專(zhuān)利名稱(chēng)：鬼針草中的活性成分鬼針聚炔苷在制備防治急性肝損傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鬼針聚炔苷的用途，尤其是制備防治急性肝損傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鬼針草又名金盞銀盤(pán)、鬼釵草、盲腸草、引線包、針包草、一把針、豆渣菜、脫力草， 分布于東北、華北、華東、西南及陜西、甘肅等地區(qū)，生長(zhǎng)于路邊、荒地、山坡及田間。該藥始載于《本草拾遺》“鬼釵草，味苦平，無(wú)毒，主蛇及蜘蛛咬，杵碎傅之，亦杵絞汁服。生地畔，有椏，方莖，子作釵腳，著人如衣針，北方呼之為鬼針”?！吨兴幋筠o典》記載鬼針草“苦、平、無(wú)毒。功能清熱解毒、散瘀消腫。主治瘧疾、腹瀉、痢疾、肝炎、急性腎炎、胃痛、 噎膈、腸癰、咽喉腫痛、跌打損傷、蛇蟲(chóng)咬傷”?！度薇静荨泛汀侗静萃瞥穼?duì)鬼針草的功效均記載。鬼針草所含化學(xué)成分主要為黃酮類(lèi)、烯炔類(lèi)、香豆素類(lèi)、有機(jī)酸及其酯類(lèi)、三萜、甾醇、揮發(fā)油等，其中黃酮類(lèi)化合物和多炔是鬼針草中的主要成分，其次還含有氨基酸和微
量元素等。從鬼針草分離的黃酮類(lèi)化合物主要包括查耳酮類(lèi)、噢挵類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、二氫黃酮類(lèi)和黃酮類(lèi)等，其中以查耳酮類(lèi)和噢挵類(lèi)為特征性成分。目前已分離出的黃酮分別為金絲桃苷(hyptroside)、奧卡寧(okanin)、異奧卡寧7_ 0-β-D-葡萄糖苷、海生菊苷 (maritimetin) ,6-0-(6 ‘乙?；? β -D-吡喃葡萄糖基)_6，7，3，4-四羥基噢挵、槲皮素3-0-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素3- 0-α- L鼠李糖苷。已分離、鑒定的鬼針草屬植物中活性成分以查耳酮類(lèi)化合物奧卡寧類(lèi)最多，有25種；噢挵類(lèi)化合物8種；黃酮醇類(lèi)化合物 8種；二氫黃酮類(lèi)5種；黃酮類(lèi)4種。從鬼針草分離的多炔主要有I9種，包括4個(gè)微量的聚乙炔類(lèi)化合物以及具有抗炎作用的鬼針聚炔苷2-β-D -吡喃葡萄糖基-1，13-二羥基-3 (反)，11 (反) -十三二烯-5，7，9-三炔。同時(shí)從鬼針草分離的還有有香豆素(如七葉苷等)、生物堿、蒽醌苷、糖、胡蘿卜素、多元酚丁香苷、維生素、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、苦味質(zhì)、膽堿。另有16種氨基酸天門(mén)冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、頡氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、賴(lài)氨酸等，其中8種為人體必需氨基酸；還含有9種人體必需無(wú)機(jī)元素，其中4種常量元素中以鈣含量最高，5種微量元素中鐵含量最高，其次是銅、鋅、鋰、鎢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供鬼針聚炔苷的用途，是制備防治急性肝損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。肝損傷是由各種肝臟疾病所產(chǎn)生的病變結(jié)果。臨床上造成急性肝損傷的原因主要
3有病毒感染、服用藥物不當(dāng)、食物添加劑、乙醇攝入過(guò)量、誤服有毒食物、放射線損傷等。近年來(lái)，隨著臨床用藥種類(lèi)的迅速增加及患者自行服藥或隨意加大藥物劑量的概率增加，藥物性肝損傷的發(fā)生率亦相應(yīng)增加。全國(guó)多中心急性藥物性肝損傷住院病歷調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)， 我國(guó)急性藥物性肝損傷發(fā)病呈逐年增加趨勢(shì)，急性藥物性肝損傷發(fā)病率占黃疸住院患者的 2^-5%,占爆發(fā)性肝功能衰竭患者的15% 30%，占非病毒性慢性肝炎的20% 50%。目前對(duì)肝損傷的治療方法很多，且均有一定的療效，但也存在著明顯的不足。肝移植療法受患者年齡、人類(lèi)白細(xì)胞抗原相同供者來(lái)源不足、感染等并發(fā)癥多、移植物抗宿主病治療難度大、病死率高等限制。西醫(yī)對(duì)肝損傷的藥物治療療效并不十分肯定，同時(shí)又具有較大的毒副作用。還有一些療法雖然對(duì)肝損傷有效，但因其價(jià)格昂貴，使患者經(jīng)濟(jì)上難以承受，因而極不利于臨床推廣。為此，研究?jī)r(jià)格便宜、療效好的中藥，發(fā)揮中醫(yī)藥治療肝損傷的優(yōu)勢(shì)，日漸成為研究熱點(diǎn)。迄今報(bào)道，對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷有效的中藥單味藥和有效組分有茵陳、核桃仁、鵝不食草、白背葉根、決明子、枸杞、丹參、五味子、絞股藍(lán)、三七、半枝蓮、黃芩、三棱、莪術(shù)、黃芪提取物、金針菇提取物、火棘果實(shí)提取物、氧化苦參堿、沙苑子黃酮、白藜蘆醇苷、苯丙素苷、葛根紊、胡盧巴多糖、紅毛五加多糖、玉米須多糖、玉郎傘多糖、知母總黃酮、胡黃連總苷、芒果苷、鯊肝肽等。鬼針草在中醫(yī)學(xué)上具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、活血消腫的功效，我們從鬼針草中提取了活性成分鬼針聚炔苷，研究其在治療各種原因引起的急性肝損傷中的作用以及作用機(jī)制。首先，我們通過(guò)以下方法在鬼針草中提取鬼針聚炔苷，我們選取的實(shí)驗(yàn)原料來(lái)源于菊科鬼針草屬植物金盞銀盤(pán)Bidens biternata (Lour.) Merr. et Sheff干燥地上的部分。粗品提取
1)取金盞銀盤(pán)30kg加70%乙醇10倍量回流提取2次；
2)合并提取液，回收乙醇至無(wú)醇味，0.1 μ m陶瓷膜過(guò)濾；
3)過(guò)濾后的濾液通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂HPD-100，然后先以1.5倍柱體積的水洗去雜質(zhì)，再用3倍柱體積的70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集乙醇洗脫液回收乙醇至無(wú)醇味；
4)干燥，獲得粗品，大約45g; 精制
5)將粗品加約20倍量乙醇超聲提取30min，提取液濾過(guò)回收乙醇；
6)進(jìn)行真空干燥或噴霧干燥，獲得提純物，大約27g；
7)將27g提純物用200ml甲醇使用熱超聲溶解；
8)用大孔樹(shù)脂吸附，然后用分別10%、35%、45%以及70%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，初步分為 4個(gè)部分，分別得到大約2. 5g、7. 0g、6. 0g、5. 5g的粗分物；
9)將4個(gè)部分分別柱層析，依次用石油醚、(石油醚乙酸乙酯)、(乙酸乙酯甲醇)、氯仿、(氯仿甲醇)梯度洗脫；
10)再依次用100-200目、200-300目，300-400目硅膠分離；
11)通過(guò)葡聚糖凝膠分離；
12)最后經(jīng)過(guò)制備液相制備得到鬼針聚炔苷，即2-β -D -吡喃葡萄糖基-1，13- 二羥基-3 (反)，11 (反)-十三二烯_5，7，9-三炔。
我們將制備獲得的鬼針聚炔苷進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的對(duì)象選取為經(jīng)CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)小鼠。實(shí)驗(yàn)使用了包括
a實(shí)驗(yàn)小鼠選用昆明種小鼠60只，6-8周，體重20士2g，$，普通級(jí)，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；
b試劑選用丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)試劑盒 (南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)20110521)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)試劑盒(廠商，同上，批號(hào)20110524)；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒(廠商，同上，批號(hào)20110521)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)ZLI-9032)、兔抗人NF-KB(p65)多抗(廠商，同上，產(chǎn)品編號(hào)SC_109)，免疫組織化試劑盒(S-P)試劑盒(廠商，同上，產(chǎn)品編號(hào)SP-9000)；
c儀器選用GL20A全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(湖南儀器儀表總廠)；MDF-382E三洋超低溫冰箱(日本三洋)；FSH-2型可調(diào)高速勻漿器(江蘇省金壇市容體儀器制造有限公司)；MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾公司)；BI2000生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)； BX50型倒置顯微鏡(日本Olympus)，Nikon 80i熒光生物顯微鏡(新飛達(dá)光學(xué)儀器公司)。實(shí)驗(yàn)方法為將60只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型組、鬼針聚炔苷BPC 給藥組(12. 5、25、50 mg · kg—1) 3組和陽(yáng)性對(duì)照藥即水飛薊素(200 mg · kg—1)組，其中BPC 和水飛薊素均以0. 3%羧甲基纖維素鈉生理鹽水溶解。除正常組和模型組灌胃給予0. 3%羧甲基纖維素鈉生理鹽水外，其余各組分別按0.1 ml - (10 g)—1體積分別灌胃給予不同劑量BPC和水飛薊素，每天1次，連續(xù)6d。末次給藥后2h，除正常組外，其余各組均腹腔注射 0. 2% CCl4橄欖油溶液IOmL · kg—1。禁食16h后自小鼠后眼眶靜脈叢采血置1. 5mL離心管中，3000r · miiT1離心lOmin，制備血清，做相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。拉頸處死動(dòng)物，立即摘取肝臟稱(chēng)重，計(jì)算相對(duì)肝重量。相同部位取肝組織0. 5g，以預(yù)冷的0. 9%生理鹽水制成10%肝組織勻漿，2500r· HiirT1離心lOmin，上清液置4°C保存?zhèn)溆谩Ａ砣∠嗤课桓闻K小葉，切取組織塊5X5X2mm，置于10%福爾馬林中固定24h后進(jìn)行病理學(xué)檢查。我們制定的指標(biāo)檢測(cè)如下
肝臟指數(shù)分別剖取肝臟，稱(chēng)重，按肝臟指數(shù)=[肝臟重量(g)/體重(g)]X100計(jì)算肝臟指數(shù)；
血清生化指標(biāo)血清中ALT、AST的測(cè)定參照改良賴(lài)氏法-，按試劑盒說(shuō)明書(shū)的具體步驟進(jìn)行，于酶標(biāo)儀上測(cè)定血清中的ALT、AST ；
肝組織生化指標(biāo)肝組織中的S0D、GSH_Px、MDA、N0的活性和含量按試劑盒說(shuō)明書(shū)的具體步驟進(jìn)行測(cè)定，其中MDA的含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定；
組織病理學(xué)和免疫組化學(xué)觀察肝組織于10%福爾馬林固定液中固定Mh，用水沖洗后經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，進(jìn)行石蠟包埋處理后切成4Mm厚的薄片，HE染色觀察病理切片；采用免疫組化S-P法顯色系統(tǒng)，按照試劑盒說(shuō)明依次切片脫蠟和水化、抗原修復(fù)、 滴加一抗、37°C孵育、DAB顯色，最后二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察蛋白表達(dá)情況；
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多樣本的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較用One-Way ANOVA檢驗(yàn)。
我們得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下
(1)表1所示，鬼針聚炔苷BPC (12.5,25,50 mg .kg—1) ig給藥能夠不同程度的降低肝指數(shù)，抑制ALT、AST活性，與模型組比較有顯著性差異。表1鬼針聚炔苷對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝指數(shù)、血清ALT和AST的影響( ，n=10)
權(quán)利要求
1.鬼針草中的活性成分鬼針聚炔苷在制備防治急性肝損傷藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了鬼針草中的活性成分鬼針聚炔苷的新用途，具體是在制備防治急性肝損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確了鬼針聚炔苷能夠?qū)Cl4誘導(dǎo)急性肝損傷的實(shí)驗(yàn)小鼠起到保護(hù)作用，鬼針聚炔苷能顯著降低血清中ALT、AST的水平、肝組織MDA含量，顯著增強(qiáng)肝組織SOD、GSH-Px活性，明顯降低肝組織中NO含量，并可抑制肝細(xì)胞NF-κB的表達(dá)，因此鬼針聚炔苷在制備預(yù)防治療急性肝損傷的藥物中具有較理想的前景。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102335183SQ20111029496
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月27日
發(fā)明者劉建軍, 吳繁榮, 葛金榮, 許慧, 陳飛虎 申請(qǐng)人:安徽醫(yī)科大學(xué)