專利名稱：表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株及在癌模型應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及將綠色熒光蛋白及螢火蟲螢光素酶導(dǎo)入細(xì)胞，建立表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株及在癌模型應(yīng)用，用于胃癌基礎(chǔ)及臨床前研究。
背景技術(shù)：
根據(jù)世界衛(wèi)生組織2008年統(tǒng)計(jì)，胃癌是僅次于肺癌的常見惡性腫瘤。而我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年胃癌新發(fā)高達(dá)40余萬人，死亡人數(shù)近30萬，為世界首位。在衛(wèi)生部199(Γ1992年的全國第二次死因調(diào)查中，胃癌約占到所有癌癥死亡人數(shù)的四分之一。胃癌已日益成為影響人們健康的重大疾病，同時也為社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)復(fù)負(fù)擔(dān)。近年來， 隨著各國政府對胃癌的重視，胃癌的治療和基礎(chǔ)研究得到了很大的發(fā)展，新興藥品和治療手段不斷涌現(xiàn)，但各種治療效果均有限，胃癌的死亡率和復(fù)發(fā)率仍依舊很高。因此，深入研究胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為胃癌治療開辟新手段，為胃癌診斷創(chuàng)造新思路，具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。而胃癌的研究必須基于可靠、優(yōu)良的生物研究平臺和方式，然而，目前國內(nèi)外缺乏一種有效可靠的體外、體內(nèi)胃癌研究平臺，嚴(yán)重制約了胃癌的基礎(chǔ)及臨床前研究。慢病毒感染較其他轉(zhuǎn)染方式有較強(qiáng)的優(yōu)勢，具有感染譜廣、效率高，可感染非分裂細(xì)胞、并可使目的基因整合至基因組因而能夠長期表達(dá)、免疫反應(yīng)小等特點(diǎn)，是一種高效的基因轉(zhuǎn)移工具。綠色熒光蛋白作為一種常見的報告基因已廣泛用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，它相比于其他標(biāo)記物有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)①熒光穩(wěn)定。綠色熒光蛋白對光漂白有較強(qiáng)的耐受性，能耐受長時間的光照；綠色熒光蛋白在ΡΗ7 12范圍內(nèi)也能正常發(fā)光，且對高溫(70°C)、堿性、 除垢劑、鹽、有機(jī)溶劑和大多數(shù)普通酶(鏈霉蛋白酶ftxmase除外)都有較強(qiáng)抗性。②檢測方便，簡單直觀。用熒光顯微鏡或肉眼就可以觀察到，且可進(jìn)行活體觀察，不會損傷正在生長的細(xì)胞和組織。③對受體細(xì)胞基本無毒害。④不需任何反應(yīng)底物和輔助因子。⑤可制成永久標(biāo)本?？赡褪芨栺R林的固定，因而可制成長期保存的標(biāo)本。但是綠色熒光蛋白也有其缺陷①需要激發(fā)光。在激發(fā)綠色熒光蛋白產(chǎn)生熒光的過程中，生物體內(nèi)很多物質(zhì)也會發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度。②綠色熒光蛋白發(fā)射波長局限于510nm 左右，當(dāng)發(fā)光部位深藏于組織中時，由于組織的吸收，綠色熒光很難透過組織?；谖灮鹣x熒光素酶的生物發(fā)光是近些年出現(xiàn)的成像方法，有別于其他光學(xué)成像方法，其特點(diǎn)在于①不需要激發(fā)光。因?yàn)樯锇l(fā)光采用的是底物發(fā)光的形式，因此不需要激發(fā)光。②高靈敏度，雖然生物發(fā)光強(qiáng)度弱于熒光，但是由于不需要激發(fā)光，組織自發(fā)熒光少， 因而信噪比高，靈敏度高。③穿透力強(qiáng)。由于螢火蟲熒光素酶發(fā)出的光在M(T600nm，組織吸收少，因此對有深部組織成像具有較高的優(yōu)勢。④良好的相關(guān)性。光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。其缺點(diǎn)在于，檢測不方便，需要底物；并且由于空間分辨率低及檢測方式點(diǎn)的限制，因而無法觀察細(xì)胞的形態(tài)。因此，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式將綠色熒光蛋白和熒光素酶基因?qū)胛赴┘?xì)胞，便
4可充分利用熒光和生物發(fā)光在成像上的優(yōu)勢，因而方便胃癌的基礎(chǔ)和臨床前研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供人胃癌雙標(biāo)細(xì)胞株的建立及應(yīng)用，它通過慢病毒基因感染的方法，建立表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株及在癌模型應(yīng)用，用于在胃癌臨床前研究中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株， 其特征是以人胃癌細(xì)胞系為母細(xì)胞，采用慢病毒感染的方法，將綠色熒光蛋白(GFP)和螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase, LUC)帶入細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和螢火蟲熒光素酶的細(xì)胞株。將所述的細(xì)胞株通過皮下，尾靜脈及原位注射的方式建立不同的胃癌動物模型。所述的慢病毒感染的方法是將外源基因?qū)耄牟襟E是
a)大腸桿菌擴(kuò)增慢病毒包裝質(zhì)粒pWPT-GFP，pMD2. G，pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC, VSVg, pCMV-dR8. 91，并酶切鑒定，純化；
b)用上述純化獲得的質(zhì)粒按照一定比例，用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，以分別產(chǎn)生含有綠色熒光蛋白和螢火蟲熒光素酶慢病毒顆粒的上清；
c)以胃癌SGC7901為母細(xì)胞(亦可以其他胃癌細(xì)胞株為母細(xì)胞)，用上述病毒順次感
染；
d)擴(kuò)增建系，并通過流式細(xì)胞分選技術(shù)及嘌呤霉素藥物加壓篩選技術(shù)，獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶的陽性克隆。所述的綠色熒光蛋白GFP及螢火蟲熒光素酶Firefly luciferase的測手段均為光學(xué)信號檢測方法，其中包括
a)體外檢測手段GFP檢測條件為熒光倒置顯微鏡，激發(fā)光波長為488士30nm,發(fā)射波長為509 士 30 nm;螢火蟲熒光素酶檢測手段為化學(xué)發(fā)光檢測手段，施加D-Iuciferin后，分別用多功能酶標(biāo)儀器(Thermo kientific)，及小動物成像系統(tǒng)(Kinetics, Caliper Life Science)；
b)動物體體內(nèi)檢測手段，動物體體內(nèi)檢測均采用小動物體內(nèi)成像系統(tǒng)(Kinetics， Caliper Life Science)；分別為熒光成像和生物發(fā)光成像。所選用的動物為裸鼠或SCID鼠。表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株在癌模型應(yīng)用，其特征是具體步驟為
1)慢病毒載體擴(kuò)增將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G, pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC， VSVg, pCMV-dR8. 74常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用氨芐抗生素篩選陽性克隆，37 ！搖菌擴(kuò)增，用質(zhì)粒純化提取試劑盒收集，純化慢病毒質(zhì)粒；其中pWPT-GFP，質(zhì)粒含有綠色熒光蛋白GFP基因，用于觀察和流式細(xì)胞分選；pLenti-CMV-puro-LUC含有熒光素酶基因及真核篩選標(biāo)記嘌呤霉素(Puromycin)基因，用于生物發(fā)光成像和藥物加壓篩選；
2)含綠色熒光蛋白慢病毒包裝前一天將四31~細(xì)胞鋪于10cm培養(yǎng)板，培養(yǎng)于5 % CO2 37 0C恒溫培養(yǎng)箱；培養(yǎng)基為DMEM，血清選用進(jìn)口小牛血清，待細(xì)胞密度長至6(Γ70 %時， 進(jìn)行轉(zhuǎn)染；首先將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G，pSPAX2按照一定的比例與Opti-MEM混合，并將Iipofectamine 2000與Opti-MEM充分混合，室溫孵育5分鐘后，將上述2種液體充分混合孵育20分鐘后，加入細(xì)胞中；8小時后熒光顯微鏡觀察包裝效果，并收集病毒上清；收集的病毒上清經(jīng)0. 2 ym濾器過濾分裝后于-80°C保存；
3)含熒光素酶慢病毒包裝前一天將細(xì)胞鋪于IOcm培養(yǎng)板，帶細(xì)胞密度長至 60-70%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；首先將慢病毒載體pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg, pCMV_dR8. 91按照一定的比例與Opti-MEM混合，并將Iipofectamine 2000與Opti-ΜΕΜ充分混合，室溫孵育 5分鐘后，將上述2種液體充分混合孵育20分鐘后，加入細(xì)胞中；8小時后熒收集病毒上清；收集的病毒上清經(jīng)0.2 ym濾器過濾分裝后于-80 °C保存；
4)病毒感染感染前一天將SGC7901細(xì)胞鋪于M孔板，密度約2X105，培養(yǎng)于5% CO2 37 恒溫培養(yǎng)箱；培養(yǎng)基為DMEM，血清選用進(jìn)口小牛血清將含有綠色熒光蛋白的病毒液加入，并加polybrene 4 μ g/ml增加感染效率；12小時后更換為完全培養(yǎng)基；48小時后，觀察感染效果；如果感染效果不佳，進(jìn)行流式分選；之后將帶有綠色熒光的SGC7901按照密度再次鋪入M孔板，并加入上述含有熒光素酶的病毒液，并加入4 μ g/ml polybrene,于48小時后，加入篩選藥物Puromycin，加壓篩選2周后，獲得陽性克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)；此時獲得雙標(biāo)胃癌細(xì)胞亞系SGC7901-GFP-LUC ；
5)雙標(biāo)細(xì)胞系體外發(fā)光驗(yàn)證利用熒光顯微鏡觀察SGC7901綠色熒光效果，倒置熒光顯微鏡觀察條件為，激發(fā)條件為488 nm ；采用倍比稀釋的方法，采用用小動物活體成像儀鑒定在不同細(xì)胞數(shù)量下，熒光素酶及綠色熒光表達(dá)，并判斷其線性關(guān)系；其中生物發(fā)光成像條件為，加入底物D-Iuciferin 1分鐘后顯像，曝光時間設(shè)為自動；
6)腫瘤皮下注射方法將胃癌亞系SGC7901-GFP-LUC消化后，用PBS重懸于200μ 1，在裸鼠左肩部皮下注射細(xì)胞2Χ 106，并通過小動物活體成像儀動態(tài)觀察細(xì)胞皮下增殖狀況；
7)腫瘤原位種植方法6 7周裸鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心，85mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，待麻醉穩(wěn)定后，使裸鼠仰臥位，于左上腹部開3cm切口，依次剪開皮膚，腹膜，暴露胃組織；將胃癌亞系SGC7901-GFP-LUC消化后，重懸約5X106細(xì)胞于50 μ 1 DMEM中，用30G 注射器緩慢吸取，在體視顯微鏡的輔助下，注射于胃漿膜下；之后將胃還納，7-0手術(shù)縫線縫合連續(xù)縫合腹膜，4-0手術(shù)縫線間斷縫合皮膚；種植后每周，用小動物活體成像儀動態(tài)在體觀察生物發(fā)光信號，檢測條件為腹腔注射D-Iuciferin 10分鐘后，裸鼠用異氟烷麻醉后，取左側(cè)仰臥位，曝光時間5分鐘；
8)4周后，將荷瘤裸鼠處死，制作原位胃癌HE染色切片及冰凍切片，觀察胃癌原位模型建模效果。所述的胃癌原位模型的建立是通過癌細(xì)胞胃漿膜下注射的方式完成。所述的藥物加壓篩選所選用為嘌呤霉素Puromycin，篩選標(biāo)記為熒光素酶。上述可用于體內(nèi)實(shí)時監(jiān)測腫瘤生長評價藥物療效。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是國內(nèi)外目前缺乏融合上述兩種成像方式的胃癌研究細(xì)胞，因此本發(fā)明基于綠色熒光蛋白和熒光素酶各自的優(yōu)缺點(diǎn)，通過在同一種細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)這兩種光學(xué)標(biāo)記，用熒光成像做體外生物學(xué)觀察，用生物發(fā)光成像進(jìn)行動物體內(nèi)的評價，建立針對胃癌的多功能影像學(xué)研究平臺，以滿足胃癌研究的需要。


下面結(jié)合實(shí)施例和實(shí)施例附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。圖1慢病毒包裝質(zhì)粒pWPT-GFP結(jié)構(gòu)圖； 圖2慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2. G結(jié)構(gòu)圖3慢病毒包裝質(zhì)粒PSPAX2結(jié)構(gòu)圖； 圖4慢病毒包裝質(zhì)粒pLenti-CMV-puro-LUC結(jié)構(gòu)圖； 圖5慢病毒包裝質(zhì)粒pCMV-dR8. 91結(jié)構(gòu)圖； 圖6慢病毒包裝質(zhì)粒VSVg結(jié)構(gòu)圖7胃癌細(xì)胞亞系SGC7901-GFP-LUC熒光顯微鏡下觀察綠色熒光效果； 圖8胃癌細(xì)胞亞系SGC7901-GFP-LUC倍比稀釋觀察生物發(fā)光效果及線性關(guān)系； 圖9胃癌細(xì)胞亞系SGC7901-GFP-LUC倍比稀釋觀察熒光效果及線性關(guān)系； 圖10活體成像系統(tǒng)觀察胃癌細(xì)胞亞系SGC7901-GFP-LUC在肺上的定植情況； 圖11利用活體成像系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測胃癌細(xì)胞亞系在裸鼠皮下成長； 圖12裸鼠原位胃癌腫瘤構(gòu)建過程大體視野，組織切片及冰凍切片； 圖13利用活體成像系統(tǒng)動態(tài)檢測胃癌裸鼠原位胃癌的發(fā)展。
具體實(shí)施例方式表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株，以胃癌SGC7901為母細(xì)胞，采用慢病毒感染的方法，將綠色熒光蛋白GFP和螢火蟲熒光素酶Firefly luciferase, LUC基因帶入細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和螢火蟲熒光素酶的細(xì)胞株，將所述的細(xì)胞株通過皮下，尾靜脈及原位注射的方式建立不同的胃癌動物模型。所述的慢病毒感染的方法是將外源基因?qū)?，它的步驟是
a)大腸桿菌擴(kuò)增慢病毒包裝質(zhì)粒pWPT-GFP，pMD2.G，pSPAX2, pLenti- CMV-puro-LUC, VSVg, pCMV-dR8. 91，并酶切鑒定，純化；
b)用上述純化獲得的質(zhì)粒按照一定比例，用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，以產(chǎn)生含有慢病毒的上清；
c)以胃癌SGC7901為母細(xì)胞，亦可以其他胃癌細(xì)胞株為母細(xì)胞，用上述病毒順次感染；
d)擴(kuò)增建系，并通過流式細(xì)胞分選技術(shù)及嘌呤霉素藥物加壓篩選技術(shù)，獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶的陽性克隆。所述的綠色熒光蛋白GFP及螢火蟲熒光素酶Firefly luciferase的測手段均為光學(xué)信號檢測方法，其中包括，其中包括
a)體外檢測手段GFP檢測條件為熒光倒置顯微鏡，激發(fā)光波長為488士30nm,發(fā)射波長為509士30 nm ；螢火蟲熒光素酶檢測手段為化學(xué)發(fā)光檢測手段，施加D-Iuciferin后， 分別用多功能酶標(biāo)儀器Varadiflash Scanner, Thermo Scientific,及小動物成像系統(tǒng) kinetics, Caliper Life Science ；
b)動物體體內(nèi)檢測手段，動物體體內(nèi)檢測均采用小動物體內(nèi)成像系統(tǒng)kinetics， Caliper Life Science ；分別為熒光成像和生物發(fā)光成像。所述的動物模型為裸鼠。其中胃癌原位模型的建立是通過癌細(xì)胞胃漿膜下注射的方式完成。
藥物加壓篩選所選用為嘌呤霉素Puromycin，篩選標(biāo)記為熒光素酶。
用于體內(nèi)實(shí)時監(jiān)測腫瘤生長評價藥物療效。表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株在癌模型應(yīng)用，具體步驟為
1)慢病毒載體擴(kuò)增將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G, pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC， VSVg，pCMV-dR8.74常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用氨芐抗生素篩選陽性克隆，37 V搖菌擴(kuò)增，用質(zhì)粒純化提取試劑盒收集，純化慢病毒質(zhì)粒；其中pWPT-GFP，質(zhì)粒含有綠色熒光蛋白GFP基因，用于觀察和流式細(xì)胞分選；pLenti-CMV-puro-LUC含有熒光素酶基因及真核篩選標(biāo)記 Puromycin基因，用于生物發(fā)光成像和藥物加壓篩選(如圖1.慢病毒包裝質(zhì)粒pWPT-GFP結(jié)構(gòu)圖；圖2.慢病毒包裝質(zhì)粒pMD2. G結(jié)構(gòu)圖；圖3.慢病毒包裝質(zhì)粒PSPAX2結(jié)構(gòu)圖；圖4. 慢病毒包裝質(zhì)粒pLenti-CMV-puro-LUC結(jié)構(gòu)圖)；
2)含綠色熒光蛋白慢病毒包裝前一天將四31~細(xì)胞鋪于10cm培養(yǎng)板，培養(yǎng)于5 % CO2 37 0C恒溫培養(yǎng)箱；培養(yǎng)基為DMEM，血清選用進(jìn)口小牛血清，待細(xì)胞密度長至60-70%時， 進(jìn)行轉(zhuǎn)染；首先將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G，pSPAX2按照一定的比例與Opti-MEM混合， 并將Iipofectamine 2000與Opti-MEM充分混合，室溫孵育5分鐘后，將上述2種液體充分混合孵育20分鐘后，加入細(xì)胞中；8小時后熒光顯微鏡觀察包裝效果，并收集病毒上清；收集的病毒上清經(jīng)0. 2 ym濾器過濾分裝后于-80°C保存；
3)含熒光素酶慢病毒包裝前一天將細(xì)胞鋪于10cm培養(yǎng)板，帶細(xì)胞密度長至 60^70 %時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；首先將慢病毒載體pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg，pCMV-dR8. 91按照一定的比例與Opti-MEM混合，并將Iipofectamine 2000與Opti-ΜΕΜ充分混合，室溫孵育 5分鐘后，將上述2種液體充分混合孵育20分鐘后，加入細(xì)胞中；8小時后熒收集病毒上清；收集的病毒上清經(jīng)0.2 ym濾器過濾分裝后于-80°C保存(如圖5.慢病毒包裝質(zhì)粒 pCMV-dR8. 91結(jié)構(gòu)圖；圖6.慢病毒包裝質(zhì)粒VSVg結(jié)構(gòu)圖)；
4)病毒感染感染前一天將SGC7901細(xì)胞鋪于M孔板，密度約2X105，培養(yǎng)于5% CO2 37。C恒溫培養(yǎng)箱；培養(yǎng)基為DMEM，血清選用進(jìn)口小牛血清將含有綠色熒光蛋白的病毒液加入，并加polybrene 4 μ g/ml增加感染效率；12小時后更換為完全培養(yǎng)基；48小時后，觀察感染效果；如果感染效果不佳，進(jìn)行流式分選；之后將帶有綠色熒光的SGC7901按照密度再次鋪入M孔板，并加入上述含有熒光素酶的病毒液，并加入4 μ g/ml polybrene,于48 小時后，加入篩選藥物Puromycin，加壓篩選2周后，獲得陽性克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)；此時獲得雙標(biāo)胃癌細(xì)胞亞系SGC7901-GFP-LUC(如圖7.胃癌細(xì)胞亞系SGC7901-GFP-LUC熒光顯微鏡下觀察綠色熒光效果；圖8.胃癌細(xì)胞亞系SGC7901-GFP-LUC倍比稀釋觀察生物發(fā)光效果及線性關(guān)系；圖9.胃癌細(xì)胞亞系SGC7901-GFP-LUC倍比稀釋觀察熒光效果及線性關(guān)系)；
5)雙標(biāo)細(xì)胞系體外發(fā)光驗(yàn)證利用熒光顯微鏡觀察SGC7901綠色熒光效果，倒置熒光顯微鏡觀察條件為，激發(fā)條件為488nm ；采用倍比稀釋的方法，采用用小動物活體成像儀鑒定在不同細(xì)胞數(shù)量下，熒光素酶及綠色熒光表達(dá)，并判斷其線性關(guān)系；其中生物發(fā)光成像條件為，加入底物D-Iuciferin 1分鐘后顯像，曝光時間設(shè)為自動；
6)腫瘤皮下注射方法將胃癌亞系SGC7901-GFP-LUC消化后，用PBS重懸于200μ 1， 在裸鼠左肩部皮下注射細(xì)胞2 X 106，并通過小動物活體成像儀動態(tài)觀察細(xì)胞皮下增殖狀況 (如圖10.活體成像系統(tǒng)觀察胃癌細(xì)胞亞系SGC7901-GFP-LUC在肺上的定植情況；圖11.利用活體成像系統(tǒng)動態(tài)監(jiān)測胃癌細(xì)胞亞系在裸鼠皮下成長)；7)腫瘤原位種植方法6 7周裸鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心，85mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，待麻醉穩(wěn)定后，使裸鼠仰臥位，于左上腹部開3 cm切口，依次剪開皮膚，腹膜，暴露胃組織；將胃癌亞系SGC7901-GFP-LUC消化后，重懸約5X IO6細(xì)胞于50 μ 1 DMEM中，用30G 注射器緩慢吸取，在體視顯微鏡的輔助下，注射于胃漿膜下；之后將胃還納，7-0手術(shù)縫線縫合連續(xù)縫合腹膜，4-0手術(shù)縫線間斷縫合皮膚；種植后每周，用小動物活體成像儀動態(tài)在體觀察生物發(fā)光信號，檢測條件為腹腔注射D-Iuciferin 10分鐘后，裸鼠用異氟烷麻醉后，取左側(cè)仰臥位，曝光時間5分鐘(如圖12.裸鼠原位胃癌腫瘤構(gòu)建過程大體視野，組織切片及冰凍切片)；
8)4周后，將荷瘤裸鼠處死，制作原位胃癌HE染色切片及冰凍切片，觀察胃癌原位模型建模效果(如圖13. 8)4周后，將荷瘤裸鼠處死，制作原位胃癌HE染色切片及冰凍切片， 觀察胃癌原位模型建模效果。所述的胃癌原位模型的建立是通過癌細(xì)胞胃漿膜下注射的方式完成。所述的藥物加壓篩選所選用為嘌呤霉素Puromycin，篩選標(biāo)記為熒光素酶。穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和螢火蟲熒光素酶的胃癌細(xì)胞株的應(yīng)用，可用于體內(nèi)實(shí)時監(jiān)測腫瘤生長及評價藥物療效。用于體內(nèi)實(shí)時監(jiān)測腫瘤生長評價藥物療效。
權(quán)利要求
1.表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株，其特征是以人胃癌細(xì)胞系為母細(xì)胞， 采用慢病毒感染的方法，將綠色熒光蛋白(GFP)和螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase, LUC)基因帶入細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和螢火蟲熒光素酶的細(xì)胞株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株，其特征是將所述的細(xì)胞株通過皮下，尾靜脈及原位注射的方式建立不同的胃癌動物模型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株，其特征是所述的慢病毒感染的方法是將外源基因?qū)?，它的步驟是a)大腸桿菌擴(kuò)增慢病毒包裝質(zhì)粒pWPT-GFP，pMD2. G, pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC, VSVg, pCMV-dR8. 91，并酶切鑒定，純化；b)用上述純化獲得的質(zhì)粒按照一定比例，用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，以分別產(chǎn)生含有綠色熒光蛋白和螢火蟲熒光素酶慢病毒顆粒的上清；c)以人胃癌細(xì)胞系為母細(xì)胞，用上述病毒順次感染；d)擴(kuò)增建系，并通過流式細(xì)胞分選技術(shù)及藥物加壓篩選技術(shù)，獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶的陽性克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株，其特征是所述的綠色熒光蛋白(GFP)及螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)的測手段均為光學(xué)信號檢測方法，其中包括a)體外檢測手段GFP檢測條件為熒光倒置顯微鏡，激發(fā)光波長為488士30nm,發(fā)射波長為509 士 30 nm;螢火蟲熒光素酶檢測手段為化學(xué)發(fā)光檢測手段，施加D-Iuciferin后，分別用多功能酶標(biāo)儀器及小動物成像系；b)動物體內(nèi)檢測手段，動物體體內(nèi)檢測采用小動物體內(nèi)成像系統(tǒng)分別為熒光成像和生物發(fā)光成像。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株，其特征是所述的動物模型為裸鼠或SCID鼠。
6.表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株在癌模型應(yīng)用，其特征是具體步驟為1)慢病毒載體擴(kuò)增將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G, pSPAX2, pLenti-CMV-puro-LUC， VSVg, pCMV-dR8.74常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用氨芐抗生素篩選陽性克隆，37°C搖菌擴(kuò)增，用質(zhì)粒純化提取試劑盒收集，純化慢病毒質(zhì)粒；其中PWPT-GFP，質(zhì)粒含有綠色熒光蛋白GFP基因，用于觀察和流式細(xì)胞分選；pLenti-CMV-puro-LUC含有熒光素酶基因及真核篩選標(biāo)記嘌呤霉素基因，用于生物發(fā)光成像和藥物加壓篩選；2)含綠色熒光蛋白慢病毒包裝將四31~細(xì)胞鋪于10cm培養(yǎng)板，培養(yǎng)于5 % CO2 37 °C 恒溫培養(yǎng)箱；待細(xì)胞密度長至6(Γ70%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；首先將慢病毒載體pWPT-GFP，pMD2. G，pSPAX2按照比例混合，并與脂質(zhì)體充分混合并孵育后，加入細(xì)胞中；熒光顯微鏡觀察包裝效果，并收集病毒上清；過濾分裝后于-80°C保存；3)含熒光素酶慢病毒包裝前一天將細(xì)胞鋪于10cm培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度長至 60 70%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染；首先將慢病毒載體pLenti-CMV-puro-LUC，VSVg, pCMV_dR8. 91按照一定的比例并與脂質(zhì)體充分混合并孵育后，加入細(xì)胞中；收集病毒上清過濾后分裝后于-80 °C保存；4)病毒感染感染前一天將人胃癌細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板，將含有綠色熒光蛋白的病毒液加入；后更換為完全培養(yǎng)基；觀察感染效果，并進(jìn)行流式分選；之后將帶有綠色熒光的胃癌細(xì)胞按照密度再次鋪入細(xì)胞板，并加入上述含有熒光素酶的病毒液，于48小時后，加入篩選藥物，加壓篩選后，獲得陽性克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)；此時獲得穩(wěn)定綠色熒光蛋白和螢火蟲熒光素酶基因的；5)雙標(biāo)細(xì)胞系體外發(fā)光驗(yàn)證利用倒置熒光顯微鏡觀察雙標(biāo)胃癌細(xì)胞亞系綠色熒光效果；亦可采用倍比稀釋的方法，采用用小動物活體成像儀鑒定在不同細(xì)胞數(shù)量下，熒光素酶及綠色熒光表達(dá)，并判斷其線性關(guān)系；6)腫瘤皮下注射方法將雙標(biāo)胃癌細(xì)胞消化后，用PBS重懸于，在裸鼠右肩部皮下注射細(xì)胞2X 106，并通過小動物活體成像儀或卡尺動態(tài)觀察細(xì)胞皮下增殖狀況；7)腫瘤原位種植方法裸鼠麻醉穩(wěn)定后，取仰臥位，于上腹部開手術(shù)切口，依次剪開皮膚，腹膜，暴露胃組織；將雙標(biāo)胃癌細(xì)胞消化后，重懸于適量培養(yǎng)基中，用注射器緩慢吸取， 注射于胃漿膜下；之后手術(shù)縫線縫合縫合腹膜及皮膚；種植后每周，用小動物活體成像儀動態(tài)在體觀察生物發(fā)光信號；8)4周后，將荷瘤裸鼠處死，制作原位胃癌HE染色切片及冰凍切片，觀察胃癌原位模型建模效果。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和螢火蟲熒光素酶在癌模型應(yīng)用， 其特征是所述的胃癌原位模型的建立是通過癌細(xì)胞胃漿膜下原位注射的方式完成。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株在癌模型應(yīng)用， 其特征是所述的藥物加壓篩選所選用為嘌呤霉素(Puromycin)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株在癌模型應(yīng)用，其特征是用于體內(nèi)實(shí)時監(jiān)測腫瘤生長及評價藥物療效。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及將綠色熒光蛋白及螢火蟲螢光素酶導(dǎo)入細(xì)胞，建立表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株及在癌模型應(yīng)用，其特征是以人胃癌細(xì)胞系為母細(xì)胞，采用慢病毒感染的方法，將綠色熒光蛋白(GFP)和螢火蟲熒光素酶(Fireflyluciferase,LUC)基因帶入細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白和螢火蟲熒光素酶的細(xì)胞株；將所述的細(xì)胞株通過皮下，尾靜脈及原位注射的方式建立不同的胃癌動物模型。它提供了人胃癌雙標(biāo)細(xì)胞株的建立及應(yīng)用，它通過慢病毒基因感染的方法，建立表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶胃癌細(xì)胞株及在癌模型應(yīng)用，用于在胃癌臨床前研究中的應(yīng)用。
文檔編號A61K49/00GK102399748SQ201110332648
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者吳開春, 殷繼鵬, 聶勇戰(zhàn), 胡皓 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)