專利名稱：針對硬骨素蛋白質(zhì)的高親和力核酸適配體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文描述的是針對硬骨素的新核酸配體(適配體)，硬骨素是骨生長的細(xì)胞外負(fù)調(diào)節(jié)物。公開的適配體有希望直接刺激骨形成且用作治療骨疾病例如骨質(zhì)疏松癥的療法。
背景技術(shù)：
核酸適配體是能夠結(jié)合且抑制蛋白質(zhì)功能的體外演化的核酸。在過去20年已開發(fā)核酸適配體，以開發(fā)針對多種靶的治療適配體用于許多疾病，尤其包括黃斑變性、HIV、癌癥、心血管疾病。由Gilead Sciences發(fā)現(xiàn)，授權(quán)給EyetechPharmaceuticals且通過Pfizer在美國外銷售的一種適配體,培加尼布(MACUGEN)在臨床上用于治療黃斑變性。其他基于適配體的藥物在針對凝血因子、生長因子、炎癥標(biāo)記及其他靶的臨床試驗中。就我們所知，仍未開發(fā)與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)的適配體。骨質(zhì)疏松癥在全世界具有顯著的醫(yī)學(xué)和經(jīng)濟影響。在發(fā)達(dá)國家，約4%的人口具有骨質(zhì)疏松癥，并且單獨對于美國的經(jīng)濟負(fù)荷已估計在每年$140億。目前，目前在臨床中使用的大多數(shù)藥物試劑是基于二膦酸鹽的抗吸收劑，包括阿屈膦酸鹽(alendronate，F(xiàn)0SAMAX)、利塞勝酸鹽(risedronate, ACT0NEL)或伊班勝酸鹽(ibandronate, B0NIVA)。已確立的藥物試劑可以在控制骨量中略微有效，但它們具有許多缺點，包括弱口腔吸收、食管炎和顎的骨壞死。因此，存在朝向刺激骨形成的促合成劑(anabolic agents)的進(jìn)展，所述骨形成會潛在地加速骨生長。近來，特立帕肽(重組甲狀旁腺激素，F(xiàn)0RTE0)被批準(zhǔn)作為進(jìn)入臨床的第一種促合成劑，但存在關(guān)于FORTEO僅在前12個月治療過程中有效重塑骨并且隨后功效下降的一些關(guān)注。硬骨素是骨形成的骨細(xì)胞特異性負(fù)調(diào)節(jié)物，這使得其成為用于骨質(zhì)疏松癥治療的有吸引力的藥物靶。Amgen在開發(fā)用于骨質(zhì)疏松癥治療的針對硬骨素的基于蛋白質(zhì)的抗體(人臨床2期)。Novartis和Eli Lily也在開發(fā)硬骨素阻斷抗體(臨床前)。OsteogeneX在開發(fā)針對硬骨素的小分子抑制劑，其目前在臨床前和先導(dǎo)優(yōu)化中?？贵w一般具有許多局限性，包括免疫應(yīng)答的危險，分批間變異和有限的保存期限。小分子具有結(jié)合親和力和特異性的明顯問題。概述
本發(fā)明提供了在本文中稱為“硬骨素適配體”，與蛋白質(zhì)硬骨素結(jié)合的適配體，包括其制劑和/或組合物，和關(guān)于使用此類硬骨素適配體用于治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥及其他相關(guān)骨疾病的方法。本發(fā)明提供了可替代的分子方法，其通過抑制硬骨素功能來刺激骨生長，并且對于骨質(zhì)疏松癥及其他相關(guān)疾病具有更少的副作用。這隨著特異性且有效地靶向且抑制硬骨素的核酸適配體的開發(fā)得到解決。本發(fā)明具體涉及能夠與硬骨素結(jié)合且抑制硬骨素功能的適配體，所述硬骨素是骨生長的重要負(fù)調(diào)節(jié)物且牽涉骨疾病例如骨質(zhì)疏松癥。本發(fā)明請求保護(hù)作為獨特的新物質(zhì)組分的適配體，其抑制硬骨素功能且具有作為用于骨質(zhì)疏松癥和相關(guān)疾病的療法的明確牽涉。本發(fā)明涉及使用抗硬骨素適配體作為療法用于刺激骨形成的方法。該方法包括給人施用有效引起骨形成速率增加的抗硬骨素適配體的量。本文描述的制劑包含硬骨素適配體或其藥學(xué)可接受的鹽。制劑可以包含與硬骨素或其變體或片段結(jié)合的任何適配體。優(yōu)選地，適配體與硬骨素結(jié)合且抑制其活性。本發(fā)明還提供了使用抗硬骨素適配體用于治療其中硬骨素的存在引起不希望的病理學(xué)效應(yīng)的骨相關(guān)疾病、病癥或狀況的方法。此類疾病、病癥和狀況包括但不限于骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎、骨軟化、骨營養(yǎng)不良、骨骨髓瘤(osteomyeloma)、骨折、Paget’ s病、成骨不全、骨硬化、發(fā)育不全型骨病癥、體液血鈣過高性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤和在引起或誘導(dǎo)骨變薄的病癥后的骨變薄。此類骨變薄(hinning)疾病、病癥和狀況包括但不限于轉(zhuǎn)移、血鈣過多、慢性腎疾病、腎透析、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、炎性腸病、克羅恩病、皮質(zhì)類固醇的長期使用或促性腺素釋放激素(GnRH)激動劑或拮抗劑 的長期使用。受試者可以是任何年齡的男性或女性。本發(fā)明可以給人受試者施用單獨或與其他藥物組合的一定量的抗硬骨素適配體。本發(fā)明還提供了定量硬骨素表達(dá)的診斷方法?？褂补撬剡m配體可以通過可檢測物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，所述可檢測物質(zhì)包括但不限于熒光材料、酶、發(fā)光材料和放射性材料。本發(fā)明的此類實施方案可以用于檢測生物學(xué)樣品中的硬骨素水平。附圖
簡述
圖I是顯示用于硬骨素適配體選擇的方法的圖。圖2是顯示在針對硬骨素的15輪選擇后從ssDNA庫中分離且在本發(fā)明中請求保護(hù)的適配體序列的表。保守核苷酸由星號標(biāo)記。圖3是顯示使用適配體酶聯(lián)測定來測定適配體針對硬骨素的相對結(jié)合強度的圖表。就其結(jié)合活性和交叉反應(yīng)性估計硬骨素適配體、凝血酶結(jié)合適配體、GST-硬骨素和GST蛋白質(zhì)的組合(通過在圖表下的加號指示)。數(shù)據(jù)由一式三份樣品求平均值。圖4是顯示修飾的適配體的穩(wěn)定性的圖在補充有5% FBS的MC3T3-E1細(xì)胞中估計的A.)未修飾的Scl 2適配體和B. ) 3’反向胸苷修飾的Scl 2適配體。圖5是顯示W(wǎng)nt報道分子測定的原理和硬骨素適配體在細(xì)胞培養(yǎng)物中的效應(yīng)的圖。A.)示意性顯示在報道分子螢光素酶活性測定后的原理。B. )3’反向胸苷修飾的硬骨素適配體對MC3T3-E1細(xì)胞中Wnt3a介導(dǎo)的活性的作用。所示數(shù)據(jù)代表獨立測定的一式三份的值。***代表通過具有95%置信度的不配對t檢驗分析的彼此統(tǒng)計學(xué)顯著的值。C.)不同濃度的3’反向胸苷修飾的Scl 2適配體針對硬骨素功能的效應(yīng)。圖6是測定Scl 2適配體的二級結(jié)構(gòu)的圖表。A. ) Scl 2適配體的⑶光譜。B.)Scl 2適配體的⑶解鏈光譜。圖7是顯示通過等溫滴定量熱法以測量在硬骨素和硬骨素適配體之間的結(jié)合的數(shù)據(jù)的圖表。用硬骨素的系列注射滴定Scl 2適配體(上)。在就適配體稀釋度的熱校正后，起因于原始量熱法數(shù)據(jù)整合的結(jié)合等溫線(下)。詳述
本發(fā)明現(xiàn)在就下述實驗程序和結(jié)果而言進(jìn)一步描述。下述實驗細(xì)節(jié)預(yù)期是本發(fā)明的實踐的例示，并且不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。使用圖I中的方案，伴隨圖2中的細(xì)節(jié)，在本發(fā)明中鑒定且請求保護(hù)DNA適配體的七個不同序列。值得注意的是，適配體Scl I和Scl 2是占優(yōu)勢序列，其占庫中的總共79%。此外，觀察到高水平的序列同源性，其中在幾乎所有克隆中在隨機區(qū)域中的大致相同位置上存在保守基序(5’-GGXGGXXGGXTGGG-3’)(SEQ ID NO :1 )，其中X是任何核苷酸堿基。酶聯(lián)結(jié)合測定顯示硬骨素適配體與硬骨素的特異性結(jié)合。結(jié)果暗示其對于硬骨素的相對結(jié)合強度以下述次序Scl4> Scl I=Scl 2 > Scl 3(圖3)。適配體顯示與GST可忽略不計的結(jié)合，暗示適配體與硬骨素特異性結(jié)合。此外，具有真正的G-四鏈體結(jié)構(gòu)的凝血酶結(jié)合適配體不與硬骨素蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)。硬骨素適配體通過用3’反向胸苷(3’ -InT)給3’末端戴帽得到穩(wěn)定，且在補充有5% FBS的MC3T3-E1細(xì)胞中進(jìn)行估計(圖4)。如果沒有任何修飾，適配體通過血清中的核酸酶快速降解，如通過涂片注意到的。在3’反向胸苷適配體的情況下，該寡核苷酸保持完整28小時，暗示適配體的穩(wěn)定性可以得到極大增強。還可以對適配體作出幾個不同種類的修飾，以減少外切核酸酶降解且增加在個體的血清中的壽命。降解可以伴隨適配體的肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和口服施用出現(xiàn)。用反向胸苷、脫氧胸苷核苷酸和聚乙二醇(PEG)修飾適配體的3’末端可以減少寡核苷酸適配體的降解，增加適配體的穩(wěn)定性。在一個實施方案中，PEG具有約20 - 80 kDa的平均分子量。進(jìn)一步地，還可以修飾適配體的脫氧核糖-磷酸主鏈的磷酸二酯鍵，以改善穩(wěn)定性。如在本文件中使用的，術(shù)語“適配體”指具有式I中所示結(jié)構(gòu)的重復(fù)單位的分子。波浪線區(qū)別一個核苷酸和/或重復(fù)單位與鄰近的核苷酸和/或重復(fù)單位。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含 包含具有序列5’ -GGXGGXXGGXTGGG-3’ (SEQ ID NO 1)的寡核苷酸的DNA適配體或其鹽， 其中所述適配體抑制硬骨素， 優(yōu)選地，所述適配體具有約14 -約50個核苷酸重復(fù)單位； 優(yōu)選地，所述適配體與選自脫氧胸苷核苷酸、反向胸苷和聚乙二醇的一種或多種綴合； 優(yōu)選地，所述適配體是具有由脫氧核糖-磷酸鍵構(gòu)成的主鏈的寡核苷酸； 優(yōu)選地，所述適配體是具有通過選自硫酯鍵和酰胺鍵中的一種或多種穩(wěn)定的一個或多個脫氧核糖-磷酸鍵的寡核苷酸； 優(yōu)選地，所述適配體具有平行的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。
2.一種能夠結(jié)合硬骨素的適配體，所述適配體選自包含下述序列之一的組 5'-frnTCCAAAGCCGOGOGGGTGGGATGGGTT-3, (SEO ID NO: 2) (Scl I); 5,_TTGCGCG^AA,^GGGGGGGTGGGTGGG1T^3< (-SEq ID 釀 3j (Sci 2j Si-Tgccttgttattgtggtgggcgggtgggac-J' (seq id no 4) (Sci 3); S1-GGGGGGGGTGGGGTGGGTCAATArrCTCGTC-Sf (S EQ ID NO: 5) (Scl 4); 5 _WOCOCGW^rTGGGGGGC}TGGGTGGGTT_31 (SEQ ID N0;玢 |Sd 5j； 5’-CCCTCCAAAG03GGGC]GCIGTGGGTG<3GCAG-3* (SEQ ID NO: 7) (Scl 6); Jl 5f^CTGTCACATGTGGGGGGGGGGGTGGG1T_3, {SEq lD ^i0: gj (Sd 或SEQ ID NOS 2-8之一的變體。
3.權(quán)利要求2的適配體，其中所述適配體與選自脫氧胸苷核苷酸、反向胸苷和聚乙二醇中的一種或多種綴合。
4.權(quán)利要求3的適配體，其中所述適配體在3’末端與選自脫氧胸苷核苷酸、反向胸苷和聚乙二醇中的一種或多種綴合。
5.權(quán)利要求2的適配體，其中所述適配體是具有由脫氧核糖-磷酸鍵構(gòu)成的主鏈的寡核苷酸。
6.權(quán)利要求2的適配體，其中所述適配體是具有通過選自硫酯鍵和酰胺鍵中的一種或多種穩(wěn)定的一個或多個脫氧核糖-磷酸鍵的寡核苷酸。
7.權(quán)利要求2的適配體，其中所述適配體具有平行的G-四鏈體結(jié)構(gòu)。
8.用于治療其中硬骨素引起不希望的病理學(xué)效應(yīng)的骨相關(guān)疾病、病癥或狀況的權(quán)利要求I的組合物或根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一項的適配體，所述治療包括給個體施用權(quán)利要求I的組合物和或根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一項的適配體，其中所述個體需要用于其中硬骨素引起不希望的病理學(xué)效應(yīng)的骨相關(guān)疾病、病癥或狀況的治療， 優(yōu)選地，其中所述組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)載體。
9.權(quán)利要求8的組合物或適配體，其中所述適配體選自具有下述序列之一的寡核苷酸
10.權(quán)利要求9的組合物或適配體，其中所述適配體在3’末端與選自脫氧胸苷核苷酸、反向胸苷和聚乙二醇中的一種或多種綴合； 優(yōu)選地，所述適配體是具有由脫氧核糖-磷酸鍵構(gòu)成的主鏈的寡核苷酸； 優(yōu)選地，所述適配體是具有通過選自硫酯和酰胺鍵中的一種或多種穩(wěn)定的一個或多個脫氧核糖-磷酸鍵的寡核苷酸； 優(yōu)選地，所述骨相關(guān)疾病、病癥或狀況包含選自下述中的至少一種骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎、骨軟化、骨營養(yǎng)不良、骨骨髓瘤、骨折、Paget’ s病、成骨不全、骨硬化、發(fā)育不全型骨病癥、體液血鈣過高性骨髓瘤、多發(fā)性骨髓瘤和骨變??； 優(yōu)選地,所述骨相關(guān)疾病、病癥或狀況包含骨質(zhì)疏松癥。
全文摘要
描述的是能夠與硬骨素結(jié)合且抑制硬骨素功能的核酸適配體，所述硬骨素是骨生長的重要負(fù)調(diào)節(jié)物。適配體具有作為用于骨疾病的療法的應(yīng)用，所述骨疾病包括骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎及其他骨質(zhì)疏松癥相關(guān)狀況和并發(fā)癥。
文檔編號A61K31/7125GK102971424SQ201180025929
公開日2013年3月13日 申請日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者J.A.坦納, 沈家滔, S.C.陳 申請人:香港大學(xué)