專利名稱：一種人胰島來源的胰腺干細胞系的構(gòu)建及向胰島素分泌細胞分化的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細胞工程技術領域，特別涉及一種人胰島來源的胰腺干細胞系構(gòu)建及向胰島素分泌細胞分化的方法。
背景技術：
糖尿病是繼心血管疾病和癌癥之后的第三大高發(fā)慢性疾病，它嚴重危害著人類的生命健康。目前，對糖尿病的治療雖然有很多方法，如口服降糖藥物，注射外源性胰島素，并結(jié)合飲食限制以及體育鍛煉的方法，但都不能從根本上解決問題。器官移植是一種比較好的解決方法，但該方法的應用受到供體不足和免疫排斥問題的限制。而干細胞增殖力強、數(shù)量充足、移植排斥反應相對較低。因此，人們寄希望于干細胞替代療法能夠解決供體不足和免疫排斥的問題。干細胞的使用雖然能夠解決供體細胞數(shù)量問題，但是在應用前還需要先將其誘導分化為功能性的胰島素分泌細胞。胰腺干細胞(Pancreatic stem cells)是一類存在于胎兒和成年胰腺組織中的成體干細胞，具有自我更新，多向分化潛能，在自然分化過程中首先分化為胰腺組織內(nèi)的各種細胞。由于該細胞來源于胰腺組織，因此，在向胰島素分泌細胞分化方面具有更大的潛力。越來越多的證據(jù)表明胰腺導管、胰島和腺泡組織內(nèi)都存在著具有多向分化潛能的干細胞。目前有觀點認為，由胰島組織獲得的間充質(zhì)樣干細胞可能來源于去分化后的 β 細胞(Russ, H. Α.，Bar, Y.，Ravassard, P.，Efrat, S. 2008 In vitro proliferation of cells derived from adult human beta-cells revealed by cell-lineage tracing. Diabetes, 57 :1575 1583)。并且這些細胞在體外多次傳代后其胰島素啟動子仍處于活化狀態(tài)，因此具有巨大的糖尿病治療潛力。體外分離、培養(yǎng)胰腺干細胞作為種子細胞，并將其定向誘導分化為功能性胰島細胞，是解決胰島供體短缺的有效途徑。已有多個研究小組在胰腺干細胞的研究上開展了一定的基礎工作。西北農(nóng)林科技大學效梅(單克隆人胰腺干細胞分離培養(yǎng)體系的建立[J].分子細胞生物學，2008，41 (6) :450-456.)、趙婷(人胰腺干細胞誘導胰島樣細胞團及其治療大鼠糖尿病的效果[J]·中國組織工程研究與臨床康復，2007，11 (7) :1259-1洸2.)、第三軍醫(yī)大學姚忠祥(人胰腺干細胞的體外分離培養(yǎng)、鑒定和分化特性[J].第三軍醫(yī)大學學報， 2003，25(1) :23-25.)吉林大學等先后在胰腺干細胞的分離純化，培養(yǎng)基的篩選，以及細胞生物學，分子生物學鑒定方面做了大量的工作；分離到的胰腺干細胞在體內(nèi)定向誘導后形成胰島樣細胞團，并檢測到胰島素和C-肽的分泌，但分化效率都很低，移植后對糖尿病的治療效果不顯著。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術問題在于提供一種人胰島來源的胰腺干細胞系體外構(gòu)建的方法，將該干細胞系體外誘導分化成胰島樣細胞團的方法，以及用上述方法得到的胰腺干細胞系和胰島樣細胞團。將所述胰島樣細胞團移植至糖尿病模型動物后能夠改善其血糖水平。本發(fā)明提供一種人胰島來源的胰腺干細胞系體外構(gòu)建的方法，該方法包括如下步驟消化人胰腺組織，挑出胰島細胞團，進一步消化形成單細胞懸液，傳代培養(yǎng)后形成間充質(zhì)樣胰腺干細胞。所述的胰腺干細胞系，其細胞為成纖維樣，多呈三角形和短梭狀，單核細胞，有兩個或兩個以上的核仁，細胞間存在接觸抑制。所述的胰腺干細胞系，經(jīng)誘導可分化形成胰島樣細胞團。本發(fā)明的第一方面提供一種人胰島來源的胰腺干細胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)將人胰腺細胞加入培養(yǎng)液A中培養(yǎng)2-3天；2)挑出上述培養(yǎng)物中的胰島細胞團，用蛋白酶消化成單細胞，接種于培養(yǎng)液A中
培養(yǎng)；3)待細胞生長至80-90%融合時，傳代，加入培養(yǎng)液B培養(yǎng)，得到胰島細胞來源的人胰腺干細胞系(PPSC)；其中所述培養(yǎng)液A為含有10-25% FBS、8-12mM尼克酰胺、18-22ng/mL EGF和 18-22ng/mL bFGF 的 RPMI1640 ；所述培養(yǎng)液 B 為含有 10-25 % FBS、18-22ng/mLbFGF 的 Low-DMEM0在一個實施方案中，所述培養(yǎng)液A還含有0. 8-1. 2mM丙酮酸鈉、1. 8-2. 2mM谷氨酰氨、0. 05-0. 15mM β -巰基乙醇和90-110mg/mL青霉素/鏈霉素；所述培養(yǎng)液B還含有 0. 05-0. 15mM β -巰基乙醇、1. 8-2. 2mM谷氨酰胺和90_110mg/mL青霉素/鏈霉素。在一個優(yōu)選實施方案中，上述方法包括以下步驟1)向人胰腺的組織塊中加入0. 05-0. 2% (質(zhì)量/體積)膠原酶消化，終止消化后過濾、離心并清洗得到單細胞，加入所述培養(yǎng)液A培養(yǎng)2-3天；2)在顯微鏡下挑出胰島細胞團，0.25% (質(zhì)量/體積)蛋白酶將其進一步消化成單細胞，接種于多孔板內(nèi)，添加所述培養(yǎng)液A培養(yǎng)；3)待細胞生長至80-90%融合時，以0.25%蛋白酶消化，以1 3_1 5比例傳代，加入所述培養(yǎng)液B進行培養(yǎng)；培養(yǎng)超過50代后得到胰島細胞來源的人胰腺干細胞系。本發(fā)明的第二方面提供一種使人胰腺干細胞系誘導分化成胰島樣細胞團的方法， 包括以下步驟1)將人胰腺干細胞接種于含有0. 8-1. 2% BSA.0. 8-1. 2mM 丁酸鈉、80_120ng/mL ActivinA,40-60mM LY294002,8-12mM尼克酰胺、0. 8-1. 2 X ITS 的 RPMI1640/B27 培養(yǎng)液，在貼壁皿內(nèi)培養(yǎng)3-4天；0. 25%蛋白酶消化，懸浮培養(yǎng)形成EB (類胚體)，更換將上述培養(yǎng)液撤去丁酸鈉、ActivinA和 LY^4002 并添加 0. 8-1. 2 X 1(Γ6Μ RA (維甲酸)、18-22ng/mLEGF和 18-22ng/mL bFGF的培養(yǎng)液，繼續(xù)在常規(guī)培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)進行初步分化誘導7_9天；在一個優(yōu)選實施方案中，所述接種培養(yǎng)液還含有1.8-2. 2mM L-谷氨酰胺、0. 05_0. 15mM β-巰基乙醇和0. 8-1. 2mM丙酮酸鈉；2)將初步分化誘導后的細胞轉(zhuǎn)移到含有0.8-1. 2% BSA、1. 8-2. 2mM谷氨酰胺、0. 8-1. 2mM 丙酮酸鈉、22-28 μ M 醋酸鋅、0. 8-1. 2Χ ITS、90_110mM 煙堿、8_12ng/mLexendin-4和8_12ng/mL β -細胞素的RPMI1640/B27培養(yǎng)液上，在常規(guī)培養(yǎng)條件下繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，得到胰島樣細胞團；在一個優(yōu)選實施方案中，所述培養(yǎng)液還含有1.8-2.2mM L-谷氨酰胺、0. 8-1. 2mM β-巰基乙醇和0. 8-1. 2mM丙酮酸鈉。在一個優(yōu)選實施方案中，所使用的人胰腺干細胞系是依照本發(fā)明第一方面的方法構(gòu)建的人胰島來源的胰腺干細胞系。本發(fā)明的第三方面提供一種使依照本發(fā)明第一方面的方法建立的人胰島來源的胰腺干細胞系體外誘導分化成類神經(jīng)細胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細胞系的細胞接種于培養(yǎng)液B培養(yǎng)20-30h后棄去培養(yǎng)液，添加神經(jīng)細胞預誘導液處理20-30h后，換成神經(jīng)細胞誘導液繼續(xù)作用8-1 ；所述神經(jīng)細胞預誘導液為 Low-DMEM基礎培養(yǎng)液中加入lmmol/L β -巰基乙醇；所述神經(jīng)細胞誘導液為Low-DMEM基礎培養(yǎng)液中加入5mmol/L β -巰基乙醇。本發(fā)明的第四方面提供一種使依照本發(fā)明第一方面的方法建立的人胰島來源的胰腺干細胞系誘導成類脂肪細胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細胞系的細胞接種于上述培養(yǎng)液B培養(yǎng)，待細胞融合度達到約80-90%，更換誘導培養(yǎng)基 (STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit 試劑盒(GIBCO))繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)14 21天。本發(fā)明的第五方面提供一種使依照本發(fā)明第一方面的方法建立的人胰島來源的胰腺干細胞系誘導成類骨細胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細胞系的細胞接種于上述培養(yǎng)液B培養(yǎng)，待細胞融合度達到約80-90%，即更換誘導培養(yǎng)基 (STEMPRO Osteogenesis Differentiation Kit 試劑盒(GIBCO))繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)21 沘天。在一個實施方案中，通過上述方法得到的類骨細胞為茜素紅染色陽性。本發(fā)明的第六方面提供依照本發(fā)明第一方面的方法建立的人胰腺干細胞系。本發(fā)明的第七方面提供依照本發(fā)明第二方面的方法建立的胰島樣細胞團。本發(fā)明的第八方面提供包含本發(fā)明第六方面所述的人胰腺干細胞系或本發(fā)明第七方面所述的胰島樣細胞團的藥物、試劑、組合物、試劑盒。本發(fā)明的第九方面提供本發(fā)明第六方面所述的人胰腺干細胞系或本發(fā)明第七方面所述的胰島樣細胞團在制備用于降低血糖或治療糖尿病的藥物、試劑、組合物、試劑盒中的用途。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果1)本發(fā)明獲得的人胰島來源的胰腺干細胞系，其生長狀況良好，其群體倍增時間由原來的45.28h縮短為22. 36 士 1. 06h，且細胞的存活率較之以前的大大提高，便于規(guī)?；膽?；在體外傳代50代以上仍有較好的活力，仍保持分裂增殖，不易發(fā)生衰老和凋亡。2)本發(fā)明獲得的人胰島來源的胰腺干細胞系，其營養(yǎng)要求較低，原始分離得到的胰島細胞的培養(yǎng)需要20%的胎牛血清、EGF、bTOF、尼克酰胺等各種營養(yǎng)因子，而現(xiàn)在只要求約10%的胎牛血清和bFGF，大大降低了培養(yǎng)的成本。3)本發(fā)明獲得的人胰腺干細胞系來源于人胰島β細胞的去分化，添加誘導因子后其分化形成功能性胰島樣細胞團效率顯著提高，高糖刺激后能夠分泌胰島素和C-肽，將其移植到患有糖尿病的裸鼠模型的體內(nèi)，能降低血糖濃度甚至可恢復至正常的血糖水平， 并且在1個月內(nèi)能夠維持較低的血糖水平。4)由于本發(fā)明獲得的胰島樣細胞團是人源的，因此可以預期其在用于治療患有糖尿病的患者時的相容程度優(yōu)于其他來源的胰島樣細胞團。


圖1為人胰島來源的胰腺干細胞形態(tài)學特征顯示圖；圖2為人胰島來源的胰腺干細胞特征性標志鑒定圖；圖3為流式細胞儀檢測的人胰島來源的胰腺干細胞的細胞周期的結(jié)果圖，其中橫坐標為DNA含量，縱坐標為細胞數(shù)；圖4為人胰島來源的胰腺干細胞系的細胞生長曲線圖，其中橫坐標為時間(天數(shù))，縱坐標為細胞數(shù)(104)；圖5為人胰島來源的胰腺干細胞誘導分化為類神經(jīng)細胞的特征性標志鑒定圖；圖6為人胰島來源的胰腺干細胞成脂誘導的特征性標志鑒定圖；圖7為人胰島來源的胰腺干細胞成骨誘導的特征性標志鑒定圖；圖8為人胰島來源的胰腺干細胞誘導分化為胰島樣細胞團的特征性標志鑒定圖；圖9為胰島樣細胞團移植裸鼠糖尿病模型后的血糖濃度變化曲線，其中橫坐標為時間(天數(shù))，縱坐標為血糖濃度。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種人胰島來源的胰腺干細胞系的構(gòu)建及分化的方法。該細胞系在體外傳代50代以上仍有較好的活力，保持分裂增殖，不易發(fā)生衰老和凋亡，經(jīng)過誘導后能夠分化形成功能性胰島樣細胞團。以下通過對該細胞系的構(gòu)建、細胞形態(tài)特征、標志物的基因及免疫學鑒定、誘導分化，高低糖刺激胰島素和C-肽分泌以及移植糖尿病模型體內(nèi)的血糖變化試驗來做詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。本說明書中的FBS是指胎牛血清，關于FBS的百分數(shù)，如無特別說明，均是指體積百分數(shù)。本說明書中的BSA是指牛血清白蛋白，關于FBS的百分數(shù)，如無特別說明，均是指質(zhì)量百分數(shù)。本說明書中使用的其他百分數(shù)，如無特別說明，則依從本領域慣常使用的含義。本說明書中提及的培養(yǎng)液均購自Gibico公司，試劑均購自Sigma公司本。說明書中所述的常規(guī)培養(yǎng)液、常規(guī)培養(yǎng)條件，是指本領域技術人員能夠根據(jù)現(xiàn)有技術確定的適合培養(yǎng)所述細胞的培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件。實施例實施例1、人胰島來源的胰腺干細胞系的構(gòu)建人胰島來源的胰腺干細胞系的構(gòu)建具體包括以下步驟1)無菌采集流產(chǎn)胎兒胰腺，置于預冷的Hank' s中沖洗并除去外周的血液和剪去周圍的脂肪、血管、組織被膜及結(jié)締組織，然后剪成lmm3左右的組織塊，加入0. 1% IV型膠原酶，于37°C消化20-30min。期間不時振蕩，含有10% FBS Hank' s的終止消化后過80 目篩網(wǎng)，離心(500r/min) 3min,并清洗2次，加入含有20% FBS、ImM丙酮酸鈉、IOmM尼克酰胺、0. ImM β-巰基乙醇、2mM谷氨酰胺、20ng/mLEGF、20ng/mL bFGF和 100mg/mL青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48h。2)在顯微鏡下手工挑出胰島細胞團，0. 25%胰蛋白酶將其進一步消化形成單細胞懸液，終止消化后接種于12孔板內(nèi)，添加含有20% FBS、ImM丙酮酸鈉、IOmM尼克酰胺、0. ImM β-巰基乙醇、2mM谷氨酰胺、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF和100mg/mL青霉素/鏈霉素的 RPMI1640培養(yǎng)液，置于37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3)待細胞生長至90%融合時，以0. 25%胰蛋白酶消化，以1 3比例傳代，將細胞接種于含有10% FBS,0. ImM β-巰基乙醇、2mM谷氨酰胺、20ng/mL bFGF和100mg/mL青霉素/鏈霉素的Low-DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每兩天半量換液。實施例2、人胰島來源的胰腺干細胞系的鑒定2. 1細胞形態(tài)學特征在相差顯微鏡下觀察人胰島來源的胰腺干細胞的形態(tài)變化。具體結(jié)果如圖1所示，其中，圖A為原代分離的人胰島細胞團，圖B為擴大培養(yǎng)后的人胰島來源的胰腺干細胞 (pPSC)，與胰島細胞相比，細胞為成纖維樣，多呈三角形和短梭狀，呈網(wǎng)絡狀排列，細胞間存在接觸抑制，圖C為對人胰腺干細胞進行吉姆薩染色，細胞為單核，核比較明顯，有2個或 2個以上的核仁，能夠看到明顯的細胞分裂相。該細胞在體外傳代50代以上仍有較好的活力，仍保持分裂增殖，不易發(fā)生衰老和凋亡。2. 2胰腺干細胞相關標記的鑒定2. 2. 1免疫熒光檢測將人胰島來源的胰腺干細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定后，免疫熒光染色對胰腺干細胞特征性標志進行鑒定。免疫熒光染色步驟為a.細胞經(jīng)4%多聚甲醛固定lOmin，用PBS洗滌2_3次；b.加入 0. 1 % TritionX-IOO 室溫作用 lOmin, PBS 洗 2-3 次，每次作用 5min ；c.加入含 1 % BSA 的 PBS 作用 30min ；d.加入一抗，4°C過夜；e. PBS洗2-3次，每次作用5min，加入熒光二抗，37°C作用Ih ；f. PBS洗2-3次，熒光顯微鏡下觀察。免疫熒光檢測所使用的一抗主要有波形蛋白(Vim)、PDXU Ngn3、葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子(GluU)、hTERT和CK19。免疫熒光染色結(jié)果分別如圖2A所示，結(jié)果顯示該胰腺干細胞系呈波形蛋白(Vim)、PDXl、Ngn3、葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子(Glut2)和hTERT陽性，而不表達上皮細胞標記CK19。2. 2. 2PCR檢測胰腺干細胞、誘導后的胰島細胞團標記基因的表達根據(jù)GenBank中已發(fā)表的反轉(zhuǎn)錄酶基因參考序列，設計并人工合成特異性檢測引物，相關引物序列、長度、及Tm值見表1。表1.胰腺干細胞相關標志物及其相應的PCR擴增引物
權(quán)利要求
1.一種人胰島來源的胰腺干細胞系的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟1)將人胰腺細胞加入培養(yǎng)液A中培養(yǎng)2-3天；2)挑出上述培養(yǎng)物中的胰島細胞團，用蛋白酶消化成單細胞，接種于培養(yǎng)液A中培養(yǎng)；3)待細胞生長至80-90%融合時，傳代，加入培養(yǎng)液B培養(yǎng)，得到胰島細胞來源的人胰腺干細胞系(PPSC)；其中所述培養(yǎng)液A為含有10-25% FBS、8-12mM尼克酰胺、18-22ng/mLEGF和18_22ng/ mL bFGF 的 RPMI1640 ；所述培養(yǎng)液 B 為含有 10-25% FBSU8-22ng/mLbFGF 的 Low-DMEM。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)液A還含有0.8-1.2mM丙酮酸鈉、1.8-2. 2mM谷氨酰氨、0. 05-0. 15mM β -巰基乙醇和90-110mg/mL青霉素/鏈霉素；所述培養(yǎng)液B還含有 0. 05-0. 15mM β -巰基乙醇、1. 8-2. 2mM谷氨酰胺和90_110mg/mL青霉素/鏈霉素。
3.權(quán)利要求1或2的方法，該方法包括以下步驟1)向人胰腺的組織塊中加入0.05-0.2% (質(zhì)量/體積)膠原酶消化，終止消化后過濾、 離心并清洗得到單細胞，加入所述培養(yǎng)液A培養(yǎng)2-3天；2)在顯微鏡下挑出胰島細胞團，0.25%(質(zhì)量/體積)蛋白酶將其進一步消化成單細胞，接種于多孔板內(nèi)，添加所述培養(yǎng)液A培養(yǎng)；3)待細胞生長至80-90%融合時，以0.25%蛋白酶消化，以1 3_1 5比例傳代，加入所述培養(yǎng)液B進行培養(yǎng)；培養(yǎng)超過50代后得到胰島細胞來源的人胰腺干細胞系。
4.一種使人胰腺干細胞系體外誘導分化成胰島樣細胞團的方法，該方法包括以下步驟1)將人胰腺干細胞接種于含有0.8-1. 2 % BSA、0. 8-1. 2mM 丁酸鈉、80_120ng/mL ActivinA,40-60mM LY294002,8-12mM 尼克酰胺、0. 8-1. 2X ITS 的 RPMI1640/B27 培養(yǎng)液， 在貼壁皿內(nèi)培養(yǎng)3-4天；0. 25%蛋白酶消化，懸浮培養(yǎng)形成EB，更換將上述培養(yǎng)液撤去丁酸鈉、ActivinA 和 LY294002 并添加 0. 8-1. 2X KT6M RAU8-22ng/mL EGF 和 18_2aig/mL bFGF的培養(yǎng)液，繼續(xù)在常規(guī)培養(yǎng)條件下懸浮培養(yǎng)進行初步分化誘導7-9天；在一個優(yōu)選實施方案中，所述接種培養(yǎng)液還含有1. 8-2. 2mM L-谷氨酰胺、0. 05-0. 15mM β -巰基乙醇和 0. 8-1.2mM丙酮酸鈉；2)將初步分化誘導后的細胞轉(zhuǎn)移到含有0.8-1. 2 % BSA、1. 8-2. 2mM谷氨酰胺、 0. 8-1.2mM 丙酮酸鈉、2248μΜ 醋酸鋅、0. 8-1. 2Χ ITS、90_110mM 煙堿、8-iaig/mL exendin-4和8_12ng/mL β -細胞素的RPMI1640/B27培養(yǎng)液上，在常規(guī)培養(yǎng)條件下繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，得到胰島樣細胞團；在一個優(yōu)選實施方案中，所述培養(yǎng)液還含有1. 8-2. 2mM L-谷氨酰胺、0. 8-1. 2mM β-巰基乙醇和0. 8-1. 2mM丙酮酸鈉。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述人胰腺干細胞系是依照權(quán)利要求1-3任一項的方法建立的人胰島來源的胰腺干細胞系。
6.一種使依照權(quán)利要求1-3任一項的方法建立的人胰島來源的胰腺干細胞系誘導分化成類神經(jīng)細胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細胞系的細胞接種于所述培養(yǎng)液B培養(yǎng)20-30h后棄去培養(yǎng)液，添加神經(jīng)細胞預誘導液處理20-30h后，換成神經(jīng)細胞誘導液繼續(xù)作用8-12h ；所述神經(jīng)細胞預誘導液為Low-DMEM基礎培養(yǎng)液中加入 lmmol/L β -巰基乙醇；所述神經(jīng)細胞誘導液為Low-DMEM基礎培養(yǎng)液中加入5mmol/L β -巰基乙醇。
7.一種使依照權(quán)利要求1-3任一項的方法建立的人胰島來源的胰腺干細胞系誘導成類脂肪細胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細胞系的細胞接種于上述培養(yǎng)液B培養(yǎng)，待細胞融合度達到80-90 %，更換誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng) 14 21 天；其中所述誘導培養(yǎng)基為STEMPRO Adipogenesis Differentiation Kit 試劑盒(GIBCO)。
8.一種使依照權(quán)利要求1-3任一項的方法建立的人胰島來源的胰腺干細胞系誘導成類骨細胞的方法，該方法包括以下步驟將所述人胰島來源的胰腺干細胞系的細胞接種于上述培養(yǎng)液B培養(yǎng)，待細胞融合度達到80-90 %，更換誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)21 28天;其中所述誘導培養(yǎng)基為STEMPRO Osteogenesis Differentiation Kit試劑盒 (GIBCO)。
9.依照權(quán)利要求1-3任一項的方法建立的人胰腺干細胞系。
10.依照權(quán)利要求4或5的方法建立的胰島樣細胞團。
11.包含權(quán)利要求9所述的人胰腺干細胞系或權(quán)利要求10所述的胰島樣細胞團的藥物、試劑、組合物或試劑盒。
12.權(quán)利要求9所述的人胰腺干細胞系或權(quán)利要求10所述的胰島樣細胞團在制備用于降低血糖或治療糖尿病的藥物、試劑、組合物或試劑盒中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人胰島來源的胰腺干細胞系的構(gòu)建與分化的方法，所述的胰腺干細胞系，是從人胰島細胞團內(nèi)擴增出胰腺干細胞，且具有多向分化潛能。其經(jīng)過誘導后能夠分化形成類神經(jīng)細胞、類脂肪細胞、類骨細胞、以及功能性胰島樣細胞團。將功能性胰島樣細胞團移植到患有糖尿病裸鼠模型的體內(nèi)，能降低模型裸鼠血糖濃度，在1個月能夠維持正常的血糖水平。
文檔編號A61K35/39GK102433300SQ20111038067
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者孫振華, 徐軍軍, 曹暉 申請人:厚樸生物科技(蘇州)有限公司