IgGl和/或IgG2域被缺失；例如， Angal (安蓋爾)等描述具有絲氨酸241替換為脯氨酸的IgGl和IgG2。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，F(xiàn)e域含有氨基酸插入、缺失或取代，這些插入、缺失或取代增強(qiáng)與⑶16A的結(jié)合。增加與⑶16A的結(jié)合并且減少與⑶32B的結(jié)合的人IgGl的 Fe域中的很多取代是本領(lǐng)域中已知的并且描述于Stavenhagen (斯塔文哈根)等人,癌癥研究(Cancer Res. ),57(18) :8882-90 (2007年)中。具有降低的與CD32B的結(jié)合和/或增加的與CD16A的結(jié)合的人IgGlFc域的示例性變體含有F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L 取代。這些氨基酸取代可按任何組合存在于人IgGlFc域中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該人IgGlFc域變體含有F243L、R929P以及Y300L取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人IgGlFc域變體含有F243L、R929P、Y300L、V305I以及P296L取代。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，人IgGlFc域變體含有N297A/Q取代，因?yàn)檫@些突變消除Fe Y R結(jié)合。非限制、說(shuō)明性、示例性類(lèi)型的突變描述于2006年2月16日公開(kāi)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?20060034852中，該申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合在此，其引用程度如同完全在此闡明一樣。術(shù)語(yǔ)“Fe 鏈”還任選地包括任何類(lèi)型的Fe片段。
已經(jīng)鑒定對(duì)于IgG子類(lèi)中的抗體恒定區(qū)介導(dǎo)的活性而言重要的幾個(gè)特定氨基酸殘基。因此，包含、取代或排除這些特定氨基酸允許包含或排除特定免疫球蛋白恒定區(qū)介導(dǎo)的活性。此外，特定變化可產(chǎn)生例如去糖基化和/或Fe鏈的其他所希望變化?？扇芜x地產(chǎn)生至少一些變化以便阻斷被認(rèn)為不合需要的Fe功能，例如不合需要的免疫系統(tǒng)效應(yīng)，如下文更詳細(xì)描述的。
可產(chǎn)生以調(diào)節(jié)融合蛋白的活性的Fe突變的非限制性、說(shuō)明性實(shí)例包括以下變化 (根據(jù)Kabat (卡巴特)EA等具有免疫學(xué)重要性的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),美國(guó)衛(wèi)生和公眾服務(wù)部(US Department of Health and Human Services), NIH，1991，參照如Kabat(卡巴特)給出的Fe序列命名法來(lái)給出)220C->S ； 233-238ELLGGP->EAEGAP ；265D->A,優(yōu)選地結(jié)合 434N_>A ；297N->A (例如用于阻斷 N-糖基化);318-322EYKCK->AYACA ；330-331AP->SS ;或其組合(參見(jiàn)例如 M. Clark (克拉克)，“化學(xué)免疫學(xué)與抗體工程化(Chemical Tmmunol and Antibody Engineering)”,第 1-31 頁(yè)以便獲得這些突變及其效果的描述)。特征為以上變化的Fe鏈的構(gòu)建體任選地并且優(yōu)選地包括鉸鏈區(qū)與CH2和CH3域的組合。
以上突變可任選地實(shí)施以便增強(qiáng)所希望的特性或替代地阻斷不希望的特性。例如，已顯示抗體的去糖基化可在阻斷T-細(xì)胞的耗盡或觸發(fā)細(xì)胞因子釋放的同時(shí)維持所希望的結(jié)合功能性，此舉可任選地為不希望有的功能(參見(jiàn)M. Clark, “化學(xué)免疫學(xué)與抗體工程化(Chemical Tmmunol and Antibody Engineering)”,第 1-31 頁(yè))。將 331 腦氨酸取代為絲氨酸可阻斷活化補(bǔ)體的能力，此舉可任選地被認(rèn)為是不希望有的功能(參見(jiàn)M. Clark (克拉克)，“化學(xué)免疫學(xué)與抗體工程化(Chemical Tmmunol and Antibody Engineering)”,第 1-31頁(yè))。結(jié)合此變化將330丙氨酸改變成絲氨酸也可增強(qiáng)阻斷活化補(bǔ)體的能力的所希望的效果。
已顯示殘基235和237涉及到抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，使得如果 ADCC被認(rèn)為是不合需要的功能，如所描述改變233-238殘基區(qū)塊也可阻斷這種活性。
殘基220通常是來(lái)自IgGl的Fe的半胱氨酸，它是重鏈與輕鏈形成共價(jià)鍵的位點(diǎn)。 任選地，此殘基可改變?yōu)榻z氨酸，以避免任何類(lèi)型的共價(jià)鍵(參見(jiàn)M. Clark (克拉克)，“化學(xué)免疫學(xué)與抗體工程化(Chemical Tmmunol and Antibody Engineering)”,第 1-31 頁(yè))。
殘基265和434的以上變化可任選地實(shí)施以便減少或阻斷與Fe受體的結(jié)合，這可任選地阻斷Fe的與其免疫系統(tǒng)功能相關(guān)的不希望有的功能(參見(jiàn)“人IgGl上的Fe受體結(jié)合位點(diǎn)(Binding site on Human IgGlfor Fe Receptors)”, Shields(希爾茲)等人,第 276 卷，第 6591-6604 頁(yè)，2001 年)。
以上變化只用來(lái)說(shuō)明任選的變化并且不欲以任何方式具有限制性。此外，以上解釋只出于描述目的而提供，而不希望受單一假設(shè)限制。
示例性融合蛋白在SEQ ID號(hào)8、22、23、38、29中闡明。
前述示例性融合蛋白可合并有在此描述的變體的任何組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，前述示例性融合蛋白的末端賴氨酸被刪除。
所披露的融合蛋白可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)分離。例如，將含有編碼 C10RF32多肽、其片段或融合蛋白的DNA序列的表達(dá)載體通過(guò)磷酸鈣沉淀而轉(zhuǎn)染至293 細(xì)胞中并且在無(wú)血清DMEM中培養(yǎng)。在72h收集上清液并且通過(guò)蛋白G、或優(yōu)選地蛋白 A SEPHAROSE 管柱(Pharmacia公司，烏普薩拉(Uppsala),瑞典)來(lái)純化融合蛋白。任選地，將編碼C10RF32多肽、其片段或融合蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)染至GPEx 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中并且在四輪逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，在CHO-S細(xì)胞中表達(dá)。該蛋白通過(guò)使用蛋白A色譜法從上清液中凈化。
在另一個(gè)實(shí)施方 案 中，第二多肽可具有一個(gè)偶聯(lián)域，通過(guò)該偶聯(lián)域另外的分子可結(jié)合至這些C10RF32融合蛋白。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，被偶聯(lián)的分子能夠?qū)⑷诤系鞍装邢蜉斔椭撂囟ㄆ鞴倩蚪M織；這類(lèi)靶向域和/或分子的進(jìn)一步的具體、說(shuō)明性、非限制性實(shí)例在下文給出。
在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，被偶聯(lián)的分子是可增強(qiáng)或增進(jìn)C10RF32融合蛋白的效果的另一種免疫調(diào)節(jié)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被偶聯(lián)的分子是聚乙二醇(PEG)。
肽或多肽連接物域
所披露的C10RF32融合蛋白任選地含有將C10RF32多肽與第二多肽分離開(kāi)的肽或多肽連接物域。在一個(gè)實(shí)施方案中，該連接物域含有一種免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該鉸鏈區(qū)來(lái)源于人免疫球蛋白。該鉸鏈可來(lái)源自的適合的人免疫球蛋白包括IgG、IgD以及IgA。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)來(lái)源于人IgG。免疫球蛋白鉸鏈區(qū)以及其他域的氨基酸序列在本領(lǐng)域中是熟知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32融合多肽含有與以下SEQ ID號(hào)20中闡明的氨基酸序列具有至少85%、90%、95%、99%或100%序列同源性的人免疫球蛋白C Y I鏈的鉸鏈、CH2以及CH3區(qū)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGK
鉸鏈可進(jìn)一步縮短以便去除SEQ ID號(hào)20的氨基酸1、2、3、4、5或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，SEQ ID號(hào)20的氨基酸1-5被缺失。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32融合多肽含有與在以下SEQ ID號(hào)21中闡明的氨基酸序列具有至少85%、90%、95%、99%或100%序列同源性的人免疫球蛋白C Y I鏈的CH2以及CH3區(qū)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在另一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32融合多肽含有與以下SEQ ID號(hào)31中闡明的氨基酸序列具有至少85%、90%、95%、99%或100%序列同源性的鼠免疫球蛋白C Y 2a鏈的鉸鏈、 CH2以及CH3區(qū)
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVE VHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTK KQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHT TKSFSRTPGK.在另一個(gè)實(shí)施方案中，該連接物域含有如上所述的一種免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)， 并且進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)另外的免疫球蛋白域。
其他適合的肽/多肽連接物域包 含天然發(fā)生或非天然發(fā)生的肽或多肽。肽連接物序列具有至少2個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。任選地，肽或多肽域是柔性肽或多肽。“柔性連接物” 在此是指含有由一個(gè)或多個(gè)肽鍵相連接的兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的肽或多肽，這與在不存在該柔性連接物的情況下的兩個(gè)連接的多肽相比，為由此連接的兩個(gè)多肽提供增加的轉(zhuǎn)動(dòng)自由度。這種轉(zhuǎn)動(dòng)自由度允許由該柔性連接物連接的兩個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)各自更有效地接近一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)抗原。示例性柔性肽/多肽包括但不局限于氨基酸序列 Gly-Ser (SEQ ID 號(hào)24)、Gly-Ser-Gly-Ser (SEQ ID 號(hào)25)、Ala-Ser (SEQ ID 號(hào)26)、 Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID 號(hào)27)、Gly4_Ser (SEQ ID 號(hào)39)、(Gly4-Ser) 2 (SEQ ID 號(hào)40)、(Gly4-Ser) 3 (SEQ ID 號(hào)32)以及(Gly4-Ser)4 (SEQ ID 號(hào)33)。額外的柔性肽/多肽序列在本領(lǐng)域中是熟知的。
二聚化、多聚化以及靶向域
在此披露的融合蛋白任選地含有起作用以便使兩個(gè)或更多個(gè)融合蛋白二聚化或多聚化的一個(gè)二聚化或多聚化域。起作用以便使融合蛋白二聚化或多聚化的該域可為一個(gè)單獨(dú)的域，或可替代地可包含于融合蛋白的一個(gè)其他域(C10RF32多肽、第二多肽、或肽/多肽連接物域)中。
“ 二聚化域”通過(guò)至少兩個(gè)氨基酸殘基或至少兩個(gè)肽或多肽(可具有相同或不同的氨基酸序列)的締合來(lái)形成。肽或多肽可經(jīng)由共價(jià)和/或非共價(jià)締合來(lái)彼此相互作用。任選的二聚化域含有能夠與伴侶融合蛋白上的半胱氨酸形成分子間二硫鍵的至少一個(gè)半胱氨酸。二聚化域可含有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基以使得可在伴侶融合蛋白之間形成一個(gè)或多個(gè)二硫鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，二聚化域含有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)至約十個(gè)半胱氨酸殘基。 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，二聚化域是一種免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)。
另外的示例性二聚化域可以是本領(lǐng)域中已知的任何一種并且包括但是不局限于卷曲螺旋、酸補(bǔ)丁、鋅指、鈣手、CHl-CL對(duì)、如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，821，333中描·述的具有經(jīng)過(guò)工程化的“突起(knob)”和/或“隆起(protruberance)”的“界面”、亮氨酸拉鏈(例如來(lái)自jun 和 / 或 fos)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，932，448)、SH2 (src 同源性 2)、SH3 (src 同源性 3) (VI dal (威代爾)等人，生物化學(xué)(Biochemistry), 43, 7336-44 ((2004))、磷酸酪氨酸結(jié)合(PTB)(Zhou (周)等人，自然(Nature), 378:584-592(1995) (Sudol (薩杜爾)，生物物理學(xué)與分子生物學(xué)進(jìn)展(Prog, Biochys. MoLBio. ),65:113-132(1996) )、PDZ (Kim (金姆)等人，自然 (Nature), 378:85-88(1995) ;Komau (考茅)等人，科學(xué)(Science), 269. 1737-1740 (1995)) 14-3-3、WD40 (Hu5 等人，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem. )，273，33489-33494 (1998) ) EH、 Lim、異亮氨酸拉鏈、受體二聚體對(duì)(例如白介素-8受體(IL-8R);以及整聯(lián)蛋白異源二聚體例如LFA-1和GPIIIb/IIIa)，或其二聚化區(qū)、二聚體配體多肽(例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3 (NT-3)、白介素-8 (IL-8)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、 I3DGF成員，以及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF) (Arakawa (荒川)等人，生物化學(xué)雜志(J Biol. Chem. )，269 (45) : 27833-27839 (1994)以及 Radziejewski (拉切耶夫斯基)等人，生物化學(xué)(Biochem. ),32(48):1350 (1993))并且還可為其中親和力發(fā)生改變的這些域的變體。這些多肽對(duì)可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法，包括酵母雙雜交篩選來(lái)鑒定。酵母雙雜交篩選描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，283，173以及6，562，576中。一對(duì)相互作用域之間的親和力可使用在本領(lǐng)域中已知的方法,包括如Katahira (片平)等人，生物化學(xué)雜志(J. Biol Chem), 277,9242-9246 (2002年)中所描述來(lái)確定?？商娲?，可針對(duì)異源二聚化，例如使用在 W001/00814中描述的方法來(lái)篩選肽序列文庫(kù)。蛋白-蛋白相互作用的有用方法還描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，790,624中。
“多聚化域”是經(jīng)由共價(jià)和/或非共價(jià)締合引起三個(gè)或更多個(gè)肽或多肽彼此相互作用的域。適合的多聚化域包括但不局限于卷曲螺旋域。卷曲螺旋是具有間隔開(kāi)3個(gè)和4個(gè)殘基的主要疏水性殘基的連續(xù)型式的肽序列，通常呈七個(gè)氨基酸(七價(jià)重復(fù))或十一個(gè)氨基酸(十一價(jià)重復(fù))的序列形式的，這些氨基酸組裝(折疊)以形成多聚體螺旋束。還涵蓋具有包含3個(gè)和4個(gè)殘基間隔的某種不規(guī)則分布的序列的卷曲螺旋。疏水性殘基具體來(lái)說(shuō)是疏水性氨基酸Val、He、Leu、Met、Tyr、Phe以及Trp?！爸饕杷浴笔侵钢辽?0%的殘基必須選自所提到的疏水性氨基酸。
卷曲螺旋域可來(lái)源于層粘連蛋白。在細(xì)胞外空間中，異源三聚體卷曲螺旋蛋白層粘連蛋白在基底膜的形成中發(fā)揮重要作用。顯然地，多官能低聚結(jié)構(gòu)是層粘連蛋白功能所要求的。卷曲螺旋域還可來(lái)源于其中連接三個(gè)(TSP-1和TSP-2)或五個(gè)(TSP-3、TSP-4 以及TSP-5)鏈的血小板反應(yīng)蛋白，或來(lái)源于折疊成平行五鏈卷曲螺旋的COMP (COMPcc) (Guo (郭)等人，EMBO J, 1998，17:5265-5272) (Malashkevich (馬拉舍科維奇)等人，科學(xué)(Science), 274:761-765(1996))。來(lái)源于其他蛋白的另外卷曲螺旋域，以及介導(dǎo)多肽多聚化的其他域是本領(lǐng)域中已知的并且適用于所披露的融合蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)結(jié)合至例如抗體的第二多價(jià)多肽來(lái)誘導(dǎo)C10RF32多肽、其融合蛋白或片段以便形成多聚體。適合于用于使C10RF32多肽、其融合蛋白或片段多聚化的抗體包括但不局限于IgM抗體以及交聯(lián)的多價(jià)IgG、IgA、IgD或IgE復(fù)合物。
靶向域
C10RF32多肽和融合蛋白可含有用于將分子靶向至體內(nèi)特定位點(diǎn)的一個(gè)靶向域。 任選的靶向域?qū)⒎肿影邢蜉斔椭裂装Y區(qū)域。示例性靶向域是對(duì)于發(fā)炎組織或促炎癥細(xì)胞因子具有特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述細(xì)胞因子包括但不局限于IL17、IL-4、IL-6、 IL-12、IL-21、IL-22以及IL-23。在神經(jīng)學(xué)病癥，例如多發(fā)性硬化的情況下，靶向域可將分子靶向至CNS或可結(jié)合至血管上皮上的VCAM-1。另外的靶向域可以是對(duì)于促炎癥分子具有特異性的肽適體。在其他實(shí)施方案中，C10RF32融合蛋白可包括對(duì)于展示于例如T細(xì)胞的免疫細(xì)胞的表面上的多肽具有特異性的結(jié)合伴侶。仍然在其他實(shí)施方案中，靶向域特異性地靶向活化的免疫細(xì)胞。被靶向的任選的免疫細(xì)胞包括ThO、Thl、Thl7、Th2以及Th22T細(xì)胞、分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞，這些炎癥分子包括但不局限于IL-1 β、 TNF-α ,TGF-β、IFN-Y、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP，以及 Trego 例如，Treg 的靶向域可特異性地結(jié)合至⑶25。
術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”、“宿主”、“受試者”，以及“患者”在此可互換使用，并且是指任何人類(lèi)或非人類(lèi)動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“非人類(lèi)動(dòng)物”包括所有脊椎動(dòng)物，例如，哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長(zhǎng)類(lèi)、綿羊、犬、貓、馬、牛、雞、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、等。
本發(fā)明的不同方面在以下小節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)描述。
核酸
“核酸片段”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”在此可互換使用以指代核酸殘基的聚合物。本發(fā)明的多核苷酸序列是指單或雙鏈核酸序列，它以RNA序列、互補(bǔ)多核苷酸序列 (cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復(fù)合多核苷酸序列(例如，以上的組合)形式分離和提供。
因此，本發(fā)明涵蓋在上文中描述的核酸序列；其片段、與其雜交的序列、與其同源的序列[例如與在此闡明的核酸序列至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%或更大程度一致、編碼具有不同密碼子使用的類(lèi)似多肽的序列、以一個(gè)或多個(gè)核苷酸的天然發(fā)生的或者隨機(jī)亦或以靶向方式人工誘導(dǎo)的突變?yōu)樘卣鞯母淖冃蛄?，所述突變例如缺失、插入或取代?本發(fā)明還涵蓋包括本發(fā)明的多核苷酸獨(dú)特的序列區(qū)的同源核酸序列(即，形成本發(fā)明的多核苷酸序列的一部分)。
如果本發(fā)明的多核苷酸序列編碼先前未鑒定的多肽，本發(fā)明還涵蓋由在上文中描述的分離的多核苷酸以及其相應(yīng)核酸片段和/或其簡(jiǎn)并變體所編碼的新穎多肽或其部分。
因此，本發(fā)明還涵蓋由本發(fā)明的多核苷酸序列編碼的多肽。本發(fā)明還涵蓋這些多肽的同系物，這類(lèi)同系物可與以下闡明的氨基酸序列至少90%、至少95%、96%、97%、 98%或99%或更大程度同源，如可使用國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information ;NCBI)的BlastP軟件使用缺省參數(shù)來(lái)確定的。最后,本發(fā)明還涵蓋以上描述的多肽以及具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的天然發(fā)生的隨機(jī)亦或以靶向方式人工誘導(dǎo)的突變的多肽的片段，所述突變例如缺失、插入或取代。
如在上文中提到的，本發(fā)明的生物分子序列可有效地用作組織或病理標(biāo)志以及作為治療或預(yù)防疾病的假定藥物或藥物靶標(biāo)。
被設(shè)計(jì)成針對(duì)在此提供的任何序列來(lái)進(jìn)行本發(fā)明方法(如上所述來(lái)設(shè)計(jì))的寡核苷酸可根據(jù)在本領(lǐng)域中已知的任何寡核苷酸合成法，例如酶促合成或固相合成來(lái)產(chǎn)生。進(jìn)行固相合成的設(shè)備和試劑例如從美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)可購(gòu)得。也可使用這類(lèi)合成的任何其他手段；寡核苷酸的實(shí)際合成完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面使用的寡核苷酸是具有選自從約10至約200個(gè)堿基、優(yōu)選地從約15至約150個(gè)堿基、更優(yōu)選地從約20至約100個(gè)堿基、最優(yōu)選地從約20至約50個(gè)堿基的范圍的長(zhǎng)度的那些寡核苷酸。
本發(fā)明的寡核苷酸可包含由嘌呤和嘧啶堿基組成的雜環(huán)核苷，這些堿基以3’至 5’磷酸二酯鍵來(lái)鍵結(jié)。
優(yōu)選的寡核苷酸是在骨架、核苷間鍵或堿基中經(jīng)過(guò)修飾的那些寡核苷酸，如下文中廣泛描述。這類(lèi)修飾可時(shí)常促進(jìn)寡核苷酸吸收以及對(duì)于細(xì)胞內(nèi)條件的抵抗性。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面適用的優(yōu)選寡核苷酸的具體實(shí)例包括含有經(jīng)過(guò)修飾的骨架或非天然核苷間鍵的寡核苷酸。具有修飾的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保持磷原子的那些寡核苷酸，如在以下美國(guó)專(zhuān)利號(hào)中所披露的4，469, 863 ;4，476，301 ;5，023，243 ； 5，177，196 ;5，188，897 ;5，264，423 ;5，276，019 ;5，278，302 ;5，286，717 ;5，321，131 ； 5，399，676 ;5，405，939 ;5，453，496 ;5，455，233 ;5，466,677 ;5，476，925 ;5，519，126 ； 5，536，821 ;5，541，306 ;5，550，111 ;5，563，253 ;5，571，799 ;5，587，361 ;以及 5，625，050。
優(yōu)選的修飾的寡核苷酸骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(包括3’-亞烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、 硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸三酯，以及具有正常3’ -5’鍵、這些鍵的 2’-5’連接類(lèi)似物的硼烷磷酸酯，以及具有其中相鄰對(duì)的核苷單位以3’-5’至5’-3’或 2’-5’至5’-2’來(lái)連接的反向極性的那些硼烷磷酸酯。也可使用不同鹽、混合鹽以及游離酸形式。
可替代地，其中不包括磷原子的修飾的寡核苷酸骨架具有通過(guò)短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子以及烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一個(gè)或多個(gè) 短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成的骨架。這些骨架包括具有嗎啉鍵(部分地由核苷的糖部分形成)的那些骨架； 硅氧烷骨架；硫化物、亞砜以及砜骨架；甲?；约傲虼柞；羌埽粊喖谆柞；约傲虼柞；羌埽缓邢N的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基以及亞甲基肼基骨架； 磺酸酯以及磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S以及CH2組成部分的其他骨架， 如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5,034，506 ;5，166,315 ;5，185,444 ;5，214，134 ;5，216，141 ;5，235,033 ；5，264，562 ;5，264，564 ;5，405，938 ;5，434，257 ;5，466，677 ;5，470，967 ;5，489，677 ； 5，541，307 ;5，561，225 ;5，596，086 ;5，602, 240 ;5，610, 289 ;5，602, 240 ;5，608, 046 ； 5，610，289 ;5，618，704 ;5，623,070 ;5，663，312 ;5，633，360 ;5，677，437 ;以及 5，677，439 中所披露。
根據(jù)本發(fā)明可使用的其他寡核苷酸是核苷酸單位的糖和核苷間鍵(S卩，骨架)替換為新穎的基團(tuán)而修飾的那些寡核苷酸。保持堿基單位以便與適當(dāng)?shù)亩嗪塑账崮繕?biāo)互補(bǔ)。這類(lèi)寡核苷酸模擬物的實(shí)例包括肽核酸(PNA)。PNA寡核苷酸是指其中糖-骨架替換為含有酰胺的骨架，特別是氨乙基甘氨酸骨架的寡核苷酸。堿基得以保持并且直接或間接地結(jié)合至骨架的酰胺部分的氮雜氮原子。傳授PNA化合物的制備的美國(guó)專(zhuān)利包括但不局限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，539，082 ;5，714，331 ;以及5，719，262，它們各自通過(guò)引用結(jié)合在此?？捎糜诒景l(fā)明中的其他骨架修飾披露于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，303，374中。
本發(fā)明的寡核苷酸還可包括堿基修飾或取代。如在此使用，“未修飾的”或“天然” 堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥(niǎo)嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修飾堿基包括但不局限于其他合成以及天然堿基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、 5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶以及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-鹵基、8-氨基、8-氫硫基、8-硫烷基、8-羥基以及其他8-取代腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤、5-鹵基尤其5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮鳥(niǎo)嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和7-脫氮腺嘌呤、以及3-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。另外的堿基包括在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3，687，808中披露的那些堿基、在聚合物科學(xué)與工程簡(jiǎn)明百科全書(shū)(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering),第 858-859 頁(yè)， Kroschwitz (克洛舍維奇)，J.1.編著，約翰威利出版公司(John Wiley&Sons)，1990年中披露的那些堿基、在Englisch等人,應(yīng)用化學(xué)(Angewandte Chemie),國(guó)際版，1991, 30,613 中披露的那些堿基、以及在Sanghvi (賽格維)，Y. S.，第15章,反義研究與應(yīng)用(Antisense Research and Applications),第 289-302 頁(yè)，Crooke (克魯克)，S.T.和 Lebleu (拉布列)，B.編著，CRC出版社，1993中披露的那些堿基。這類(lèi)堿基尤其適用于增加本發(fā)明的低聚化合物的結(jié)合親和力。這些堿基包括5-取代嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6以及0-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已顯示5-甲基胞嘧啶取代可將核酸雙鏈穩(wěn)定性增加0. 6-1. 2。C [Sanghvi YS (賽格維)等人(1993)反義研究與應(yīng)用(Antisense Research and Applications), CRC 出版社，波卡拉頓(Boca Raton) 276-278]并且是目前優(yōu)選的堿基取代，在與2’-O-甲氧基乙基糖修飾相結(jié)合時(shí)甚至更特別如此。
本發(fā)明的寡核 苷酸的另一種修飾涉及將增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞吸收的一種或多種部分或偶聯(lián)物化學(xué)連接至該寡核苷酸。
這類(lèi)部分包括但不局限于脂質(zhì)部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醚)、巰基膽固醇、脂肪鏈(例如十二烷二醇或i^一基殘基)、磷脂(例如二 -十六基-rac-甘油或1，2- 二 -O-十六基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙基銨)、多胺或聚乙二醇鏈，或金剛烷乙酸、棕櫚基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇部分，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，303，374中所披露。
不需要給定寡核苷酸分子中的所有位置被均勻地修飾，并且事實(shí)上多于一種的上述修飾可并入單一化合物中或甚至一個(gè)寡核苷酸內(nèi)的單一核苷處。
肽
術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”及“蛋白”在此可互換使用以指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)天然發(fā)生氨基酸的類(lèi)似物或模擬物的氨基酸聚合物，以及天然發(fā)生的氨基酸聚合物。多肽可例如通過(guò)添加碳水化合物殘基以便形成糖蛋白來(lái)修飾。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”以及“蛋白”包括糖蛋白，連同非糖蛋白。
多肽產(chǎn)物可例如通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)固相技術(shù)來(lái)生化合成。這類(lèi)方法包括排阻固相合成、部分固相合成方法、片段縮合、經(jīng)典溶液合成。這些方法優(yōu)選地當(dāng)肽相對(duì)較短(即， IOkDa)和/或當(dāng)它不能通過(guò)重組技術(shù)來(lái)產(chǎn)生(B卩，未由核酸序列來(lái)編碼)并且因此涉及不同化學(xué)時(shí)使用。
固相多肽合成程序在本領(lǐng)域中是熟知的，并且進(jìn)一步由John Morrow Stewart (約翰莫羅斯圖爾特)以及Janis Dillaha Young(詹尼斯迪拉哈楊)，固相肽合成(Solid Phase Peptide Syntheses)(第 2 版,Pierce Chemical Company 公司，1984)描述。
合成多肽可通過(guò)制備型高效液相色譜來(lái)純化[Creighton (克雷頓)Τ· (1983年) 蛋白、結(jié)構(gòu)以及分子原則(Proteins, structures and molecular principles)WH Freeman (弗里曼)和Co. N. Y.]并且其組成可經(jīng)由氨基酸測(cè)序來(lái)確認(rèn)。
如果希望有大量多肽，它可使用例如以下文獻(xiàn)描述的重組技術(shù)來(lái)產(chǎn)生Bitter (比特爾)等人，(1987)酶學(xué)方法(Methods in Enzymo1. ) 153:516-544, Studier (斯圖迪爾) 等人(1990 年)酶學(xué)方法(Methods inEnzymol. ) 185:60-89,Brisson (布里松)等人(1984 年)自然(Nature) 310:511-514，Takamatsu (高松)等人(1987 年)EMBO J. 6:307-311, Coruzzi (科魯茲)等人(1984 年)EMBO J. 3:1671-1680 以及 fcogli (布羅意)等人，(1984 年)科學(xué)(Science) 224:838-843，Gurley (葛爾萊)等人(1986年)分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào) (Mol. Cell. Biol. ) 6:559-565 以及 Weissbach (懷斯巴赫)&Weissbach, 1988,植物分子生物學(xué)方法(Methods for Plant Molecular Biology),學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),紐約(NY),第VIII部分，第421-463頁(yè)。
將理解，根據(jù)本發(fā)明的傳授內(nèi)容鑒定的肽可以是降解產(chǎn)物、合成肽或重組肽以及擬肽物，通常是作為肽類(lèi)似物的合成肽以及類(lèi)肽以及半類(lèi)肽，它們可具有例如使得肽在處于體內(nèi)時(shí)更穩(wěn)定或更能夠滲透至細(xì)胞中的修飾。這類(lèi)修飾包括但不局限于N末端修飾、C 末端修飾、肽鍵修飾(包括但不局限于CH2-NH、CH2-S、CH2_S=0、O=C-NH, CH2-0、CH2-CH2、 S=C-NH、CH=CH或CF=CH)、 骨架修飾以及殘基修飾。用于制備擬肽物化合物的方法在本領(lǐng)域中是熟知的，并且在例如定量藥物設(shè)計(jì)(Quantitative Drug Design), C. A. Ramsden (拉姆斯登)Gd·,第17. 2章，F(xiàn). Choplin Pergamon Press出版社(1992)中加以規(guī)定,該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合在此，如同完全在此闡明一樣。此方面的進(jìn)一步細(xì)節(jié)提供于下文。
肽內(nèi)的肽鍵(-C0-NH-)可例如被以下鍵取代N-甲基化鍵(_N(CH3)-C0-)、酯鍵 (-C (R) H-C-0-0-C (R) -N-)、酮亞甲基鍵(-C0-CH2-)、α -氮雜鍵(-NH-N (R) -CO-)(其中 R 是任何烷基例如甲基)、carba鍵(-CH2-NH-)、羥基亞乙基鍵(-CH (OH) -CH2-)、硫代酰胺鍵(-CS-NH-)、烯系雙鍵(-CH=CH-)、逆向酰胺鍵(-NH-CO-)、肽衍生物(-N (R) -CH2-C0-)，其中 R是天然地呈現(xiàn)于碳原子上的“正?！眰?cè)鏈。
這些修飾可 沿著肽鏈在任何鍵處出現(xiàn)并且甚至同時(shí)在若干(2-3)個(gè)鍵處出現(xiàn)。
天然芳香族氨基酸Trp、Tyr以及Phe可由合成非天然酸來(lái)取代，所述合成非天然酸例如苯甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的環(huán)甲基化衍生物、Phe的鹵化衍生物或o_甲基-Tyr0
除了上述以外，本發(fā)明的肽還可包含一種或多種修飾氨基酸或一種或多種非氨基酸單體(例如脂肪酸，復(fù)合碳水化合物等)。
如在此說(shuō)明書(shū)以及以下權(quán)利要求部分中使用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸(amino acid)”或“氨基酸(amino acids)”應(yīng)理解為包括20種天然發(fā)生的氨基酸；經(jīng)常在體內(nèi)翻譯后修飾的那些氨基酸，包括例如羥基脯氨酸、磷酸絲氨酸以及磷酸蘇氨酸；以及其他獨(dú)特氨基酸，包括但不局限于2-氨基己二酸、羥基賴氨酸、異鎖鏈賴氨素、正纈氨酸、正亮氨酸以及鳥(niǎo)氨酸。 此外，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括D-以及L-氨基酸。
由于本發(fā)明的肽優(yōu)選地用于要求肽呈可溶性形式的治療劑中，本發(fā)明的肽優(yōu)選地包含一種或多種非天然或天然極性氨基酸，這些氨基酸包括但不局限于歸因于其含羥基的側(cè)鏈而能夠增加肽溶解性的絲氨酸和蘇氨酸。
如果希望大量本發(fā)明的肽，本發(fā)明的肽可使用例如以下文獻(xiàn)描述的重組技術(shù)來(lái)產(chǎn)生Bitter (比特爾)等人,(1987 年)酶學(xué)方法(Methods in Enzymo1. ) 153:516-544， Studier (斯圖迪爾)等人(1990 年)酶學(xué)方法(Methods in Enzymo1. )185:60-89,Brisson (布里松)等人(1984)自然(Nature) 310:511-514, Takamatsu (高松)等人(1987 年) EMBO J. 6:307-311,Coruzzi 等人(1984 年)EMBO J. 3:1671-1680 以及 Brogli (布羅意)等人，(1984年)科學(xué)(Science) 224:838-843，Gurley (葛爾萊)等人(1986年)分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)(Mol. Cell. Biol. ) 6:559-565 以及 Weissbach(懷斯巴赫)&Weissbach, 1988 年， 植物分子生物學(xué)方法(Methods for Plant Molecular Biology),學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),紐約(NY),第 VIII 部分，第 421-463 頁(yè)。
表達(dá)系統(tǒng)
為了使得本發(fā)明的多核 苷酸能夠進(jìn)行細(xì)胞表達(dá)，可使用根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，它包括以上核酸序列之一的至少一個(gè)編碼區(qū)，并且進(jìn)一步包括至少一種順式作用調(diào)控元件。如在此使用，短語(yǔ)“順式作用調(diào)控元件”是指結(jié)合反式作用調(diào)控子并且調(diào)控位于其下游的編碼序列的轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列，優(yōu)選為啟動(dòng)子。
任何適合的啟動(dòng)子序列可由本發(fā)明的核酸構(gòu)建體來(lái)使用。
優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體使用的啟動(dòng)子在所轉(zhuǎn)化的具體細(xì)胞群中是活性的。 細(xì)胞類(lèi)型特異性和/或組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括具有肝特異性的啟動(dòng)子，例如白蛋白 [Pinkert (平克特)等人，(1987年)基因和發(fā)育(Genes Dev. )1:268-277]、淋巴特異性啟動(dòng)子[Calame (卡拉姆)等人，(1988年)免疫學(xué)進(jìn)展(Adv.1mmunol. ) 43:235-275];尤其 T-細(xì)胞受體[Winoto(溫諾托)等人，(1989年)EMBO J. 8:729-733]和免疫球蛋白的啟動(dòng)子； [Banerji (巴納基)等人(1983年)細(xì)胞(Cell) 33729-740]、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子，例如神經(jīng)微絲啟動(dòng)子[Byrne(伯恩)等人(1989年)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sc1.) USA86:5473-5477]、胰腺特異性啟動(dòng)子[Edlunch(艾德倫齊)等人(1985)科學(xué)(Science)230:912-916]或乳腺特異性啟動(dòng)子，例如乳清啟動(dòng)子(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，873，316以及歐洲申請(qǐng)公布號(hào)264，166)。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可進(jìn)一步包括增強(qiáng)子，該增強(qiáng)子可相鄰于或遠(yuǎn)離啟動(dòng)子序列并且可起作用以便上調(diào)由其進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明的核酸構(gòu)建體優(yōu)選地進(jìn)一步包括一個(gè)適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記和/或復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選地，所使用的核酸構(gòu)建體是穿梭載體，它可在大腸桿菌中繁殖(其中該構(gòu)建體包含適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn))并且適合于在細(xì)胞中繁殖、或整合于所選擇的基因和組織之中。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體可以是例如質(zhì)粒、桿粒、噬菌粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。
適合的構(gòu)建體的實(shí)例包括但不局限于pcDNA3、pcDNA3.1 (+/-)、pGL3、 PzeoSV2 (+/_) > pDisplay> pEF/myc/cyto> pCMV/myc/cyto,它們各自可購(gòu)自英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen Co. ) (www.1nvitrogen.com)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及包裝系統(tǒng)的實(shí)例是由加利福尼亞州圣迭戈Clontech公司(Clontech, San Diego (圣迭戈)，Calif.(加利福尼亞州))出售的那些，包括Retro-X載體pLNCX以及pLXSN，這些載體允許克隆至多個(gè)克隆位點(diǎn)中并且該轉(zhuǎn)基因從CMV啟動(dòng)子來(lái)轉(zhuǎn)錄。還包括來(lái)源于Mo-MuLV的載體，例如pBabe，其中該轉(zhuǎn)基因?qū)?’ LTR啟動(dòng)子來(lái)轉(zhuǎn)錄。
目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒或非病毒構(gòu)建體來(lái)轉(zhuǎn)染，所述構(gòu)建體例如腺病毒、慢病毒、單純性皰疹I(lǐng)病毒，或腺伴隨病毒(AAV)以及基于脂質(zhì)的系統(tǒng)。用于基因的脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的有用脂質(zhì)是例如D0TMA、D0PE以及DC-Choi [Tonkinson (托金森)等人，癌癥研究(Cancer Investigation)，14 (I) : 54-65 (1996)]。用于基因療法中的最優(yōu)選構(gòu)建體是病毒，最優(yōu)選為腺病毒、AAV、慢病毒、或逆轉(zhuǎn)錄病毒。例如逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的病毒構(gòu)建體包含至少一種轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或基因座界定元件，或通過(guò)例如選擇性剪接、 核RNA輸出或信使的翻譯后修飾的其他手段來(lái)控制基因表達(dá)的其他元件。這類(lèi)載體構(gòu)建體還包括一個(gè)包裝信號(hào)、多個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)或其部分，以及適合于所用病毒的正和負(fù)鏈引物結(jié)合位點(diǎn)，除非它已經(jīng)存在于病毒構(gòu)建體中。此外，這種構(gòu)建體典型地包括用于使肽從它所安放的宿主細(xì)胞中分泌的一個(gè)信號(hào)序列。優(yōu)選地，用于這一目的的信號(hào)序列是哺乳動(dòng)物信號(hào)序列或本發(fā)明的多肽的信號(hào)序列。任選地，該構(gòu)建體還可包括引導(dǎo)多聚腺苷酸化的一個(gè)信號(hào)，以及一個(gè)或多個(gè)限制位點(diǎn)和一個(gè)翻譯終止序列。例如，這類(lèi)構(gòu)建體通常包括一個(gè)5’LTR、tRNA結(jié)合位點(diǎn)、包裝信號(hào)、第二鏈DNA合成的起點(diǎn)，以及3' LTR或其一部分?？墒褂梅遣《拘缘钠渌d體，例如陽(yáng)離子脂質(zhì)、聚賴氨酸，以及樹(shù)枝狀化合物。
重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及含有編碼本發(fā)明的蛋白、或其衍生物、片段、類(lèi)似物或同源物的核酸的載體，優(yōu)選地是表達(dá)載體。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠運(yùn)輸它所連接的另一種核酸的核酸分子。一種類(lèi)型的載體是“質(zhì)粒"，是指另外DNA片段可連接至其中的一個(gè)圓形雙鏈DNA環(huán)。另一種類(lèi)型的載體是病毒載體，其中另外DNA片段可連接至病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入至其中的宿主細(xì)胞中 自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體以及附加型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)在引入至宿主細(xì)胞中時(shí)被整合進(jìn)該宿主細(xì)胞的基因組中，并且由此與宿主基因組一起復(fù)制。此外， 某些載體能夠引導(dǎo)它們可操作連接的基因的表達(dá)。這類(lèi)載體在此稱為“表達(dá)載體”。一般而言，可用于重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體經(jīng)常呈質(zhì)粒形式。在本說(shuō)明書(shū)中，“質(zhì)粒”和“載體” 可互換地使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最通常使用形式。然而，本發(fā)明旨在包括充當(dāng)同等功能的這類(lèi)其他形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒以及腺伴隨病毒)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包括呈適合于在宿主細(xì)胞中表達(dá)核酸的形式的本發(fā)明的核酸，這意味著這些重組表達(dá)載體包括基于待用于表達(dá)的宿主細(xì)胞來(lái)選擇的一種或多種調(diào)控序列，這些調(diào)控序列可操作地連接至待表達(dá)的核酸序列。在重組表達(dá)載體中，“可操作地連接”旨在表示所感興趣的核苷酸序列以允許表達(dá)該核苷酸序列的方式連接至調(diào)控序列 (例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或在載體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)在該宿主細(xì)胞中)。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及其他表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸化信號(hào))。這類(lèi)調(diào)控序列描述于例如Goeddel (戈德?tīng)?，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology) 185,學(xué)術(shù)出版社(Academic Press), 圣迭戈(San Diego),加利福尼亞州(Calif. ) (1990年)中。調(diào)控序列包括引導(dǎo)一個(gè)核苷酸序列在許多類(lèi)型的宿主細(xì)胞中的組成性表達(dá)的那些序列以及引導(dǎo)該核苷酸序列只在某些宿主細(xì)胞中表達(dá)的那些序列(例如，組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所希望的蛋白表達(dá)水平等的因素。本發(fā)明的表達(dá)載體可引入宿主細(xì)胞中，從而產(chǎn)生由在此描述的核酸編碼的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可被設(shè)計(jì)成在原核或真核細(xì)胞中產(chǎn)生變體蛋白。例如，本發(fā)明的蛋白可表達(dá)于例如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。適合的宿主細(xì)胞進(jìn)一步討論于Goeddel (戈德?tīng)?，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology) 185,學(xué)術(shù)出版社 (Academic Press),圣迭戈(San Diego),加利福尼亞州(Calif. ) (1990年)中。可替代地，重組表達(dá)載體可在體外例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)控序列以及T7聚合酶來(lái)轉(zhuǎn)錄和翻譯。
蛋白在原核生物中的表達(dá)最經(jīng)常在大腸桿菌中用含有引導(dǎo)融合或非融合蛋白的表達(dá)的組成性或可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的載體來(lái)進(jìn)行。融合載體將許多氨基酸添加至其中所編碼的蛋白，添加至重組蛋白的氨基或C末端。這類(lèi)融合載體通常用于三個(gè)目的(i)增加重組蛋白的表達(dá)；(ii)增加重組蛋白的溶解性；以及(iii)通過(guò)在親和力純化中充當(dāng)配體來(lái)幫助純化重組蛋白。經(jīng)常，在融合表達(dá)載體中，將蛋白裂解位點(diǎn)引入至融合部分與重組蛋白的接合處以使得能夠在純化融合蛋白之后將重組蛋白與融合部分分離。這 類(lèi)酶、以及其同源識(shí)別序列包括因子X(jué)a、凝血酶、PreScission、TEV以及腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括 pGEX(Pharmacia Biotech Inc;史密斯和約翰遜(Smith and Johnson), 1988.基因(Gene) 67:31-40)、pMAL (紐英倫生物技術(shù)公司(New England Biolabs),貝弗利(Beverly)，馬薩諸塞州(Mass·))以及pRIT5 (Pharmacia公司，皮斯卡塔韋(Piscataway)，新澤西州 (N. J.))，它們分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A融合至目標(biāo)重組蛋白。
適合的可誘導(dǎo)性非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc (Amrann (阿姆蘭)等人，(1988年)基因(Gene)69:301-315)以及pETlld (Studier (斯圖迪爾)等人，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)185,學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),圣迭戈(San Diego),力口利福尼亞州(Calif. ) (1990 年)60-89)-不精確地，pETlla-d具有N末端T7標(biāo)簽。
將大腸桿菌中的重組蛋白表達(dá)最大化的一種策略是在蛋白裂解重組蛋白的能力被削弱的細(xì)菌宿主中表達(dá)該蛋白。參見(jiàn)例如Gottesman (高特斯曼)，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology) 185,學(xué)術(shù)出版社(Academic Press),圣迭戈(San Diego),加利福尼亞州(Calif. ) (1990) 119-128。另一種策略是改變待插入表達(dá)載體中的核酸的核酸序列以使得每個(gè)氨基酸的單獨(dú)密碼子是在大腸桿菌使用的那些優(yōu)選密碼子(參見(jiàn)例如Wada (和田)等人，1992.核酸研究(Nucl. Acids Res.) 20:2111-2118)。本發(fā)明的核酸序列的這種改變可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)來(lái)進(jìn)行。解決密碼子偏愛(ài)的另一種策略是使用BL21-密碼子加上細(xì)菌菌株(英杰生命技術(shù)有限公司 (Invitrogen))或Rosetta菌株(諾華公司(Novagen)),這些菌株含有罕見(jiàn)大腸桿菌tRNA基因的額外副本。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的蛋白的表達(dá)載體是一種酵母表達(dá)載體。用于在酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)的載體的實(shí)例包括pYepSecl (Baldari (班得瑞)等人，1987. EMBO J. 6:229_234)、pMFa (Kurjan (庫(kù)爾揚(yáng))和 Herskowitz (赫斯克維茨)，1982.細(xì)胞(Cell)30:933-943)、pJRY88 (Schultz (舒爾茨)等人，1987.基因(Gene) 54:113_123)、pYES2 (英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen Corporation),圣迭戈(San Diego),加利福尼亞州(Calif.))以及picZ (英杰生命技術(shù)有限公司，圣迭戈,加利福尼亞州)。
可替代地，本發(fā)明的多肽可在昆蟲(chóng)細(xì)胞中使用桿狀病毒表達(dá)載體來(lái)產(chǎn)生?？捎糜诘鞍自谒囵B(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如SF9細(xì)胞)中表達(dá)的桿狀病毒載體包括pAc系列(史密斯(Smith)等人，1983.分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol. Cell. Biol. ) 3:2156-2165)以及 pVL 系列 (Lucklow (路克勞)和 Summers (薩默斯)，1989.病毒學(xué)(Virology) 170:31-39)。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體來(lái)表達(dá)。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括PCDM8 (Seed (希德)，1987.自然(Nature) 329:840) 以及 pMT2PC (Kaufman 等人，1987. EMBO J. 6:187-195),pIRESpuro (Clontech)、pUB6 (英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen))、pCEP4 (英杰生命技術(shù)有限公司)、pREP4 (英杰生命技術(shù)有限公司)、pcDNA3 (英杰生命技術(shù)有限公司)。當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中時(shí)，表達(dá)載體的控制功能經(jīng)常由病毒調(diào)控元件來(lái)提供。例如，通常使用的啟動(dòng)子來(lái)源于多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒、勞斯肉瘤病毒以及猿病毒40。關(guān)于用于原核和真核細(xì)胞的其他適合的表達(dá)系統(tǒng)，參見(jiàn)例如薩姆布魯克(Sambrook)等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.)第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約州 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ) , 19 89 的第 16 和 17 章。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，重 組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠引導(dǎo)核酸優(yōu)先在特定細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)(例如，使用組織特異性調(diào)控元件來(lái)表達(dá)核酸)。組織特異性調(diào)控元件是本領(lǐng)域中已知的。適合的組織特異性啟動(dòng)子的非限制實(shí)例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝特異性；Pinkert (平克特)等人，1987基因和發(fā)育(Genes Dev. ) 268-277)、淋巴特異性啟動(dòng)子(Calame (卡拉姆)和Eaton (伊頓)，1988免疫學(xué)進(jìn)展(Adv.1mmunol. ) 43:235-275)、尤其T細(xì)胞受體 (Winoto (溫諾托)和Baltimore (巴爾的摩)，1989EMB0 J. 8:729-733)和免疫球蛋白的啟動(dòng)子(Banerji 等人 1983 細(xì)胞(Cell)33:729-740 ;Queen(昆)和 Baltimore(巴爾的摩)，1983.細(xì)胞(Cell) 33:741-748)、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(例如神經(jīng)微絲啟動(dòng)子；Byrne (伯恩)和 Ruddle (拉德?tīng)?1989 美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sc1. )USA86:5473-5477)、胰腺特異性啟動(dòng)子(Edlunch ((艾德倫齊)等人1985科學(xué)(Science)230:912-916)或乳腺特異性啟動(dòng)子(例如乳清啟動(dòng)子；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，873，316以及歐洲申請(qǐng)公布號(hào)264，166)。還涵蓋發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子，例如鼠hox啟動(dòng)子(Kessel (凱塞爾)和Gruss (格魯斯)，1990年.科學(xué)(Science) 249:374-379)以及α -胎蛋白啟動(dòng)子(Campes (康拍斯)和Tilghman (蒂爾曼)，1989年·基因和發(fā)育3:537-546) ·
本發(fā)明在至少一些實(shí)施方案中進(jìn)一步提供一種重組表達(dá)載體，它包括以反義取向克隆至該表達(dá)載體中的本發(fā)明的DNA分子。也就是說(shuō)，該DNA分子以允許表達(dá)(通過(guò)DNA分子的轉(zhuǎn)錄)與編碼本發(fā)明的蛋白的mRNA呈反義的RNA分子的方式可操作地連接至調(diào)控序列?？刹僮鞯剡B接至以反義取向克隆的核酸的調(diào)控序列可被選擇成引導(dǎo)反義RNA分子在各種細(xì)胞類(lèi)型中的連續(xù)表達(dá)，例如病毒啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，或調(diào)控序列可被選擇成引導(dǎo)反義RNA的組成性、組織特異性或細(xì)胞類(lèi)型特異性表達(dá)。反義表達(dá)載體可呈重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒形式，其中反義核酸在一個(gè)高效率調(diào)控區(qū)的控制下產(chǎn)生，該高效率調(diào)控區(qū)的活性可由將載體引入其中的細(xì)胞類(lèi)型來(lái)確定。關(guān)于使用反義基因來(lái)調(diào)控基因表達(dá)的討論， 參見(jiàn)例如Weintraub (溫特勞布)等人,“作為基因分析的分子工具的反義RNA (Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis)”遺傳學(xué)趨勢(shì)評(píng)論(Reviews-Trends in Genetics),第 I (I)卷 1986 年。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及本發(fā)明的重組表達(dá)載體已引入其中的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ) “宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在此可互換地使用。應(yīng)理解這類(lèi)術(shù)語(yǔ)不僅涉及具體對(duì)象細(xì)胞，而且涉及這種細(xì)胞的子代或潛在子代。因?yàn)槟承┳兓稍诤蟠杏捎谕蛔兓颦h(huán)境影響而發(fā)生，這種子代可能在事實(shí)上與親代細(xì)胞不同，但是仍然包括在如在此使用的術(shù)語(yǔ)范圍內(nèi)。
宿主細(xì)胞可為任何原核或真核細(xì)胞。例如，本發(fā)明的蛋白可在例如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母、植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS或293 細(xì)胞)中產(chǎn)生。其他適合的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
載體DNA可經(jīng)由常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)而引入原核或真核細(xì)胞中。如在此使用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”用來(lái)指用于將外來(lái)核酸(例如，DNA)引入宿主細(xì)胞中的各種本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法可發(fā)現(xiàn)于薩姆布魯克(Sambrook)等人(分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè) (Molecular Cloning:A Laboratory Manual.)第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約州(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ) , 1989)以及其他實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中。
為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，已知取決于所使用的表達(dá)載體以及轉(zhuǎn)染技術(shù)， 只有小部分的細(xì)胞可將外來(lái)DNA并入其基因組中。為了鑒定并且選擇這些構(gòu)成組分 (integrant)，通常將編碼選擇標(biāo)記(例如，抗生素抗性)的基因與所感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞中。各種選擇標(biāo)記包括賦予對(duì)于例如G418、潮霉素、嘌呤霉素、殺稻瘟菌素以及甲氨喋呤的藥物的抗性的那些標(biāo)記。編碼選擇標(biāo)記的核酸可在與編碼本發(fā)明蛋白的核酸相同的載體上被引入至宿主細(xì)胞中 或可引入獨(dú)立載體中。用所引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可通過(guò)藥物選擇來(lái)鑒定(例如，并入有選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其他細(xì)胞將死亡)。
培養(yǎng)中的本發(fā)明的宿主細(xì)胞，例如原核或真核宿主細(xì)胞,可用于產(chǎn)生(即,表達(dá))本發(fā)明的蛋白。因此，本發(fā)明在至少一些實(shí)施方案中進(jìn)一步提供使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(編碼本發(fā)明的蛋白的重組表達(dá)載體已引入其中)以使得產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括將本發(fā)明的蛋白從該培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離。
為了有效產(chǎn)生蛋白，最好將編碼本發(fā)明的蛋白的核苷酸序列置于針對(duì)在所希望宿主中的表達(dá)予以優(yōu)化的表達(dá)控制序列的控制之下。例如，這些序列可包括優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄和/ 或翻譯調(diào)控序列(例如改變的Kozak序列)。
應(yīng)注意，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，如在此描述的C10RF32多肽可任選地分離為天然發(fā)生的多肽，或從不論天然、合成、半合成或重組的任何來(lái)源而分離。因此， C10RF32蛋白可以從任何物種，特別是哺乳動(dòng)物，包括牛、羊、豬、鼠、馬，并且優(yōu)選是人類(lèi)，被分離為天然發(fā)生的蛋白。可替代地，C10RF32蛋白可以被分離為在原核生物或真核生物宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組多肽，或分離為化學(xué)合成的多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地使用標(biāo)準(zhǔn)分離方法來(lái)獲得分離的C10RF32蛋白。分離的性質(zhì)和程度取決于所分離分子的來(lái)源以及期望的用途。
基因療法
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案，編碼在此描述的可溶性C10RF32多肽的核酸序列可用于治療在此描述的任何免疫相關(guān)病癥的基因療法中。
如在此使用，“基因療法”是通過(guò)基因操縱以使得一個(gè)核酸序列轉(zhuǎn)移至一個(gè)細(xì)胞中，該細(xì)胞然后表達(dá)由該核酸編碼的任何基因產(chǎn)物來(lái)治療疾病的過(guò)程。例如，如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，核酸轉(zhuǎn)移可通過(guò)經(jīng)由各種方法離體或在體外將含有所感興趣的核酸的表達(dá)載體插入細(xì)胞中來(lái)進(jìn)行，這些各種方法包括例如磷酸鈣沉淀、二乙氨基乙基葡聚糖、聚乙二醇 (PEG)、電穿孔、直接注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或病毒感染(薩拉布魯克(Sambrook)等人，分子克隆 實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 1989年)；Kriegler (克里格勒)M.基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Gene Transfer ad Expression:A Laboratory Manual) (ff. H.弗里曼公司，紐約市，紐約州(W. H. Freeman and Co, New York, N. Y. )，1993)以及 Wu (吳)，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)(學(xué)術(shù)出版社，紐約市(Academic Press, New York), 1993)?？商娲?，所感興趣的核酸序列可在體內(nèi)在各種載體中以及通過(guò)各種方法轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中，這些各種方法包括例如將核酸直接給予至受試者體內(nèi)，或?qū)⒑怂岵迦氩《据d體中并用該病毒感染受試者。用于體內(nèi)轉(zhuǎn)移的其他方法包括將核酸封裝至脂質(zhì)體中，以及將脂質(zhì)體、或與紅血球凝集性仙臺(tái)病毒(Sendai virus)組合的脂質(zhì)體直接轉(zhuǎn)移至受試者。轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞表達(dá)由核酸編碼的蛋白產(chǎn)物以便改進(jìn)疾病或疾病癥狀。
蛋白化學(xué)修飾
在本發(fā)明中，本發(fā)明的蛋白的任何部分可任選地化學(xué)修飾，即通過(guò)添加官能團(tuán)來(lái)改變。例如，出現(xiàn)在原生序列中的側(cè)氨基酸殘基可任選地修飾，但是替代地如下所述，除了側(cè)氨基酸殘基以外或代替?zhèn)劝被釟埢鞍椎钠渌糠挚扇芜x地修飾。如果遵循一個(gè)化學(xué)合成過(guò)程，可任選地在分子合成期間進(jìn)行修飾，例如通過(guò)添加化學(xué)修飾的氨基酸。然而，已經(jīng)存在于分子中的氨基酸的化學(xué)修飾(“原位”修飾)也是可能的。
該分子的任何序列區(qū)的氨基酸可任選地根據(jù)以下示例性類(lèi)型的修飾中的任何一種(在概念地被視為“化學(xué)修飾”的肽中)來(lái)修飾。非限制性示例性類(lèi)型的修飾包括羧甲基化、酰化、磷酸化、糖基化或脂肪酰化。醚鍵可任選地用于將絲氨酸或蘇氨酸羥基連接至糖的羥基。酰胺鍵可任選地用于將谷氨酸或天冬氨酸羧基連接至糖上的氨基(Garg (蓋爾格)和Jeanloz (揚(yáng)洛茲)，碳水化合物化學(xué)與生物化學(xué)進(jìn)展(Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry),第 43 卷，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press) (1985) ；Kunz(JL 茲)，應(yīng)用化學(xué)(Ang. Chem.)國(guó)際版英語(yǔ)26:294-308(1987年))?？s醛和縮酮鍵也可任選地形成于氨基酸與碳水化合物之間。可任選地例如通過(guò)游離氨基(例如賴氨酸)的?；瘉?lái)制成脂肪酸?；苌?Toth(托斯)等人，肽化學(xué)、結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)(Peptides:Chemistry, Structure and Biology), Rivier (里維爾)和 Marshal (馬歇爾)，編著，ESCOM Publ.,萊頓(Leiden)，1078-1079(1990 年))。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“化學(xué)修飾”，在關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的蛋白或肽時(shí)是指其中它的氨基酸殘基中的至少一個(gè)殘基通過(guò)天然過(guò)程，例如加工或其他翻譯后修飾，亦或通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的化學(xué)修飾技術(shù)來(lái)修飾的蛋白或肽。許多已知修飾的實(shí)例通常包括但不局限于乙?；?、?；?、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI錨定物形成、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、甲基化、十四烷基化、聚乙二醇化、異戊烯化、磷酸化、泛素化，或任何類(lèi)似過(guò)程。
其他類(lèi)型的修飾任選地包括添加環(huán)烷烴部分至生物分子，例如像在PCT申請(qǐng)?zhí)?W02006/050262中描述的蛋白，該申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合在此，如同完全在此闡明一樣。這些部分被設(shè)計(jì)成與生物分子一起使用并且可任選地用于向蛋白賦予不同特性。
此外，任選地在蛋白上的任何點(diǎn)可被修飾。例如，蛋白上的糖基化部分的聚乙二醇化可任選地進(jìn)行，如PCT申請(qǐng)?zhí)朩02006/050247中所描述，該申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合在此，如同完全在此闡明一樣。一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇(PEG)基團(tuán)可任選地添加至O-連接和/或N-連接的糖基化。PEG基團(tuán)可任選地為分支的或直鏈的。任選地，任何類(lèi)型的水溶性聚合物可經(jīng)由糖基連接物連接至蛋白上的糖基化位點(diǎn)。
改變的糖基化蛋白修飾
本發(fā)明的蛋白可被修飾以便具有改變的糖基化型式(B卩，從原始或原生糖基化型式改變)。如在此使用，“改變”是指具有一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分缺失，和/或具有至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)添加至原始蛋白。
蛋白的糖基化通常是N-連接亦或O-連接的。N-連接是指碳水化合物部分附接至天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。其中X為除脯氨酸以外的任何氨基酸的三肽序列，天冬酰胺-X-絲氨酸以及天冬酰胺-X-蘇氨酸，是將碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。 因此，在多肽中的這些三肽序列中的任何一個(gè)的存在產(chǎn)生潛在糖基化位點(diǎn)。O-連接糖基化是指將糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一個(gè)附接至羥基氨基酸，最通常為絲氨酸或蘇氨酸，但是也可使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
添加糖基化位點(diǎn)至本發(fā)明的蛋白便利地通過(guò)改變蛋白的氨基酸序列以使得它含有一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列來(lái)完成(對(duì)于N-連接糖基化位點(diǎn))。改變也可通過(guò)原始蛋白的序列中的一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基的添加或取代來(lái)造成(對(duì)于O-連接糖基化位點(diǎn))。 蛋白的氨基酸序列也可通過(guò)引入DNA水平上的變化來(lái)改變。
增加蛋白上的碳水化合物部分的數(shù)量的另一種手段是通過(guò)將糖苷以化學(xué)或酶法偶聯(lián)至蛋白的氨基酸殘基。取決于所使用的偶聯(lián)模式，糖可連接至(a)精氨酸和組氨酸， (b)游離羧基，(c)游離巰基，例如半胱氨酸的那些，(d)游離羥基，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥基脯氨酸的那些，(e)芳香族殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。這些方法描述于W087/05330以及Aplin (艾波林)和Wriston (里斯頓)，CRC生物化學(xué)關(guān)鍵評(píng)論(CRC Crit. Rev. Biochem. )，22:259-306(1981 年)中。
去除存在于本發(fā)明的蛋白上的任何碳水化合物部分可以化學(xué)、酶法或通過(guò)引入 DNA水平上的變化來(lái)完成。化學(xué)去糖基化要求將蛋白暴露于三氟甲磺酸，或等效化合物。這種治療導(dǎo)致除連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)以外的大多數(shù)或所有糖裂解，留下氨基酸序列為完整的。
化學(xué)去糖基化由Hakimuddin (哈吉姆丁)等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)檔案 (Arch. Biochem. Biophys. ), 259 :52 (1987)；以及 Edge (艾什)等人，分析生物化學(xué)(Anal. Biochem. ),118:131 (1981年)描述。蛋白上的碳水化合物部分的酶促裂解可使用各種內(nèi)切和外切糖苷酶如Thotakura (索塔庫(kù)拉)等人，酶學(xué)方法(Meth. EnzymoL), 138:350(1987 年)中描述來(lái)實(shí)現(xiàn)?！?br> 治療方法
如在上文中提到，本發(fā)明的C10RF32蛋白和多肽、或其核酸序列或片段，尤其 C10RF32蛋白的胞外域或分泌形式，可以用于治療在此描述的任何免疫相關(guān)病癥。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)另外方面，提供了一種治療免疫相關(guān)病癥的方法。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“治療”是指預(yù)防、延緩發(fā)病、治愈、逆轉(zhuǎn)、減弱、減輕、最小化、抑制或阻止以上描述疾病、病癥或病狀的有害影響。它還包括管理如上所述的疾病。“管理” 是指降低疾病的嚴(yán)重度、降低疾病發(fā)作頻率、減少這類(lèi)發(fā)作的持續(xù)時(shí)間、降低這類(lèi)發(fā)作的嚴(yán)重度等。
根據(jù)本發(fā)明，治療可通過(guò)特異性地上調(diào)本發(fā)明的至少一種多肽在受試者體內(nèi)的量和/或表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
任選地，上調(diào)可通過(guò)向受試者給予在此描述的本發(fā)明的至少一種多肽(例如，重組或合成的)或其活性部分來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，因?yàn)檩^大多肽的生物利用率可能由于高降解率以及低滲透率而潛在地相對(duì)較小，多肽的給予優(yōu)選地被限制于小肽片段(例如，約100個(gè)氨基酸)。多肽或肽可以任選地作為藥用組合物的一部分來(lái)給予，以下更詳細(xì)描述。
將理解，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的以上描述疾病的治療可與在此描述的在本領(lǐng)域中已知的其他治療方法組合(即，組合療法)。
因此，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥劑來(lái)治療多發(fā)性硬化可與例如治療多發(fā)性硬化的任何已知治療劑或方法組合。治療多發(fā)性硬化的這種已知治療劑或方法的非限制實(shí)例包括干擾素類(lèi)、 IFN- β -1a ( REBIF 、 AV0NEX 以及 CiNNOVEX )以及 IFN- β -1b (BETASERON 、EXTAV1A 、BETAFERON ，ZIFER0N ); 乙酸格拉替雷(COPAXONE )，一種多肽；那他珠單抗(TYSABRI );以及米托蒽醌(NOVANTRONE )，一種細(xì)胞毒性劑，氨吡啶(AMPYRA )。其他藥物包括皮質(zhì)類(lèi)固醇、甲氨喋呤、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤，以及靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)、肌苷、奧瑞珠單抗(Ocrelizumab ;R1594)、米留斯(Mylinax ;Caldribine)、阿來(lái)組單抗(alemtuzumab ； Campath)、達(dá)利珠單抗(daclizumab ;Zenapax)、PanacIar/ 延胡索酸二甲酯(BG-12)、特立氟胺(Teriflunomide ;HMR1726)、芬戈莫德(fingolimod ;FTY720)、拉喹莫德(Iaquinimod ； ABR216062),以及造血干細(xì)胞移植、Neurovax、利妥昔單抗(Rituximab ;Rituxan)、BCG疫苗、低劑量納曲酮(naltrexone)、驅(qū)蟲(chóng)療法、血管成形術(shù)、靜脈支架，以及替代療法，例如維生素D、多不飽和脂肪、醫(yī)用大麻。
因此，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥劑來(lái)治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可與例如治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的任何已知治療劑或方法組合。治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的這類(lèi)已知治療劑或方法的非限制實(shí)例包括糖皮質(zhì)激素、非類(lèi)固醇抗炎癥藥物(NSAID)例如水楊酸酯，或環(huán)氧酶_2抑制劑、布洛芬(ibuprofen)和萘普生(naproxen)、雙氯芬酸 (diclofenac)、口引哚美辛(indomethacin)、依托度酸(etodolac)、疾病改進(jìn)抗風(fēng)濕藥物 (DMARD) —口服 DMARD :金諾芬(Auranof in ;Ridaura)、硫唑嘌呤(Azathioprine ；Imuran)> 環(huán)孢素(山地明(Sandimmune)、金格福(Gengraf )、內(nèi)奧拉爾(Neoral),通用名稱)、D-青霉胺(Cuprimine)、輕氯喹(Plaquenil )、IM金硫代蘋(píng)果酸金鈉(Myochrysine)、金硫葡糖 (Solganal)、來(lái)氟米特(Arava)、甲氨喋呤(Rheumatrex)、二甲胺四環(huán)素(Minocycline) (美滿霉素(Minocin))、金黃色葡萄球菌蛋白A免疫吸附(Prosorba管柱)、柳氮磺胺批P定 (Sulfasalazine, Azulfidine)ο 生物DMARD TNF- α 阻斷劑，包括阿達(dá)木單抗(Adalimumab ； Humira)、依那西普(Etanercept ;Enbrel )、英利昔單抗(Infliximab ;Remicade)、戈利木單抗(golimumab ;Simponi)、塞妥珠單抗(certolizumab pegol ；Cimzia),以及其他生物 DMARD,例如阿那白滯素(Anakinra ;Kineret)、利妥昔單抗(Rituximab ;Rituxan)、托珠單抗(Tocilizumab ；Actemr. a), CD28 抑制劑，包括阿巴西普(Abatacept ；Orencia)以及貝拉西普(Be Iatacept )。
因此，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥劑來(lái)治療IBD可以與例如治療 IBD的任何已知治療劑或方法組合。治療IBD的這類(lèi)已知治療劑或方法的非限制實(shí)例包括控制癥狀的免疫抑制，例如潑尼松(prednisone)、美沙拉嗪(Mesalazine ;包括安薩科 (Asacol )、頗得斯安(Pentasa)、Lialda> Aspiro)、硫唑嘌呤(Azathioprine, Imuran)、甲氨喋呤或6-巰基嘌呤、類(lèi)固醇、昂丹司瓊(Ondansetron)、TNF-α阻斷劑(包括英利昔單抗、阿達(dá)木單抗、戈利木單抗、塞妥珠單抗)、奧瑞希納(Orencia ;阿巴西普(abatacept))、 烏泰努單抗(ustekinumab ;Ste丨ai’a )、必克努單抗(Briakinumab ;ABT_874)、塞妥珠單抗(Certolizumab pegol, Cimzia )、ITF2357 (吉韋斯他(givinostat))、那他珠單抗 (Natalizumab ;Tysabri )、非拉司特(Firategrast ;SB_683699)、英利昔單抗(Remicade ； infliximab)、維多珠單抗(vedolizumab ；MLN0002)，其他藥物包括 GSK1605786CCX282-B (Traf icet-EN)、AJM300、Stelara (烏泰努單抗)、塞馬莫德(Semapimod ;CNI_1493)、他斯替米(tasocitinib ;CP_690550)、LMW 肝素 MMX、布地縮松(Budesonide) MMX、Simponi (戈 利木單抗)、MultiStem .、加衛(wèi)苗(Gardasil) HPV疫苗、愛(ài)巴蘇(Epaxal Berna ;病毒體甲型肝炎疫苗)，手術(shù)，例如腸切除、狹部成形術(shù)或臨時(shí)或持久結(jié)腸造口術(shù)或回腸造口術(shù)；抗真菌藥物，例如制霉菌素(一種廣譜消化道抗真菌劑)以及伊曲康唑(itraconazole ;斯皮仁諾 (Sporanox))或氟康唑(fluconazole ;大扶康(Diflucan));替代藥物、益生元以及益生菌、 大麻，驅(qū)蟲(chóng)療法或豬鞭蟲(chóng)卵子。
因此，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥劑來(lái)治療牛皮癬可以與例如治療牛皮癬的任何已知治療劑或方法組合。治療牛皮癬的這類(lèi)已知治療劑的非限制實(shí)例包括通常用于輕微疾病的外用劑、用于中度疾病的光線療法，以及用于嚴(yán)重疾病的全身劑。 外用劑的非限制實(shí)例沐浴溶液和保濕劑、礦物油以及凡士林油；含有以下物質(zhì)的藥膏和乳膏煤焦油、蒽三酹(蒽啉)、皮質(zhì)類(lèi)固醇如去輕米松(desoximetasone, Topicort)、倍他米松(Betamethasone)、氟輕松乙酸酯(fluocinonide)、維生素D3類(lèi)似物(例如卡泊三醇 (calcipotriol)),以及維甲酸。光線療法的非限制實(shí)例日光；311_313nm的波長(zhǎng)、補(bǔ)骨脂素以及紫外線A光線療法(PUVA)。全身劑的非限制實(shí)例生物制劑，例如白介素拮抗齊[J, TNF- α阻斷劑,包括抗體,例如英利昔單抗(Remicade)、阿達(dá)木單抗(Humira)、戈利木單抗、塞妥珠單抗，以及重組TNF誘餌受體、依那西普(Enbrel);靶向T細(xì)胞的藥物，例如伊法利單抗(efalizumab ;Xannelim/Raptiva)、阿法賽特(alefacept ;Ameviv)、樹(shù)突狀細(xì)胞諸如伊法利單抗；靶向細(xì)胞因子的單克隆抗體(MAb)，包括抗-1L-12/IL-23 (烏泰努單抗(商標(biāo)Stelara))以及抗-白介素_17 ;必克努單抗(ABT-874);小分子，包括但不局限于ISA247 ;免疫抑制劑，例如甲氨喋呤、環(huán)孢素；維生素A以及維甲酸(維生素A的合成形式)；以及替代療法，例如改變飲食和生活方式、禁食期、低能量飲食以及素食飲食、補(bǔ)充富含維生素A和維生素D的魚(yú)油(例如魚(yú)肝油)、富含兩種Ω-3脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸酸(DHA)的魚(yú)油并且含有維生素E的飲食、魚(yú)療(Ichthyotherapy)、催眠術(shù)療法、大麻。
因此，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥劑來(lái)治療I型糖尿病可以與例如治療I型糖尿病的任何已知治療劑或方法組合。治療I型糖尿病的這類(lèi)已知治療劑的非限制實(shí)例包括胰島素、胰島素類(lèi)似物、胰島移植、干細(xì)胞療法，包括PROCHYMAL ， 非胰島素療法，例如IL-1 β抑制劑，包括阿那白滯素(Kineret )、阿巴西普 (Orencia )、戴艾米(Diamyd)、阿法賽特(Ameviv )、奧西珠單抗(Otelixizumab)、 DiaP印277 (Hsp60衍生肽)、α1-抗胰蛋白酶、潑尼松、硫唑嘌呤、環(huán)孢素、El-1NT (包含表皮生長(zhǎng)因子類(lèi)似物和胃泌素類(lèi)似物的可注射胰島再生療法)，他汀類(lèi)藥物，包括 Z.ocoi· .、Si ml up . Simcard > Simvacor 西他列汀(Sitagliptin ; 二肽基肽酶 (DPP-4)抑制劑)、抗-⑶3mAb (例如替麗珠單抗(Teplizumab)) ;CTLA4_Ig (阿巴西普)、抗 IL-1 β (康納單抗(Canakinumab))、抗-⑶20mAb (例如,利妥昔單抗)。
因此，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥劑來(lái)治療葡萄膜炎可以與例如治療葡萄膜炎的任何已知治療劑或方法組合。治療葡萄膜炎的這類(lèi)已知治療劑的非限制實(shí)例包括皮質(zhì)類(lèi)固醇、外用睫狀肌麻痹劑，例如阿托品(atropine)或后馬托品(homatropine), 或PSTTA注射劑(后眼筋膜囊下乙酸去炎松(posterior subtenon triamcinolone acetate))、抗代謝物藥物,例如甲氨喋呤、TNF- α阻斷劑(包括英利昔單抗、阿達(dá)木單抗、依那西普、戈利木單抗、塞妥珠單抗)。
因此，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥劑來(lái)治療舍格倫氏綜合征可以與例如治療舍格倫氏綜合征的任何已知治療劑或方法組合。治療 舍格倫氏綜合征的這類(lèi)已知治療劑的非限制實(shí)例包括環(huán)孢素、匹魯卡品(pilocarpine ；Salagen)以及西維美林 (cevimeline ;Evoxac)、輕氯喹(Plaquenil)、可的松(cortisone ;潑尼松以及其他)和/或硫唑嘌呤(Imuran )或環(huán)磷酰胺(Cytoxan )、地塞米松、沙立度胺、去氫表雄酮、NGX267、瑞巴派特(Rebamipide)、FID114657、依那西普(Etanercept)、Raptiva、貝利木單抗、MabThera (利妥昔單抗)；阿那白滯素、靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)、異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(AlloMSC)、 “Saliwell Crown”的自動(dòng)神經(jīng)電刺激。
因此，使用根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥劑來(lái)治療全身性紅斑狼瘡可以與例如治療全身性紅斑狼瘡的任何已知治療劑或方法組合。治療全身性紅斑狼瘡的這類(lèi)已知治療劑的非限制實(shí)例包括皮質(zhì)類(lèi)固醇以及疾病改進(jìn)抗風(fēng)濕藥物(DMARD)、通?？够集懠菜幬锢缙绽?Plaquenil)以及免疫抑制劑(例如甲氨喋呤和硫唑嘌呤)、羥氯喹、細(xì)胞毒性藥物(例如環(huán)磷酰胺和霉酚酸酯)、羥氯喹(HCQ)、Benlysta (貝利木單抗)、非類(lèi)固醇抗炎癥藥物、潑尼松、騎悉(Cellcept )、普樂(lè)可復(fù)(Prograf)、阿塞西普(Atacicept)、Lupuzor、靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)、CellCept (霉酹酸酯)、奧瑞希納 (Orencia)、CTLA4_IgG4m (RG2077)、利妥昔單抗、奧瑞珠單抗、依帕珠單抗、CNT0136、西法木單抗(Sifalimumab ;MEDI_545)、A-623 (以前 AMG623)、AMG557、羅利珠單抗、帕喹莫德 (paquinimod ;ABR_215757)、LY2127399、CEP-33457、去氫表雄酮、左旋甲狀腺素、阿貝莫司鈉(abetimus sodium ;LJP394)、美金剛、阿片類(lèi)藥物、雷帕霉素、腎移植、干細(xì)胞移植。
本發(fā)明在至少一些實(shí)施方案中還涵蓋連同治療免疫系統(tǒng)疾病的其他藥劑一起使用根據(jù)至少一些實(shí)施方案的本發(fā)明的組合物。例如，MS疾病可用本發(fā)明的分子結(jié)合但是不局限于以下物質(zhì)來(lái)治療免疫抑制劑，例如皮質(zhì)類(lèi)固醇、環(huán)孢菌素、潑尼松、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、TNF- α阻斷劑或拮抗劑，或靶向任何炎癥細(xì)胞因子的任何其他生物制劑、非類(lèi)固醇抗炎癥藥物/Cox-2抑制劑、輕氯喹、柳氮磺批唳(sulphasalazopryine)、金鹽、依那西普、英利昔單抗、雷帕霉素、霉酚酸酯、硫唑嘌呤、他克莫司、巴利昔單抗、癌得星(Cytoxan)、干擾素β-la、干擾素β-lb、乙酸格拉替雷、米托蒽醌鹽酸鹽、阿那白滯素和/或其他生物制劑。 C10RF32多肽、其片段或融合蛋白也可結(jié)合一種或多種以下調(diào)控免疫應(yīng)答的藥劑來(lái)使用 可溶性gp39 (又稱為⑶40配體(⑶40L)、⑶154、T-BAM、TRAP)、可溶性⑶29、可溶性⑶40、 可溶性CD80 (例如ATCC68627)、可溶性CD86、可溶性CD28 (例如68628)、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性 ELAM-1、可溶性 CD44、與 gp39 反應(yīng)的抗體(例如 ATCC HB-10916、ATCC HB-12055 以及 ATCC HB-12056)、與CD40反應(yīng)的抗體(例如ATCC HB-9110)、與B7反應(yīng)的抗體(例如ATCC HB-253、 ATCC CRL-2223、ATCCCRL-2226、ATCC HB-30UATCC HB-11341 等)、與 CD28 反應(yīng)的抗體(例如 ATCC HB-11944 或 mAb9. 3)、與 LFA-1 反應(yīng)的抗體(例如 ATCCHB-9579 和 ATCC TIB-213)、與 LFA-2反應(yīng)的抗體、與IL-2反應(yīng)的抗體、與IL-12反應(yīng)的抗體、與IFN- Y反應(yīng)的抗體、與⑶2 反應(yīng)的抗體、與⑶48反應(yīng)的抗體、與任何ICAM反應(yīng)的抗體(例如ICAM-1 (ATCCCRL-2252)、 ICAM-2以及ICAM-3)、與CTLA4反應(yīng)的抗體(例如ATCCHB-304)、與Thy-1反應(yīng)的抗體、與 CD56反應(yīng)的抗體、與CD3反應(yīng)的抗體、與CD29反應(yīng)的抗體、與TCR反應(yīng)的抗體、與VLA-4反應(yīng)的抗體、與VCAM-1反應(yīng)的抗體、與LECAM-1反應(yīng)的抗體、與ELAM-1反應(yīng)的抗體、與CD44 反應(yīng)的抗體。在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體是優(yōu)選的。在其他實(shí)施方 案中，抗體片段是優(yōu)選的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，組合可包括C10RF32多肽、其片段或融合蛋白與一種其他免疫抑制劑、與兩種其他免疫抑制劑、與三種其他免疫抑制劑等。確定優(yōu)化組合以及劑量可使用本領(lǐng)域中熟知的方法來(lái)確定并優(yōu)化。
C10RF32多肽、其片段或融合蛋白也可結(jié)合一種或多種以下藥劑來(lái)使用L104EA29YIg, CD80 單克隆抗體(mAb)、CD86mAb、gp39mAb、CD40mAb、CD28mAb ;抗-LFAlmAb、 靶向免疫系統(tǒng)機(jī)制例如⑶52 (阿來(lái)組單抗)、⑶25 (達(dá)利珠單抗)、VLA-4 (那他珠單抗)、 CD20 (利妥昔單抗)、IL2R (達(dá)利珠單抗)以及MS4A1 (奧瑞珠單抗)的抗體或其他藥劑；新的口服免疫調(diào)節(jié)劑已表明可防止淋巴細(xì)胞從淋巴器官再循環(huán)，例如芬戈莫德(fingolimod; FTY720)或?qū)е铝馨图?xì)胞耗盡，例如米留斯(口服克拉屈濱(cladribine))或特立氟胺 (teriflunomide);以及防止免疫活化的藥劑,例如panaclar (延胡索酸二甲酯BG-12)或拉喹莫德(ABR216062)。其他組合將容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到并且理解。
可溶性C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可作為單獨(dú)活性成分或連同免疫調(diào)節(jié)方案中的其他藥物或其他抗炎癥劑一起給予例如用于治療或預(yù)防同種異體或異種移植急性或慢性排斥反應(yīng)或炎癥性或自身免疫病癥，或誘導(dǎo)耐受性。例如，它可與以下物質(zhì)組合使用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，例如環(huán)孢菌素A或FK506 ;免疫抑制大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)，例如雷帕霉素或其衍生物；例如40-0-(2-羥基)乙基-雷帕霉素、淋巴細(xì)胞歸巢劑，例如FTY720或其類(lèi)似物、皮質(zhì)類(lèi)固醇；環(huán)磷酰胺；咪唑硫嘌呤；甲氨喋呤；來(lái)氟米特或其類(lèi)似物；咪唑立賓；麥可酚酸；霉酚酸酯；15-脫氧精胍菌素或其類(lèi)似物；免疫抑制單克隆抗體，例如白細(xì)胞受體的單克隆抗體，例如 MHC、CD2、CD3、CD4、CDlla/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、 CD137、I COS, CD150 (SLAM)、0X40、4_1BB或其配體；或其他免疫調(diào)節(jié)化合物，例如CTLA4/ CD28-1g，或其他粘附分子抑制劑，例如mAb或低分子量抑制劑，包括LFA-1拮抗劑、選擇蛋白拮抗劑以及VLA-4拮抗劑。
當(dāng)C10RF32多肽、其片段或融合蛋白結(jié)合例如在上文中指定的其他免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)或抗炎癥療法來(lái)給予時(shí)，共同給予的免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)或抗炎癥化合物的劑量當(dāng)然取決于所使用的共用藥物的類(lèi)型(例如它是類(lèi)固醇或是環(huán)孢菌素)、所使用的具體藥物、所治療的病狀等等而變化。
治療使用的方法
在此披露的C10RF32多肽，或其片段或融合作為治療劑是有用的。根據(jù)至少一些實(shí)施方案，免疫細(xì)胞，優(yōu)選地T細(xì)胞，可在體內(nèi)或離體與C10RF32融合多肽接觸以便降低或抑制免疫應(yīng)答，包括但不局限于炎癥。與C10RF32融合多肽接觸的T細(xì)胞可以是表達(dá)T細(xì)胞受體，包括α/β以及Y / δ T細(xì)胞受體的任何細(xì)胞。T-細(xì)胞包括表達(dá)⑶3的所有細(xì)胞， 包括還表達(dá)⑶4和⑶S的T-細(xì)胞子集。T-細(xì)胞包括初始和記憶細(xì)胞以及效應(yīng)細(xì)胞，例如 CTLo T-細(xì)胞還包括例如 Thl、Tel、Th2、Tc2、Th3、Thl7、Th22、Treg 以及 Trl 細(xì)胞的細(xì)胞。 T-細(xì)胞還包括NKT-細(xì)胞以及T-細(xì)胞譜系的相似獨(dú)特類(lèi)別。例如，這些組合物可用于調(diào)節(jié) ThU Thl7、Th22或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞，這些炎癥分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a、TGF-β、IFN-Y、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。這些組合物也可用于增加或促進(jìn)Treg的活性、增加Treg的例如IL-10細(xì)胞因子的產(chǎn)生、增加 Treg的分化、增加Treg的數(shù)量或增加Treg的存活。這些組合物也可用于增加或促進(jìn)Th2 細(xì)胞的活性、增加Th2細(xì)胞的例如IL-10或IL-4細(xì)胞因子的產(chǎn)生、增加Th2細(xì)胞的分化、增加Th2細(xì)胞的數(shù)量或增加Th2細(xì)胞的存活。
在一些實(shí)施方案中，所披露的C10RF32多肽，其片段或融合物結(jié)合第二治療劑來(lái)給予。組合療法可以適用于免疫調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方案中，C10RF32多肽，或片段，或融合物可用于減弱或逆轉(zhuǎn)促炎癥性藥物的活性，和/或限制這類(lèi)藥物的不良影響。可以用所披露的C10RF32多肽、其片段或融合物來(lái)治療的其他免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞前體、抗原呈遞細(xì)胞 (例如樹(shù)突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞或其前體)、B細(xì)胞或其組合。C10RF32組合物可用于調(diào)節(jié)B細(xì)胞的抗體產(chǎn)生，方法是通過(guò)使B細(xì)胞與有效量的C10RF32組合物接觸以便相對(duì)于對(duì)照來(lái)抑制或減少B細(xì)胞的抗體產(chǎn)生。C10RF32組合物也可調(diào)節(jié)B細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。
治療炎癥應(yīng)答的方法
C10RF32多肽、其片段或融合蛋白抑制T細(xì)胞活化，如T細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子分泌所表明的。確切地，這些蛋白抑制Thl和Thl7應(yīng)答，同時(shí)促進(jìn)Th2應(yīng)答。
C10RF32多肽、其片段或融合蛋白潛在地用于治療要求下調(diào)共刺激通路和/或因此要求下調(diào)Thl和/或Thl7應(yīng)答的疾病。
另一個(gè)實(shí)施方案提供治療或減輕炎癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所披露的這些組合物以及方法可以用于治療慢性并且持續(xù)的炎癥。炎癥一般可以使用所披露的C10RF32多肽或其片段或融合物來(lái)治療。
可抑制或降低受試者(優(yōu)選為人類(lèi))的免疫應(yīng)答(包括炎癥)，方法是給予有效量的 C10RF32多肽或其片段或融合物以便抑制或減少免疫細(xì)胞的生物活性或減少炎癥部位的促炎癥分子的量。示例性促炎癥分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-a、TGF_ β、IFN-Y、IL-17、 IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。Thl和Thl7是可以被C10RF32多肽、其融合蛋白或片段靶向而抑制以便抑制或減少炎癥的示例性T細(xì)胞。
不希望受關(guān)于此生物機(jī)制或在此描述的任何其他生物機(jī)制的單一假設(shè)限制， C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可以用于通過(guò)任何或所有以下機(jī)制來(lái)治療炎癥抑制或減少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的分化，這些炎癥分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a , TGF- β、IFN1、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及MMP ;抑制或減少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的活性，這些炎癥分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-a、TGF-β、IFN1、IL-17, IL-6, IL-23、IL-22、IL-21以及MMP ;抑制或減少Thl和/或Thl7通路；抑制或減少ThU Thl7、 Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌，這些炎癥分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a、TGF-β、IFN1、IL-17, IL-6IL-23、IL-22, IL-21以及MMP ;抑制或減少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的增殖，這些炎癥分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-a、TGF-β、IFN- y , IL-17, IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。
額外地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白還可以增強(qiáng)Th2免疫應(yīng)答。C10RF32多肽、其片段或融合蛋白還可以直接作用于Th2細(xì)胞以便促進(jìn)或增強(qiáng)IL-4、IL-5或IL-10的產(chǎn)生，或增加Th2細(xì)胞的數(shù)量，從而導(dǎo)致Thl和/或Thl7的抑制，以及經(jīng)由Thl/Th2轉(zhuǎn)變的免疫調(diào)節(jié)。
額外地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可導(dǎo)致Treg對(duì)于免疫應(yīng)答具有增強(qiáng)的抑制作用。Treg可抑制Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的分化、增殖、活性和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌，這些炎癥分子包括但不局限于 IL-1 β、TNF-a ,TGF-β、IFN-Y、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。例如，C10RF32 多肽、其片段或融合蛋白可引起Treg對(duì)于Thl和/或Thl7細(xì)胞具有增強(qiáng)的抑制作用以便相應(yīng)地減少所產(chǎn)生的IFN-Y和IL-17水平。C10RF32多肽、其片段或融合蛋白還可直接作用于Treg以便促進(jìn)或增強(qiáng)IL-10的產(chǎn)生，從而抑制Thl和/或Thl7通路，和/或增加Treg 的數(shù)量。
額外 地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可以引起Th2對(duì)于免疫應(yīng)答具有增強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。Th2細(xì)胞可調(diào)節(jié)Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的分化、增殖、活性和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌，這些炎癥分子包括但不局限于 IL-1 β , TNF- a , TGF- β、IFN1、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21 以及 MMP。例如， C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可引起Th2細(xì)胞對(duì)于Thl和/或Thl7細(xì)胞具有增強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，以便相應(yīng)地減少所產(chǎn)生的IFN-Y和IL-17的水平。C10RF32多肽、其片段或融合蛋白還可直接作用于Th2細(xì)胞以便促進(jìn)或增強(qiáng)IL-10的產(chǎn)生，從而抑制Thl和/或Thl7通路，和/或增加Th2細(xì)胞的數(shù)量。
不希望受單一假設(shè)限制，據(jù)信C10RF32多肽、其片段或融合蛋白作用于多個(gè)T細(xì)胞通路中的多個(gè)點(diǎn)。例如，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可抑制初始T細(xì)胞分化成Thl或 Thl7細(xì)胞。可替代地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可與Thl細(xì)胞或Thl7細(xì)胞或這兩種細(xì)胞相互作用以便抑制或減少促炎癥分子的產(chǎn)生。
額外地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可增加Th2分化和/或促進(jìn)Th2應(yīng)答，導(dǎo)致對(duì)于Thl和/或Thl7通路的免疫調(diào)節(jié)作用，從而減少所產(chǎn)生的INF- Y和/或IL-17的水平。C10RF32多肽、其片段或融合蛋白增強(qiáng)IL-10從細(xì)胞(例如Th2和/或Treg)產(chǎn)生，這進(jìn)而抑制Thl和/或Thl7細(xì)胞的活性。
額外地，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可以影響Treg，以便對(duì)于Thl和/或 Thl7通路具有增強(qiáng)的抑制作用，從而減少所產(chǎn)生的INF-γ和/或IL-17的水平。額外地， C10RF32多肽、其片段或融合蛋白可以增強(qiáng)對(duì)Thl和/或Thl7細(xì)胞活性進(jìn)行抑制的IL-10的產(chǎn)生。
抑制Thl應(yīng)答
a.抑制Thl發(fā)育
抑制或減少炎癥的一種方法包括給予有效量的C10RF32多肽、其融合蛋白、變體或其片段，以便抑制對(duì)其有需要的受試者的Thl發(fā)育?？赏ㄟ^(guò)給予C10RF32多肽、其融合蛋白、片段或其變體來(lái)阻斷初始T細(xì)胞分化成Thl細(xì)胞，從而抑制或降低炎癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32多肽或其融合蛋白可抑制或減少Thl細(xì)胞的增殖。C10RF32多肽、其片段或融合蛋白也可通過(guò)阻斷抗原呈遞細(xì)胞成熟來(lái)減少初始T細(xì)胞分化成Thl細(xì)胞?？商娲?，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白增加Th2細(xì)胞分化并且由此減少受試者的Thl細(xì)胞數(shù)。通過(guò)限制可以在受試者體內(nèi)發(fā)育的Thl細(xì)胞的數(shù)量，可以降低或遏制促炎癥分子，例如 INF-γ的量。INF-γ刺激包括IL-Ιβ、TNF-a以及MMP的其他促炎癥分子的產(chǎn)生或釋放。 因此，通過(guò)控制受試者中的Thl細(xì)胞數(shù)，可以控制這些其他促炎癥分子的水平，由此減少炎癥應(yīng)答。
b.抑制促炎癥分子
另一個(gè)實(shí)施方案提供一種通過(guò)向受試者給予有效量的C10RF32多肽、其融合蛋白或其片段，以便抑制或減少Thl細(xì)胞的促炎癥分子產(chǎn)生，來(lái)抑制或減少受試者中的炎癥的方法。
Thl細(xì)胞產(chǎn)生的示例性促炎癥分子包括IFN- Y。在此實(shí)施方案中，C10RF32多肽、其融合蛋白或其片段可以直接與Thl細(xì)胞相互作用并且抑制或減少Thl細(xì)胞的IFN-Y產(chǎn)生。在此實(shí)施方案中，調(diào)控促炎癥分子的量而非Thl細(xì)胞的群體。
抑制Th 17應(yīng)答
a.抑制Th 17發(fā)育
還可通過(guò)給予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合物以便抑制或阻斷初始T細(xì)胞發(fā)育成Thl7細(xì)胞來(lái)抑制或減少受試者中的炎癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，C10RF32多肽或融合蛋白將Treg對(duì)于初始T細(xì)胞分化成Thl7細(xì)胞的抑制活性增加了足以減少受試者的Thl7 細(xì)胞數(shù)的量?？商娲?，C10RF32多肽或其融合蛋白抑制或減少Thl7細(xì)胞的增殖。C10RF32 多肽或其融合蛋白也可以通過(guò)阻斷抗原呈遞細(xì)胞成熟來(lái)減少初始T細(xì)胞分化成Thl7細(xì)胞。 通過(guò)減少受試者的Thl7細(xì)胞群，可以減少I(mǎi)L-17，以及IL-22和IL-21的量。IL-17是引起其他促炎癥分子，例如IL-1 β、TNF-α以及MMP增加的促炎癥細(xì)胞因子。因此，通過(guò)減少 IL-17的量，可減少這些其他促炎癥分子，從而減少或抑制炎癥。
b.抑制 IL-17 產(chǎn)生
仍另一個(gè)實(shí)施方案提供一種通過(guò)給予有效量的C10RF32多肽、其融合蛋白或其片段以便抑制Thl7細(xì)胞的IL-17以及IL-22和IL-21產(chǎn)生來(lái)治療受試者中炎癥的方法。在此實(shí)施方案中，C10RF32多肽或融合蛋白可以直接作用于Thl7細(xì)胞，例如通過(guò)結(jié)合至Thl7 細(xì)胞，導(dǎo)致抑制那些Thl7細(xì)胞的IL-17 (或IL-22和IL-21)產(chǎn)生。如以上提及，抑制或減少I(mǎi)L-17 (以及IL-22或IL-21)導(dǎo)致減少其他促炎癥分子，由此減少或抑制炎癥。
抑制Thl和Th 17應(yīng)答
所披露的C10RF32多肽、其融合蛋白以及片段可以用于同時(shí)抑制Thl和Thl7通路。使用一種抗炎癥劑來(lái)抑制兩種單獨(dú)通路提供了免疫應(yīng)答的更魯棒抑制或減少。
促進(jìn)Th2應(yīng)答和IL-10產(chǎn)生。
還可通過(guò)將C10RF32多肽、其融合蛋白或其片段以有效增強(qiáng)Th2應(yīng)答以及IL-10 產(chǎn)生細(xì)胞的抑制活性、并且增強(qiáng)對(duì)于Thl和/或Thl7通路的抑制或調(diào)節(jié)活性的量給予至受試者來(lái)治療炎癥。在此實(shí)施方案中，所披露的C10RF32多肽以及融合蛋白引起對(duì)于IFN-Y 和/或IL-17產(chǎn)生的增加的抑制作用。另一個(gè)實(shí)施方案提供一種通過(guò)給予有效量的C10RF32 多肽、其融合蛋白或其片段以便增加Th2、Treg或其他免疫細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生來(lái)治療炎癥的方法。
增加的IL-10產(chǎn)生導(dǎo)致Thl7細(xì)胞的IL-17產(chǎn)生降低以及Thl細(xì)胞的IFN-Y產(chǎn)生降低。在此實(shí)施方案中，C10RF32多肽、其融合蛋白以及片段可以直接與免疫細(xì)胞相互作用以便增加IL-10產(chǎn)生。
仍另一個(gè)實(shí)施方案提供一種通過(guò)給予有效量的C10RF32多肽、其融合蛋白及其片段以便抑制或干擾Thl通路和Thl7通路、并且增強(qiáng)Th2細(xì)胞對(duì)于Thl和/或Thl7通路的抑制作用來(lái)治療炎癥的方法。
C10RF32多肽、其融合蛋白及其片段還可按有效增加Th2細(xì)胞群或數(shù)量的量給予至受試者。
可以通過(guò)使Th2細(xì) 胞、Treg或其他免疫細(xì)胞與有效量的C10RF32多肽、C10RF32融合蛋白或其具有C10RF32活性的片段接觸以便相對(duì)于對(duì)照來(lái)增加IL-10產(chǎn)生。該增加可以在體外或在體內(nèi)發(fā)生。
待治療的炎癥性疾病
在此描述了可使用C10RF32融合多肽來(lái)治療的免疫相關(guān)疾病和病癥。
C10RF32作為主要調(diào)控因子而作用于炎癥通路中的多個(gè)點(diǎn)以便控制效應(yīng)細(xì)胞因子，例如IFN- Y和TNF- α的表達(dá)和/或活性。因此，在此描述的C10RF32組合物在治療對(duì)于TNF-α阻斷劑,例如Enbrel、英利昔單抗、賽妥珠單抗以及阿達(dá)木單抗不起反應(yīng)的患者， 或在TNF-α阻斷劑不安全或無(wú)效時(shí)特別有用。另外，由于其在炎癥通路中作為主要調(diào)控因子的活性，所披露的C10RF32組合物特別適用于治療慢性并且持續(xù)的炎癥。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在此描述的C10RF32組合物用于治療復(fù)發(fā)性和/或緩解性多發(fā)性硬化。
抑制表位擴(kuò)展
表位擴(kuò)展是指B和T細(xì)胞免疫應(yīng)答在從自身抗原上的單一決定子到許多位點(diǎn)的特異性水平上，并且在V基因使用水平上發(fā)生多樣化的能力(Monneaux (曼努斯)，F(xiàn).等人，關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕癥(Arthritis&amp; Rheumatism), 46 (6) : 1430-1438 (2002 年))。表位擴(kuò)展不局限于全身性自身免疫疾病。它已經(jīng)在人類(lèi)，以及具有各種髓磷脂蛋白的EAE誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的的T細(xì)胞依賴性器官特異性疾病，例如I型糖尿病和多發(fā)性硬化中得到描述。
表位擴(kuò)展涉及相同自身分子中的新的表位連同存在于相同大分子復(fù)合物中有關(guān)的蛋白中的表位的獲得性識(shí)別。表位擴(kuò)展可通過(guò)測(cè)量延遲型過(guò)敏(DTH)應(yīng)答來(lái)評(píng)估，其方法是本領(lǐng)域中已知的。
一個(gè)實(shí)施方案提供一種通過(guò)向受試者給予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合蛋白來(lái)抑制或減少受試者的表位擴(kuò)展的方法。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，C10RF32多肽、 其片段或融合蛋白抑制患有多發(fā)性硬化的個(gè)體的表位擴(kuò)展。優(yōu)選地，C10RF32多肽或其融合物抑制或阻斷炎癥通路的多個(gè)點(diǎn)。
仍另一個(gè)實(shí)施方案提供一種通過(guò)向受試者給予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合蛋白以便抑制或減少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的分化、增殖、活性和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌來(lái)抑制或減少患有多發(fā)性硬化的受試者的表位擴(kuò)展的方法，這些炎癥分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-a ,TGF-β、IFN_ Y、 IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。另一個(gè)實(shí)施方案提供一種通過(guò)向受試者給予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合蛋白以便與Treg相互作用、增強(qiáng)Treg活性、促進(jìn)或增強(qiáng)Treg的IL-10分泌、增加Treg數(shù)量、增加Treg的抑制能力或其組合來(lái)治療多發(fā)性硬化的方法。另一個(gè)實(shí)施方案提供一種通過(guò)向受試者給予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合蛋白以便與Th2細(xì)胞相互作用、增強(qiáng)Th2活性、促進(jìn)或增強(qiáng)Th2細(xì)胞的IL-10分泌、增加Th2細(xì)胞數(shù)、增加Th2細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力或其組合來(lái)治療多發(fā)性硬化的方法。
誘導(dǎo)免疫耐受性
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種通過(guò)向受試者給予有效量的C10RF32多肽、 其片段或融合蛋白來(lái)誘導(dǎo)或重建受試者的免疫耐受性的方法。 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白誘導(dǎo)患有免疫相關(guān)疾病的個(gè)體的耐受性。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白誘導(dǎo)患有多發(fā)性硬化的個(gè)體的耐受性。優(yōu)選地，C10RF32多肽或其融合物抑制或阻斷炎癥通路的多個(gè)點(diǎn)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中， C10RF32多肽、其片段或融合蛋白誘導(dǎo)患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的個(gè)體的耐受性。另一個(gè)實(shí)施方案提供一種通過(guò)向受試者給予有效量的C10RF32多肽、其片段或融合蛋白以便與Treg相互作用、增強(qiáng)Treg活性、增加Treg數(shù)量、增加Treg的抑制能力或其組合來(lái)誘導(dǎo)免疫耐受性而治療免疫相關(guān)疾病的方法。另一個(gè)實(shí)施方案提供一種通過(guò)向受試者給予有效量的C10RF32 多肽、其片段或融合蛋白以便促進(jìn)或增強(qiáng)免疫細(xì)胞的IL-10分泌來(lái)治療免疫相關(guān)疾病的方法。
組合療法
C10RF32融合多肽可單獨(dú)或與另外治療劑組合來(lái)使用。該另外治療劑包括但不局限于免疫抑制劑(例如針對(duì)其他淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記(例如CD40、α -4整聯(lián)蛋白)或針對(duì)細(xì)胞因子的抗體)，其他融合蛋白(例如CTLA-4-lg ( Orencia )、TNFR-1g ( Enbrel ))， TNF-α阻斷劑，例如Enbrel、英利昔單抗、賽妥珠單抗以及阿達(dá)木單抗，環(huán)磷酰胺(CTX)(即 Encloxan 、Cytoxan 、Neosai' 、Proc>4ox 、Rev immune ),甲氨喋呤(MTX)(即Rheumatrex 、Trexall )，貝利木單抗(即Benlysta )，或其他免疫抑制藥物(例如環(huán)孢菌素A、FK506樣化合物、雷帕霉素化合物或類(lèi)固醇)，抗增殖劑，細(xì)胞毒性劑，或可以有助于免疫抑制的其他化合物。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該額外治療劑起作用以便通過(guò)單獨(dú)通路來(lái)抑制或減少T細(xì)胞活化。在一種這樣的實(shí)施方案中，該額外治療劑為CTLA-4融合蛋白，例如 CTLA-4-1g (阿巴西普)。CTLA-4-1g融合蛋白與T細(xì)胞上的共刺激受體⑶28競(jìng)爭(zhēng)以便結(jié)合至抗原呈遞細(xì)胞上的⑶80/⑶86(Β7-1/Β7-2)，并且因此起作用來(lái)抑制T細(xì)胞活化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該另外治療劑是被稱為貝拉西普的CTLA-4-1g融合蛋白。貝拉西普含有在體內(nèi)顯著地增加其對(duì)于⑶86的親合力的兩個(gè)氨基酸取代(L104E和A29Y)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該額外治療劑是Maxy-4 (馬克西_4)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑為環(huán)磷酰胺(CTX)。環(huán)磷酰胺 (Cyclophosphamide) ( Endoxan ，Cytoxan 、Neosai·1 、Procytox 、Rev immune 的通用名稱)，又稱為環(huán)磷酰胺(cytophosphane),是來(lái)自卩惡唑弗林(oxazophorine)組的氮芥烷基化劑。它用于治療不同類(lèi)型的癌癥以及一些自身免疫病癥。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白與CTX以預(yù)防或治療慢性自身免疫疾病或病癥， 例如全身性紅斑狼瘡(SLE)的有效量共同給予。環(huán)磷酰胺(CTX)是用于患有腎狼瘡的患者的彌漫增生性腎小球腎炎的主要藥物。在一些實(shí)施方案中，組合療法以減少抗-雙鏈 DNA(抗-ds DNA)自身抗體的血液或血清水平和/或減少對(duì)其有需要的患者的蛋白尿的有效量來(lái)給予。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑增加血清中的腺苷量，參見(jiàn)例如W008/147482。 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第二治療劑為增加⑶73表達(dá)的⑶73-1g、重組⑶73或另一種藥劑(例如細(xì)胞因子或單克隆抗體或小分子)，參見(jiàn)例如W004/084933。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑為干擾素_β。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑為那他珠單抗或用于MS 的另一種治療劑。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，C10RF32多肽、其片段或融合蛋白與那他珠單抗循環(huán)使用或在藥物假期期間使用，以便允許第二治療劑給藥的頻率更低并且減少副作用，例如PML的風(fēng)險(xiǎn)并防止對(duì)于第二治療劑的抗性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑優(yōu)先治療慢性炎癥，由此治療方案靶向急性和慢性炎癥。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，第二治療劑是TNF-α阻斷劑。
在另一個(gè)實(shí)施方案 中，第二治療劑是抑制或減少Thl、Thl7、Th22和/或分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞的分化、增殖、活性和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌的小分子，這些炎癥分子包括但不局限于IL-1 β、TNF-α、TGF-β、IFN-Y、IL-17、IL-6, IL-23、IL-22、IL-21以及MMP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二治療劑是與Treg相互作用、增強(qiáng)Treg活性、促進(jìn)或增強(qiáng)Treg的IL-10分泌、增加Treg數(shù)量、增加Treg的抑制能力或其組合的小分子。
典型地有用的小分子是有機(jī)分子，優(yōu)選地是具有大于100并且小于約2，500道爾頓，更優(yōu)選地在100與2000之間，更優(yōu)選地在約100與約1250之間，更優(yōu)選地在約100與約 1000之間，更優(yōu)選地在約100并約750之間，更優(yōu)選地在約200與約500道爾頓之間的分子量的小有機(jī)化合物。小分子包括與蛋白結(jié)構(gòu)性相互作用所必需的官能團(tuán)，特別是氫鍵合，并且典型地至少一個(gè)胺、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選地包括這些官能化學(xué)基團(tuán)的至少兩種。小分子經(jīng)常包括用一個(gè)或多個(gè)以上官能團(tuán)取代的環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳族或多芳環(huán)結(jié)構(gòu)。 小分子還包括生物分子，包括肽類(lèi)、糖類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、類(lèi)固醇類(lèi)、嘌呤類(lèi)、嘧啶類(lèi)、衍生物類(lèi)、 結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，小分子是視黃酸或其衍生物。以下實(shí)例證明視黃酸抑制或減少ThI7細(xì)胞的分化和/或活性。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這些組合物與增加Treg活性或產(chǎn)生的化合物組合或順次使用。示例性Treg增強(qiáng)劑包括但不局限于糖皮質(zhì)激素氟替卡松(glucocorticoid fluticasone)、沙美特羅(salmeterol)、IL-12、IFN- Y 以及IL-4的抗體；維生素D3，以及地塞米松及其組合。其他促炎癥分子的抗體也可與所披露的C10RF32多肽、其融合蛋白或片段組合或交替使用。優(yōu)選的抗體結(jié)合至IL-6、IL-23、 IL-22 或 IL-21。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“雷帕霉素化合物”包括中性三環(huán)化合物雷帕霉素、雷帕霉素衍生物、雷帕霉素類(lèi)似物，以及被認(rèn)為具有與雷帕霉素相同的作用機(jī)制(例如，抑制細(xì)胞因子功能)的其他大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物。措辭“雷帕霉素化合物”包括具有與雷帕霉素結(jié)構(gòu)相似性的化合物，例如具有被修飾以便增強(qiáng)其療效的相似大環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。示例性雷帕霉素化合物是本領(lǐng)域中已知的。措辭“FK506樣化合物”包括FK506，以及FK506衍生物和類(lèi)似物， 例如具有與FK506結(jié)構(gòu)相似性的化合物，例如具有被修飾以便增強(qiáng)其療效的相似大環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。FK506樣化合物的實(shí)例包括例如W000101385中描述的那些化合物。優(yōu)選地，如在此使用的措辭“雷帕霉素化合物”不包括FK506樣化合物。
其他適合的治療劑包括但不局限于抗炎癥劑。抗炎癥劑可為非類(lèi)固醇、類(lèi)固醇或其組合。一個(gè)實(shí)施方案提供含有約1% (w/w)至約5% (w/w)、通常約2.5% (w/w)抗炎癥劑的口服組合物。非類(lèi)固醇抗炎癥劑的代表性實(shí)例包括但不局限于昔康類(lèi)藥物 (oxicams),例如卩比羅昔康(piroxicam)、伊索昔康(isoxicam)、替諾昔康(tenoxicam)、舒多昔康(sudoxicam);水楊酸酯類(lèi)，例如阿斯匹林、雙水楊酸酯制劑(disalcid)、貝諾酯 (^611(^713七6)、三水楊酸膽堿鎂(11'；[1丨83七6)、沙發(fā)樸林(83€3。1711)、索樸林(80]^1'；[11)、雙氟尼酸(difIunisal)以及芬多沙(fendosal)；乙酸衍生物,例如雙氯芬酸(diclofenac)、 芬氯酸(fenclofenac)、卩引哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美汀 (10111161；[11)、伊索克酸(丨8( 6。30)、呋羅芬酸(；1!\11'(^61^0)、硫平酸(1；[(^；[1^0)、齊多美辛 (zidometacin)、阿西美辛(acemetacin)、芬替酸(fentiazac)、佐美酸(zomepirac)、克侖達(dá)那(clm danac)、奧昔平酸(oxepinac)、吩布默克(felbmac)以及酮咯酸(ketorolac)； 芬那酯衍生物類(lèi)(fenamates),例如甲滅酸(mefenamic)、甲氯芬那酸(meclofenamic)、氟滅酸(flufenamic)、尼氟滅(niflumic)以及托芬那酸酸(tolfenamic acid);丙酸衍生物，例如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、苯惡洛芬(benoxaprofen)、氟比洛芬 (flurbiprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、非諾洛芬(fenoprofen)、芬布芬(fenbufen)、口引哚洛芬(indoprofen)、卩比洛芬(pirprofen)、卡洛芬(carprofen)、奧沙普秦(oxaprozin)、 普拉洛芬(pranoprofen)、咪洛芬(miroprofen)、硫惡洛芬(tioxaprofen)、舒洛芬 (suprofen)、阿明洛芬(alminoprofen)以及噻洛芬酸(tiaprofenic);卩比唑，例如苯基丁氮酮(phenylbutazone)、輕保松(oxyphenbutazone)、非潑拉酮(feprazone)、阿扎丙酮 (azapropazone),以及三甲保泰松(trimethazone)。也可以釆用這些非類(lèi)固醇抗炎癥劑的混合物。
類(lèi)固醇抗炎癥藥物的代表性實(shí)例包括但不局限于皮質(zhì)類(lèi)固醇類(lèi)，例如氫可的松(hydrocortisone)、輕基-曲安西龍(hydroxyl-triamcinolone)、α -甲基地塞米松(alpha-methyldexamethasone)、地塞米松憐酸酯(dexamethasone-phosphate)、 二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、氯倍他索戊酸酯(clobetasol valerate)、輕潑尼縮松(desonide)、去氧米松(desoxymethasone)、乙酸去氧皮質(zhì)酮 (desoxycorticosterone acetate)、地塞米松、雙氯松(dichlorisone)、雙氟拉松雙乙酸 Ih (diflorasone diacetate)、雙氟米松戊酸酯(diflucortolone valerate)、 氟氫縮松(fluadrenolone)、氟氯縮松(fluclorolone acetonide)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟米松特戊酸酯(flumethasone pivalate)、游離氟輕松 (fIuosinolone &06如111(16)、氟輕松乙酸酯([1110(3；!_110111(16)、氟氯可汀丁基酯(fIucortine butylesters)、氟可龍(fluocortolone)、氟潑尼定(fIuprednidene ；fIuprednyIidene) 乙酸酯、氟雄諾龍(flurandrenolone)、哈西縮松(halcinonide)、乙酸氫化可的松 (hydrocortisone acetate)、氫可的松丁酸酯(hydrocortisone butyrate)、甲基潑尼松龍(methy lpredni so lone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、可的松(cortisone)、 可托多松(cortodoxone)、膚輕松(flucetonide)、氟氫可的松(fludrocortisone)、二氟若松雙乙酸酯(difluorosone diacetate)、氟若卓龍(fluradrenolone)、氟氫可的松(fludrocortisone)、二氟樂(lè)松雙乙酸酯(diflurosone diacetate)、氟若卓龍安奈德 (fluradrenolone acetonide)、甲輕松(medrysone)、安西那飛(amcinafel)、安西非特 (amcinafide)、倍他米松(betamethasone)以及其平衡酯、氯潑尼松(chloroprednisone)、 克洛潑尼龍乙酸酯(chlorprednisone acetate)、可洛替龍(clocortelone)、可洛西龍(clescinolone)、雙氯松(dichlorisone)、二氟潑耐酯(diflurprednate)、氟氯奈德(flucloronide)、氟尼縮松(flunisolide)、氟米 % (f Iuoromethalone)Λ 氟培龍(fluperolone)、氟潑尼龍(fluprednisolone)、氫可的松戊酸酉旨(hydrocortisone valerate)、氫可的松環(huán)戊丙酸酯(hydrocortisone cyclopentylpropionate)、氫可松氨酯(hydrocortamate)、甲潑尼松(meprednisone)、帕拉米松(paramethasone)、波尼松龍(prednisolones)、潑尼松(prednisone)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、曲安西 龍(triamcinolone)及其混合物。
藥用組合物
本發(fā)明在一些實(shí)施方案中的特征在于一種包含治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的治療劑的藥用組合物。根據(jù)本發(fā)明，該治療劑可為可溶性C10RF32蛋白、C10RF32胞外域、或其片段或變體、或融合蛋白或?qū)?yīng)核酸編碼序列中的任何一個(gè)。根據(jù)本發(fā)明的藥用組合物進(jìn)一步用于治療自身免疫性并且優(yōu)選地用于治療在此描述的免疫相關(guān)病癥。本發(fā)明的治療劑可以單獨(dú)，或作為它們與藥學(xué)上可接受的載體混合于其中的藥用組合物的一部分來(lái)提供給受試者。
如在此使用，“藥學(xué)上可接受的載體”包括生理相容的任何以及所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。優(yōu)選地，載體適合于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、 皮下、腸胃外、脊柱或表皮給予(例如通過(guò)注射或輸注)。取決于給予途徑，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的活性化合物，即可溶性C10RF32蛋白、C10RF32胞外域、或其片段或變體、 或融合蛋白、或?qū)?yīng)的編碼藥用化合物的核酸序列，可以包括一種或多種藥學(xué)上可接受的鹽?！八帉W(xué)上可接受的鹽”是指保留母體化合物的所希望生物活性并且不賦予任何不希望有的毒性效應(yīng)的鹽(參見(jiàn)例如Berge (貝爾熱)，S.M.等人(1977年)藥理學(xué)雜志(J. Pharm. Sc1. ) 66:1-19)。這類(lèi)鹽的實(shí)例包括酸加成鹽以及堿加成鹽。酸加成鹽包括來(lái)源于無(wú)毒無(wú)機(jī)酸的那些鹽，這些無(wú)機(jī)酸例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸等等，以及來(lái)源于無(wú)毒有機(jī)酸的鹽，這些有機(jī)酸例如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸類(lèi)、脂族以及芳族磺酸等等。堿加成鹽包括來(lái)源于堿土金屬的那些鹽，這些堿土金屬例如鈉、鉀、鎂、鈣等等，以及來(lái)源于無(wú)毒有機(jī)胺的鹽，這些有機(jī)胺例如N，N’-二芐基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)等等。
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥用組合物還可以包括藥學(xué)上可接受的抗氧化劑。藥學(xué)上可接受的抗氧化劑的實(shí)例包括(I)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等等；(2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒(méi)食子酸丙酯、α-生育酚等等；以及(3) 金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸、以及類(lèi)似物。根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥用組合物還可包含添加劑，例如清潔劑和增溶劑(例如， TWEEN20 (聚山梨醇酯-20)，TWEEN80 (聚山梨醇酯-80))以及防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇) 以及增量物質(zhì)(例如乳糖、甘露糖醇)。
可用于根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥用組合物中的適合的水性和非水性載體的實(shí)例包括水、不同緩沖內(nèi)容物(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH以及離子強(qiáng)度的緩沖鹽水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)、以及其適合的混合物、植物油， 例如橄欖油，以及可注射有機(jī)酯，例如油酸乙酯。
適當(dāng)流動(dòng)性可例如通過(guò)使用涂層材料，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過(guò)維持所要求粒徑，以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持。
這些組合物還可含有佐劑，例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑以及分散劑。預(yù)防存在微生物可通過(guò)上述滅菌程序，以及通過(guò)包含不同抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如對(duì)羥苯甲酸酯 (paraben)、氯代丁醇、苯酚山梨酸、以及類(lèi)似物來(lái)確保?？赡苓€希望將等滲劑，例如糖、氯化鈉、以及類(lèi)似物包括于組合物中。另外，可通過(guò)包含延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁以及明膠來(lái)實(shí)現(xiàn)可注射藥物形式的延 長(zhǎng)的吸收。
藥學(xué)上可接受的載體包括無(wú)菌水溶液或分散液以及用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。這些介質(zhì)和試劑對(duì)于藥學(xué)活性物質(zhì)的使用在本領(lǐng)域中是已知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，否則考慮其在根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥用組合物中的用途。輔助活性化合物也可以并入組合物中。
治療組合物典型地必須在制造以及儲(chǔ)存條件下是無(wú)菌并且穩(wěn)定的。組合物可配制為溶液、微乳液、脂質(zhì)體，或適合于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。載體可以為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇，以及液體聚乙二醇等等)以及其合適混合物的溶劑或分散介質(zhì)。適當(dāng)流動(dòng)性可例如通過(guò)使用涂層，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過(guò)維持所希望粒徑，以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持。在許多情況下，可取的是將等滲劑，例如糖、多元醇 (例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉包括在組合物中?？赏ㄟ^(guò)在組合物中包括例如單硬脂酸鹽以及明膠的延遲吸收的試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長(zhǎng)的吸收。無(wú)菌可注射溶液可通過(guò)將所需量的活性化合物根據(jù)需要與以上列舉的成分中的一個(gè)或其組合一起并入適當(dāng)溶劑中，隨后滅菌微濾來(lái)制備?？傮w上,分散液通過(guò)將活性化合物并入無(wú)菌媒介物中來(lái)制備, 該無(wú)菌媒介物含有一種基礎(chǔ)分散介質(zhì)以及來(lái)自以上列舉的那些成分的所需其他成分。在制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選制備方法是真空干燥以及冷凍干燥(凍干)， 這從先前無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
無(wú)菌可注射溶液可通過(guò)將所需量的活性化合物根據(jù)需要與以上列舉的成分中的一個(gè)或其組合一起并入適當(dāng)溶劑中，隨后滅菌微濾來(lái)制備?？傮w上，分散液通過(guò)將活性化合物并入無(wú)菌媒介物中來(lái)制備，該無(wú)菌媒介物含有一種基礎(chǔ)分散介質(zhì)以及來(lái)自以上列舉的那些成分的所需其他成分。在制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選制備方法是真空干燥以及冷凍干燥(凍干)，這從先前無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
可與載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量取決于所治療的受試者以及具體給予模式而變化?？膳c載體材料組合以便產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量總體上是產(chǎn)生治療效果的組合物的量。總體上，在一百個(gè)百分?jǐn)?shù)中，此量在從約0.01百分?jǐn)?shù)至約九十九百分?jǐn)?shù)的活性成分的范圍內(nèi)，優(yōu)選地從約O.1百分?jǐn)?shù)至約70百分?jǐn)?shù)，最優(yōu)選地從約 I百分?jǐn)?shù)至約30百分?jǐn)?shù)的活性成分以及藥學(xué)上可接受的載體。
將劑量方案加以調(diào)整以便提供最佳所希望應(yīng)答(例如治療應(yīng)答)。例如，可以給予單次丸劑，可隨著時(shí)間的推移來(lái)給予多個(gè)分次劑量或劑量可按治療情況的緊急狀態(tài)指示來(lái)按比例減少或增加。尤其有利的是將腸胃外組合物配制成劑量單位形式以實(shí)現(xiàn)方便給予以及劑量均勻性。如在此使用的劑量單位形式是指適合作為用于待治療的受試者的單一劑量的物理上離散單位；每個(gè)單位含有預(yù)定數(shù)量的經(jīng)過(guò)計(jì)算結(jié)合所需藥用載體可產(chǎn)生所希望治療效果的活性化合物。根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的劑量單位形式的規(guī)格由以下因素支配以及直接取決于以下因素(a)活性化合物的獨(dú)特特征以及待達(dá)到的特定治療效果， 以及(b)調(diào)配這種活性化合物以便治療個(gè)體的感受性的領(lǐng)域中固有的限制。
本發(fā)明的組合物可經(jīng)由一種或多種給予途徑、使用在本領(lǐng)域中已知的各種方法中的一種或多種來(lái)給予。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，給予途徑和/或模式取決于所希望結(jié)果而變化。根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的治療劑的優(yōu)選給予途徑包括血管內(nèi)遞送(例如注射或輸注)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊柱、口服、腸內(nèi)、直腸、肺部(例如吸入)、鼻腔、外用(包括經(jīng)皮膚、口 腔以及舌下)、膀胱內(nèi)、玻璃體內(nèi)、腹膜內(nèi)、陰道、大腦遞送 (例如腦室內(nèi)、大腦內(nèi)以及對(duì)流增強(qiáng)擴(kuò)散)、CNS遞送(例如鞘內(nèi)、髓周以及脊柱內(nèi))或腸胃外(包括皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)(I V )以及真皮內(nèi))、經(jīng)皮膚(被動(dòng)地或使用離子電滲或電穿孔)、經(jīng)粘膜(例如舌下給予、鼻腔、陰道、直腸或舌下)給予或經(jīng)由植入物給予，或其他腸胃外給予途徑，例如通過(guò)注射或輸注，或在本領(lǐng)域中已知的其他遞送途徑和/或給予形式。 如在此使用的短語(yǔ)“腸胃外給予”是指除腸內(nèi)以及局部給予以外的通常通過(guò)注射實(shí)現(xiàn)的給予模式，并且包括(不局限于)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、包膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜上以及胸骨內(nèi)注射和輸注或使用可生物蝕解的插入物，并且可配制成適合于每一種給予途徑的劑型。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的蛋白、治療劑或藥用組合物可腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給予。
本發(fā)明的組合物在以具有小于約5微米的氣體動(dòng)力學(xué)直徑的氣溶膠亦或噴霧干燥顆粒形式遞送時(shí)，可以在吸入時(shí)被遞送至肺并且橫穿肺上皮襯里到達(dá)血流。可使用被設(shè)計(jì)成經(jīng)肺部遞送治療產(chǎn)品的廣泛范圍的機(jī)械裝置，包括但不局限于霧化器、計(jì)量劑量吸入器以及粉末吸入器，這些全部是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的?？少?gòu)得裝置的一些具體實(shí)例是Ultravent霧化器(馬林克羅制藥公司(Mallinckrodt Inc.),密蘇里州圣路易斯(St. Louis, Mo. )) ;Acorn II 霧化器(Marquest Medical Products,科羅拉多州恩格爾伍德 (Englewood, Colo. )) ；Ventolin計(jì)量劑量吸入器(Glaxo Inc.,北卡羅來(lái)納州研究三角園 (Research Triangle Park, N. C.));以及 Spinhaler 粉末吸入器(Fisons Corp.公司，馬薩諸塞州貝德福德(Bedford, Mass. ))。Nektar、Alkermes以及Mannkind都具有經(jīng)過(guò)批準(zhǔn)或處于臨床試驗(yàn)中的可吸入胰島素粉末制劑，其中這種技術(shù)可應(yīng)用于在此描述的配制品。
在一些體內(nèi)方法中，在此披露的組合物以治療有效量給予至受試者。如在此使用， 術(shù)語(yǔ)“有效量”或“治療有效量”是指足以治療、抑制或減輕所治療的病癥的一個(gè)或多個(gè)癥狀或以其他方式提供所希望藥理和/或生理效應(yīng)的劑量。確切劑量將根據(jù)各種因素，例如受試者依賴變量(例如年齡、免疫系統(tǒng)健康狀況、等)、疾病以及所實(shí)現(xiàn)的治療而變化。對(duì)于在此披露的多肽組合物以及編碼它們的核酸，在進(jìn)行進(jìn)一步研究時(shí)，關(guān)于治療不同患者的不同病狀的適當(dāng)劑量水平的信息將出現(xiàn)，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，考慮到接受者的治療情況、年齡以及一般健康狀況，將能夠確定適當(dāng)劑量。選擇的劑量取決于所希望的治療效果、 給予途徑以及所希望治療的持續(xù)時(shí)間。對(duì)于多肽組合物，通常將每天O. 0001至100mg/kg體重的劑量水平給予至哺乳動(dòng)物并且更通常為0. 001至20mg/kg。例如，劑量可為0. 3mg/kg 體重、lmg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或在Ι-lOmg/kg范圍內(nèi)。示例性治療方案必須每周給予一次、每?jī)芍芤淮巍⒚咳芤淮?、每四周一次、每月一次、?個(gè)月一次或每3至6個(gè)月一次。通常，對(duì)于靜脈內(nèi)注射或輸注，劑量可以更低。劑量方案經(jīng)過(guò)調(diào)整以便提供最佳所希望應(yīng)答(例如治療應(yīng)答)。例如，可給予單次丸劑，可隨著時(shí)間的推移來(lái)給予若干分次劑量或劑量可按治療情況的緊急狀態(tài)指示來(lái)按比例減少或增加。尤其有利的是將腸胃外組合物配制成劑量單位形式，以實(shí)現(xiàn)方便給予以及劑量均勻性。如在此使用的劑量單位形式是指適合作為用于待治療的受試者的單一劑量的物理上離散單位；每個(gè)單位含有預(yù)定數(shù)量的經(jīng)過(guò)計(jì)算結(jié)合所需藥用載體以產(chǎn)生所希望治療效果的活性化合物。根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的劑量單位形式的規(guī)格由以下因素支配以及直接取決于以下因素(a)活性化合 物的獨(dú)特特征以及待達(dá)到的特定治療效果，以及(b)調(diào)配這種活性化合物以便治療個(gè)體的感受性的領(lǐng)域中固有的限制。
任選地，根據(jù)任何適合的定時(shí)方案，多肽制劑可以O(shè). 0001至100mg/kg患者體重/ 天之間的量給予，優(yōu)選為O. 001至20. Omg/kg/天之間。根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的治療組合物可例如每天三次、每天兩次、每天一次、每周三次、每周兩次或每周一次、每?jī)芍芑?、4、5、6、7或8周一次來(lái)給予。此外，組合物可給予短或長(zhǎng)時(shí)期(例如I周、I月、I年、5 年)。
可替代地，治療劑可以持續(xù)釋放配制品形式給予，在此情況下所要求的給予頻率更小。劑量和頻率取決于治療劑在患者體內(nèi)的半衰期而變化?？傮w上，人類(lèi)抗體展示最長(zhǎng)半衰期，隨后為人源化抗體、嵌合抗體以及非人類(lèi)抗體。融合蛋白的半衰期可廣泛地變化。給予劑量和頻率可取決于治療是預(yù)防性或是治療性而變化。在預(yù)防性應(yīng)用中，相對(duì)較低劑量以相對(duì)稀少的間隔在長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)給予。一些患者在其余生繼續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中， 有時(shí)要求相對(duì)較短間隔下的相對(duì)較高劑量直到疾病進(jìn)展減少或終止為止，并且優(yōu)選地直到患者展示疾病癥狀的部分或完全改進(jìn)為止。此后，可向患者給予預(yù)防方案。
本發(fā)明的藥用組合物中的活性成分的實(shí)際劑量水平可改變以便獲得對(duì)于具體患者、組合物以及給予模式可有效實(shí)現(xiàn)所希望治療應(yīng)答，而對(duì)患者無(wú)毒的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于各種藥代動(dòng)力學(xué)因素，包括所使用的本發(fā)明的具體組合物的活性、給予途徑、給予時(shí)間、所使用的具體化合物的排泄速率、治療持續(xù)時(shí)間、與所使用的具體組合物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料、所治療的患者的年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況以及以前病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域熟知的類(lèi)似因素。
“治療有效劑量”的C10RF32可溶性蛋白或C10RF32胞外域或含有它們的C10RF32 融合蛋白優(yōu)選地引起疾病癥狀的嚴(yán)重度降低、無(wú)病癥期的頻率以及持續(xù)時(shí)間增加、壽命增加、疾病緩解，或預(yù)防或減少歸因于疾病折磨的損害或傷殘。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠基于諸如受試者體型、受試者癥狀的嚴(yán)重度以及所選擇的具體組合物或給予途徑的因素來(lái)確定治療有效量。
在某些實(shí)施方案中，多肽組合物例如通過(guò)直接注射至待治療的部位來(lái)局部給予。 典型地，該注射引起多肽組合物的局部濃度增加，它大于可通過(guò)全身給予而獲得的濃度。例如，在如多發(fā)性硬化的神經(jīng)病癥的情況下，蛋白可局部給予至CNS附近的部位。在另一個(gè)實(shí)例中，如在如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)病癥的情況下，蛋白可局部給予至患病關(guān)節(jié)中的滑膜。 多肽組合物可與如上所述的基質(zhì)組合以便通過(guò)減少多肽從待治療的部位中被動(dòng)擴(kuò)散出來(lái)而幫助建立多肽組合物的增加的局部濃度。
本發(fā)明的藥用組合物可用在本領(lǐng)域中已知的醫(yī)學(xué)裝置來(lái)給予。例如，在一個(gè)任選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的藥用組合物可用針皮下注射裝置來(lái)給予，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，399，163 ;5，383,851 ;5，312，335 ;5，064，413 ;4，941,880 ； 4，790，824 ;或4，596，556中披露的裝置。適用于本發(fā)明的熟知植入物以及模塊的實(shí)例包括美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，487，603，它披露用于以受控速率分配藥物的可植入微輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，486，194，它披露經(jīng)由皮膚給予藥物的治療裝 置；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，447，233，它披露以精確輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，447，224，它披露用于連續(xù)藥物遞送的變速流可植入輸注設(shè)備；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，439，196，它披露具有多腔室隔室的滲透藥物遞送系統(tǒng)；以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，475，196，它披露滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合在此。許多其他這類(lèi)植入物、遞送系統(tǒng)以及模塊是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
活性化合物可用保護(hù)化合物以便避免快速釋放的載體來(lái)制備，例如受控釋放制劑，包括植入物、經(jīng)皮貼片以及微囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾摹⑸锵嗳莸木酆衔?，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯以及聚乳酸。制備這類(lèi)制劑的許多方法是授予專(zhuān)利的或通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見(jiàn)例如持續(xù)以及受控釋放藥物遞送系統(tǒng)(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems), J. R. Robinson (羅賓遜)編著，Marcel Dekker, Inc.公司，紐約市(New York)，1978。
治療組合物可用在本領(lǐng)域中已知的醫(yī)學(xué)裝置來(lái)給予。例如，在一個(gè)任選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的治療組合物可用針皮下注射裝置來(lái)給予，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，399，163 ;5，383，851 ;5，312，335 ;5，064，413 ;4，941，880 ;4，790，824 ；或 4，596，556中披露的裝置。適用于本發(fā)明的熟知植入物以及模塊的實(shí)例包括美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，487，603，它披露用于以受控速率分配藥物的可植入微輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，486，194， 它披露經(jīng)由皮膚給予藥物的治療裝置；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，447，233，它披露以精確輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，447，224，它披露用于連續(xù)藥物遞送的變速流可植入輸注設(shè)備；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，439，196，它披露具有多腔室隔室的滲透藥物遞送系統(tǒng)；以及美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，475，196，它披露滲透藥物遞送系統(tǒng)。這些專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合在此。許多其他這類(lèi)植入物、遞送系統(tǒng)以及模塊是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的C10RF32可溶性蛋白、 C10RF32胞外區(qū)、C10RF32融合蛋白、其他蛋白或其他治療劑可經(jīng)過(guò)配制以便確保在體內(nèi)的適當(dāng)分布。例如，血腦屏障(BBB)排除許多高度親水性化合物。為了確保根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的治療化合物穿過(guò)BBB (如果希望)，它們可例如在脂質(zhì)體中進(jìn)行配制。制造脂質(zhì)體的方法參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，522，811 ;5，374，548;以及5，399，331。脂質(zhì)體可以包括被選擇性運(yùn)輸至特定細(xì)胞或器官中，由此增強(qiáng)靶向藥物遞送的一個(gè)或多個(gè)部分(參見(jiàn)例如 V. V. Ranade (蘭納德)(1989)臨床藥理學(xué)雜志(J. Clin. Pharmacol. ) 29:685)。示例性靶向部分包括葉酸或生物素(參見(jiàn)例如Low (勞)等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，416，016);甘露糖苷(Umezawa (梅澤)等人，(1988)生物化學(xué)和生物物理研究通訊(Biochem. Biophys. Res. Commun. )153:1038);抗體(P. G. Bloeman (布羅曼)等人(1995)歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟快訊 (FEBS Lett. )357:140 ；M. Owais (歐維斯)等人(1995)抗微生物制劑和化療(Antimicrob. Agents Chemother. ) 39:180);表面活性劑蛋白A受體(Briscoe (布里斯科)等人(1995) 美國(guó)生理學(xué)雜志(Am. J Physiol. ) 1233:134)；pl20 (Schreier (施雷爾)等人(1994)生物化學(xué)雜志(J. Biol. Chem. ) 269:9090);也參見(jiàn) K. Keinanen (凱納門(mén));M. L. Laukkanen (勞卡南)(1994)歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟快訊(FEBS Lett. ) 123 ；J. J. Killion (基萊恩);1. J. Fidler (菲德勒)(1994)免疫方法(Immunomethods) 4:273。
腸胃外給予的配制品
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在此披露的組合物，包括含有肽和多肽的那些，以水溶液形式通過(guò)腸胃外注射來(lái)給予。這種制劑也可呈懸浮液 或乳液形式。通常，所提供的藥用組合物包含有效量的肽或多肽，并且任選地包括藥學(xué)上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。這類(lèi)組合物任選地包括以下物質(zhì)中的一種或多種稀釋劑、無(wú)菌水、不同緩沖內(nèi)容物(例如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH以及離子強(qiáng)度的緩沖鹽水；以及添加劑，例如清潔劑和增溶劑(例如，TWEEN20 (聚山梨醇酯-20)，TWEEN80 (聚山梨醇酯-80 ))、抗氧化劑(例如水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉；油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁羥茴醚 (BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒(méi)食子酸丙酯、α-生育酚；以及金屬螯合劑，例如檸檬酸、 乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸，以及防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇)以及增量物質(zhì)(例如乳糖、甘露糖醇)。非水性溶劑或媒介物的實(shí)例是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油 (例如橄欖油和玉米油)、明膠，以及可注射有機(jī)酯，例如油酸乙酯。這些制劑可冷凍干燥(凍干)或真空干燥并且在即將使用之前再溶解/再懸浮。這種制劑可通過(guò)例如經(jīng)由細(xì)菌保留過(guò)濾器來(lái)過(guò)濾，將滅菌劑并入組合物中，照射組合物，或加熱組合物來(lái)滅菌。
局部給予的配制品
在此披露的C10RF32多肽、片段、融合多肽、核酸以及載體可以局部應(yīng)用。局部給予對(duì)于大多數(shù)肽配制品并不能良好地起作用，但是如果應(yīng)用至肺、鼻腔、口腔(舌下、頰腔)、 陰道或直腸粘膜，它可以是尤其有效的。
組合物在以具有小于約5微米的氣體動(dòng)力學(xué)直徑的氣溶膠或噴霧干燥顆粒形式遞送時(shí)可在吸入時(shí)被遞送至肺并且橫穿肺上皮襯里到達(dá)血流。
可使用被設(shè)計(jì)成經(jīng)肺部遞送治療產(chǎn)品的廣泛范圍的機(jī)械裝置，包括但不局限于霧化器、計(jì)量劑量吸入器以及粉末吸入器，這些全部是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的?？少?gòu)得裝置的一些具體實(shí)例是Ultravent霧化器(馬林克羅制藥公司(Mallinckrodt Inc.),密蘇里州圣路易斯(St. Louis, Mo. )) ;Acorn II 霧化器(Marquest Medical Products,科羅拉多州恩格爾伍德(Englewood, Colo. )) ;Ventolin計(jì)量劑量吸入器(Glaxo Inc.公司，北卡羅來(lái)納州研究三角園(Research Triangle Park, N. C.));以及 Spinhaler 粉末吸入器(Fisons Corp.公司,馬薩諸塞州貝德福德(Bedford, Mass. ))。Nektar>Alkermes 以及 Mannkind 都具有經(jīng)過(guò)批準(zhǔn)或處于臨床試驗(yàn)中的可吸入胰島素粉末制劑，其中這種技術(shù)可應(yīng)用于在此描述的配制品。
給予至粘膜的配制品典型地將是噴霧干燥的藥物顆粒，它們可并入片劑、凝膠劑、 膠囊劑、懸浮液或乳液中。標(biāo)準(zhǔn)藥用賦形劑從任何配方設(shè)計(jì)師處可獲得。口服制劑可呈口香糖、凝膠條、片劑或錠劑形式。
還可制備經(jīng)皮配制品。這些通常是軟膏、洗劑、噴霧劑或貼片，全部可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)制備。經(jīng)皮配制品需要包括滲透促進(jìn)劑。
控制遞送聚合物基質(zhì)
在此披露的C10RF32多肽、片段、融合多肽、核酸以及載體也可以在受控釋放配制品中給予。可制造受控釋放聚合物裝置以便在植入聚合物裝置(桿、圓柱體、膜、盤(pán))或注射 (微粒)之后全身性長(zhǎng)期釋放?；|(zhì)可呈例如微球的微粒形式，其中肽分散于固體聚合物基質(zhì)或微膠囊中，其中核心具有與聚合物外殼不同的材料，并且肽是分散或懸浮于在性質(zhì)上可為液體或固體的核心中。除非在此明確定義，否則微粒、微球以及微膠囊可互換使用。可替代地，聚合物可鑄造成從數(shù)納米至四厘米范圍內(nèi)的薄板或膜、通過(guò)研磨或其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生的粉末，或甚至例如水凝膠的凝膠。
可使用不可生物降解亦或可生物降解的基質(zhì)遞送多肽或編碼多肽的核酸，但是可生物降解基質(zhì)是優(yōu)選的。這些基質(zhì)可以為天然或合成聚合物，但是合成聚合物由于降解以及釋放概況的更好表征而為優(yōu)選的。該聚合物是基于所希望的釋放時(shí)段來(lái)選擇的。在一些情況下，線性釋放可為最有用的，但是在其他情況下脈沖釋放或“整體釋放”可提供更有效的結(jié)果。聚合物可以呈水凝膠(通常吸收多達(dá)按重量計(jì)約90%的水)形式，并且可任選地與多價(jià)離子或聚合物交聯(lián)。
基質(zhì)可通過(guò)溶劑蒸發(fā)、噴霧干燥、溶劑萃取以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法來(lái)形成?？缮镂g解的微球可使用開(kāi)發(fā)用于制造微球以便進(jìn)行藥物遞送的任何方法來(lái)制備，這些方法例如由Mathiowitz (馬西威茲)和Langer (朗格爾)，受控釋放雜志(受控釋放雜志)(J. Controlled Release)，5:13-22 (1987) ；Mathiowitz (馬西威茲)等人，反應(yīng)性聚合物(Reactive Polymers), 6:275-283 (1987);以及 Mathiowitz (馬西威茲)等人，應(yīng)用高分子科學(xué)雜志(J. Appl Polymer ScL)，35:755-774 (1988)來(lái)描述。
這些裝置可經(jīng)過(guò)配制用于局部釋放來(lái)治療植入或注射區(qū)域一通常遞送比用于治療整個(gè)身體或全身遞送的劑量少得多的劑量。這些裝置可被植入或注射至皮下、肌內(nèi)、脂肪或被吞咽。
C10RF32的診斷用途
根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的可溶性多肽也可用能夠直接或間接地提供可檢測(cè)信號(hào)的標(biāo)記來(lái)修飾，該標(biāo)記包括但不局限于放射性同位素以及熒光化合物。這類(lèi)經(jīng)過(guò)標(biāo)記的多肽可用于不同用途，包括但不局限于疾病和/或指示病狀的預(yù)后、預(yù)測(cè)、篩選、早期診斷、確定進(jìn)展、療法選擇以及治療監(jiān)測(cè)，如以上詳述。
根據(jù)至少一些實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種對(duì)器官或組織成像的方法，該方法包括 (a)向需要這種成像的受試者給予一種經(jīng)過(guò)標(biāo)記的多肽；以及(b)檢測(cè)該經(jīng)過(guò)標(biāo)記的多肽以便確定經(jīng)過(guò)標(biāo)記的多肽集中于受試者體內(nèi)的位置。當(dāng)用于成像應(yīng)用中時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的經(jīng)過(guò)標(biāo)記的多肽通常具有與其共價(jià)或非共價(jià)附接的成像劑。適合的成像劑包括但不局限于放射性核素、可檢測(cè)標(biāo)簽、熒光團(tuán)、熒光蛋白、酶蛋白、以及類(lèi)似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉將成像劑連接至多肽的其他方法。例如，成像劑可經(jīng)由部位特異性偶聯(lián)來(lái)附接，例如，將成像劑共價(jià)附接至肽連接物，例如存在于Fe融合分子的羧基末端的具有五個(gè)至七個(gè)精氨酸的聚精氨酸部分。成像劑還可直接經(jīng)由非位點(diǎn)特異性偶聯(lián)來(lái)連接，例如， 將成像劑共價(jià)附接至存在于多肽中的伯胺基團(tuán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到成像劑還可經(jīng)由非共價(jià)相互作用(例如離子鍵、疏水性相互作用、氫鍵、范德華力、雙極子-雙極子鍵等)來(lái)結(jié)合至蛋白。
在某些情況下，通過(guò)將放射性核素直接附接至多肽來(lái)將多肽用放射性核素進(jìn)行放射性標(biāo)記。在某些其他實(shí)例中，放射性核素結(jié)合至螯合劑或附接至多肽的螯合劑-連接物。 用于直接偶聯(lián)的合適放射性核素包括但不局限于18F、1241、1251、131I及其混合物。與螯合劑一起使用的合適放射性核素包括但不局限于、47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、 105Rh、lllAg、lllIn、117m Sn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi 及其混合物。優(yōu)選地，結(jié)合至螯合劑的放射性核素是64Cu、90Y、IllIn或其混合物。適合的螯合劑包括但不局限于DOTA、BAD、TETA, DTPA, EDTA、NTA, HDTA、其膦酸酯類(lèi)似物及其混合物。 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉將放射性核素、螯合劑以及螯合劑-連接物附接至本發(fā)明的多肽的 方法。具體地說(shuō)，附接可便利地使用例如可購(gòu)得的雙官能連接基團(tuán)(通常為異雙官能連接基團(tuán))來(lái)完成，這些連接基團(tuán)可附接至存在于多肽的無(wú)干擾位置中的官能團(tuán)，并且然后進(jìn)一步連接至放射性核素、螯合劑或螯合劑-連接物。
適合于用作成像劑的熒光團(tuán)或熒光染料的非限制實(shí)例包括Alexa Fluor 染料(英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen Corp.);加利福尼亞州卡爾斯巴德 (Carlsbad, Calif.))、突光素、異硫氰酸突光素(FITC)、OregonGreen ;若丹明、得克薩斯紅、異硫氰酸四若丹明(TRITC)、CyDye 熒光劑(例如C Y 2、C Y 3、C Y 5)等等。
適合于用作成像劑的熒光蛋白的實(shí)例包括但不局限于綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白(例如DsRed)、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白以及其變體(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，403，374、6，800，733以及7，157,566)。GFP變體的具體實(shí)例包括但不局限于增強(qiáng)型GFP (EGFP)、去穩(wěn)定EGFP、描述于Doan (道安)等人，分子微生物學(xué)(Mol. Microbiol. ), 55:1767-1781 (2005)中的GFP變體、描述于Crameri (克萊默里)等人，自然生物技術(shù)(Nat. Biotechnol. )，14:315-319(1996)中的 GFP 變體、描述于 Rizzo (里佐)，自然生物技術(shù)(Nat. Biotechnol), 22:445 (2004)以及Tsien (錢(qián))，生物化學(xué)綜合年刊(Annu. Rev. Biochem. ),67:509(1998)中的蔚藍(lán)色熒光蛋白，以及描述于Nagal (內(nèi)格爾)等人， 自然 生物技術(shù)(Nat. Biotechnol. ),20:87-90(2002)中的黃色熒光蛋白。DsRed變體描述于例如 Shaner (謝恩)等人，自然生物技術(shù)(Nat. Biotechnol. )，22:1567-1572 (2004) 中并且包括 mStrawberry、mCherry、morange、mBanana、mHoneydew 以及 mTangerine。另外的DsRed變體描述于例如Wang (王)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad. Sc1. )U. S. A.，101:16745-16749(2004)中并且包括 mRaspberry 和 mPlum。DsRed 變體的另外實(shí)例包括描述于Fischer (菲舍爾)等人，歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟快訊(FEBS Lett. )，577:227-232(2004)中的mRFPmars以及描述于Fischer (菲舍爾)等人，歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟快訊(FEBS Lett. )，580:2495-2502(2006)中的 mRFPruby。
在其他實(shí)施方案中，結(jié)合至根據(jù)本發(fā)明的至少一些實(shí)施方案的多肽的成像劑包括可檢測(cè)標(biāo)簽，例如像生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或中性鏈親和素。在其他實(shí)施方案中，成像劑包括酶蛋白，包括但不局限于熒光素酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶、β -葡糖醛酸酶、辣根過(guò)氧物酶、木聚糖酶、堿性磷酸酶、以及類(lèi)似物。
在本領(lǐng)域中已知用于檢測(cè)受試者體內(nèi)的放射性核素的放射性發(fā)射的任何裝置或方法是適用于本發(fā)明的。例如，像使用旋轉(zhuǎn)Y射線攝像機(jī)來(lái)檢測(cè)單光子Y-發(fā)射放射性核素的輻射的單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)控制斷層攝影術(shù)(SPECT)，以及使用閃爍Y射線攝像機(jī)來(lái)獲得放射性核素在組織、器官或身體系統(tǒng)中的分布的一個(gè)圖像或一系列連續(xù)圖像的放射性 核素閃爍照相法的方法，可以用于檢測(cè)從本發(fā)明的放射性標(biāo)記多肽發(fā)出的輻射。正電子發(fā)射斷層術(shù)(PET)是用于檢測(cè)受試者體內(nèi)的輻射的另一種合適技術(shù)。旨在用于醫(yī)學(xué)用途的微型并且靈活的輻射檢測(cè)器由Intra-Medical LLC (加利福尼亞州圣塔莫尼卡(Santa Monica, Calif.))生產(chǎn)。磁共振成像(MRI)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他成像技術(shù)也適合于檢測(cè)放射性核素的放射性發(fā)射。不管所使用的方法或裝置為何，這種檢測(cè)旨在確定經(jīng)過(guò)標(biāo)記的多肽集中于受試者體內(nèi)的位置，并且這種濃度是疾病活性的指標(biāo)。
動(dòng)物和人類(lèi)的非侵入性熒光成像還可提供體內(nèi)診斷信息并且用于多種臨床專(zhuān)科中。例如，多年以來(lái)已開(kāi)發(fā)出用于在UV激發(fā)之后進(jìn)行簡(jiǎn)單眼部觀察直至使用先進(jìn)設(shè)備進(jìn)行復(fù)雜光譜成像的技術(shù)(參見(jiàn)例如Andersson (安德森)-Engels (恩格斯)等人，醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的物理學(xué)(Phys.Med.Biol. ),42:815-824(1997))。在本領(lǐng)域中已知的用于體內(nèi)檢測(cè)例如來(lái)自熒光團(tuán)或熒光蛋白的熒光的特定裝置或方法包括但不局限于體內(nèi)近紅外熒光(參見(jiàn)例如Frangioni (弗蘭基尼)，化學(xué)生物學(xué)目前觀點(diǎn) (Curr. Opin. Chem. Biol. ) ,7:626-634(2003) )、Maestro 體內(nèi)熒光成像系統(tǒng)(美國(guó)劍橋科研儀器公司(Cambridge Research&Instrumentation, Inc.);馬薩諸塞州沃本市 (Woburn, Mass.))、使用飛點(diǎn)掃描器的體內(nèi)突光成像(參見(jiàn)例如Ramanujam (拉馬努詹)等人，電氣和電子工程師學(xué)會(huì)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)報(bào)(IEEE Transactions on Biomedical Engineering) , 48:1034-1041 (2001)、等。
用于檢測(cè)光學(xué)應(yīng)答的其他方法或裝置包括但不局限于目視檢查、CXD攝像機(jī)、視頻攝像機(jī)、攝影膠片、激光掃描裝置、熒光計(jì)、光電二極管、量子計(jì)數(shù)器、落射熒光顯微鏡、掃描顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀或使用光電倍增器管的信號(hào)放大。
本發(fā)明進(jìn)一步由以下與C10RF32抗原、其域以及表達(dá)數(shù)據(jù)相關(guān)的實(shí)例連同描述其完全人類(lèi)抗體的制造的預(yù)測(cè)實(shí)例來(lái)說(shuō)明。此信息以及實(shí)例是說(shuō)明性的并且不應(yīng)被視為進(jìn)一步限制。貫穿本申請(qǐng)引用的所有圖以及所有參考文獻(xiàn)、專(zhuān)利以及公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容明確地通過(guò)引用結(jié)合在此。
實(shí)例
實(shí)例I
H19011_l 簇(H19011)的描述
本發(fā)明涉及C10RF32多肽、以及基于其的診斷劑和治療劑。
應(yīng)當(dāng)指出的是這些變體最初披露于與本申請(qǐng)共同擁有的PCT申請(qǐng)?zhí)?W02009/032845中，該申請(qǐng)通過(guò)弓I用結(jié)合在此，如同完全在此闡明一樣。
H19011_l簇(內(nèi)部ID76432827)特征為所感興趣的2個(gè)轉(zhuǎn)錄物和5個(gè)片段，其名稱分別在表I和2中給出。選擇的蛋白變體在表3中給出。
表1-所感興趣的轉(zhuǎn)錄物
權(quán)利要求
1.一種包括能夠抑制T細(xì)胞活化的可溶性C10RF32多肽或其片段或變體的分離的多肽用于治療以下疾病中的一種或多種的用途良性多發(fā)性硬化、復(fù)發(fā)緩解性多發(fā)性硬化、繼發(fā)性進(jìn)行性多發(fā)性硬化、原發(fā)性進(jìn)行性多發(fā)性硬化、進(jìn)行性復(fù)發(fā)多發(fā)性硬化、慢性進(jìn)行性多發(fā)性硬化、過(guò)渡性/進(jìn)行性多發(fā)性硬化、快速惡化性多發(fā)性硬化、臨床確診的多發(fā)性硬化、 又稱為馬爾堡變種(Marburg’s Variant)的惡性多發(fā)性硬化，以及急性多發(fā)性硬化,或選自下組的與多發(fā)性硬化有關(guān)的病狀，該組由以下各項(xiàng)組成德維克氏病(Devic’s disease), 又稱為視神經(jīng)脊髓炎；急性散播性腦脊髓炎、急性脫髓鞘性視神經(jīng)炎、脫髓鞘橫貫性脊髓炎、米勒_費(fèi)歇爾綜合征(Miller-Fisher syndrome)、腦脊髓神經(jīng)根神經(jīng)病、急性脫髓鞘多神經(jīng)病、腫脹性多發(fā)性硬化以及Balo同心圓性硬化；或以下疾病中的一種或多種痛風(fēng)以及假性痛風(fēng)、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、幼年類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、斯提耳氏病(Still’s disease)、 強(qiáng)直性脊柱炎、類(lèi)風(fēng)濕性脈管炎，或選自下組的與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)的病狀，該組由以下各項(xiàng)組成骨關(guān)節(jié)炎、肉狀瘤病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、膿毒性關(guān)節(jié)炎、血色病、肝炎、脈管炎、韋格納氏肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)、萊姆氏病(Lyme disease)、家族性地中海熱、具有回歸熱的高免疫球蛋白血癥D、TNF受體相關(guān)周期性綜合征，以及與炎癥性腸病相關(guān)的腸病性關(guān)節(jié)炎；或以下疾病中的一種或多種前葡萄膜炎(或虹膜睫狀體炎)、中間葡萄膜炎(扁平部睫狀體炎)、后葡萄膜炎(或脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎)以及全葡萄膜炎形式；或以下疾病中的一種或多種克羅恩氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、膠原性結(jié)腸炎、淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎、缺血性結(jié)腸炎、改道性結(jié)腸炎、貝切特氏病(Behcet’s disease)、未確定的結(jié)腸炎； 或以下疾病中的一種或多種非膿皰性牛皮癬，包括尋常性牛皮癬以及牛皮癬性紅皮癥(紅皮性牛皮癬)；膿皰性牛皮癬，包括泛發(fā)性膿皰性牛皮癬(宗布什膿皰性牛皮癬(pustular psoriasis of von Zumbusch))、掌妬膿皰病(永久性掌妬膿皰病、理發(fā)師類(lèi)型的膿皰性牛皮癖(pustular psoriasis ofthe Barber type)、四肢膿皰性牛皮癖)、環(huán)狀膿皰性牛皮癬、持續(xù)性肢端皮炎、皰疹樣膿皰??；藥物誘導(dǎo)的牛皮癬、皮褶牛皮癬、尿布區(qū)牛皮癬、脂溢性皮炎樣牛皮癬、滴狀牛皮癬、指甲牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎；或以下疾病中的一種或多種 胰島素依賴性糖尿病、特發(fā)性糖尿病、幼年I型糖尿病、青春晚期糖尿病、成人隱匿性自身免疫性糖尿病、妊娠糖尿病；神經(jīng)病變，包括多神經(jīng)病變、單神經(jīng)病變、周?chē)窠?jīng)病變以及自主神經(jīng)病變；青光眼、白內(nèi)障或視網(wǎng)膜病變；或以下疾病中的一種或多種原發(fā)性舍格倫氏綜合征(Primary Sjogren’s syndrome),繼發(fā)性舍格倫氏綜合征(Secondary Sjogren’s syndrome),結(jié)締組織疾病,例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,全身性紅斑狼瘡，硬皮病，肺炎，肺纖維化，間質(zhì)性腎炎，腎臟過(guò)濾器周?chē)M織的炎癥，腎小球性腎炎，腎小管性酸中毒，腕管綜合征，周?chē)窠?jīng)病變，顱神經(jīng)病變，原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)，肝硬化，食道、胃、胰腺以及肝臟(包括肝炎)的炎癥，多肌炎，雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud’s phenomenon),脈管炎，自身免疫甲狀腺問(wèn)題，淋巴瘤；以下疾病中的一種或多種盤(pán)狀狼瘡、狼瘡性關(guān)節(jié)炎、狼瘡性肺炎、狼瘡性腎炎，或選自下組的與全身性紅斑狼瘡有關(guān)的病狀，該組由以下各項(xiàng)組成骨關(guān)節(jié)結(jié)核、 抗磷脂抗體綜合征、心臟各個(gè)部分的炎癥(例如心包炎、心肌炎以及心內(nèi)膜炎)、肺和胸膜炎癥、胸膜炎、胸膜腔積液、慢性彌散性間質(zhì)性肺病、肺動(dòng)脈高壓、肺栓塞、肺出血，以及肺萎縮綜合征、狼瘡性頭痛、格-巴二氏綜合征(Guillain-Barre syndrome)、無(wú)菌性腦膜炎、脫髓鞘性綜合征、單神經(jīng)病變、多發(fā)性單神經(jīng)炎、重癥肌無(wú)力、脊髓病變、顱神經(jīng)病變、多神經(jīng)病變、脈管炎。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白的用途，其中該C10RF32多肽直接或間接地經(jīng)由一個(gè)連接物肽、多肽序列或化學(xué)連接物融合至一個(gè)異源序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中該C10RF32多肽包括C10RF32的細(xì)胞外域、或其片段或變體，或包括 H19011_1_P8 (SEQ ID 號(hào)4)、H19011_1_P8_V1 (SEQ ID 號(hào)5)、 H19011丄P9 (SEQ ID號(hào)6)或H19011_1_P9_V1 (SEQ ID號(hào)34)的細(xì)胞外域的多肽、或其片段或變體或同源物。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其中該C10RF32多肽選自下組，該組由包含與以下氨基酸殘基具有至少95%序列一致性的氨基酸殘基序列的多肽組成與在SEQ ID號(hào)14中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P8(SEQID號(hào)4)的氨基酸殘基21-186，或與在SEQ ID號(hào)35 中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P8_V1(SEQ ID號(hào)5)的殘基21-186，或與在SEQ ID 號(hào)15中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9(SEQ ID號(hào):6)的殘基21-169，或與在SEQ ID號(hào):36中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID號(hào):34)的殘基21-169， 或與在SEQ ID號(hào)37中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的序列H19011_1_P8 (SEQ ID號(hào)4)的殘基1-184，或與在SEQ ID號(hào)19中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的序列H19011丄P8_V1 (SEQ ID 號(hào)5)的殘基1-184，或與在SEQ ID號(hào)28中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9 (SEQ ID號(hào):6)的殘基1-169，或與在SEQ ID號(hào):30中描繪的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的H19011_1_P9_V1 (SEQ ID 號(hào):34)的殘基 1-169。
5.如權(quán)利要求2所述的用途，其中該異源序列包括一個(gè)免疫球蛋白恒定域的至少一部分。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其中該融合蛋白包括對(duì)應(yīng)于選自下組的抗體同種型的一個(gè)免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，該組由以下各項(xiàng)組成IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA以及 IgD0
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其中該免疫球蛋白恒定域包括選自下組的一個(gè)人IgG免疫球蛋白的鉸鏈、CH2以及CH3區(qū)，該組由以下各項(xiàng)組成Cy1、Cy2、Cy3以及Cy4鏈。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的用途，其中該融合蛋白進(jìn)一步包括介導(dǎo)該融合蛋白的二聚化或多聚化以便形成同源二聚體、異源二聚體、同源多聚體或異源多聚體的一個(gè)域。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其中該介導(dǎo)二聚化或多聚化的域選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成能夠與伴侶融合蛋白上的半胱氨酸形成分子間二硫鍵的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸、 一個(gè)卷曲螺旋域、一個(gè)酸補(bǔ)片、一個(gè)鋅指域、一個(gè)鈣手性域、一個(gè)CHI區(qū)、一個(gè)CL區(qū)、一個(gè)亮氨酸拉鏈域、一個(gè)SH2 (src同源性2)域、一個(gè)SH3 (src同源性3)域、一個(gè)PTB (磷酸酪氨酸結(jié)合)域、一個(gè)Wff域、一個(gè)PDZ域、一個(gè)14-3-3域、一個(gè)WD40域、一個(gè)域、一個(gè)Lim域、 一個(gè)異亮氨酸拉鏈域，以及一個(gè)受體二聚體對(duì)的二聚化域。
10.如權(quán)利要求2至9中任一項(xiàng)所述的用途，其中該融合蛋白包括SEQID號(hào)8、22、23、 38、29中任何一種的多肽。
11.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中該融合蛋白是包括如權(quán)利要求2至10 中任一項(xiàng)所述的第一和第二融合蛋白的一個(gè)二聚體蛋白，其中這些第一與這些第二融合蛋白通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵彼此結(jié)合以便形成一個(gè)二聚體。
12.如權(quán)利要求2至11中任一項(xiàng)所述的用途，其中這些融合蛋白通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起。
13.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中該蛋白以適配成用于治療免疫相關(guān)病癥的一種藥用組合物，以及一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體的形式來(lái)給予。
14.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中該蛋白附接至一個(gè)可檢測(cè)或治療部分。
15.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中向該受試者給予一個(gè)有效量的該蛋白或藥用組合物抑制或減少選自下組的一種免疫細(xì)胞的分化、增殖、活性和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌，該組由以下各項(xiàng)組成Thl、Thl7、Th22、分泌或引起其他細(xì)胞分泌炎癥分子的其他細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15所述的用途，其中該蛋白或藥用組合物以抑制或減少Thl、Thl7和/ 或Th22細(xì)胞的分化、增殖、活性和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或分泌的一個(gè)有效量來(lái)給予。
17.如權(quán)利要求15或16所述的用途，其中該蛋白或藥用組合物以增強(qiáng)Treg和/或Th2 細(xì)胞對(duì)于Thl或Thl7細(xì)胞的抑制或免疫調(diào)節(jié)作用的一個(gè)有效量來(lái)給予。
18.如權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的用途，其中該蛋白或藥用組合物以促進(jìn)或增強(qiáng) IL-10產(chǎn)生的一個(gè)有效量來(lái)給予。
19.如權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的用途,其中該蛋白或藥用組合物以增加Treg 和/或Th2細(xì)胞中任何一種的細(xì)胞數(shù)或增加其群體的一個(gè)有效量來(lái)給予。
20.如權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)所述的用途，其中該蛋白或藥用組合物以抑制Thl和 /或Thl7通路并且增強(qiáng)Treg和/或Th2細(xì)胞對(duì)于這些Thl和Thl7通路的活性和/或促進(jìn)或增強(qiáng)IL-10分泌的一個(gè)有效量來(lái)給予。
21.如權(quán)利要求15至20中任一項(xiàng)所述的用途，其中該蛋白或藥用組合物以減少一個(gè)受試者中的促炎癥分子產(chǎn)生的一個(gè)有效量來(lái)給予。
22.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，進(jìn)一步包括給予有效治療免疫相關(guān)病癥的一種第二治療劑。
23.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的用途，其中治療包括預(yù)防、治愈、管理、逆轉(zhuǎn)、減弱、 減輕、最小化、抑制、管理或阻止以上描述疾病的有害影響中的一個(gè)或多個(gè)。
24.如權(quán)利要求23所述的用途，其中該治療包括在沒(méi)有整體免疫抑制的情況下治療免疫相關(guān)病癥。
25.如權(quán)利要求23或24所述的用途，其中免疫相關(guān)病癥的該治療包括誘導(dǎo)免疫耐受性。
26.如權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)所述的用途，其中該治療包括抑制反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
27.如權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)所述的用途，其中該治療包括預(yù)防對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)細(xì)胞的髓磷脂外層的損傷。
28.如權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)所述的用途，其中治療包括降低疾病的嚴(yán)重度、降低疾病發(fā)作頻率、減少這類(lèi)發(fā)作的持續(xù)時(shí)間，或降低這類(lèi)發(fā)作的嚴(yán)重度或它們的一個(gè)組合。
29.如權(quán)利要求23至28中任一項(xiàng)所述的用途，其中該受試者先前對(duì)用TNF阻滯劑的治療無(wú)應(yīng)答。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白C1ORF32以及其變體以及片段以及其融合蛋白，以及其用于免疫療法和藥物開(kāi)發(fā)的方法，包括但不局限于作為免疫調(diào)節(jié)劑以及用于免疫療法，包括用于自身免疫病癥。
文檔編號(hào)A61P25/28GK103068399SQ201180038162
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者艾里斯·赫克特, 加利特·羅特曼, 朱里特·萊文, 史蒂芬·D·米勒, 約瑟夫·R·波多伊爾 申請(qǐng)人:卡姆普根有限公司