專利名稱：Rna胞體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及一種可再生的RNA胞體，其包含RNA并且表達(dá)通常只在原始精母細(xì)胞中表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白VASA。這些RNA胞體還表達(dá)c-kit，但不是表達(dá)在胞體表面，而是表達(dá)在胞體內(nèi)RNA的部位。此外，這些RNA胞體不表達(dá)E-cadherin。本發(fā)明還涉及上述RNA胞體的用途,其例如可以用于促進(jìn)組織再生和傷口修復(fù)(例如通過(guò)靜脈注射的方式)，因?yàn)檫@些胞體具有進(jìn)一步分化成組織特異細(xì)胞的潛能。本發(fā)明還涉及上述RNA胞體用于制備藥物組合物的用途，以及包含上述RNA胞體的藥物組合物。
背景技術(shù)：
外傷、缺血和纖維化疾病可導(dǎo)致組織損傷。作為組織損傷的結(jié)果，不同的組織或器官，例如皮膚、肝臟和心臟會(huì)產(chǎn)生疤痕。對(duì)于皮膚上較大的疤痕，由于缺乏有效的治療方法，會(huì)給病人帶來(lái)長(zhǎng)期的心理和生理上的負(fù)擔(dān)。在心血管系統(tǒng)疾病中，急性心臟病發(fā)作可由心肌細(xì)胞缺血引起，其可能導(dǎo)致心臟組織的壞死，并且壞死的細(xì)胞會(huì)被成纖維細(xì)胞取代進(jìn)而形成疤痕。因此，尋找組織或器官損傷的再生治療方法一直是臨床上十分關(guān)注的問(wèn)題。雖然干細(xì)胞被認(rèn)為具有再生組織的巨大潛能，但一些研究結(jié)果的結(jié)論是自相矛盾的，例如在利用成人的骨髓干細(xì)胞再生心肌細(xì)胞方面。一方面，盡管已報(bào)道骨髓或血液來(lái)源的造血干細(xì)胞參與造血譜系之外的組織(例如肌肉，神經(jīng)元，肝細(xì)胞等其他組織)的發(fā)育和再生，但迄今為止，仍未明確鑒定到具有多系潛能的特定骨髓或血液來(lái)源的干細(xì)胞亞群。另外，還有報(bào)道稱，傳統(tǒng)的骨髓干細(xì)胞在體外培養(yǎng)后會(huì)喪失再生組織的能力。另一方面，雖然已報(bào)道骨髓干細(xì)胞具有自我更新的能力，例如，干細(xì)胞維持恒定的數(shù)目并同時(shí)為組織提供祖細(xì)胞，但這些干細(xì)胞的自我更新機(jī)制仍不清楚。有報(bào)道稱，干細(xì)胞通過(guò)不對(duì)稱分裂來(lái)實(shí)現(xiàn)自我更新與定向分化，然而單個(gè)細(xì)胞如何能夠分裂產(chǎn)生2種具有不同命運(yùn)的細(xì)胞是完全不清楚的。因此，目前在使用干細(xì)胞來(lái)進(jìn)行再生治療方法方面仍存在著很多問(wèn)題。本領(lǐng)域仍然迫切需要新的有效的再生治療方法。在低等生物中，原始生殖細(xì)胞(PGC)形成于特定的種質(zhì)中，該種質(zhì)是卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成分，由線粒體衍生物和電子密集體聚集而成。其中電子密集顆粒富含來(lái)自母體的RNA0該種質(zhì)在形態(tài)上與體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)不同，它表達(dá)幾種未在其它組織和細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)的特異性分子標(biāo)記。其中一種分子標(biāo)記是VASA，它是一種DEAD-box RNA結(jié)合蛋白。在斑馬魚中，生殖細(xì)胞系形成前，vasa基因的RNA發(fā)生不對(duì)稱地分離。在果蠅卵中，將后極胞質(zhì)移植入前極或移植入U(xiǎn)V照射過(guò)的后極區(qū)域仍能維持PGC的正常形成，這提示種質(zhì)RNA對(duì)于PGC的形成是必不可少的。這一點(diǎn)進(jìn)一步得到下述事實(shí)的支持沉默VASA會(huì)抑制PGC的形成和發(fā)展。果蠅vasa基因與真核細(xì)胞的起始因子4A(eIF4A)相類似。VASA有幾種功能，其中一種是與eIF5B結(jié)合，后者是必須的翻譯起始因子，誘導(dǎo)核糖體亞單位的組裝；另一種功能是在早期生殖細(xì)胞中調(diào)節(jié)mei-P26的翻譯，進(jìn)而促進(jìn)生殖細(xì)胞的進(jìn)一步分化。這些報(bào)道表明在果蠅生殖細(xì)胞的形成過(guò)程中種質(zhì)和VASA起著非常重要的作用。雖然哺乳動(dòng)物中，種質(zhì)并不是PGC的來(lái)源，但對(duì)形成胚胎非常重要，因?yàn)閷?duì)克隆羊來(lái)說(shuō)必不可少的物質(zhì)是卵母細(xì)胞的種質(zhì)和體細(xì)胞的細(xì)胞核。本發(fā)明人意外地在血液中發(fā)現(xiàn)了一種RNA胞體，其包含RNA以及與RNA結(jié)合的VASA蛋白。該RNA胞體，例如經(jīng)血液移植后，能夠促進(jìn)組織再生和傷口修復(fù)，從而為再生治療方法提供了新的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的免疫學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。 如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“RNA胞體(RNA body) ”是指，包含由膜包被的RNA的小體，其直徑一般為O. 1-1 μ m,并且具有自我更新的能力。RNA胞體不同于本領(lǐng)域所公知的真核細(xì)胞，表現(xiàn)在它們沒(méi)有典型的細(xì)胞核，細(xì)胞器及細(xì)胞膜。RNA胞體也不同于目前已知的原核細(xì)胞，表現(xiàn)在其表面沒(méi)有膜或殼等原核細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。RNA胞體的表面蛋白主要是血漿蛋白，并且蛋白層的厚度可隨著RNA胞體的分化和成熟而變薄(見(jiàn)圖11-12)。本發(fā)明的RNA胞體可從動(dòng)物例如例如哺乳動(dòng)物(包括人和小鼠)的血液和骨髓中分離獲得。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“自我更新”是指，當(dāng)在培養(yǎng)條件下或在其天然環(huán)境中時(shí)，其能夠生長(zhǎng)和擴(kuò)增，從而使個(gè)體(例如，本發(fā)明的RNA胞體)的數(shù)目不斷增加。如本文中使用的，當(dāng)提及標(biāo)記時(shí)，術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)性”是指使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(例如流式細(xì)胞術(shù)，免疫組織化學(xué)，免疫印跡等)，能夠檢測(cè)到標(biāo)記的存在，即，標(biāo)記以可檢測(cè)的水平表達(dá)。相應(yīng)地，術(shù)語(yǔ)“陰性”是指，無(wú)法檢測(cè)到標(biāo)記的存在。因此，如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“陰性”不僅包括標(biāo)記不表達(dá)，還包括標(biāo)記以極低的、無(wú)法檢測(cè)的水平表達(dá)。如本文中使用的，當(dāng)提及標(biāo)記時(shí)，術(shù)語(yǔ)“低表達(dá)”是指表達(dá)此種標(biāo)記的個(gè)體的數(shù)目小于整個(gè)群體的約30%，例如小于約20%，例如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)定的；術(shù)語(yǔ)“高表達(dá)”是指表達(dá)此種標(biāo)記的個(gè)體的數(shù)目高于整個(gè)群體的約30%，例如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)定的。一種或數(shù)種標(biāo)記的表達(dá)模式的不同可用于區(qū)分不同的群體，例如不同的細(xì)胞群體(例如干細(xì)胞與體細(xì)胞)。可用于區(qū)分細(xì)胞群體的標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于，c-kit、VASA、E-cadherin、CD13、CD29、CD90、CXCR4、CD45、CD34、Seal 和 HiLi 等等。例如，c-kit被認(rèn)為是造血干細(xì)胞的特異性標(biāo)記之一,VASA被認(rèn)為是原始生殖細(xì)胞(PGC)的特異性標(biāo)記之一，而E-cadherin則在表皮細(xì)胞,肥大細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等上特異性表達(dá)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“RNA胞體融合體”或“融合體”是指，2個(gè)或更多個(gè)RNA胞體的膜彼此融合而形成的小體。因此，本發(fā)明的融合體包含膜和內(nèi)含物，所述膜由RNA胞體的膜融合而成，所述內(nèi)含物來(lái)源于各個(gè)RNA胞體。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“RNA胞體集落”是指，包含單獨(dú)的RNA胞體以及RNA胞體的融合體的類似于集落(colony)的結(jié)構(gòu)。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“血液”包括但不限于，外周血和臍帶血，優(yōu)選臍帶血。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種分離的RNA胞體，其包含由膜包被的RNA，具有自我更新的能力，且直徑為O. 1-1 μ m。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體是c-kit陽(yáng)性的。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體是VASA陽(yáng)性的。在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體是E-cadherin陰性的。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞 體表達(dá)⑶29、⑶90、CXCR4、⑶45、CD34、Scal和HiLi中的一種或多種。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體低表達(dá)⑶29、⑶90、CXCR4、⑶45、CD34、HiLi和Scal中的一種或多種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體的特征在于，其所包含的RNA占總核酸的50%以上，即在RNA胞體中，RNA的含量高于DNA的含量，并且在RNA胞體所包含的RNA中，有至少40%是miRNA。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述miRNA包括表I所列的miRNA的一種或多種。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體的特征在于，其能夠發(fā)生聚集和融合，并形成融合體。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述融合體包含膜和內(nèi)含物，且能夠經(jīng)歷下述過(guò)程所述膜變薄，所述內(nèi)含物中的DNA增加，而RNA減少。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體的特征在于，其具有參與和/或促進(jìn)組織再生和傷口修復(fù)的能力。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織包括但不限于，上皮組織，心肌組織，神經(jīng)組織和骨組織。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體具有選自下列的一種或多種特征I)其是c-kit陽(yáng)性的；2)其是VASA陽(yáng)性的；3)其是 E-cadherin 陰性的；4)其表達(dá) CD29、CD90、CXCR4、CD45、CD34、HiLi 和 Seal 中的一種或多種；5)其所包含的RNA占總核酸的50%以上，并且在所述RNA中，有至少40%是miRNA ；6)其能夠發(fā)生聚集和融合，形成融合體；和7)其具有參與和/或促進(jìn)組織再生和傷口修復(fù)的能力。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體能夠從動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物(包括人和小鼠)的血液和骨髓獲得。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體能夠通過(guò)以下方法獲得I)提供動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的細(xì)胞，例如使用細(xì)胞裂解液裂解血液中的細(xì)胞；2)靜置至少5分鐘(例如10分鐘，15分鐘或更長(zhǎng))，然后去除裂解產(chǎn)物的上層液體部分，而保留底層沉淀部分，該底層沉淀部分包含RNA胞體集落；3)任選地洗滌底層沉淀部分，例如使用PBS進(jìn)行洗滌；4)將所述底層沉淀部分置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，RNA胞體集落釋放出RNA胞體，由此從培養(yǎng)物中獲得RNA胞體。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在上述方法的步驟4)中，使用能夠特異性結(jié)合c-kit的制劑例如C-kit抗體來(lái)從培養(yǎng)物中富集和/或分離RNA胞體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體的特征在于，其能夠針對(duì)c-kit標(biāo)記的存在而進(jìn)行富集和/或分離。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合c-kit的制劑例如c-kit抗體來(lái)富集和/或分離本發(fā)明的RNA胞體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及由上面所定義的RNA胞體融合而形成的融合體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及包含上面所定義的RNA胞體以及上面所定義的RNA胞體融合體的RNA胞體集落。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的RNA胞體集落可以通過(guò)下述方法獲得I)提供動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的細(xì)胞，例如使用細(xì)胞裂解液裂解血液中的細(xì)胞； 2)靜置至少5分鐘(例如10分鐘，15分鐘或更長(zhǎng))，然后去除裂解產(chǎn)物的上層液體部分，而保留底層沉淀部分，該底層沉淀部分包含RNA胞體集落；3)任選地洗滌底層沉淀部分，例如使用PBS進(jìn)行洗滌；4)將所述底層沉淀部分置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得RNA胞體集落。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及包含上面所定義的RNA胞體和/或上面所定義的融合體和/或上面所定義的RNA胞體集落的組合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及上面所定義的RNA胞體和/或上面所定義的融合體和/或上面所定義的RNA胞體集落和/或上面所定義的組合物用于組織再生和傷口修復(fù)的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及上面所定義的RNA胞體和/或上面所定義的融合體和/或上面所定義的RNA胞體集落和/或上面所定義的組合物用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于組織再生和傷口修復(fù)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及用于促進(jìn)組織再生和傷口修復(fù)的方法，其包括將上面所定義的RNA胞體和/或上面所定義的融合體和/或上面所定義的RNA胞體集落和/或上面所定義的組合物施用給有此需要的受試者。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，組織包括但不限于，上皮組織，心肌組織，神經(jīng)組織和骨組織。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及分離上面所定義的RNA胞體和上面所定義的RNA胞體集落的方法，其包括I)提供動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的細(xì)胞，例如使用細(xì)胞裂解液裂解血液中的細(xì)胞；2)靜置至少5分鐘(例如10分鐘，15分鐘或更長(zhǎng))，然后去除裂解產(chǎn)物的上層液體部分，而保留底層沉淀部分，該底層沉淀部分包含RNA胞體集落；3)任選地洗滌底層沉淀部分，例如使用PBS進(jìn)行洗滌；4)將所述底層沉淀部分置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，RNA胞體集落釋放出RNA胞體，由此從培養(yǎng)物中獲得RNA胞體和RNA胞體集落。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在上述方法的步驟4)中，使用能夠特異性結(jié)合c-kit的制劑例如c-kit抗體來(lái)從培養(yǎng)物中富集和/或分離RNA胞體。如上文所描述的，可以通過(guò)靜置并獲取沉淀(即，通過(guò)重力沉降)來(lái)獲得本發(fā)明的RNA胞體和RNA胞體集落。因此，類似地，還可以使用其他沉降方式，例如離心(例如超速離心和梯度離心)等方式來(lái)獲得本發(fā)明的RNA胞體和RNA胞體集落。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及富集上面所定義的RNA胞體的方法，其包括使用能夠特異性結(jié)合c-kit的制劑例如c-kit抗體,就c-kit標(biāo)記的存在進(jìn)行富集。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及使用上文所述的方法獲得的RNA胞體和RNA胞體集落。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得顯然。


圖I展示了從血液中分離得到的RNA胞體的c-kit和VASA表達(dá)情況，如使用免疫熒光染色法所測(cè)定的。從圖中可以看出，表達(dá)c-kit的顆粒也表達(dá)VASA，c-kit和VASA這兩種標(biāo)記共定位。這表明本發(fā)明的RNA胞體同時(shí)表達(dá)c-kit和VASA這兩種標(biāo)記。標(biāo)尺為5 μ m0圖2展示了 RNA胞體的VASA表達(dá)情況以及其所包含的核物質(zhì)，其中圖2B為圖2A的局部放大圖(圖2A放大倍數(shù)為2000x，圖2B放大倍數(shù)為4000x)。從圖中可以看出，表達(dá)VASA的顆粒(即，RNA胞體)聚集在一起，具有相對(duì)較微弱的DAPI染色，然而DNA染色并不與VASA染色共定位。這表明，本發(fā)明的RNA胞體所含的核物質(zhì)主要是RNA，而DNA含量很低。此外，圖2顯示，RNA胞體可以以聚集的形式存在。標(biāo)尺為5 μ m。圖3展示了 RNA胞體中的核物質(zhì)的分析結(jié)果，總RNA分析表明RNA胞體中包含大量的miRNA (超過(guò)50% )及小RNA，但是不含核糖體RNA。圖4展示了 RNA胞體的兩種典型的類型第一種類型(圖4A，標(biāo)尺為IOOnm)包含由于致密性不同而可區(qū)分的中心區(qū)域和外層區(qū)域，并且中心區(qū)域相對(duì)于外層區(qū)域而言，較不致密；第二種類型(圖4B，標(biāo)尺為IOOnm)的中心區(qū)域和外層區(qū)域的區(qū)別較不明顯，二者
的致密性基本一致。圖5A顯示了從血液新鮮分離的RNA胞體培養(yǎng)物中RNA胞體集落的形態(tài)；圖5B為標(biāo)準(zhǔn)干細(xì)胞集落，圖5A和5B均為40 X物鏡下的觀察結(jié)果。圖6顯示了在透射電鏡下(4000 X)觀察到的RNA胞體集落。從圖中可以看出，該RNA胞體集落的外圍中不僅包含單獨(dú)的、未發(fā)生融合的RNA胞體，而且包含RNA胞體的融合體(如箭頭所示)。標(biāo)尺為O. 5 μ m。圖7進(jìn)一步顯示RNA胞體集落中的典型的RNA胞體的融合體(如箭頭1_3所示)。這些融合體的體積遠(yuǎn)大于單個(gè)的RNA胞體。標(biāo)尺為2 μ m。圖8顯示了圖7的箭頭1-3所指示的融合體的詳細(xì)形態(tài)學(xué)特征(分別對(duì)應(yīng)于圖8A-8C)。特別地，圖8A展示了圖7中箭頭I所指示的融合體，該融合體具有致密的外層區(qū)域和中心區(qū)域，然而二者的界限并不明顯(標(biāo)尺為200nm);圖SB展示了箭頭2所指示的融合體，該融合體具有致密的外層區(qū)域和中心區(qū)域，并且二者的界限較為明顯，外層區(qū)域比中心區(qū)域更致密(標(biāo)尺為IOOnm);圖SC展示了箭頭3所指示的融合體，該融合體也具有外層區(qū)域和中心區(qū)域，并且在中心區(qū)域還具有環(huán)形結(jié)構(gòu)(標(biāo)尺為lOOnm)。從圖8可以看出，這些融合體可能是由不同類型的RNA胞體融合而成的。不同類型的RNA胞體所形成的融合體的形態(tài)也不相同。圖9展示了由第一種類型的RNA胞體融合形成的RNA胞體融合體。融合后，RNA胞體的外層區(qū)域融合形成最終的外膜，中心區(qū)域物質(zhì)經(jīng)歷降解和重排，標(biāo)尺為200nm。圖10展示了由第二種類型的RNA胞體融合形成的RNA胞體融合體。標(biāo)尺為O. 5 μ m0圖11和12分別展示了由第一或第二種類型的RNA胞體形成的融合體的成熟過(guò)程融合體的外膜由RNA胞體的外膜互相融合形成，并且在成熟過(guò)程中逐漸變??；中心區(qū)域(核物質(zhì))則經(jīng)歷了降解和重排的過(guò)程，并且進(jìn)一步聚集形成致密顆粒，這些顆粒主要出現(xiàn)在外膜的內(nèi)側(cè)部位。在圖11中，圖A和D的標(biāo)尺為O. 5μπι，圖B和C的標(biāo)尺為O. 2μπι。在 圖12中，圖A的標(biāo)尺為lOOnm，圖B的標(biāo)尺為O. 5 μ m，圖C的標(biāo)尺為O. 2 μ m。圖13展示了典型的成熟的融合體，其厚厚的外膜層不復(fù)存在，代之以很薄的外膜，并且中心區(qū)經(jīng)歷了降解和重排，核物質(zhì)顆粒進(jìn)一步增加，并且主要分布在靠近膜內(nèi)側(cè)的區(qū)域。標(biāo)尺為O. 2 μ m。圖14A展示了成熟的融合體的免疫熒光染色結(jié)果；圖14B展示了成熟的融合體的電鏡觀察結(jié)果。從圖14A可以看出，在成熟的融合體中，DNA含量顯著增加，其主要分布在外膜內(nèi)側(cè)處，并且在融合體中心區(qū)域形成一個(gè)核樣結(jié)構(gòu)，整個(gè)結(jié)構(gòu)與電鏡下觀察到的成熟融合體的結(jié)構(gòu)(圖14B，箭頭所示為核樣結(jié)構(gòu))非常一致。圖14A的標(biāo)尺為5 μ m，圖14B的標(biāo)尺為O. 2 μ m。圖15顯示了創(chuàng)傷后3天傷口處的情況，其中顯示，在創(chuàng)傷后3天，攜帶VASA標(biāo)記和GFP標(biāo)記的RNA胞體就已經(jīng)轉(zhuǎn)移并聚集到傷口處，再生為真皮和表皮組織。圖15A-15C分別展示了創(chuàng)傷后3天觀察到的VASA(N) (A) ,GFP(B)和DAPI (C)的染色結(jié)果。圖IOT為圖15A-15C合并后的圖像，其顯示攜帶VASA標(biāo)記和GFP標(biāo)記的RNA胞體位于未愈的表皮層。圖15E是圖15C中方框區(qū)域的放大圖像。圖MD的標(biāo)尺為50 μ m，圖15E的標(biāo)尺為20 μ m。圖16顯示了創(chuàng)傷后5天傷口處的情況，其中顯示，攜帶GFP標(biāo)記的RNA胞體分布于皮膚毛囊的外圍(箭頭所示)以及毛囊的基質(zhì)區(qū)域。在創(chuàng)傷后5天，在熒光顯微鏡下利用抗GFP抗體檢測(cè)GFP的表達(dá)，并利用DAPI染色檢測(cè)核物質(zhì)。在低放大倍數(shù)下(上排圖)可以觀察到，GFP陽(yáng)性細(xì)胞分布于平滑肌的上方和損傷上皮組織的下方(箭頭所示)。在共聚焦顯微鏡下(下排圖)可以觀察到，GFP陽(yáng)性細(xì)胞位于毛囊的外圍和毛囊基質(zhì)區(qū)域(箭頭所示)。在圖16中，上排圖的標(biāo)尺為200 μ m,下排圖的標(biāo)尺為50 μ m。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)參照下列意在舉例說(shuō)明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照本領(lǐng)域通常已知的常規(guī)條件(參見(jiàn)例如照J(rèn). Sambrook等人，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，以及F. M. Ausubel等人，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，第3版，John Wiley & Sons, Inc. , 1995)或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。一般方法
I.流式細(xì)胞術(shù)(FACS)用PBS洗滌獲得的RNA胞體，并用I %正常馬血清(NHS)封閉I小時(shí)；然后在含1%NHS的PBS中用I : 50或I : 100稀釋的抗體(一抗)孵育RNA胞體30min ;然后用含I %NHS的PBS進(jìn)行洗滌，并用FITC或PE偶聯(lián)的二抗在4°C孵育30min。在進(jìn)一步用PBS洗滌后，利用流式細(xì)胞儀例如Vantage SE或者DiVa Vantoo FACS進(jìn)行分析。流式細(xì)胞數(shù)據(jù)可通過(guò)CellQuest (BD公司)軟件獲得并可用FlowJo軟件進(jìn)行分析。2.免疫熒光染色RNA胞體的免疫熒光染色培養(yǎng)的RNA胞體經(jīng)過(guò)固定、洗滌、封閉后，與以I : 50-1 200稀釋的抗體(一抗)在4°C孵育過(guò)夜。孵育后，進(jìn)行洗滌，然后將RNA胞體與熒光標(biāo)記偶聯(lián)的二抗反應(yīng)I小 時(shí)。洗滌后，RNA胞體用DAPI復(fù)染，然后用共聚焦顯微鏡或標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。組織的免疫熒光染色收集創(chuàng)傷后1-7天的小鼠的傷口組織，進(jìn)行固定，并包埋于OCT復(fù)合物中以做成冰凍切片。封閉切片，然后將切片與以I : 100稀釋的抗體(一抗)在4°C反應(yīng)過(guò)夜。洗滌后，切片用DAPI復(fù)染，并用共聚集顯微鏡或標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。所有對(duì)照組不用一抗處理。獲得的圖像用Volocity軟件進(jìn)行分析。3.電子顯微鏡觀察RNA胞體用2%的戊二醛和4%的多聚甲醛在pH7. 3的二甲砷酸鈉緩沖液中在室溫下固定30min。在用二甲砷酸鈉緩沖液洗滌后，向RNA胞體加入冰上預(yù)冷的、1%的四氧化鋨，并在4°C輕搖2小時(shí)。在用水洗滌后，向RNA胞體加入I %乙酸鈾酰，孵育過(guò)夜。然后，RNA胞體用系列稀釋的乙醇脫水，并包埋于環(huán)氧樹(shù)脂Epon中。然后，進(jìn)行超薄切片，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛二次染色，并在電鏡下進(jìn)行觀察。實(shí)施例I. RNA胞體的分離和培養(yǎng)在本實(shí)施例中，示例性說(shuō)明了 RNA胞體的分離和培養(yǎng)。取Balb/c小鼠的血液，加入紅細(xì)胞裂解液(155mM NH4Cl, IOmMKHCO3和O. ImMEDTA)孵育15min，血液與紅細(xì)胞裂解液的體積比為約I : 10。孵育后，將裂解產(chǎn)物的上層液體部分移入新容器內(nèi)，并且裂解產(chǎn)物的底層沉淀部分用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗2遍(SP，加入PBS，靜置2-3min，然后小心地吸去上層液體部分)。將得到的底層沉淀部分置于培養(yǎng)基(I : I的DMEM/F12培養(yǎng)基(購(gòu)自Invitrogen公司)，補(bǔ)充有20%的胎牛血清)中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2，每2-3天更換培養(yǎng)基一次。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，即可獲得RNA胞體。當(dāng)RNA胞體達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)，用胰酶進(jìn)行消化，并進(jìn)行傳代。由于RNA胞體在表面特異性表達(dá)標(biāo)記c-kit (即，其是c-kit陽(yáng)性的)，因此，可以使用本領(lǐng)域公知的分選技術(shù)，就c-kit標(biāo)記的存在進(jìn)一步富集和分離RNA胞體。例如,可以使用流式細(xì)胞術(shù)或磁珠分離技術(shù)，就c-kit標(biāo)記的存在進(jìn)一步富集和分離RNA胞體。在本實(shí)施例中，示例性地通過(guò)磁珠分離技術(shù)進(jìn)一步富集和分離RNA胞體。磁珠分離方法參照生產(chǎn)商(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)的說(shuō)明書進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將上述得到的底部沉淀部分用封閉液封閉，然后與抗c-kit抗體(Santa Cruzbiotechnology,CA)孵育 30min,接著與抗兔 IgG 偶聯(lián)的磁珠(Miltenyi Biotech,Auburn,CA)在4°C孵育30min。然后，利用磁場(chǎng)分離磁珠并用PBS清洗磁珠三次。最后，用洗脫液將RNA胞體從磁珠上洗脫。分離效率可以進(jìn)一步通過(guò)熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)(FACS)來(lái)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，通過(guò)磁珠分離技術(shù)，可有效分離和富集表達(dá)c-kit的RNA胞體(參見(jiàn)圖I)。實(shí)施例2. RNA胞體表達(dá)的標(biāo)記如實(shí)施例I所述，用抗c-kit抗體分離和富集RNA胞體。培養(yǎng)一周后，使用上文描述的免疫熒光染色法檢查RNA胞體中c-kit和VASA的表達(dá)情況。免疫熒光染色的結(jié)果參見(jiàn)圖I。從圖I中可以看出，表達(dá)c-kit的顆粒也表達(dá)VASA, c_kit和VASA這兩種標(biāo)記共定位。這表明本發(fā)明的RNA胞體同時(shí)表達(dá)c-kit和VASA這兩種標(biāo)記。進(jìn)一步，通過(guò)DAPI染色和DNA染色檢查RNA胞體的核物質(zhì)(參見(jiàn)圖2A和圖2B)。結(jié)果顯示，表達(dá)VASA的顆粒(即，RNA胞體)具有微弱的DAPI染色，然而DNA染色并不與VASA染色共定位。這表明，本發(fā)明的RNA胞體所含的核物質(zhì)主要是RNA，而DNA含量很低。
此外，從圖I和2可以看出，表達(dá)VASA的顆?？梢砸跃奂男问酱嬖冢@表明本發(fā)明的RNA胞體在培養(yǎng)條件下能夠發(fā)生聚集。還使用FACS檢測(cè)了本發(fā)明的RNA胞體所表達(dá)的其他標(biāo)記。結(jié)果顯示，本發(fā)明的RNA 胞體不表達(dá) E-cadherin，并且低表達(dá) CD29、CD90、CXCR4、CD45、CD34、Scal 和 HiLi (另一種由原始生殖細(xì)胞表達(dá)的特異蛋白)。實(shí)施例3. RNA胞體的核物質(zhì)為進(jìn)一步表征本發(fā)明的RNA胞體，收集培養(yǎng)擴(kuò)增后的RNA胞體并用Trizol方法提取總RNA,然后根據(jù)制造商的說(shuō)明書,進(jìn)一步使用Bioanalyzer (Agilent Technology)對(duì)RNA的成分進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,本發(fā)明的c-kit陽(yáng)性的RNA胞體中包含大量的miRNA (超過(guò)50% )(參見(jiàn)圖3)。這與實(shí)施例2的免疫熒光染色結(jié)果相一致RNA胞體所含的核物質(zhì)主要是RNA。進(jìn)一步,根據(jù)制造商的說(shuō)明書,使用micro-RNA芯片(Affymetrix, CA)對(duì)RNA胞體所包含的miRNA進(jìn)行分析。結(jié)果表明，RNA胞體所包含的miRNA的序列與人和小鼠的miRNA序列相匹配(參見(jiàn)表I)。表I :RNA胞體所包含的miRNAI miRNA-人miRNA-小鼠
權(quán)利要求
1.分離的RNA胞體，其包含由膜包被的RNA，具有自我更新的能力，且直徑為O.I-Iym0
2.權(quán)利要求I的RNA胞體，其是c-kit陽(yáng)性的。
3.權(quán)利要求I或2的RNA胞體，其是VASA陽(yáng)性的。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的RNA胞體,其是E-cadherin陰性的。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的RNA胞體，其表達(dá)⑶29、⑶90、CXCR4、⑶45、⑶34、HiLi和Scal中的一種或多種。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的RNA胞體，其所包含的RNA占總核酸的50%以上，并且在所述RNA中，有至少40 %是miRNA。
7.權(quán)利要求6的RNA胞體，其中所述miRNA包括表I所列的miRNA的一種或多種。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的RNA胞體，其能夠發(fā)生聚集和融合，形成融合體。
9.權(quán)利要求8的RNA胞體，其中所述融合體包含膜和內(nèi)含物，且能夠經(jīng)歷下述過(guò)程所述膜變薄，所述內(nèi)含物中的DNA增加，而RNA減少。
10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的RNA胞體，其具有參與和/或促進(jìn)組織再生和傷口修復(fù)的能力。
11.權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的RNA胞體，其能夠從動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物(包括人和小鼠)的血液和骨髓獲得。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的RNA胞體，其能夠通過(guò)以下方法獲得 1)提供動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的細(xì)胞，例如使用細(xì)胞裂解液裂解血液中的細(xì)胞； 2)靜置至少5分鐘(例如10分鐘，15分鐘或更長(zhǎng))，然后去除裂解產(chǎn)物的上層液體部分，而保留底層沉淀部分，該底層沉淀部分包含RNA胞體集落； 3)任選地洗滌底層沉淀部分，例如使用PBS進(jìn)行洗滌； 4)將所述底層沉淀部分置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，RNA胞體集落釋放出RNA胞體，由此從培養(yǎng)物中獲得RNA胞體。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的RNA胞體，其能夠針對(duì)c-kit標(biāo)記的存在而進(jìn)行富集和/或分離， 例如，可以通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合c-kit的制劑例如c-kit抗體來(lái)富集和/或分離所述RNA胞體。
14.由權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的RNA胞體融合而形成的融合體。
15.包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的RNA胞體以及權(quán)利要求14的融合體的RNA胞體集落，其例如可以通過(guò)下述方法獲得 1)提供動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的細(xì)胞，例如使用細(xì)胞裂解液裂解血液中的細(xì)胞； 2)靜置至少5分鐘(例如10分鐘，15分鐘或更長(zhǎng))，然后去除裂解產(chǎn)物的上層液體部分，而保留底層沉淀部分，該底層沉淀部分包含RNA胞體集落； 3)任選地洗滌底層沉淀部分，例如使用PBS進(jìn)行洗滌； 4)將所述底層沉淀部分置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得RNA胞體集落。
16.包含權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的RNA胞體和/或權(quán)利要求14的融合體和/或權(quán)利要求15的RNA胞體集落的組合物。
17.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的RNA胞體和/或權(quán)利要求14的融合體和/或權(quán)利要求15的RNA胞體集落和/或權(quán)利要求16的組合物用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合物用于組織再生和傷口修復(fù)。
18.分離權(quán)利要求I的RNA胞體和權(quán)利要求15的RNA胞體集落的方法，其包括 1)提供動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，例如人和小鼠)的血液并裂解血液中的細(xì)胞，例如使用細(xì)胞裂解液裂解血液中的細(xì)胞； 2)靜置至少5分鐘(例如10分鐘，15分鐘或更長(zhǎng))，然后去除裂解產(chǎn)物的上層液體部分，而保留底層沉淀部分，該底層沉淀部分包含RNA胞體集落； 3)任選地洗滌底層沉淀部分，例如使用PBS進(jìn)行洗滌； 4)將所述底層沉淀部分置于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，RNA胞體集落釋放出RNA胞體，由此從培養(yǎng)物中獲得RNA胞體和RNA胞體集落。
19.權(quán)利要求18的方法，其中在步驟4)中，使用能夠特異性結(jié)合c-kit的制劑例如c-kit抗體來(lái)從培養(yǎng)物中富集和/或分離RNA胞體。
20.富集權(quán)利要求I的RNA胞體的方法，其包括使用能夠特異性結(jié)合c-kit的制劑例如c-kit抗體,就c-kit標(biāo)記的存在進(jìn)行富集。
21.通過(guò)權(quán)利要求18的方法獲得的RNA胞體和RNA胞體集落。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可再生的RNA胞體，其包含RNA并且表達(dá)通常只在原始精母細(xì)胞中表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白VASA。這些RNA胞體還表達(dá)c-kit，但不是表達(dá)在胞體表面，而是表達(dá)在胞體內(nèi)RNA的部位。此外，這些RNA胞體不表達(dá)E-cadherin。本發(fā)明還涉及上述RNA胞體的用途，其例如可以用于促進(jìn)組織再生和傷口修復(fù)(例如通過(guò)靜脈注射的方式)，因?yàn)檫@些胞體具有進(jìn)一步分化成組織特異細(xì)胞的潛能。本發(fā)明還涉及上述RNA胞體用于制備藥物組合物的用途，以及包含上述RNA胞體的藥物組合物。
文檔編號(hào)A61P17/02GK102876666SQ201110197680
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者孔五一 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古弘泰醫(yī)學(xué)科技有限公司