專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療基于新血管生成的眼部疾病的抗-cd160特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及至少一種抗-⑶160抗體，優(yōu)選選自CL1-R2單克隆抗體(其可通過(guò)雜交瘤CNCM 1-3204獲得)、其保守片段和其保守衍生物的化合物在治療和/或預(yù)防新生血管性眼部疾病中的用途。
背景技術(shù)：
世界上視力喪失的首要原因一眼部新生血管發(fā)生于眼睛的兩個(gè)主要部位視網(wǎng)膜和角膜。在富庶國(guó)家和貧窮國(guó)家，包括異常新生血管的視網(wǎng)膜疾病呈現(xiàn)漸增的發(fā)病率。在富庶國(guó)家，由異常新生血管惡化的糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病和年齡相關(guān)性黃斑 變性(AMD)構(gòu)成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及全球低視力和法定失明的兩個(gè)主要原因。就治療成本和勞動(dòng)力及正常社交網(wǎng)絡(luò)中受影響患者的適當(dāng)整合而言，并發(fā)異常角膜新血管形成的角膜感染或角膜移植(在患有遺傳性角膜營(yíng)養(yǎng)不良或遭受環(huán)境性損傷的患者中進(jìn)行)也構(gòu)成了重要的公共健康負(fù)擔(dān)。年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病的市場(chǎng)規(guī)模是巨大的。雖然就競(jìng)爭(zhēng)市場(chǎng)而言是重要的，隨著不斷發(fā)展的研究學(xué)習(xí)，病態(tài)角膜新血管形成也對(duì)應(yīng)于阻礙透明角膜移植的維持或甚至阻礙進(jìn)行角膜移植的可能性的疾病的關(guān)鍵集合。視網(wǎng)膜新血管形成的發(fā)病機(jī)理是復(fù)雜的，并且對(duì)其的理解還不完全。當(dāng)前的研究集中于血管疾病例如AMD中的缺氧、炎癥和化膿的影響。該疾病的特點(diǎn)是視力下降、圖象失真、和由于盲點(diǎn)的無(wú)法閱讀。其部分地通過(guò)不管其形式(萎縮性或濕性)而產(chǎn)生的新血管的形成來(lái)診斷。當(dāng)前對(duì)AMD的治療性或預(yù)防性的治療沒(méi)有針對(duì)萎縮形式的。最近幾年，抗-VEGF人化單克隆抗體療法(貝伐單抗(Avastin )或蘭尼單抗(Lucentis ))已經(jīng)被廣泛用于預(yù)防或抑制AMD和水腫性糖尿病性視網(wǎng)膜病的新生血管形式。然而，功效限于濕性AMD且該療法還沒(méi)有被用于阻斷多種病理學(xué)的角膜新血管形成。此外，由于VEGF不是唯一的促血管生成因子，可預(yù)期抗性。而且，治療期間出現(xiàn)許多不良副作用，特別是使用蘭尼單抗時(shí)。用蘭尼單抗治療實(shí)際上引起結(jié)膜出血、眼睛疼痛、眼內(nèi)壓升高、虹膜炎或葡萄膜炎、以及視力障礙。約10%的濕性AMD形式無(wú)法(或僅少許)接受Avastin⑧或Lucentis 治療。為了在眾多患有濕性AMD形式的患者中獲得穩(wěn)定結(jié)果,可能在2年期間里用高達(dá)24次Avastin⑧或Lucentis 玻璃體內(nèi)注射來(lái)治療這些患者，這增加了有害事件的風(fēng)險(xiǎn)。因此在新生血管性眼部疾病的治療中需要具有較少副作用的有效治療劑。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及至少一種抗-⑶160抗體，優(yōu)選選自CL1-R2單克隆抗體(其可通過(guò)雜交瘤CNCM 1-3204獲得)、其保守片段和其保守衍生物的化合物在制備用于治療和/或預(yù)防新生血管性眼部疾病的藥物中的用途。本發(fā)明涉及至少一種抗-⑶160抗體，優(yōu)選至少一種誘導(dǎo)活性增殖內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡的抗-⑶160抗體，用于治療和/或預(yù)防新生血管性眼部疾病。本發(fā)明也涉及選自CL1-R2單克隆抗體(其可通過(guò)雜交瘤CNCMI-3204獲得)、其保守片段和其保守衍生物的化合物，用于治療和/或預(yù)防新生血管性眼部疾病。優(yōu)選地，所述至少一種抗-⑶160抗體誘導(dǎo)活性增殖內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡。本發(fā)明也涉及抗-CD160抗體和抗-VEGF抗體作為聯(lián)合制劑用于同時(shí)、分別或相繼·用來(lái)治療和/或預(yù)防新生血管性眼部疾病。由于抗-⑶160和抗-VEGF抗體作用于不同的靶標(biāo)和生物途徑，抗-⑶160抗體和抗-VEGF抗體的聯(lián)合提高了用于治療新生血管性眼部疾病的治療策略成功的機(jī)會(huì)。本發(fā)明也涉及至少一種抗-⑶160抗體，用于治療和/或預(yù)防耐抗-VEGF療法的受試者的新生血管性眼部疾病。本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療受試者，優(yōu)選人類(lèi)的新生血管性眼部疾病的方法，其中向所述受試者施用治療有效量的抗-CD160抗體，優(yōu)選CL1-R2、其保守片段或其保守衍生物。術(shù)語(yǔ)“⑶160抗體”或“抗-⑶160抗體”是指任何結(jié)合人⑶160的抗體。因此，該術(shù)語(yǔ)包括針對(duì)CD160的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性結(jié)合⑶160的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子，包括肽。同樣地，術(shù)語(yǔ)抗體不僅指完整抗體分子，還指抗體片段以及抗體和抗體片段的變體(包括衍生物)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，可相繼或同時(shí)使用針對(duì)CD160的不同表位的幾種抗-CD160抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗-CD160抗體可為選自抗-CD160單克隆抗體、它們的保守片段和它們的保守衍生物的化合物。在本發(fā)明的上下文中，所述抗體確實(shí)誘導(dǎo)活性增殖內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡且不直接作用于VEGF。所述抗-⑶160抗體可選自CL1-R2、其保守片段和其保守衍生物。CL1-R2單克隆抗體可由2004年4月28日按照布達(dá)佩斯條約保藏于法國(guó)國(guó)家微生物保藏中心巴斯德研究所(National Collection of Cultures of Microorganisms CNCMInstitut Pasteur) (Institute Pasteur CNCM,25rue du Docteur Roux F_75724ParisCedex 15，法國(guó))的雜交瘤細(xì)胞系獲得。所保藏的雜交瘤的保藏號(hào)為CNCM 1-3204。CD160屬于免疫球蛋白家族。人CD160的cDNA對(duì)應(yīng)于TO98/21240中描述的SEQID NO l(1361bp) (DANA-FARBER 癌癥研究所)。人CD160mRNA 可在 GenBank 中以登錄號(hào) AF060981 獲得；鼠 CD160mRNA 可在GenBank中以登錄號(hào)AF060982獲得。人CD160蛋白序列對(duì)應(yīng)于W098/21240中描述的SEQ ID NO :2，并可在GenBank中以登錄號(hào)AAC72302(181aa)獲得。⑶160為27kDa的糖蛋白，其尤其存在于內(nèi)皮細(xì)胞的表面。CL1-R2靶標(biāo)，即⑶160受體通過(guò)活性增殖內(nèi)皮細(xì)胞而非休止內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。活性增殖內(nèi)皮細(xì)胞是形成新生血管，尤其是存在于眼部疾病中的新生血管的原因。CL1-R2具有與Avastin 或Lucentis 不同的作用機(jī)理其僅誘導(dǎo)活性增殖內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡，而不直接作用于VEGF。其還對(duì)血管生成的新生血管具有非常高的特異性。因此，該抗體令人驚訝地向耐抗-VEGF療法的患者提供了良好的治療潛力。因此，發(fā)明人擔(dān)此重任而開(kāi)發(fā)出了一種用于治療患有不能通過(guò)抗-VEGF療法而治療的新生血管性眼部疾病的受試者的新生血管性眼部疾病的非常有前途的策略。因此，本發(fā)明也涉及至少一種抗-⑶160抗體，用于治療和/或預(yù)防耐抗-VEGF療法的受試者的新生血管性眼部疾病。優(yōu)選地，所述抗-⑶160抗體誘導(dǎo)活性增殖內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡。優(yōu)選地，所述抗體選自CL1-R2單克隆抗體(其可通過(guò)雜交瘤CNCMI-3204獲得)、其保守片段和其保守衍生物。如本文所使用，表達(dá)“耐抗-VEGF療法的受試者”適用于對(duì)所述抗-VEGF抗體而言為無(wú)應(yīng)答者的受試者。對(duì)于“無(wú)應(yīng)答者”，其是指用抗-VEGF抗體，受試者不恢復(fù)、改善、或穩(wěn) 定其病癥。例如，耐抗-VEGF療法的受試者為用抗-VEGF抗體未被成功治療的受試者或已知不能成功應(yīng)答基于抗-VEGF抗體的治療的受試者。通過(guò)提供治療患有新生血管性眼部疾病且耐抗-VEGF療法的受試者的新策略，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期探索的需求。該抗體也可識(shí)別表位，所述表位在許多物種，如人、兔、鼠和獼猴中是常見(jiàn)的；這容易地允許動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。根據(jù)本發(fā)明，CL1-R2或其保守片段或其保守衍生物可用于治療和/或預(yù)防眼部新生血管性疾病。對(duì)于“眼部新生血管性疾病”或“新生血管性眼部疾病”，其是指所有新生血管性眼部疾病，包括角膜、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的所有新生血管性疾病。這些疾病包括 所有形式的角膜新血管形成，無(wú)論其原因可能為何，包括作為角膜移植和/或角膜感染或包括病原體感染(如皰疹)和化學(xué)燒傷的角膜環(huán)境性損傷的并發(fā)癥發(fā)生的新血管形成； 所有形式的視網(wǎng)膜病，包括糖尿病性缺血性和水腫性形式、早發(fā)性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖和增殖形式、黃斑囊樣水腫、所有形式的年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、包括Best病的所有黃斑卵黃變性(只要其伴有視網(wǎng)膜和/或脈絡(luò)膜新生血管)、眼部血管瘤如Von Hippel-Lindau 氏??；Eale 氏病；Coats 氏??； 諾里病(先天性胸水性玻璃體視網(wǎng)膜病)； 所有形式的脈絡(luò)膜新血管形成、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜息肉狀血管病(無(wú)論其臨床表現(xiàn)可能為何)、與近視和Sorsby氏營(yíng)養(yǎng)不良(其幾乎總與異常脈絡(luò)膜新生血管相關(guān))相關(guān)的反凹(retrofoveolar)脈絡(luò)膜新生血管； 葡萄膜黑色素瘤，包括脈絡(luò)膜黑色素瘤及其轉(zhuǎn)移；和 虹膜紅變和新生血管性青光眼。然而，CL1-R2單克隆抗體、其保守片段和其保守衍生物靶向的新生血管性眼部疾病的范圍可以更為廣泛。優(yōu)選地，眼部新生血管性疾病(或新生血管性眼部疾病)選自 所有形式的角膜新血管形成，包括作為角膜移植和/或角膜感染和/或選自病原體感染(如皰疹)和化學(xué)燒傷的角膜環(huán)境性損傷的并發(fā)癥發(fā)生的新血管形成； 所有形式的視網(wǎng)膜病，包括糖尿病性缺血性和水腫性形式、早發(fā)性糖尿病性視網(wǎng)膜病、非增殖和增殖形式、黃斑囊樣水腫、所有形式的年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、包括Best病的所有黃斑卵黃變性、眼部血管瘤如Von Hippel-Lindau氏??；Eale氏病；Coats氏病； 諾里病； 所有形式的脈絡(luò)膜新血管形成、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜息肉狀血管病、與近視和Sorsby氏營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的反凹脈絡(luò)膜新生血管； 葡萄膜黑色素瘤，包括脈絡(luò)膜黑色素瘤及其轉(zhuǎn)移；和 虹膜紅變和新生血管性青光眼。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及至少一種抗-⑶160抗體，優(yōu)選選自CL1-R2單克隆抗體、其保守片段和其保守衍生物的抗體，用于治療和/或預(yù)防所有形式的年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)。對(duì)于“預(yù)防疾病”，其是指預(yù)防受試者，尤其是人的疾病發(fā)作，所述受試者的疾病尚未顯現(xiàn)。對(duì)于“治療疾病”，其是指減少疾病的發(fā)展或抑制疾病，即停止其發(fā)展、癥狀和疾病嚴(yán)重性的衰退或消失、或病因的終止。根據(jù)本發(fā)明，單克隆抗體CL1-R2、以及其保守衍生物和其保守片段可用于預(yù)防和/或治療眼部新生血管性疾病。對(duì)于抗-⑶160抗體的“保守片段”和“保守衍生物”，其分別是指保留了所述抗體，優(yōu)選CL1-R2對(duì)于CD160的結(jié)合親和力和特異性的片段和衍生物。這種保守片段和保守衍生物在功能上與所述抗體，優(yōu)選CL1-R2相同。它們是“保守的”，因?yàn)槠淙缢隹贵w，優(yōu)選CL1-R2與相同的表位充分結(jié)合和/或?qū)τ诮Y(jié)合CD160，其能夠與所述抗體，優(yōu)選CL1-R2競(jìng)爭(zhēng)，并且它們保留了結(jié)合CD160的特異性。該結(jié)合特異性是充分的以便保守片段或保守衍生物不結(jié)合除⑶160外的其它HLA受體。對(duì)于抗-⑶160抗體，優(yōu)選CL1-R2的“片段”，其是指這種抗體的一部分，如重鏈、輕鏈、VL、VH、Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab' )2、或dAb，以及任何由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基組成的最小單元，例如 CDR(CDR1H、CDR2H、CDR3H、CDR1L、CDR2L、CDR3L)。本發(fā)明抗-CD160 抗體，優(yōu)選CL1-R2的片段是保守的。只有抗體的一部分，即可變區(qū)涉及使抗體結(jié)合其表位?？贵w的恒定區(qū)激活免疫效應(yīng)物、噬菌細(xì)胞或殺傷細(xì)胞、以及補(bǔ)體，并且這些恒定區(qū)不涉及結(jié)合抗原。具有恒定區(qū)(Fe)的抗體酶解以致保持鉸鏈區(qū)被指定為片段F(ab' ) 2并保留兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。類(lèi)似地，其恒定區(qū)(包括鉸鏈區(qū))已被酶解的抗體、或不含該區(qū)而產(chǎn)生的抗體被指定為Fab片段并且僅保留了兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)。Fab片段由共價(jià)連接至一部分重鏈(稱(chēng)為Fd)的輕鏈組成?？勺儏^(qū)中有互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R，互補(bǔ)決定區(qū))，也稱(chēng)作高變區(qū)，其與抗原直接相互作用。因此，修改CDR可助于改變抗體的親和力?？勺儏^(qū)中有稱(chēng)作框架區(qū)(FR，框架)的第二類(lèi)區(qū)域，其保留了⑶R的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這些框架區(qū)是相當(dāng)特異性的區(qū)域，抗體在其中產(chǎn)生。重鏈和輕鏈的Fd片段中有四個(gè)框架區(qū)(FR1-4)，分別被三個(gè)CDR(CDRl-3)分隔。本發(fā)明的保守片段也包括dAb。dAb(單區(qū)抗體)為僅包含一條蛋白質(zhì)鏈的抗體，其衍生自抗體正常結(jié)構(gòu)的兩個(gè)區(qū)中的一個(gè)。事實(shí)上，在某些情況下，一半抗體可以以能與野生型抗體的親和力相比較的親和力結(jié)合其靶抗原。根據(jù)本發(fā)明的抗-CD160抗體，優(yōu)選CL1-R2的保守片段可使用現(xiàn)有技術(shù)所熟知的方法制備。這種片段可通過(guò)常規(guī)方法獲得，例如蛋白水解消化(例如，胃蛋白酶消化以產(chǎn)生Fiah1 ) 2 ;用木瓜蛋白酶消化以產(chǎn)生Fab)。優(yōu)選地，CL1-R2的保守片段選自 CL1-R2 的 Fab、Fab'、F (ab) 2、F (ab' )2 和 dAb。對(duì)于CL1-R2的“保守衍生物”，其是指融合至少一種與天然序列(例如另一物種的一個(gè)接頭序列……)不同的序列的CL1-R2片段，優(yōu)選包括CL1-R2的至少一種⑶R，優(yōu)選CL1-R2的至少一種⑶R3，所述衍生物具有可與CL1-R2相比較的⑶160結(jié)合親和力、和與CL1-R2相似的⑶160結(jié)合特異性?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識(shí)、通過(guò)合成和/或基因工程獲得該保守衍生物。
本發(fā)明保守衍生物可為單價(jià)(單個(gè)CD160結(jié)合位點(diǎn))，或多價(jià)(至少兩個(gè)CD160結(jié)合位點(diǎn))。優(yōu)選的保守多價(jià)衍生物包括四價(jià)保守衍生物。該保守衍生物包括嵌合抗體，其可通過(guò)將CL1-R2的至少一種Fv片段接枝至衍生自另一種抗體的Fe片段而獲得。優(yōu)選地，F(xiàn)e片段選擇為對(duì)施用其的受試者具有盡可能少的免疫反應(yīng)性。例如，當(dāng)意欲將抗體施用于人時(shí)，所述Fe片段優(yōu)選為人Fe片段。本發(fā)明保守衍生物也包括人化抗體，其可通過(guò)將至少一種CL1-R2或其部分接枝在人框架片段(hFR)上而獲得。再一次，目標(biāo)是獲得對(duì)施用其的機(jī)體具有盡可能少免疫原性的抗體。本發(fā)明保守衍生物也包括單鏈可變片段Fv :它們被稱(chēng)為scFv。單鏈可變片段scFv為融合蛋白，包含輕鏈VL和重鏈VH的可變區(qū)，通過(guò)約25個(gè)氨基酸的短接頭連接。適當(dāng)?shù)慕宇^為允許VH和VL區(qū)以與完整抗體CL1-R2的初始結(jié)構(gòu)相同的方式結(jié)構(gòu)一致，并因此維持結(jié)合特異性的那些。這種接頭為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如申請(qǐng)WO 88/01649 (GENEXCorp.)中。該scFv可為單價(jià)或多價(jià)的。本發(fā)明保守衍生物也包括(scFv)2，其為scFv的二聚體。本發(fā)明保守衍生物也包括雙特異性抗體。雙特異性抗體包含兩種不同抗原的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。它們包含至少一種抗原的VH和VL區(qū)，和另一種抗原的VH和VL區(qū)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的雙特異性抗體包含一個(gè)⑶160結(jié)合位點(diǎn)，和一個(gè)VEGF結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明保守衍生物也包括雙抗體。雙抗體為一類(lèi)新的小二價(jià)和雙特異性抗體片段。它們包含連接至通過(guò)肽接頭連接的相同多肽鏈(VH-VL)上的VL區(qū)的VH區(qū)，所述肽接頭太短以致不允許相同鏈上的兩個(gè)區(qū)之間配對(duì)。這迫使與另一條鏈的互補(bǔ)區(qū)配對(duì)并促進(jìn)具有兩個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的二聚分子的組裝。為了構(gòu)建雙特異性雙抗體，抗體A和抗體B的V-區(qū)融合以產(chǎn)生兩條鏈VHA-VLB、VHB-VLA。每條鏈在結(jié)合抗原方面是無(wú)活性的，但與另一條鏈配對(duì)后重新產(chǎn)生了抗體A和B的功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如，CL1-R2的保守衍生物包含scFv，其包含至少一種通過(guò)肽接頭L與至少一種CL1-R2的VL區(qū)連接的CL1-R2的VH區(qū)；該scFv可具有特異性VL-L-VH或VH-VL-L方向。
CL1-R2的另一種保守衍生物包含衍生自融合Fe片段的CL1-R2的scFv多聚體。CL1-R2的另一種保守衍生物通過(guò)在完整CL1-R2的每條重鏈H的C端處添加一個(gè)或多個(gè)CL1-R2的Fab衍生物而獲得。 CL1-R2的另一種保守衍生物通過(guò)將完整CL1-R2抗體共價(jià)連接在一起以實(shí)現(xiàn)整合形式而獲得。CL1-R2的另一種保守衍生物通過(guò)首尾連接兩個(gè)或多個(gè)Fab而獲得。本發(fā)明多價(jià)scFv可通過(guò)將至少兩個(gè)scFv (例如(scFv) 2)連接在一起而獲得。該締合可為共價(jià)或非共價(jià)的。作為例子可提及的是scFv四聚體(4-CD160結(jié)合位點(diǎn))。多價(jià)scFv的好處是存在若干個(gè)CD160結(jié)合位點(diǎn)，這增加了結(jié)合抗原的能力。多聚scFv可為單一特異性的，即其所有結(jié)合位點(diǎn)靶向⑶160?；蛘?，該多聚scFv可包含一個(gè)或多個(gè)⑶160結(jié)合位點(diǎn)、和一個(gè)或多個(gè)不同于⑶160的其它抗原的結(jié)合位點(diǎn)。例如，這種抗原可為VEGF。制備多聚scFv的方法為現(xiàn)有技術(shù)已知的，例如WO 94/13806(陶氏化學(xué)公司)或WO 93/11161 (Enzon Inc.)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的CL1-R2的保守衍生物選自scFv、(scFv) 2、雙抗體、衍生自CL1-R2并融合Fe片段的多聚scFv、連接在一起以實(shí)現(xiàn)整合形式的完整CL1-R2抗體、和包含至少兩個(gè)首尾連接的Fab的抗體形式。CL1-R2抗體、其保守片段之一或其保守衍生物之一可存在于藥物組合物或藥物中。該藥物組合物優(yōu)選包含藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指與生物體系相容的無(wú)毒材料，且其不會(huì)干擾組合物的其它活性成分的生物活性效力，所述生物體系例如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或器官。載體特性取決于施用方式。藥物組合物或藥物可為可施用于患者的任何形式，并包括溶液、懸浮液、凍干粉、膠囊和片劑。藥物組合物或藥物可以以與注射(即局部注射)、黏膜施用、吸入、口服施用和，更通常地，任何適于期望目的的制劑相容的形式存在。優(yōu)選地，藥物組合物或藥物以與結(jié)膜下、筋膜下(sub-tenonal)、玻璃體內(nèi)、視網(wǎng)膜下、眼框內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮膚下或眼內(nèi)施用相容的形式存在。本發(fā)明進(jìn)一步涉及治療受試者，優(yōu)選人的新生血管性眼部疾病的方法，其中向受試者施用治療有效量的CL1-R2、其保守片段或其保守衍生物。該CL1-R2抗體、其保守片段或其保守衍生物以治療有效量施用。治療有效量代表足以預(yù)防和/或治療所靶向的新生血管性眼部疾病的量。該量可隨受試者的年齡、性別和疾病階段而變化并將通過(guò)技術(shù)人員來(lái)確定。治療有效量可在O. 01mg/kg和50mg/kg之間,優(yōu)選O. lmg/kg和20mg/kg之間和更優(yōu)選O. lmg/kg和2mg/kg之間變化,優(yōu)選每月施用一次。施用方式可為通過(guò)注射或逐步輸液。注射優(yōu)選在玻璃體內(nèi)。玻璃體內(nèi)施用制劑可包括水性或非水性無(wú)菌懸浮液或乳劑。非水性溶劑的實(shí)例為丙二醇、乙二醇、植物油例如橄欖油或可注射有機(jī)酯例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳劑或懸浮液。本發(fā)明的CL1-R2、其保守片段的一種或其保守衍生物之一也可包括另一種成分。例如，CL1-R2、其保守片段或其保守衍生物可為經(jīng)標(biāo)記的。標(biāo)記物的實(shí)例包括酶、放射性同位素、熒光化合物、膠狀金屬、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。將標(biāo)記物結(jié)合至抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。另一種標(biāo)記技術(shù)在于將抗體耦合至低分子量半抗原；這些半抗原可為通過(guò)第二反應(yīng)而特定修飾的。半抗原的實(shí)例為生物素(其與抗生素蛋白反應(yīng))、二硝基酚、吡哆醛、或熒光素(其可與特定抗半抗原反應(yīng))。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體可用可檢測(cè)分子或物質(zhì)來(lái)標(biāo)記，例如熒光分子、放射性分子或任何其它本領(lǐng)域已知的標(biāo)記物。標(biāo)記物為本領(lǐng)域已知的，其通常(直接或間接地)提供用作信號(hào)。如本文所使用，關(guān)于抗體的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記的”意指通過(guò)將可檢測(cè)物質(zhì)，例如放射性試劑或熒光團(tuán)(例如異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5))耦合(即物理連接)至抗體而涵蓋抗體的直接標(biāo)記、以及通過(guò)與可檢測(cè)物質(zhì)反應(yīng)而涵蓋抗體的間接標(biāo)記。
本發(fā)明的抗體可用放射性分子、通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)標(biāo)記。例如，放射性分子包括但不限于用于影像學(xué)研究的放射性原子，例如1123、1124、InllU Rel86、Rel88。本發(fā)明的抗體也可用用于核磁共振(NMR)成像(也稱(chēng)作磁共振成像，mri)的自旋標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記，例如鵬_123、鵬-131、鋼_111、氣-19、碳-13、氣-15、氧-17、禮、猛或鐵。附圖
簡(jiǎn)要說(shuō)明圖I :CL1_R2抑制FGF2-誘導(dǎo)的兔角膜新血管生成。對(duì)照IgGl (Ctrl)-和CL1-R2-處理的角膜中新血管形成的定量分析。值為四個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)獲得的平均值土SEM，每個(gè)實(shí)驗(yàn)的η = 5只兔每組。< O. 0001 (Mann-Whitney測(cè)試)。含F(xiàn)GF2植入物的角膜移植8天后評(píng)價(jià)新血管形成。移植后24和72小時(shí)進(jìn)行CL1-R2或IgGl Ctrl的結(jié)膜下注射并基于由異色邊緣向含F(xiàn)GF2植入物的新形成血管的長(zhǎng)度計(jì)分4-級(jí)等級(jí)。圖2A和B :CL1_R2減少氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病的鼠科模型中視網(wǎng)膜新血管形成。來(lái)自小鼠的視網(wǎng)膜血管形成(組織學(xué)，視網(wǎng)膜切片計(jì)數(shù))的定量評(píng)價(jià)，所述小鼠暴露于帶有對(duì)照IgGl (Ctrl, 5 yg,η = 9)、或 CL1-R2 (5 μ g，η = 11)的無(wú)注射(“模擬”，η = 6)或玻璃體內(nèi)注射的高含氧條件下。內(nèi)皮細(xì)胞(EC)核(A)和血管內(nèi)腔(B)的平均數(shù)。呷< 0.001。圖3Α和B CL1-R2和貝伐單抗/Avastin⑧減少氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病的鼠科模型中視網(wǎng)膜新血管形成的各自能力的比較。定量評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜血管形成。內(nèi)皮細(xì)胞核(A)和血管內(nèi)腔(B)的平均數(shù)采用聚集數(shù)據(jù)的Poisson衰退模型來(lái)測(cè)定。平均數(shù)評(píng)估的95%置信區(qū)間顯示為誤差棒。通過(guò)Bonferroni法校準(zhǔn)P值，用于事后組比較。*P < O. 05，< O. 001。圖4 CL1R2和抗-VEGF抗體在抑制新血管形成上的協(xié)同效應(yīng)。幾組兔中獲得的結(jié)果，向所述兔施用-僅IgGl (注射 25 μ g);-僅Avastin (25 μ g 注射 2 次)；-僅CL1-R2 (25、50 或 100 μ g 注射 2 次)；-Avastin 與 IgGl 聯(lián)合；和-Avastin ⑧與 CL1-R2 聯(lián)合。級(jí)對(duì)應(yīng)于新生血管的長(zhǎng)度。圖5 :完整形式的CL1-R2以及Fab' 2形式的CL1-R2的效果。
該圖顯示了完整形式的CLl_R2、Fab' 2形式的CL1-R2對(duì)角膜新血管形成的效果，以及通過(guò)對(duì)照IgGl提供的效果。級(jí)對(duì)應(yīng)于新生血管的長(zhǎng)度。圖6 =AMD (激光誘導(dǎo)CNV)小鼠模型中小鼠和嵌合抗-⑶160mAb的效果幾組小鼠中獲得的結(jié)果，向所述小鼠施用-小鼠IgGl同型對(duì)照;-Kenacort retard 40 ;-CNX46. 3 (來(lái)自 eBioscience 的大鼠抗小鼠 CD160mAb)；-小鼠抗人CD160Fab’ 2 ； -小鼠抗人CD160IgGl ;和-合抗人CD160IgGl。測(cè)量新生血管表面積的平均數(shù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I 材料和方法鼠科抗-CD160CLl-R2mAb。該小鼠抗 _CD160CLl-R2mAb (IgGl)生長(zhǎng)于我們的實(shí)驗(yàn)室并在第七屆人類(lèi)白細(xì)胞分化抗原研討會(huì)(7th Human Leukocyte DifferentiationAntigen Workshop (26))期間作為抗-⑶160mAb評(píng)價(jià)。我們由特定分泌雜交瘤細(xì)胞系、通過(guò)使用高細(xì)胞密度體系CeLLine (VALDEA Biosciences)制備CLl_R2mAb。小鼠IgGl同型對(duì)照單克隆抗體He6通過(guò)用乙肝表面抗原(HB)使小鼠免疫而產(chǎn)生。CL1-R2和IgGl同型對(duì)照都通過(guò)在AKT Atm純化體系中Hi Trap 蛋白G柱(GE Healthcare)上的親和層析類(lèi)似地純化、用PBS pH 7. O透析、濃縮和通過(guò)O. 22-μ m過(guò)濾器過(guò)濾。動(dòng)物。我們使用BALB/c、C57BL/6J 和 NMRI-nu(nu/nu)裸鼠(JanvierLaboratories)。除了用于缺血性視網(wǎng)膜病實(shí)驗(yàn)的那些(其為7天大)之外，小鼠為7_10周大。動(dòng)物居住于常規(guī)溫度控制室(21°C )，當(dāng)通過(guò)Jackson實(shí)驗(yàn)室測(cè)定C57BL6/J小鼠品系時(shí)暴露于每天12-小時(shí)周期的光暗條件并用平衡飲食隨意喂食。我們使用來(lái)自InstitutNational de la Recherche Agronomique (Castanet-Tolosan)的雄性新西蘭白化病兔。對(duì)于小鼠視網(wǎng)膜實(shí)驗(yàn)，根據(jù)動(dòng)物保健機(jī)構(gòu)委員會(huì)的指導(dǎo)處理動(dòng)物，使用經(jīng)倫理委員會(huì)(EthicsCommittee)和眼科和視力研究中使用動(dòng)物(Use of Animals in Ophthalmic and VisionResearch)的ARVO聲明批準(zhǔn)的方案。依照歐盟指導(dǎo)并經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)(Midi_Pyr6n6es,法國(guó))批準(zhǔn)進(jìn)行所有其它動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)兔角膜血管生成試驗(yàn)。本研究中使用的角膜袋試驗(yàn)先前已經(jīng)描述(28)。我們?cè)诮悄ど喜恐圃烨锌?，距麻醉兔異色邊?mm。將FGF2-處理的植入物(500ng，R&DSystems)插入該袋中。角膜移植后24和72小時(shí)向異色邊緣上部施用CLl_R2mAb或?qū)φ誌gGiaooyg于30μ IPBS中)的結(jié)膜下注射。移植8天后測(cè)量角膜新血管形成并基于由異色邊緣向含F(xiàn)GF2植入物的新形成血管的長(zhǎng)度在四級(jí)等級(jí)上計(jì)分(28)。氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病和玻璃體內(nèi)注射的鼠科模型。使用氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病的完善和可重復(fù)模型，在小鼠C57BL/6J幼崽中誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新血管形成(32)。簡(jiǎn)言之，將小鼠(7天大，Ρ7)和它們的哺乳期母親置于密封孵化器中并暴露于75±2%氧氣氛5天。用PROOX氧分析器(模型110，BioSpherix)持續(xù)監(jiān)控氧水平。P12時(shí)移出小鼠并將其維持于含氧量正常條件(室空氣)下直至P17。在操作顯微鏡下玻璃體內(nèi)注射小鼠。除無(wú)注射組之外，P12時(shí)每只幼崽在其左眼和右眼接受玻璃體內(nèi)注射。簡(jiǎn)言之，用肌內(nèi)注射克他命(100mg/kg體重)和甲苯噻嗪(10mg/kg體重)麻醉小鼠幼崽。用微型剪刀打開(kāi)瞼裂并用局部10%苯腎上腺素和O. 5%托品酰胺擴(kuò)大瞳孔。將安裝于5 μ I Hamilton注射器上的10-mm 33-號(hào)鋼針尖通過(guò)鞏膜(角膜鞏膜異色邊緣后Imm)推入玻璃體。將大約I μ I的CLl-R2mAb (5 μ g/ μ I)、貝伐單抗(25 μ g/ μ I, Roche)或IgGl同型對(duì)照mAb (5 μ g/ μ I)注入玻璃體腔。視網(wǎng)膜新血管形成的定性和定量評(píng)價(jià)。Ρ17時(shí)處死小鼠以通過(guò)組織學(xué)和定量測(cè)量分析新血管形成。某些小鼠用熒光素-右旋糖酐經(jīng)歷視網(wǎng)膜血管造影。對(duì)于該定性評(píng)價(jià)，我們?nèi)缜八雎樽硇∈笥揍滩⑹褂煤?0mg/ml熒光素標(biāo)記的右旋糖酐(2x106平均分子量，Sigma)的Iml PBS (已經(jīng)通過(guò)以IOOOOrpm離心5min澄清)通過(guò)左心室灌注心臟。摘除眼睛并在4%多聚甲醛中固定3小時(shí)。移除角膜和晶狀體并從眼罩剝離出視網(wǎng)膜。將視網(wǎng)膜·切成四象限并平裝在蓋玻片下的Vectashield中用于通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)。檢測(cè)每種處理的至少12只眼睛。對(duì)于組織學(xué)分析，處死小鼠幼崽，摘除它們的眼睛，4°C下在4%多聚甲醛固定至少16小時(shí)并埋入石蠟中。我們用HM355、MICROM MICROTEC顯微鏡用薄片切片機(jī)制備了徑向5-μ m切片，用高碘酸-SchifT試劑染色該切片并用H&E復(fù)染色。我們?cè)谝暽窠?jīng)的每一側(cè)上計(jì)數(shù)5-8個(gè)切片。兩名受訓(xùn)調(diào)查人在XlOO放大倍率下盲目計(jì)數(shù)每個(gè)完整切片中跨越整個(gè)視網(wǎng)膜樣品的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)腔數(shù)。使用用于聚集數(shù)據(jù)的Poisson衰退模型測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞核和血管數(shù)量的平均數(shù)；平均數(shù)評(píng)估的95%置信區(qū)間表示為誤差棒。通過(guò)Bonferroni法校準(zhǔn)P值，用于事后組比較。統(tǒng)計(jì)學(xué)。對(duì)于小鼠和兔模型實(shí)驗(yàn),用GraphPad Prism 4或Prism 5程序分析定量數(shù)據(jù)(表示為平均值土 SEM)。對(duì)每個(gè)動(dòng)物測(cè)定每個(gè)可變血管平均值(活體顯微鏡和組織學(xué)分析)，并使用這些值計(jì)算每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中所有動(dòng)物的總平均。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)測(cè)試前，我們確定數(shù)據(jù)是否是正常分布并評(píng)價(jià)它們的差異。然后，我們?nèi)缢具M(jìn)行適當(dāng)?shù)臏y(cè)試。對(duì)于體內(nèi)時(shí)間-過(guò)程實(shí)驗(yàn)，我們使用兩路ANOVA分析或Student' s t_測(cè)試。我們報(bào)告了每個(gè)測(cè)試的實(shí)際P值。P <0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。對(duì)于視網(wǎng)膜計(jì)數(shù)，因?yàn)樵趯儆谙嗤劬拖嗤∈蟮慕M織學(xué)切片間有2個(gè)嵌套的相關(guān)水平，使用SAS統(tǒng)計(jì)包v9. I. 3的proc GLMMIX(SasInstitute),通過(guò)Poisson廣義線(xiàn)性混合模型(59)分析細(xì)胞核和血管內(nèi)腔計(jì)數(shù)。我們視實(shí)驗(yàn)處理組為固定影響因素并視單個(gè)眼睛為隨機(jī)影響。在上限處，通過(guò)定義小鼠為簇用計(jì)算機(jī)計(jì)算固定影響評(píng)估的穩(wěn)健實(shí)證方差￠0)。P < O. 05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。結(jié)果CLl_R2mAb抑制兔角膜和小鼠模型中氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病中眼部新血管形成。通過(guò)使用兩個(gè)不同的眼部新血管生成動(dòng)物模型體內(nèi)評(píng)價(jià)CLl-R2mAb的抗血管生成性質(zhì)。對(duì)于這些研究，脊椎動(dòng)物眼睛具有優(yōu)勢(shì)，其被認(rèn)為是免疫豁免位點(diǎn)(31)，因此可能缺乏可結(jié)合CL1-R2的免疫細(xì)胞。我們首先使用兔角膜袋試驗(yàn)(28)以確定CL1-R2是否抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)誘導(dǎo)的角膜新血管形成。角膜通常缺乏血液和淋巴血管并積極地維持該無(wú)血管性(31)。在該模型中，新生血管由異色邊緣引起。含F(xiàn)GF2的角膜植入物的移植和兩次100 μ gCLl-R2或?qū)φ誌gGl結(jié)膜下注射8天后評(píng)價(jià)新血管形成。當(dāng)與對(duì)照IgGl-處理兔相比，用CL1-R2處理顯著地減少了角膜新血管形成(圖I)。這些發(fā)現(xiàn)表明CL1-R2處理抑制生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的角膜新血管形成。接著，通過(guò)將早產(chǎn)新生小鼠(P7-P12)暴露于高氧水平，在人早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病的小鼠模型中研究CL1-R2的效果(32，33)。在100%這些動(dòng)物中，向含氧量正常條件的恢復(fù)誘導(dǎo)了視網(wǎng)膜缺血和VEGF相關(guān)的視網(wǎng)膜前血管形成(32)。首先在CL1-R2或?qū)φ誌gGl的玻璃體內(nèi)注射之后，在平裝FITC-右旋糖酐-灌注完整視網(wǎng)膜上進(jìn)行視網(wǎng)膜脈管系統(tǒng)的定性評(píng)價(jià)(數(shù)據(jù)未顯示)。來(lái)自正常未處理動(dòng)物的視網(wǎng)膜顯示正常的血管形成，即由視神經(jīng)向外圍延伸的表面和深血管層。血管在表面視網(wǎng)膜層中形成徑向分枝圖案和在深視網(wǎng)膜層中形成多邊形網(wǎng)狀圖案。未經(jīng)眼內(nèi)注射(‘模擬’)或?qū)φ誌gGl (‘Ctrl’)的眼內(nèi)注射的氧處理動(dòng)物的視網(wǎng)膜顯示了新生血管簇，其釋放熒光素并具有曲折放射狀血管和中央無(wú)血管區(qū)，與該模型的之前描述一致(32，33)。眼內(nèi)注射CL1-R2之后，無(wú)血管區(qū)域的尺寸顯著減少，并且視網(wǎng)膜包含更少的新生血管簇和更少的曲折及擴(kuò)大的放射狀血管(數(shù)據(jù)未顯示)，表明中央血管中更好的灌注效率。通過(guò)組織學(xué)進(jìn)一步分析來(lái)自多種未處理或氧處理動(dòng)物的眼睛。用高碘酸-SchifT試劑染色一系列眼部組織切片以顯 現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞核(數(shù)據(jù)未顯示)。與來(lái)含氧量正常環(huán)境中小鼠的視網(wǎng)膜(正常視網(wǎng)膜)不同，模擬處理小鼠的視網(wǎng)膜典型地在玻璃體空間和視網(wǎng)膜內(nèi)層中包含多種尺寸的、豐富的縱向和橫向的異常微血管、以及內(nèi)皮細(xì)胞核。來(lái)自對(duì)照IgG-處理動(dòng)物的視網(wǎng)膜顯示了相似的新血管形成，其具有豐富的異常微血管和內(nèi)皮細(xì)胞核。相反，來(lái)自注射了 CL1-R2的小鼠的視網(wǎng)膜具有明顯較少的異常血管，其尺寸大幅減少，尤其是在玻璃體空間中和視網(wǎng)膜內(nèi)，并具有更少的內(nèi)皮細(xì)胞核。為了量化視網(wǎng)膜的新血管形成，在施用抗血管生成或?qū)φ仗幚碇昂椭?，在大量樣品中?jì)數(shù)新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞核和內(nèi)腔(圖2，A和B)。這些是精確評(píng)價(jià)任何視網(wǎng)膜抗血管生成效果的關(guān)鍵參數(shù)。與注射了對(duì)照IgGl的動(dòng)物(P < O. 001 ;圖2A)相比，CL1-R2的玻璃體內(nèi)注射顯著地減少了神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)核層中每切片的內(nèi)皮細(xì)胞核的平均數(shù)。此外，當(dāng)分別與模擬-處理(P < O. 001)或IgGl-處理的對(duì)照小鼠(P < O. 001)相比時(shí)，CL1-R2的眼內(nèi)注射減少了每切片的血管內(nèi)腔平均數(shù) 50%和 35% (圖2B)。隨后在無(wú)視爭(zhēng)議(關(guān)于貝伐單抗中和鼠科VEGF-A的特異性)的相同小鼠模型中將CL1-R2處理效果與廣泛使用的mAb貝伐單抗的效果相比較(34)。多篇報(bào)道確實(shí)已經(jīng)最終證實(shí)了貝伐單抗在處理這些動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的角膜新血管形成中是有效的，盡管其對(duì)于通過(guò)小鼠、大鼠、豚鼠和兔產(chǎn)生的VEGF-A的親和力較弱(35-39)。此外，最近的研究明確顯示貝伐單抗在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病小鼠模型中的視網(wǎng)膜血管生成上具有非常明顯的抑制效果(40)。這些最近結(jié)果與我們的結(jié)果完全相符。眼內(nèi)注射貝伐單抗之后，在平裝視網(wǎng)膜上觀察到了正常的視網(wǎng)膜血管形成，其與CL1-R2處理后所得的相當(dāng)(數(shù)據(jù)未顯示)。定量分析顯示注射貝伐單抗的小鼠中每切片的血管內(nèi)腔的平均數(shù)低于IgGl-處理的對(duì)照小鼠中的平均數(shù)，并且在CL1-R2-處理和貝伐單抗-處理的小鼠之間沒(méi)有顯著差異(圖3，P = O. 93)。綜上，這些數(shù)據(jù)表明CLl_R2mAb單一療法有效地抑制了兔角膜和具有早產(chǎn)視網(wǎng)膜病的小鼠模型中的病態(tài)血管生成。實(shí)施例2 CL1R2和抗-VEGF抗體在抑制新血管形成上的協(xié)同效應(yīng)通過(guò)使用如實(shí)施例I的帶有FGF2-處理的植入物的角膜血管生成模型，發(fā)明人評(píng)價(jià)了 CLl-R2mAb聯(lián)合抗-VEGF抗體(Avastin )的體內(nèi)抗血管生成性質(zhì)。為此目的，他們比較了獲自幾組兔的結(jié)果，向所述兔施用
-僅IgGl (注射 25 μ g)；-僅Avastin (25 μ g 注射 2 次)；-僅CL1_R2(25、50 或 IOOyg 注射 2 次)；-Avastin 與 IgGl 聯(lián)合；和-Avastin ⑧與 CL1-R2 聯(lián)合。每組包括4只兔。級(jí)對(duì)應(yīng)于新生血管的長(zhǎng)度。結(jié)果示于圖4。發(fā)明人證明了在眼部新血管生成模型中抑制新血管形成中一起使用CL1-R2和抗-VEGF抗體提供了更好的結(jié)果。該結(jié)果表明CL1-R2和抗VEGF在聯(lián)合治療新生血管性眼部疾病中非常有用，因?yàn)樗鼈兊穆?lián)合提供了新血管形成的協(xié)同抑制。實(shí)施例3 :完整形式的CL1-R2以及Fab' 2形式的CL1-R2的效果發(fā)明人比較了完整形式的CL1-R2和Fab' 2形式的CL1-R2在角膜新血管形成上的效果。為此目的，他們使用對(duì)照I gGI。 結(jié)果披露于圖5。級(jí)對(duì)應(yīng)于新生血管的長(zhǎng)度。發(fā)明人已經(jīng)表明，與對(duì)照IgGl提供的效果相比，完整形式的CL1-R2在抑制新血管形成上提供了更好的結(jié)果。他們進(jìn)一步證明了 Fab ' 2形式非常適于抑制新血管形成，因?yàn)槠渑c完整形式CL1-R2和對(duì)照IgGl相比提供了更好的結(jié)果。實(shí)施例4 AMD小鼠樽型中小鼠和嵌合杭_CD160mAb的效果本研究的目的是評(píng)價(jià)在再現(xiàn)AMD的許多特征的脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)的小鼠模型中，小鼠和嵌合抗_CD160mAb對(duì)抑制病態(tài)眼部新血管形成的治療效果。通過(guò)氪激光影響施用誘導(dǎo)脈絡(luò)膜血管生成。通過(guò)體內(nèi)血管造影術(shù)定性評(píng)價(jià)CNV，和通過(guò)直接測(cè)量平裝脈絡(luò)膜上的CNV面積定量評(píng)價(jià)CNV。材料和方法動(dòng)物由Janvier Laboratories (Lassalle, QC)獲得雄性 C57B1/6J 小鼠(6 周大)。動(dòng)物居住于常規(guī)溫度控制室(21°C )，具有每天12h日光周期。對(duì)于由Jackson實(shí)驗(yàn)室推薦的C57BL6/J小鼠品系隨意喂食平衡飲食。根據(jù)動(dòng)物保健機(jī)構(gòu)委員會(huì)的指導(dǎo)處理動(dòng)物，使用經(jīng)機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(institutional review board)批準(zhǔn)的方案,并依照眼科和視力研究中使用動(dòng)物的ARVO聲明。在整個(gè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)監(jiān)控小鼠的一般狀態(tài)，包括它們的體重、食物攝入和行為。激光誘導(dǎo)CNV的鼠科模型如前所述,通過(guò)Bruch’ s膜的氪激光誘導(dǎo)的破裂產(chǎn)生CNV(Tobe等，1998,EdelmanJl 2000 ；Montezuma SR 等，2009)。通過(guò)肌內(nèi)注射 100mg/kg 克他命(克他命 1000 ,VirbacFrance, Carros,法國(guó))和 10mg/kg 甲苯噻嗪(Rompun 2% ，Bayer Pharma, PuteauxJi國(guó))的混合物麻醉小鼠。用0. 4%奧布卡因鹽酸鹽(Cebesine , Chauvin Laboratory,Montpellier,法國(guó))麻醉小鼠角膜并用10%苯腎上腺素(Neosynephrine Faure 10 % 。Pharmaster。Erstein。法國(guó))和 0. 5 % 托品酸胺(Mydriaticum , Farmila, TheaFarmaceutici, Settimo Milanese,意大利)眼滴劑擴(kuò)大瞳孔。使用小心校準(zhǔn)的氪激光在每只小鼠的一只眼睛中誘導(dǎo)3種激光誘導(dǎo)影響(通常在視盤(pán)周?chē)?、12和3點(diǎn)鐘位置)，以引起B(yǎng)ruch’ s膜分裂和萌發(fā)自鎊伊施氏膜(光點(diǎn)直徑50 μ m ;功率 400mW,曝光時(shí)間 100ms, Ophthalas, Biophysics Medical, Clermont Ferrand,法國(guó))和隱形眼鏡的二級(jí)脈絡(luò)膜新血管形成。在本研究所包括的所有處理的眼睛中，激光處理后在視網(wǎng)膜表面觀察到了活性創(chuàng)傷性泡，這提供了適當(dāng)對(duì)焦的證據(jù)并作為Bruch’ s膜破裂的跡象。玻璃體內(nèi)注射方案在操作顯微鏡下進(jìn)行所有程序和，每個(gè)動(dòng)物在氪激光施用之后I天接受玻璃體內(nèi)注射入眼。將小鼠(6周大)分配為6組組I :嵌合抗人-Q)160mAb-處理的小鼠(CLl_R2chim. , η = 15)；組2 :小鼠抗人-CD160mAb-處理的小鼠(CL1-R2, η = 17)； 組3 :小鼠IgGl同型對(duì)照mAb-處理的小鼠(HE6，η = 15)；組4 :大鼠抗小鼠CD160mAb-處理的小鼠(CNX46-3，η = 14)；組5 :小鼠抗人_CD160mAb Fab’ 2片段-處理的小鼠(Fab，2，η = 15)；組6 Kenacort retard 40 -處理的小鼠(Kenacort, η = 15)。通過(guò)肌內(nèi)注射克他命(100mg/k)和甲苯噻嗪(10mg/kg)的混合物來(lái)麻醉小鼠。用局部10%苯腎上腺素和0. 5%托品酰胺放大瞳孔。將安裝于5 μ I Hamilton注射器的IOmm33號(hào)鋼針的尖通過(guò)鞏膜推入玻璃體中在角膜鞏膜異色邊緣之后1_的位置。對(duì)于每個(gè)產(chǎn)品，將1μ I注射入玻璃體腔* 嵌合抗人-CD160mAb(10y g/μ 1，批次 29120-00，MAT 生物制藥)，* 小鼠抗人-CD160mAb (10 μ g/μ 1，批次 280910-00，MAT 生物制藥)，* 小鼠 IgGl 同型對(duì)照 mAb(10y g/μ 1，批次 191110-00，MAT 生物制藥)，* 大鼠抗小鼠 CD 16 OmAb (10 μ g/μ I, eBioscience)，* 小鼠抗人-CD160mAb Fab’ 2 片段(10 μ g/μ 1，批次 191110-00，MAT 生物制藥)*Kenacort retard 40 (40mg/ml, Bristol Myers Squibb,法國(guó))。CNV的定性和定量評(píng)價(jià)氪激光施用后14天和21天，小鼠經(jīng)歷熒光素血管造影以定性評(píng)價(jià)脈絡(luò)膜的新血管形成。氪激光施用21天后處死小鼠，以定量分析脈絡(luò)膜平裝。體內(nèi)血管造影-激光誘導(dǎo)影響誘導(dǎo)之后14天和21天進(jìn)行熒光素血管造影。如前所述麻醉小鼠并在腹膜內(nèi)注射0.5ml 10%熒光素鈉(10% Faure ，Novartis Pharma,Rueil-Malmaison,法國(guó))之后拍攝一系列眼底照片(Canon CF_60UVi, Haag-Streit,Chambery，法國(guó))。來(lái)自新形成的異常滲透血管的熒光素滲漏導(dǎo)致在氪激光影響誘導(dǎo)的病變位點(diǎn)處超熒光點(diǎn)的顯影，明顯地區(qū)別于正常視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜脈管系統(tǒng)。脈絡(luò)膜平裝-激光處理后21天，用通過(guò)IOOOOrpm(IIIOxg)下離心5分鐘澄清的300 μ I 50mg/ml熒光素-標(biāo)記的右旋糖酐的PBS溶液(異硫氰酸熒光素-右旋糖酐，2xl06平均分子量，Sigma，法國(guó))通過(guò)左心室進(jìn)行心臟灌注。將激光-處理的眼睛摘除并立即通過(guò)4°C下培養(yǎng)在4%多聚甲醛中固定至少16小時(shí)。移除角膜和晶狀體并從眼罩小心剝離出整個(gè)視網(wǎng)膜。通過(guò)4至5個(gè)放射狀切口剝離出視網(wǎng)膜色素上皮-脈絡(luò)膜-鞏膜眼罩，平裝于Vectashield中的載玻片，并用蓋玻片覆蓋以用于具有xlO物鏡的突光顯微鏡(Axioplan2, Zeiss, Le Pecq，法國(guó))檢查。也獲得了校準(zhǔn)圖像。用Image J軟件測(cè)量受脈絡(luò)膜新血管形成影響的面積(以μ m2表示)。對(duì)單個(gè)眼睛和單個(gè)動(dòng)物計(jì)算多種病變獲得的新生血管面積的測(cè)量平均值。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。對(duì)于組間重大差異的檢測(cè)，使用參數(shù)測(cè)試進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(差異ANOVAJP PLSD Fisher測(cè)試的分析-Statview軟件,第5版)。P < O. 05的值被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。MM實(shí)驗(yàn)期間各組的死亡率相似組2為3/17(5.8% )、組3為2/15 (13 % )、組41/14(7. 1% )、組5為2/15 (13.3% )、和組I和組6中無(wú)死亡。用于激光光凝或體內(nèi)血管造影的麻醉期間或之后發(fā)生死亡。
隨后未在6組小鼠間觀察到體重增加的明顯差異。如前所述，通過(guò)直接測(cè)量在平裝脈絡(luò)膜上顯示脈絡(luò)膜新血管形成的面積來(lái)量化處理效果(Edelman and Castro, 2000)。使用參數(shù)測(cè)試進(jìn)行顯示CNV的面積分析(差異ANOVA和PLSD Fisher測(cè)試的分析)。結(jié)果示于圖 6。CL1-R2U12，P < O. 0001)和 Fab’2-處理的小鼠(組 5，P = O. 0001)中CNV面積明顯小于小鼠IgGl同型對(duì)照-處理的小鼠(組3)中的面積。用作陽(yáng)性對(duì)照的Kenacort (組 6，P < O. 0001)處理、和 CNX46-3 (組 4，P < O. 0001)顯示了與同型對(duì)照組相比類(lèi)似的效果。與在小鼠IgGl同型-處理的小鼠(P < O. 0001)中測(cè)量的面積相比，使用CL1-R2嵌合抗體的處理顯著地減少了 CNV面積。值得注意的是，在CL1-R2與CL1-R2嵌合處理(P = O. 9888)之間和Fab，2與CL1-R2或CL1-R2嵌合處理(分別為P = O. 0951和P = O. 0925)之間觀察到了類(lèi)似的效果。新血管形成的定量評(píng)價(jià)表明CL1-R2、嵌合CL1-R2、Fab’ 2處理和CNX46_3i)與小鼠IgGl同型對(duì)照處理相比，減少了受CNV影響的面積和ii)在氪激光誘導(dǎo)CNV以及陽(yáng)性對(duì)照(Kenacort )的完善小鼠模型中預(yù)防脈絡(luò)膜的新生血管形成。參考文獻(xiàn)本申請(qǐng)中引用的參考文獻(xiàn)為I. Carmeliet P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 2005 ；438(7070) :932-936.2. Sherris D. Ocular drug development-future directions.Angiogenesis. 2007 ； 10(2) :71-76.3.Buckanovich RJ,等·Endothelin B receptor mediates the endothelialbarrier to T cell homing to tumors and disables immune therapy. Nat Med. 2008 ；14(1) :28-36.4. Shojaei F,Ferrara N. Antiangiogenesis to treat cancer and intraocularneovascular disorders. Lab Invest. 2007 ；87 (3) :227-230.5. Cao Y. Tumor angiogenesis and molecular targets for therapy. FrontBiosci. 2009 ； 14 (3962-3973.6. Folkman J. Angiogenesis an organizing principle for drug discovery Nat Rev Drug Discov. 2007 ；6 (4) :273-286.7.Paez-Ribes M，等·Antiangiogenic therapy elicits malignant progressionof tumors to increased local invasion and distant metastasis. Cancer Cell. 2009 ；15(3) :220-231.8. Takeda A，等.CCR3 is a target for age-related macular degenerationdiagnosis and therapy. Nature. 2009 ；460 (7252) :225-230.9. Ma WW，Adjei AA. Novel agents on the horizon for cancer therapy. CACancer J Clin. 2009 ；59(2) :111-137.10. Rosenfeld PJ,等·Ranibizumab for neovascular age-related maculardegeneration. N Engl J Med. 2006 ；355 (14) 1419-1431.
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權(quán)利要求
1.抗-⑶160抗體，用于治療和/或預(yù)防新生血管性眼部疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的抗-CD160抗體，其中所述抗-CD160抗體誘導(dǎo)活性增殖內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的抗-CD160抗體，其中所述抗-CD160抗體為選自抗-CD160單克隆抗體、它們的保守片段和它們的保守衍生物的化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的抗-CD160抗體，其中所述抗-CD160抗體為選自CL1-R2單克隆抗體、其保守片段和其保守衍生物的化合物。1
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的抗-CD160抗體和抗-VEGF抗體作為聯(lián)合制劑，用于同時(shí)、分別或相繼治療和/或預(yù)防新生血管性眼部疾病。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的抗-CD160抗體，其特征在于所述新生血管性眼部疾病選自 籲所有形式的角膜新血管形成； 所有形式的視網(wǎng)膜病； 諾里病； 所有形式的脈絡(luò)膜新血管形成、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜息肉狀血管病、與近視和Sorsby氏營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的反凹脈絡(luò)膜新生血管； 葡萄膜黑色素瘤；和 虹膜紅變和新生血管性青光眼。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗-⑶160抗體，其特征在于新生血管性眼部疾病選自 作為角膜移植和/或角膜感染和/或選自病原體感染和化學(xué)燒傷的角膜環(huán)境性損傷的并發(fā)癥發(fā)生的新血管形成； 糖尿病性缺血性和水腫性視網(wǎng)膜病、早發(fā)性糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜病的非增殖和增殖形式、黃斑囊樣水腫、所有形式的年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)、包括Best病的所有黃斑卵黃變性；眼部血管瘤如Von Hippel-Lindau氏病；Eale氏??；Coats氏病； 諾里病； 所有形式的脈絡(luò)膜新血管形成、視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜息肉狀血管病、與近視和Sorsby氏營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的反凹脈絡(luò)膜新生血管； 脈絡(luò)膜黑色素瘤及其轉(zhuǎn)移；和 虹膜紅變和新生血管性青光眼。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的抗-CD160抗體，用于治療和/或預(yù)防耐抗-VEGF療法的受試者的新生血管性眼部疾病。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的抗-CD160抗體，用于治療年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)的抗-CD160抗體，其特征在于所述化合物為單克隆抗體CL1-R2。
11.根據(jù)權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)的抗-CD160抗體，其特征在于所述化合物為選自CL1-R2的 Fab、Fab、F(ab)2、F(ab' )2 和 dAb 的 CL1-R2 保守片段。
12.根據(jù)權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)的抗-CD160抗體，其特征在于所述化合物為選自衍生自CL1-R2并融合至Fe片段的scFv、(scFv) 2、雙抗體、多聚scFv ;連接在一起達(dá)到整合形式的完整CL1-R2抗體；以及含有至少兩個(gè)首尾連接的Fab的抗體的CL1-R2的保守衍生物。
13.根據(jù)權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)的抗-CD160抗體，其特征在于所述保守衍生物為單價(jià)或多價(jià)scFv。
全文摘要
本發(fā)明涉及至少一種抗-CD160抗體，優(yōu)選選自CL1-R2單克隆抗體(其可通過(guò)雜交瘤CNCM I-3204獲得)、其保守片段和其保守衍生物的化合物在制備設(shè)計(jì)用以治療新生血管性眼部疾病的藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102892432SQ201180024138
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者P·勒布泰耶, A·邦敘桑 申請(qǐng)人:國(guó)家醫(yī)療保健研究所, 瑪博生命