專利名稱：一種注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種注射用凍干粉制劑，特別涉及一種紅細(xì)胞的注射用凍干粉制劑。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞主要由細(xì)胞膜和血紅蛋白組成，是血液的重要成分，主要功能是輸送氧氣和二氧化碳。在氧分壓較高的肺部，血紅蛋白與氧結(jié)合成氧合血紅蛋白，然后隨血液流到氧分壓較低的組織，血紅蛋白分離，將攜帶的氧氣釋放，再與組織所產(chǎn)生的二氧化碳結(jié)合，運(yùn)輸至肺部，排出體外。人體在大量失血后需要補(bǔ)充血液。隨著成分輸血技術(shù)的推廣，失血后已不必補(bǔ)充全血，而是給予一定量的紅細(xì)胞等血液組分即可。因此，紅細(xì)胞的體外保存和生物活性的保持成為成分輸血技術(shù)的技術(shù)前體。現(xiàn)用紅細(xì)胞的保存方法主要有液體保存法、冷凍保存法和冷凍干燥法。其中液體法一般指的是 4°C低溫保存法，冷凍保存指-80°C或_196°C深低溫保存。冷凍干燥法是將其適當(dāng)脫水后經(jīng)干燥制成，比液體法和冰凍法有明顯的優(yōu)勢(shì)，其制品可以室溫保存，易于水化，重量大大減輕，便于運(yùn)輸，減少浪費(fèi)。目前，液體保存紅細(xì)胞已廣泛應(yīng)用于臨床，并得到不斷的完善；冷凍保存紅細(xì)胞已開(kāi)始應(yīng)用于臨床；冷凍干燥保存紅細(xì)胞的技術(shù)尚未成熟，缺乏實(shí)用性。紅細(xì)胞保存的研究倍受重視。其保存期的長(zhǎng)短已成為衡量一個(gè)國(guó)家臨床輸血水平的一個(gè)重要指標(biāo)。目前研究認(rèn)為，采用凍干技術(shù)可以延長(zhǎng)紅細(xì)胞的保存期，研究中常用的冷凍保護(hù)劑等關(guān)鍵輔料包括海藻糖、二甲基亞砜、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白等。海藻糖是一種穩(wěn)定的非還原性雙糖，其羥基能代替水分子同蛋白質(zhì)表面部分結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)形成保護(hù)層，對(duì)細(xì)胞形成保護(hù)。但只有當(dāng)海藻糖達(dá)到一定濃度并均勻分布在細(xì)胞膜內(nèi)外時(shí)，才能在凍干過(guò)程中對(duì)紅細(xì)胞起到保護(hù)作用。因此，凍干前有效負(fù)載海藻糖至胞內(nèi)是紅細(xì)胞凍干保存成功的主要因素之一。然而紅細(xì)胞膜對(duì)海藻糖具有非滲透性，因此將海藻糖負(fù)載進(jìn)入紅細(xì)胞胞內(nèi)，需要復(fù)雜的工藝過(guò)程，耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)4小時(shí)，并需要引入更多種化學(xué)物質(zhì)。使得工藝問(wèn)題和安全性問(wèn)題成為困擾紅細(xì)胞凍干粉應(yīng)用的難題之一。二甲基亞砜可防止凍干過(guò)程中形成冰晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。溫度接近0°C時(shí)，二甲基亞砜使溶液的凝固點(diǎn)下降，無(wú)冰晶形成；溫度繼續(xù)降低時(shí)，細(xì)胞外液中形成冰晶，而紅細(xì)胞內(nèi)溶液不凍結(jié)。紅細(xì)胞胞外水不斷形成冰晶，胞外濃度增大，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的自由水透過(guò)細(xì)胞膜滲出到胞外，如果降溫速度足夠慢，即可使紅細(xì)胞逐漸脫水而不會(huì)形成冰晶。但是，二甲基亞砜作為一種化學(xué)試劑，對(duì)人體具有一定的毒性作用，不適于注射給藥，殘留的二甲基亞砜可能會(huì)在長(zhǎng)期輸注凍干紅細(xì)胞的患者體內(nèi)逐漸積累而形成傷害，所以使用前需要反復(fù)沖洗，從而造成紅細(xì)胞回收率降低的問(wèn)題。聚乙烯吡咯烷酮與海藻糖相似，是非滲透性細(xì)胞保護(hù)劑，對(duì)凍干細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。牛血清白蛋則是一種膜保護(hù)劑。目前實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果認(rèn)為，紅細(xì)胞凍干過(guò)程中，需要海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白組合使用才能對(duì)凍干過(guò)程中的紅細(xì)胞發(fā)揮一定的保護(hù)作用。而海藻糖需要二甲基亞砜才能有效進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。并且，目前研發(fā)的各種紅細(xì)胞凍干工藝和處方，因成分復(fù)雜，工藝參數(shù)不易控制等原因，存在紅細(xì)胞回收率低、凍干紅細(xì)胞形態(tài)變異、凍干紅細(xì)胞酶活性降低等諸多問(wèn)題。因此，尋找新的安全性高且能夠維持凍干紅細(xì)胞高回收率和高活性的紅細(xì)胞凍干粉處方和工藝，已成為已成為制約紅細(xì)胞臨床使用的關(guān)鍵因素。四氫嘧啶，化學(xué)名為1，4，5，6-四氫-2-甲基_4_嘧啶羧酸或2-Methyl-l，4，5，6 -tetrahydropyrimidine-4-carboxylic acid 或(S)_2_methyl_l， 4, 5, 6-tetra-hydro pyrimidine-4-carboxylic acid 或 1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carbonic acid, CAS號(hào)為96702-03-3，是1985年從海洋生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的氨基酸衍生物，具有保濕、防紫外線照射等作用，近年來(lái)已被用于化妝品作為保濕性成分或輔料。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于提供一種注射用凍干粉制劑，具體的說(shuō)是一種注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑。另一方面，本發(fā)明還提供了一種注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑，由紅細(xì)胞和冷凍保護(hù)劑組成，所述冷凍保護(hù)劑由非滲透性冷凍保護(hù)劑和四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶組成，所述非滲透性冷凍保護(hù)劑選自聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白和海藻糖中的任意一種；所述四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶用量為每 IO12個(gè)紅細(xì)胞細(xì)胞用5mg-80mg，所述非滲透性冷凍保護(hù)劑的用量為每IO12個(gè)紅細(xì)胞細(xì)胞用 2mg_50mgo所述四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶的用量為每IO12個(gè)紅細(xì)胞細(xì)胞用10mg-30mg。所述非滲透性冷凍保護(hù)劑的用量為每IO12個(gè)紅細(xì)胞細(xì)胞用aiig-20mg。所述非滲透性冷凍保護(hù)劑為聚乙烯吡咯烷酮。所述聚乙烯吡咯烷酮的用量為每IO12個(gè)紅細(xì)胞細(xì)胞用ang-Hmg。所述注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑的制備方法，步驟為
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入非滲透性冷凍保護(hù)劑和四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至7Pa-15I^，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至_10°C，維持干燥6小時(shí)；
c、二次干燥一次干燥后，以0. I0C /分鐘的升溫速度升溫至25V，維持干燥5小時(shí)， 滅菌分裝即得。本發(fā)明的技術(shù)方案中所述的四氫嘧啶，化學(xué)名為2-Methyl-l，4，5，6-tetra hydropyrimidine-4-carboxylic acid 或(S)-2-methyl-l, 4, 5, 6-tetra-hydro pyrimidine-4-carboxylic acid 或 1, 4, 5, 6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carbonic acid。1，4，5，6-四氫-2-甲基-5-羥基-4-嘧啶羧酸俗稱羥基四氫嘧啶，CAS號(hào)為96702-03-3，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的。本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)研究中驚奇的發(fā)現(xiàn)，四氫嘧啶與某些非滲透性冷凍保護(hù)劑的混合物，對(duì)凍干紅細(xì)胞有出乎意料的保護(hù)作用，紅細(xì)胞與四氫嘧啶及其衍生物和非滲透性冷凍保護(hù)劑混合后凍干，所得的注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑安全性高，穩(wěn)定性強(qiáng)，回收率、體內(nèi)存活時(shí)間和紅細(xì)胞功能相對(duì)較高，凍干對(duì)紅細(xì)胞的影響極小，利于紅細(xì)胞的長(zhǎng)期貯存和運(yùn)輸。


圖1光鏡下實(shí)施例9制備的注射用紅細(xì)胞凍干粉復(fù)水后的紅細(xì)胞形態(tài)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋。應(yīng)當(dāng)理解的是，以下實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
四氫嘧啶12mg
聚乙烯吡咯烷酮IOmg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為IX IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入四氫嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至12Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例2注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
羥基四氫嘧啶20mg
聚乙烯吡咯烷酮7mg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入羥基四氫嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至9Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥6 小時(shí)；c、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25V，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例3 紅細(xì)胞細(xì)胞羥基四氫嘧啶海藻糖 1)配液:
注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
2 X IO9 細(xì)胞/ml 1000ml 30mg 45mg將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入羥基四氫嘧啶和海藻糖，靜置1小時(shí)； 2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至10Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例4 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
羥基四氫嘧啶4ang
牛血清白蛋白18mg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入羥基四氫嘧啶和牛血清白蛋白，靜置1小時(shí)；
2)凍干a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C/分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2小時(shí)；b、一次干燥抽真空至10Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C， 維持干燥6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25V，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例5 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
四氫嘧啶26mg
聚乙烯吡咯烷酮IOmg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入四氫嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至10Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例6 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
四氫嘧啶58mg
海藻糖50mg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入四氫嘧啶和海藻糖，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備 2 X IO9 細(xì)胞/ml 60mg
3mg
小時(shí)；b、一次干燥抽真空至12Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，即得。實(shí)施例7 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
四氫嘧啶7ang
牛血清白蛋白23mg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入四氫嘧啶和牛血清白蛋白，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至10Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例8 紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml 四氫嘧啶聚乙烯吡咯烷酮
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入四氫嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至12Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例9 紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml 四氫嘧啶聚乙烯吡咯烷酮
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入四氫嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至15Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。
注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備 2 X IO9 細(xì)胞/ml 15mg
12g
實(shí)施例10 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
四氫嘧啶17mg
聚乙烯吡咯烷酮19mg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入四氫嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至9Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥6 小時(shí)；c、二次干燥一次干燥后，以0. I0C /分鐘的升溫速度升溫至25V，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例11 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
羥基四氫嘧啶20mg
聚乙烯吡咯烷酮IOmg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入羥基四氫嘧啶和聚乙烯吡咯烷酮，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至10Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例12 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
羥基四氫嘧啶iang
牛血清白蛋白15mg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入羥基四氫嘧啶和牛血清白蛋白，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至10Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例13 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
四氫嘧啶18mgCN 102327289 A
說(shuō)明書7/9頁(yè)
海藻糖59mg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入四氫嘧啶和海藻糖，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至10Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例14 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
四氫嘧啶Ilmg
海藻糖75mg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入四氫嘧啶和海藻糖，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至10Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例15 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
四氫嘧啶Ilmg
牛血清白蛋白32mg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入四氫嘧啶和牛血清白蛋白，靜置1小時(shí)；
2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至7Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥6 小時(shí)；c、二次干燥一次干燥后，以0. I0C /分鐘的升溫速度升溫至25V，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例16 注射用紅細(xì)胞凍干粉處方及制備
紅細(xì)胞細(xì)胞2X IO9細(xì)胞/ml 1000ml
四氫嘧啶19mg
海藻糖41mg
1)配液:
將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液，然后加入四氫嘧啶和海藻糖，靜置1小時(shí)； 2)凍干
a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C /分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至10Pa，然后以5°C /分鐘的升溫速度升溫至-10°C，維持干燥 6小時(shí)；C、二次干燥一次干燥后，以0. 1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)，滅菌分裝即得。實(shí)施例17 注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑的急性毒性實(shí)驗(yàn)
SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，體重16g-30g，稱重后隨機(jī)分為17組，一組尾靜脈注射給予未凍干的紅細(xì)胞，其余16組分別靜脈注射給予實(shí)施例1-實(shí)施例16所制備的凍干粉(凍干粉用生理鹽水復(fù)溶)，以紅細(xì)胞細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算給藥劑量為IO12/只，給藥后連續(xù)觀察14天。觀察項(xiàng)目包括毒性反應(yīng)、體重和組織病理學(xué)。結(jié)果表明，小鼠尾靜脈注射給予紅細(xì)胞凍干粉， 以紅細(xì)胞細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)為IO14/只時(shí)，無(wú)明顯毒性反應(yīng)，給藥前后及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠體重?zé)o明顯差異，組織病理學(xué)觀察，未發(fā)現(xiàn)顯著異常。說(shuō)明本發(fā)明的注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑安全性良好。實(shí)施例18 注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)
Wister大鼠，雌雄各半，420g-600g，稱重后隨機(jī)分為17組，一組尾靜脈注射給予未凍干的紅細(xì)胞，其余16組分別靜脈注射給予實(shí)施例1至實(shí)施例16所制備的凍干粉(凍干粉用生理鹽水復(fù)溶)，以紅細(xì)胞細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算給藥劑量為2 X IO9/只，每?jī)商旖o藥1次，共30天， 恢復(fù)期為14天。給藥期間及恢復(fù)期內(nèi)，觀察大鼠給藥前及給藥后進(jìn)行大體觀察，記錄大鼠的一般癥狀、記錄給藥前及給藥后大鼠的體重，并定期進(jìn)行血液學(xué)、尿液學(xué)和血生化檢查， 記錄給藥前及給藥后大鼠的心電圖。結(jié)果顯示，各組動(dòng)物體重與對(duì)照組無(wú)顯著差異，大體觀察未發(fā)現(xiàn)異常。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的血液學(xué)、尿液學(xué)和血生化數(shù)據(jù)與對(duì)照組無(wú)顯著差異。說(shuō)明四注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑長(zhǎng)期給藥的安全性良好，耐受性符合臨床用藥的要求。實(shí)施例19 注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑的紅細(xì)胞回收率
體外紅細(xì)胞細(xì)胞回收率=(復(fù)水后紅細(xì)胞數(shù)目/凍干前紅細(xì)胞數(shù)目)χιοο% 將實(shí)施例1-實(shí)施例16所制備的凍干粉用生理鹽水復(fù)水，對(duì)各組紅細(xì)胞細(xì)胞復(fù)水前及復(fù)水后個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算各組紅細(xì)胞細(xì)胞回收率(每組取三份樣品測(cè)定后取平均值)。結(jié)果表明，各組凍干粉的體外紅細(xì)胞細(xì)胞回收率(均值)為85. 7%-96. 0%，其中實(shí)施例1、實(shí)施例 2、實(shí)施例9和實(shí)施例11制備的由四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶與聚乙烯吡咯烷酮組成的凍干粉的體外紅細(xì)胞細(xì)胞回收率集中于87. 1%-98. 3%，顯著高于其他各組。實(shí)施例20 注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑的紅細(xì)胞復(fù)水后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
將實(shí)施例1至實(shí)施例16所制備的注射用紅細(xì)胞凍干粉用生理鹽水復(fù)溶后，紅細(xì)胞涂片作姬姆薩染色(Giemsa stain)，新鮮紅細(xì)胞經(jīng)同樣涂片染色后作為正常對(duì)照；光學(xué)顯微鏡觀察并照相。結(jié)果表明實(shí)施例1至實(shí)施例16所制備的注射用紅細(xì)胞凍干粉用生理鹽水復(fù)溶后，紅細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)異常。實(shí)施例9注射用紅細(xì)胞凍干粉復(fù)水后的紅細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。實(shí)施例21 注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑的紅細(xì)胞復(fù)水后的三磷酸腺苷酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性測(cè)定
將實(shí)施例1至實(shí)施例16所制備的注射用紅細(xì)胞凍干粉用生理鹽水復(fù)溶后，使用試劑盒測(cè)定三磷酸腺苷酶(ATP)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)活性。新鮮紅細(xì)胞和洲標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液作同樣測(cè)定作為對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)表1。
表 權(quán)利要求
1.一種注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑，其特征在于由紅細(xì)胞和冷凍保護(hù)劑組成，所述冷凍保護(hù)劑由非滲透性冷凍保護(hù)劑和四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶組成，所述非滲透性冷凍保護(hù)劑選自聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白和海藻糖中的任意一種；所述四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶用量為每IO12個(gè)紅細(xì)胞細(xì)胞用5mg-80mg，所述非滲透性冷凍保護(hù)劑的用量為每IO12個(gè)紅細(xì)胞細(xì)胞用ang-50mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑，其特征在于所述四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶的用量為每IO12個(gè)紅細(xì)胞細(xì)胞用10mg-30mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑，其特征在于所述非滲透性冷凍保護(hù)劑的用量為每IO12個(gè)紅細(xì)胞細(xì)胞用ang-20mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑，其特征在于所述非滲透性冷凍保護(hù)劑為聚乙烯吡咯烷酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑，其特征在于所述聚乙烯吡咯烷酮的用量為每IO12個(gè)紅細(xì)胞細(xì)胞用2mg-Hmg。
6.權(quán)利要求1-5所述的注射用紅細(xì)胞凍干粉制劑的制備方法，其特征在于，步驟為1)配液:將紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌2次，用滅菌注射用水配成濃度為2X IO9細(xì)胞/ml的懸液， 然后加入非滲透性冷凍保護(hù)劑和四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶，靜置1小時(shí)；2)凍干a、預(yù)凍將分裝于西林瓶的溶液以10°C/分鐘的速度從_20°C降至_50°C，維持冷凍2 小時(shí)；b、一次干燥抽真空至7Pa-15I^，然后以5°C/分鐘的升溫速度升溫至_10°C，維持干燥6小時(shí)；c、二次干燥一次干燥后，以0.1°C /分鐘的升溫速度升溫至25°C，維持干燥5小時(shí)， 滅菌分裝即得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種注射用凍干紅細(xì)胞制劑及其制備方法，凍干保護(hù)劑由非滲透性保護(hù)劑與四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶組成。本發(fā)明的注射用凍干紅細(xì)胞制劑安全性高，穩(wěn)定性強(qiáng)，回收率、體內(nèi)存活時(shí)間和紅細(xì)胞功能相對(duì)較高，凍干對(duì)紅細(xì)胞的影響極小，利于紅細(xì)胞的長(zhǎng)期貯存和運(yùn)輸。
文檔編號(hào)A61K47/32GK102327289SQ20111031273
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者厲保秋, 厲凌子, 高繼友 申請(qǐng)人:濟(jì)南環(huán)肽醫(yī)藥科技有限公司