專利名稱：穩(wěn)定的生長激素化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗蛋白水解性降解的穩(wěn)定的生長激素(GH)化合物。
背景技術：
生長激素(GH)是一種由哺乳 動物垂體前葉分泌的多肽激素。依物種而定，GH是一種由大約190個氨基酸殘基組成的蛋白質，對應分子量約為22 kDa。GH與細胞表面受體即GH受體(GHR)結合，并通過GH受體發(fā)出信號。GH在促進生長、保持正常身體組成、合成代謝和脂質代謝中起關鍵作用。它還對中間代謝具有直接作用，例如葡萄糖攝取降低、脂解作用(Iipolysis)增加、氨基酸攝取和蛋白質合成增加。該激素還對其它組織發(fā)揮作用，包括脂肪組織、肝、腸、腎、骨骼、結締組織和肌肉。重組hGH已有生產且可市售獲得，例如Genotropin (Pharmacia Upjohn)、Nutropin 和 Protropin (Genentech)、Humatrope (Eli Lilly) > Serostim (Serono)、諾地托品(Novo Nordisk)、Omnitrope (Sandoz)、Nutropin Depot (Genentech和Alkermes)。另外,在N末端具有額外甲硫氨酸殘基的類似物還以例如 Somatonorm (Pharmacia Upjohn/Pfizer)銷售。GH與蛋白質GH家族的其它成員催乳素(PRL)和胎盤催乳激素(PL)有共同的拓撲結構。GH被歸類為4螺旋束蛋白質(圖I)，顯示具有兩個保守的二硫鍵的“上-上-下-下(up-up-down-down) ”拓撲結構。具體而言,野生型人GH (hGH)由191個氨基酸殘基組成，并在53、165、182和189位上具有4個半胱氨酸殘基，其通過形成分別連接C53與C165和C182與C189的2個分子內二硫鍵而穩(wěn)定蛋白質的三維結構(圖I)。通過X射線晶體學實驗性地測定了以下的hGH結構游離形式(Chantalet L.等(1995) Protein and PeptideLetters 3,333-340)和與其結合蛋白(人GHR (hGHR)的胞外結構域)的復合物(Devos，A. M.等(1992) Science 255,306-312)。這些結構已保藏在蛋白質數據庫(PDB)中，并且是可公開獲取的(PDB登錄代碼分別為IHGU和1HWG)。因此，根據已發(fā)表的hGH結構，可鑒定出對于hGH與hGHR結合重要的殘基。此外，通過核磁共振(NMR)波譜術研究了 hGH的動力學特性(Kasimova M. R.等.J. Mol. Biol. (2002) 318,679-695)。聯(lián)合地，X 射線和NMR數據可區(qū)分結構化良好和定義明確的hGH的區(qū)域與結構化較少并且是動態(tài)的區(qū)域。預期hGH的較少結構化的動態(tài)區(qū)特別易遭蛋白酶剪切，該區(qū)域的適當穩(wěn)定可導致蛋白水解穩(wěn)定性改進。已對hGH進行大量誘變以試圖產生具有所需化學或生物性質的hGH類似物。具體而言，已描述了用于若干目的的半胱氨酸突變體。US 2003/0162949公開了 GH超基因家族成員的半胱氨酸變體。提供用于產生這些蛋白質的位點特異性的生物活性綴合物的通用方法。所述方法包括將半胱氨酸殘基加到蛋白質的非必需區(qū)或采用定點誘變用半胱氨酸殘基取代蛋白質中的非必需氨基酸，然后通過所加入的半胱氨酸殘基，將半胱氨酸反應性聚合物或其它類型的半胱氨酸反應性部分與蛋白質共價偶聯(lián)。WO 02/055532描述了遺傳工程改造的具有至少一個共價連接的非多肽部分的hGH突變體，特別是其中所引入的半胱氨酸殘基被用于聚乙二醇化的hGH突變體。
US 5,951,972描述了有生理活性的衍生化天然和重組的哺乳動物和人蛋白質和多肽，其中蛋白質內至少一個天然存在的或摻入的半胱氨酸殘基用各種取代基衍生化。詳細研究了 hGH的蛋白酶剪切。由殘基128-154組成的長環(huán)具有例如以下幾種蛋白酶的推定的切割位點凝血酶、纖維蛋白溶酶、膠原酶、枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。因此，該部分的hGH顯示特別易受蛋白酶剪切影響(Lewis,U. J. Ann.Rev. Physiol. (1984.) 46，33_42)。已報道的降解hGH的酶包括凝血酶、纖維蛋白溶酶、枯草桿菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶和激肽釋放酶。已對大鼠組織中的hGH降解進行了研究(Garcia-Barros等.J. Endocrinol.Invest. (2000) 23,748-754)。發(fā)現在大鼠甲狀腺中，有利于在大型和親脂性氨基酸殘基處切割的胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶首先切割Y143和S144之間的肽鍵，產生2鏈分子，接著在Y42和S43之間切割，釋放N端肽F1-Y42。再通過胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶在F146和D147之間切割并再通過羧肽酶的作用，加工2鏈分子中的裂解環(huán)(split loop) o 已報道了產生對蛋白水解性降解穩(wěn)定的hGH類似物的幾種方法。Alam等人(J. Biotech. 65,183-190 (1998))通過特異性點突變，設計了抗凝血酶和纖維蛋白溶酶的hGH突變體。凝血酶特別在R134和T135之間切割hGH，雙重突變體R134D, T135P產生抗凝血酶切割的hGH變體，而三重突變體R134D，T135P, K140A產生纖維蛋白溶酶抗性。此外，后一種hGH突變體具有在7天時間內抗人血漿蛋白酶解的抗性。EP534568描述了通過使R134突變成丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或組氨酸而對蛋白水解性降解穩(wěn)定的hGH突變體。W02004022593/Nautilus描述了通用的高通量定向進化方法，以產生蛋白水解穩(wěn)定性提高的修飾細胞因子(包括GH變體)。W02006048777/Nautilus特別描述了蛋白水解穩(wěn)定性改進的修飾的hGH類似物。類似物在 1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185和187-191位含有1_5個突變。半胱氨酸殘基的引入可能導致形成不需要的二硫鍵連接的二聚體，在W02006048777的范圍明確不包括氨基酸殘基被半胱氨酸取代；在102006048777 (第65頁)中闡述“明確避免氨基酸被半胱氨酸殘基置換，因為這種改變可能導致形成分子間二硫鍵”。顯然需要開發(fā)抗蛋白水解性降解的hGH化合物。這種穩(wěn)定化合物對蛋白酶剪切應顯示出提高的穩(wěn)定性，同時保持所需的hGH的生物學性質。這種GH分子應提高穩(wěn)定性、降低清除率和/或延長體內半衰期。此外，蛋白質治療劑通常需要靜脈內或皮下給予，因為其通常不能通過口服而充分利用。蛋白質口服生物利用度低部分是由于胃腸道中的蛋白水解性降解所致。因此，還需要開發(fā)可以口服給予以治療hGH相關病癥的hGH化合物。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及生長激素化合物，所述化合物與人生長激素相比，包含一個或多個額外的二硫鍵和至少一個額外的單點突變。在本發(fā)明的GH化合物中，通過將野生型hGH序列中的至少一個氨基酸突變成半胱氨酸而引入至少一個額外的半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的GH化合物中，以一定方式選擇一個或多個突變位點，使得(I)將所引入的一個或多個半胱氨酸殘基適當置于折疊的蛋白質的三維結構中，以允許形成不存在于野生型蛋白質中的一個或多個額外的二硫鍵，(2)不破壞hGH的天然結構，(3)與野生型hGH相比，GH化合物對于蛋白酶剪切的穩(wěn)定性提高或其它功能增強，和(4) GH化合物保持所需的與野生型hGH相關的生物活性。在胃腸道中抗蛋白水解性降解的hGH的這類二硫化物變體可被開發(fā)作為口服給予的用于治療hGH相關病癥的藥物。附圖
簡述
圖I :與2拷貝hGH結合蛋白結合的hGH的結構(PDB IHWG)。hGH中4個主要螺旋以暗灰色顯示，標為m-H4。方向(N — C端)用箭頭標示。hGH的N端和C端分別標為N和C。分別連接C53與C165和C182與C189的2個二硫鍵用黑色棒與球表示。還標記了 L128和D154,分別表不連接H3和H4的長的柔性環(huán)中的第一個和最后一個殘基。圖2 :具有突出顯示并標記的4個主要螺旋(H1-H4)的hGH的野生型氨基酸序列。還標記了連接主要螺旋的3個環(huán)(L1-L3)。螺旋定義(helix definition)是指與其結合蛋白復合的 hGH (PDB 1HWG)。
定義
在本文中，詞語“人生長激素(hGH) ”、“hGH wt"和“野生型hGH wthGH) ”可互換使用，均是指具有SEQ ID No. I的氨基酸序列的蛋白質。在本文中，術語“肽”和“多肽”可互換使用，意欲表示相同含義。術語“肽”或“多肽”欲表示由肽鍵連接的兩個或更多個氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然的或非天然的。組分氨基酸(constituent amino acid)可來自由遺傳密碼編碼的氨基酸的組，它們可以是并非由遺傳密碼編碼的天然氨基酸和合成氨基酸。非遺傳密碼編碼的天然氨基酸例如Hyp (輕脯氨酸)、Y -羧基谷氨酸(y-carboxyglutamate)、Orn (鳥氨酸)、磷酸絲氨酸、D-丙氨酸和D-谷氨酰胺。合成氨基酸包括化學合成法制備的氨基酸，例如由遺傳密碼編碼的氨基酸的D-異構體，例如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aad (a -氨基己二酸)、Aib ( a -氨基異丁酸)、Abu (a-氨基丁酸)、Agl ( a -氨基甘氨酸)、Asu ( a -氨基辛二酸)、Cha ( P -環(huán)戍基-丙氨酸)、Chg (環(huán)己基甘氨酸)、Dab ( a，y - 二氨基丁酸)、DapU，￠-二氨基丙酸)、Hcy (高半胱氨酸)、Hpr (高脯氨酸)、Nle (正亮氨酸)、Phg (苯甘氨酸)、Hph (聞苯丙氨酸)、INal ( P-(I-萘基-丙氨酸)、2Nal (￠-(2-萘基-丙氨酸)、2Pal (-(2-吡啶基)-丙氨酸、3Pal ( P _ (3_吡啶基)-丙氨酸)、Pip (4-氨基-哌啶-4-羧酸)、Pra (炔丙基-甘氨酸)、Pyr (焦谷氨酸)、Gla ( Y -羧基-谷氨酸)、Hci(高瓜氨酸)、Nva (正纈氨酸)、ne (叔丁基甘氨酸)、￠-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸和鄰氨基苯甲酸。該術語還包括術語“蛋白質”，其可由一條多肽鏈組成，或者由通過非共價或共價相互作用(例如半胱氨酸橋)連接在一起的兩條或更多條多肽鏈組成。要理解的是，該術語還欲包括這樣的肽，除包含額外的二硫鍵以外，例如還通過例如但不限于以下部分與肽的側鏈或主鏈連接而被衍生化PEG、碳水化合物、脂肪酸、白蛋白結合劑、烷基鏈、親脂基團、維生素、膽汁酸或間隔物(spacer)。術語肽包括任何合適的肽，并且可與術語多肽和蛋白質作為同義詞使用，除非另有說明或與上下文抵觸，只要讀者認識到，各種含有氨基酸聚合物的分子的各個類型可能與顯著差異有關，從而構成本發(fā)明的各個實施方案(例如由多個多肽鏈組成的肽例如抗體顯著不同于例如單鏈抗體、肽免疫黏附素或單鏈免疫原性肽)。因此，本文的術語肽一般應理解為是指任何合適大小和組成(就氨基酸的數目和蛋白質分子中相關鏈的數目而言)的任何合適的肽。此外，本文所述肽可包含非天然存在的和/或非L氨基酸殘基，除非另有說明或與上下文抵觸。除非另有說明或與上下文抵觸(且如果作為術語多肽和/或蛋白質的各個實施方案論述時)，否則術語肽還包括衍生化肽分子。衍生化肽分子是這樣的肽分子，其中肽的一個或多個氨基酸殘基被化學修飾(例如通過烷基化、?；?、酯形成或酰胺形成)或與一個或多個非氨基酸有機和/或無機原子或分子取代基(例如聚乙二醇(PEG)基團、親脂性取代基(其任選可通過間隔物殘基或基團例如P -丙氨酸、Y -氨基丁酸(GABA)、L/D-谷氨酸、琥珀酸等與肽的氨基酸序列連接)、熒光團、生物素、放射性核素等)締合，并且衍生化肽分子可另外或備選地包含非必需的、非天然存在的和/或非L氨基酸殘基，除非另有說明或與上下文抵觸(然而，還應認識到，這種衍生物本身且獨立地被視為本發(fā)明的獨立特征，肽的含義中包括這類分子是為了便于描述本發(fā)明，并非意味著裸肽和這種衍生物之間有任何某種的等同性)。這類氨基酸殘基的非限制性實例包括例如2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、P -丙氨酸、3 -氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、 3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、鎖鏈素、2，2’ -二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥賴氨酸、別羥賴氨酸、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-N-甲基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、炔丙基-甘氨酸和抑制素(statine)鹵化的氨基酸。本發(fā)明所述“化合物”可以是“蛋白質”或“肽”或“多肽”，不論其修飾方式，其均可以是保持所需要的類似于WthGH的生物活性的“類似物”或“衍生物”或“變體”。當指多肽時本文所用術語“類似物”或“變體”，意指所述肽的修飾形式，其中肽的一個或多個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基取代和/或其中一個或多個氨基酸殘基從肽中缺失，和/或其中一個或多個氨基酸殘基被添加至肽中。氨基酸殘基的這類取代或添加或缺失可發(fā)生在肽的N端和/或肽的C端和/或肽的N端或C端之間。未規(guī)定旋光異構體的所有氨基酸要理解為意指L-異構體。術語“二硫鍵”或“二硫橋”可互換使用，意欲表示相同含義。在半胱氨酸殘基的疏基之間形成蛋白質中的“~■硫鍵”或“_■硫橋”。術語“額外的半胱氨酸”或“引入的半胱氨酸”可互換使用，意欲表示相同含義。該術語欲包括不存在于野生型hGH中的半胱氨酸殘基。為了使結構變化降到最小，通常通過一個或多個氨基酸殘基的取代引入一個或多個半胱氨酸殘基，以此保持hGH的長度。在環(huán)部分中或在螺旋的邊界(boarder)可容許額外cys殘基的插入,但在螺旋內引入cys殘基不太有吸引力。術語“額外的二硫鍵”或“引入的二硫鍵”可互換使用，意欲表示相同含義。該術語欲包括在兩個半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵，其中至少一個半胱氨酸殘基不存在于野生型hGH中。本文所用術語“額外的單點突變”表示突變(與SEQ ID NO I限定的hGH相比)，其與引入到生長激素化合物中的形成二硫橋的額外半胱氨酸無關。術語“額外的單個cys突變”可用來指引入半胱氨酸殘基的點突變。這類突變可以是“額外的單點突變”或甚至是hGH中的更多突變。本文所用術語“衍生物”是指肽或多肽，其中肽的一個或多個氨基酸殘基通過將聚合物(例如PEG)、碳水化合物部分、白蛋白結合劑、脂肪酸、親脂基團、維生素、膽汁酸或間隔物引入生長激素化合物的側鏈或主鏈而進行化學修飾?；瘜W修飾在性質上也可以是暫時的，即其可容易地在體內除去。例如可通過細胞本身或通過在表達后在肽上進行化學修飾，在翻譯后引入化學修飾。
本領域所知術語“同一性”是指兩個或更多個肽序列間的關系，這通過比較序列來確定。本領域中，“同一性”還指肽之間序列相關性的程度，這通過兩個或更多個氨基酸殘基的串(string)之間的匹配數目確定?！巴恍浴睖y量兩個或更多個序列之間相同匹配的百分比，這用由具體的數學模型或計算機程序(即“算法”)得出的缺口比對(如果有的話)來進行?？梢酝ㄟ^已知方法容易地計算出相關肽的同一性。這類方法包括但不限于描述于以下文獻的方法〖Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.,主編，Oxford University Press, New York, 1988 ；Biocomputing: Informatics and GenomeProjects, Smith, D. ff.,主編，Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysisof Sequence Data,第 I 部分，Griffin, A. M.和 Griffin, H. G.,主編，HumanaPress, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,Academic Press, 1987 ；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. ^PDevereux, J.,主編，M. Stockton Press, New York, 1991 ;以及 Carillo 等，SIAM J. Applied Math.48, 1073 (1988)。設計了確定同一性的優(yōu)選方法以得到所測試序列之間的最大匹配。確定同一性的方法在可公開獲取的計算機程序中描述。確定2個序列之間同一性的優(yōu)選計算機程序方法包括 GCG 程序包，包括 GAP (Devereux 等，Nucl. Acid. Res. j_^，387 (1984) ；GeneticsComputer Group, University of Wisconsin, Madison, ffis.)、BLASTP> BLASTN 和 FASTA(Altschul 等，J. Mol. Biol. 215,403-410 (1990))。BLASTX 程序可公開獲自美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)和其它來源(BLAST 手冊，Altschul 等 NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894 ；Altschul 等，同上)。眾所周知的Smith Waterman算法也可用于確定同一丨丨生。例如，運用計算機算法GAP (Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, Wis.),針對其相應氨基酸的最佳匹配,對待確定序列同一1丨生百分比的兩個肽進行比對(“匹配跨度(matched span) ”，由算法確定)。缺口開放罰分(gapopening penalty)(經計算為平均對角線(average diagonal)的三倍；“平均對角線”是所用比較矩陣對角線的平均值；“對角線”是通過具體比較矩陣賦予每個完全匹配氨基酸的分值或數目)，缺口延伸罰分(其通常為{分數(1/10)}乘以缺口開放罰分)以及比較矩陣(例如PAM 250或BLOSUM 62)與算法結合使用。算法還利用了標準比較矩陣(對于PAM250 比較矩陣參見 Dayhoff 等，Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, (1978)；對于 BLOSUM 62 比較矩陣參見 Henikoff 等，PNAS USA 89,10915-10919 (1992))。肽序列比較的優(yōu)選參數包括下列參數
算法Needleman 等，J. Mol. Biol. 48,443-453 (1970);比較矩陣Henikoff 等，PNAS USA 型，10915-10919 (1992)的 BLOSUM 62 ;缺口罰分12，缺口長度罰分4，相似性閾值
具有上述參數的GAP程序是有用的。運用GAP算法，上述參數對于肽比較是默認參數(連同末端缺口無罰分)。術語“蛋白酶”意欲包括具有催化肽鍵水解切割能力的所有酶。蛋白酶可以是胞內、胞外或膜結合的蛋白酶、蛋白水解酶或肽酶，并包括哺乳動物腸腔的蛋白酶和哺乳動物血漿中存在的蛋白酶。蛋白酶可以是內切蛋白酶和外切蛋白酶兩種類型。術語“抗蛋白水解性降解”或“對蛋白水解性降解的穩(wěn)定性提高”或“對蛋白酶剪切的穩(wěn)定性提高”或“蛋白水解穩(wěn)定性改進”或“蛋白水解穩(wěn)定性”可互換使用，意欲表示相同含義。如果與本發(fā)明的hGH化合物聯(lián)用，則該術語意欲表示與野生型hGH相比，所述hGH化合物的多肽鏈在特定情況下以較慢的速度被蛋白酶剪切。蛋白質的蛋白酶剪切速度可通過本領域技術人員已知的幾種技術測定。測量hGH 或hGH化合物降解速率的測定法的實例描述于實施例5。本發(fā)明還涉及可用于改進hGH化合物的藥理性質的方法。這些藥理性質可為例如延長功能性體內半衰期、血漿體內半衰期、平均滯留時間、降低腎清除率。術語“功能性體內半衰期”以其標準意義使用，即達到肽(例如生長激素化合物)的50%生物活性的時間，其中生長激素化合物仍然存在于機體/靶器官中，或肽(例如生長激素化合物)的活性是其起始值的50%時的時間。作為測定功能性體內半衰期的備選方法，可測定“體內血漿半衰期”和延長作用，即在被清除前50%的肽在血流中循環(huán)的時間。血漿半衰期的測定通常比測定功能性半衰期更簡單，血漿半衰期的大小常常是功能性體內半衰期大小的良好指示物。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及GH化合物，與hGH相比，所述化合物具有一個或多個額外的二硫鍵和至少一個額外的單點突變。在半胱氨酸對之間形成二硫鍵，其中通過點突變將一個或兩個半胱氨酸引入野生型hGH序列中。選擇突變位點，使得所引入的半胱氨酸殘基適當位于折疊蛋白質的三維結構中以允許形成二硫鍵?？赏ㄟ^合適的宿主生物表達可溶形式的hGH的合適半胱氨酸突變體，或采用生長激素化合物的標準再折疊條件從包涵體中回收，獲得具有額外二硫鍵的折疊蛋白質，這是本領域技術人員眾所周知的(Cabrita和Bottomley,Biotechnology Annual Review 10, 31-50 (2004))。用于引入額外二硫鍵的候選位置的鑒定可用計算方法輔助，例如使用實驗測定的與其2拷貝結合蛋白復合的hGH (PDB登錄代碼1HWG)的三維結構。引入二硫鍵的合適位置的選擇可基于以下文獻所述二硫鍵的距離和幾何標準Dombkowski A. , A. , Bioinformatics 19, 1852-1853 (2003)和 Petersen 等，Protein Eng. J_2，535-548 (1999)。選擇這樣的半胱氨酸突變體，使得引入的二硫鍵不破壞蛋白質的天然結構，并且對與hGH有關的所需要生物活性具有最小的負面影響。因此，構建這樣的化合物，使得引入的二硫鍵不損害與hGHR的相互作用。已從IHWG中鑒定出對受體相互作用重要的hGH區(qū)。因此，可通過分析IHWG結構，指導引入二硫鍵的合適位置(其對生物活性而言是中性的)的選擇?？蛇x擇這樣的半胱氨酸突變體，使得引入的二硫鍵提供對蛋白酶剪切的穩(wěn)定性提高。蛋白質對蛋白酶切割的敏感性部分由所述蛋白質的一級氨基酸序列確定。蛋白酶可以是相對無特異性的，或者可以以可變的選擇性程度識別一級氨基酸序列中的特定基序。然而，用作底物的蛋白質分子的三維結構和動力學強烈影響蛋白水解穩(wěn)定性。高度柔性和動態(tài)的環(huán)結構特別易受蛋白酶催化的切割的影響，而結構化良好的區(qū)域一般不太如此。因此，可通過引入二硫鍵穩(wěn)定蛋白質的動態(tài)區(qū)，來獲得保護以免于蛋白酶剪切。本發(fā)明的一個方面涉及生長激素化合物，與SEQ ID NO I限定的hGH相比，所述生長激素化合物包含一個或多個額外的二硫鍵和至少一個額外的單點突變。如下文中所述，本發(fā)明的生長激素化合物的多肽優(yōu)選與由SEQ ID NO I確定的人生長激素具有高水平的同一性。因此，本發(fā)明的一個實施方案提供穩(wěn)定的GH化合物，通過將一個或多個額外的二硫鍵引入由SEQ ID No. I限定的hGH中而使所述化合物抗蛋白水解性降解。在一個實施方案中，生長激素化合物對于下文中進一步描述的蛋白酶解是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物的蛋白水解穩(wěn)定性通過將二硫鍵引入環(huán)區(qū)段和螺旋結構之間而實現。
在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物的蛋白水解穩(wěn)定性通過將二硫鍵引入環(huán)區(qū)段內而實現。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物的蛋白水解穩(wěn)定性通過將二硫鍵引入環(huán)區(qū)段之間而實現。 在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物的蛋白水解穩(wěn)定性通過將二硫鍵引入螺旋之間而實現。在本發(fā)明的一個實施方案中，至少一個引入的二硫鍵連接生長激素化合物的2個半胱氨酸殘基，其中至少一個所述半胱氨酸殘基不存在于野生型hGH中。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物的引入的二硫鍵位于采用以下文獻描述的距離和幾何標準而選擇的半胱氨酸殘基之間Dombkowski A., A.,Bioinformatics 19, 1852-1853 (2003)和 Petersen 等，ProteinEng. 12(7)，535-548(1999)。在本發(fā)明的一個實施方案中，生長激素化合物的引入的二硫鍵使連接H3和H4的環(huán)(L3，殘基128-154)穩(wěn)定，即引入的二硫鍵中的至少一個半胱氨酸位于包含殘基128-154的區(qū)段中(圖I和2)。如上所述，本發(fā)明涉及生長激素化合物，其包含連接多肽的環(huán)區(qū)段和螺旋區(qū)段或在多肽的環(huán)區(qū)段內或連接多肽的環(huán)區(qū)段或連接多肽的螺旋區(qū)段的額外的二硫鍵。任何這類額外的二硫鍵的定位均是為了參照SEQ ID NO I限定的hGH多肽描述的本申請的目的。提供連接螺旋、環(huán)和環(huán)與螺旋的鍵(linkage)的cys突變的非限制性實例列舉在下表I中。表I
權利要求
1.生長激素化合物，所述化合物與由SEQID NO I限定的人生長激素(hGH)相比，包含一個或多個額外的二硫鍵和至少一個額外的單點突變。
2.權利要求I的生長激素化合物，其中所述生長激素化合物包含一個或多個連接環(huán)區(qū)段與螺旋區(qū)段的額外的二硫鍵。
3.前述權利要求中任一項的生長激素化合物，其中所述化合物包含至少一對突變，所述突變對應于 SEQ ID NO I 中的 R16C/L117C、A17C/E174C、H21C/M170C、D26C/V102C、D26C/Y103C、N47C/T50C、Q49C/G161C、F54C/Y143C、F54C/S144C、F54C/F146C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、P61C/E66C、P61C/T67C、S71C/S132C、L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/1138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C、F92C/T148C、R94C/D107C、V102C/A105C、L156C/F146C、L156C/T148C 和 / 或 V185C/S188C。
4.權利要求1-3中任一項的生長激素化合物，其中所述生長激素化合物包含一個或多個額外的二硫鍵，其中其至少一個半胱氨酸存在于對應于SEQ ID NO I的AA 128-154的環(huán)3 (L3)中。
5.權利要求4的生長激素化合物，其中所述生長激素化合物包含一個或多個連接L3與螺旋2 (H2)或環(huán)I (LI)的額外的二硫鍵。
6.權利要求3的生長激素化合物，其中所述化合物包含至少一對突變，所述突變對應于 SEQ ID NO I 中的 H21C/M170、D26C/V102C、D26C/Y103C、F54C/Y143C、F54C/S144C、S55C/Y143C、S57C/Y143C、I58C/Q141C、I58C/Y143C、I58C/S144C、P59C/Q137C、S71C/S132C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C、F92C/T148C 和 / 或 R94C/D107C。
7.前述權利要求中任一項的生長激素化合物，其中與由SEQID NO I限定的人生長激素(hGH)相比，所述生長激素化合物的蛋白酶穩(wěn)定性提高。
8.前述權利要求中任一項的生長激素化合物，其中至少一個額外的單點突變存在于對應于 SEQ ID NO I 的 1-55、57、58、60-63、67-87、89-91、93、95-100、101、102-128、131-132、135-139、141、142、144、148-182、184、185 和 / 或 187-191 位的一個或多個位置。
9.前述權利要求中任一項的生長激素化合物，其中至少一個額外的單點突變存在于對應于 SEQ ID NO I 的 40、41、42、55、57、62、101、134、136、139、142 和 / 或 144 位的位置。
10.前述權利要求中任一項的生長激素化合物，其中至少一個額外的單點突變存在于LI (對應于 SEQ ID NO I 的 AA 36-71)和 / 或 L3 (對應于 SEQ ID NO I 的 AA 128-154)中。
11.前述權利要求中任一項的生長激素化合物，其中至少一個額外的單點突變存在于LI的中區(qū)(對應于SEQ ID NO I的AA 40-65)和/或L3的中區(qū)(對應于SEQ ID NO I的AA 135-148)。
12.前述權利要求中任一項的生長激素化合物，其與SEQID NO I限定的人生長激素相t匕，包含正好I個額外的二硫鍵和至少一個額外的單點突變。
13.13.用于制備具有對蛋白水解性降解的穩(wěn)定性提高的生長激素化合物的方法，所述方法包括以下步驟 a.與SEQ ID No. I限定的人生長激素(hGH)相比，在所述生長激素化合物中引入一個或多個額外的二硫鍵和至少一個額外的單點突變。
14.藥物組合物，其包含權利要求1-12中任一項的生長激素化合物和一種/多種藥學上可接受的載體。
15.治療其中患者獲益于循環(huán)生長激素化合物的量增加的疾病或狀態(tài)的方法，所述方法包括給予患者有效量的權利要求1-12中任一項的生長激素化合物或權利要求14的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生長激素(GH)化合物，所述化合物具有額外的二硫鍵和至少一個額外的單點突變，使得所述化合物具有蛋白水解性降解抗性。
文檔編號A61P5/00GK102834109SQ201180006742
公開日2012年12月19日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權日2010年1月22日
發(fā)明者H.德穆特, C.B.S.希奧特, L.諾斯科夫-勞里森, J.陳, P.泰格森 申請人:諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司