專利名稱：肝癌特異性基因-病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥的祀向基因-病毒治療(Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy,CTGVT)，特別涉及肝癌靶向基因-病毒治療(CTGVT-LC)，具體涉及肝癌特異性基因-病毒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1999-2001年，劉新垣創(chuàng)建了一種癌癥治療策略，叫癌癥的靶向基因-病毒治療(Cancer Targeting Gene-Viro-Thearpy, CTGVT),它是將抗癌基因插入到溶瘤病毒(oncolytic virus, 0V)而成，故 CTGVT 策略即 OV-(gene)策略或 Gene Armed OncolyticVirus Therapy(GAOVT)策略，它也是OV-(gene)，它把基因治療和溶瘤病毒治療各自的優(yōu)勢結(jié)合起來了，因?yàn)槿芰霾《颈旧砭陀锌拱┳饔?，又可能特異性地在癌?xì)胞中復(fù)制數(shù)百倍，插入其中的抗癌基因也可隨之復(fù)制數(shù)百倍，故其抗癌效果大大地增加，既比相應(yīng)單獨(dú)基因治療好很多，也比相應(yīng)單獨(dú)溶瘤病毒治療好很多，故現(xiàn)在成為國際熱點(diǎn)課題?；蛑委煟m然2009年被Science評為全球十大科學(xué)成果之一，但那都是對單基因缺乏的遺傳病所獲得的成果，對癌癥這樣復(fù)雜的基因突變疾病，基因治療的抗癌效果，遠(yuǎn)不如CTGVT (GAOVT)的抗癌效果，基因治療為Ad-(gene)，其中所用的載體Ad無靶向性，無復(fù)制能力(即非復(fù)制型Ad)。在CTGVT，即OV-(gene))的構(gòu)建和應(yīng)用中，OV(Oncolytic Virus)主要決定其靶向性，可用各式各樣的方法加以修飾，使它只特異性靶向肝癌或其它癌癥。Gene主要決定殺傷性，光OV的殺傷作用不強(qiáng)，故需加殺傷基因增強(qiáng)其殺傷性，故需構(gòu)成OV-(gene)，即CTGVT (GAOVT)才能構(gòu)成很強(qiáng)的抗癌藥物，對CTGVT還可作更多改進(jìn)，如將兩個CTGVT合用，其抗癌作用更強(qiáng)，如專門靶向癌癥干細(xì)胞，則有根除癌癥，有徹底消滅癌癥的可能性。溶瘤病毒(Oncolytic Virus，0V)，是指在腫瘤中特異表達(dá)和感染復(fù)制的病毒，有癌細(xì)胞靶向性，還能復(fù)制，但非肝癌特異性。任何病毒(Adenovirus (腺病毒)，SimplexHerpes Virus (HSV-1)(皰疹病毒)，Pox Virus (痘苗病毒))經(jīng)改造后均可構(gòu)成為OV。溶瘤病毒攜帶gene則變成0V-gene,但Ad-gene即基因治療(其中Ad無祀向性,無復(fù)制倍增能力)。圖I為腺病毒(Adenovirus, Ad)基因組圖，簡稱Ad基因組圖。腺病毒有早期基因E1、E2、E3、E4及晚期基因LI、L2、L3、L4、L5?？刂屏嗽缙诨虻谋磉_(dá)，就控制了整個Ad的復(fù)制和感染。其中早期基因El又分為E1A、E1B，最重要的是E1A，其次是E1B，E1A的天然啟動子被肝癌特異性的啟動子替換，則此腺病毒只能在肝癌細(xì)胞中感染復(fù)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肝癌特異性基因-病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案將Ad ElA中，用肝癌特異甲胎蛋白啟動子(a -Feto pertein, AFP)等取代其天然啟動子，即Ad .enAFP *E1A，控制腺病毒(Adenovirus，Ad)的表達(dá)，則此Ad AFP ElA只能在肝癌中感染復(fù)制，最后將肝癌消滅。本方法是用AFP啟動子替換ElA本身的天然啟動子，則此腺病毒變成了肝癌特異性溶瘤腺病毒，可簡寫為(LC) -OncoAd,構(gòu)建Ad* AFP* ElA是本專利的根本要求，此外，ElA中的24bp也可刪除，在ElB有兩個基因，S卩19KD及55KD，或者缺失55KD，或者19KD及55KD雙缺失均可，則構(gòu)成A ElB, A為刪除之意，即ElB全部被刪了。只要根本要求Ad AFP ElA存在就行，我們所用AFP都為enAFP (即AFP用SV40的增強(qiáng)子強(qiáng)化(enhance)其啟動子能力，寫成enAFP)(當(dāng)然AFP也可換成其它肝癌特異性啟動子)。要構(gòu)成CTGVT-LC，當(dāng)然首先還要在(LC)OncoAd然后在其中加上肝癌特異性的抗癌基因(包括抑癌基因)。至于基因方面，對肝癌來說，或者加入肝癌特異性抗癌基因，包括肝癌特異性抑癌基因，如 S0CS3、HCCS-I、TSLC-I，構(gòu)成 Ad enAFP ElA …E1B_(S0CS_3)。如上述Ad enAFP ElA…E1B_(S0CS_3)的抗癌能力還不夠強(qiáng)，則可在上述同樣(LC)OncoAd中加上抗癌作用很強(qiáng)的但非肝癌特異性抗癌基因，如IL-24、MnS0D、TRAIL等等與之合用，即 Ad enAFP ElA ⑴ E1B_(S0CS_3)與 Ad enAFP ElA ⑴ E1B-(IL_24)共同使用于肝癌治療。此夕卜，還發(fā)現(xiàn)Ad enAFP ElA AElB-(IL-24)，也算 CTGVT-LC，這是因?yàn)?AElB與IL-24合用可能特異地全部消滅小鼠移植性肝癌，還可對未經(jīng)瘤內(nèi)注射的遠(yuǎn)端移植性肝癌也起到治療作用，抗肝癌率達(dá)80%以上。本發(fā)明的肝癌特異性基因-病毒，將抗癌基因插入到溶瘤病毒而制成，所述溶瘤病毒為溶瘤腺病毒，在一優(yōu)選例中，ElA的天然啟動子被肝癌特異性啟動子所取代(如肝癌特異甲胎蛋白啟動子)。根據(jù)本發(fā)明，所抗癌基因選自S0CS3、HCCS-U TSLC-I等肝癌特異性抗癌能力很強(qiáng)的基因，如其抗癌能力還不夠強(qiáng)，可用抗癌能力特別強(qiáng)的基因加入相同的(LC)OncoAd載體中與之共同使用，如 IL-24、MnSOD、CD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase 3、Bax或TRAIL,如上述任何兩個基因共同使用時,也可采用聯(lián)接子(linker)將兩個基因聯(lián)接起來，成為一個基因使用，如TRAIL-linker-IL-24。本發(fā)明除ElA需 被AFP等肝癌特異性啟動子所調(diào)控表達(dá)外，ElA及ElB均可進(jìn)行各種改造，構(gòu)成OV的雙調(diào)控或三調(diào)控載體，雖然不改變其肝癌特異性靶向，但可增強(qiáng)其癌癥靶向性和安全性(不過表達(dá)率可能有所降低)，如將ElB中55KD缺失則成為ElB ( A 55)，A表示缺失之意，如將ElB中的兩個基因19KD及55KD全部缺失，則構(gòu)成AE1B，ElA的24bp也可缺失構(gòu)成ElB (A 24)，它靶向Rb缺失的腫瘤，可加強(qiáng)靶向Rb缺失的癌癥，ElB也可被HIF(低氧誘導(dǎo)因子)，特異性決定于ElA被AFP控制其在肝癌中表達(dá)。


圖I為腺病毒基因組圖。圖2為實(shí)施例I涉及的基因組圖。圖3為實(shí)施例2涉及的基因組圖。圖4為實(shí)施例3涉及的基因組圖。圖5A為pAd-ElA(ANat.p)_AElB構(gòu)建過程示意圖，圖5B為Ad. enAFP-ElA-A ElB-(IL-24)構(gòu)建過程示意圖。圖6為實(shí)施例4的體外抗癌效果圖。圖7為實(shí)施例5體內(nèi)抗癌效果圖。圖8為實(shí)施例6體外抗癌效果圖，其中QSG-7701為肝正常細(xì)胞，H印G2、H印3B、Huh-7為肝癌細(xì)胞。圖9為實(shí)施例7體內(nèi)抗癌效果圖。
具體實(shí)施方案
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癌癥的革巴向基因-病毒治療(CancerTargeting Gene-Viro-Therapy, CTGVT)是將抗癌基因加到溶瘤腺病毒中，即OV-gene，本申請的發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)只用溶瘤腺病毒(Oncolytic Adenovirus,簡寫OncoAd),因其有癌癥祀向性,但非肝癌特異的革巴向性，要構(gòu)建肝癌特異性的革巴向基因-病毒(Liver Cancer Specific CTGVT,簡稱CTGVT-LC)，則需要將肝癌特異性的抗癌基因(LC)-gene加到肝癌特異性的溶瘤腺病毒中(LC OncoAd),構(gòu)成(LC) OncoAd-(LC)-gene。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。肝癌特異性基因-病毒及其構(gòu)建方法在本申請中，(LC) OncoAd是將Ad ElA的天然啟動子換成肝癌特異性啟動子AFPJP Ad AFP E1A，至于對Ad ElB如何改造無嚴(yán)格要求，其啟動子可換成HIF (低氧誘導(dǎo)因子)，或刪除其中55KD(Ad ElB (A 55)) (A為刪除符號)或?qū)lB中19KD與55KD兩個基因全部刪除，則等于刪除了全部ElB (即A ElB)，這就是Ad* AFP* ElA* AE1B，在LC OncoAd構(gòu)建中，Ad ElA是關(guān)鍵性的。LC-gene則宜選用肝癌特異性抗癌基因如HCCS1、S0CS3、TSLC_1等，其總的結(jié)果為Ad AFP ElA E1B(A55)-(S0CS3)等，如抗癌還不理想，可選用抗癌作用較強(qiáng)的IL-24、TRAIL，構(gòu)成 Ad AFP ElA ElB ( A 55) -(IL-24)，與上述帶 S0CS3 的 CTGVT-LC 共用，也叫CTGVT-LC。其中 S0CS3 與 IL-24 兩基因也可用聯(lián)接子(Linker)連成(S0CS3-Linker-IL_24)作為一個基因加入(LC) OncoAd 中，則成為 Ad AFP ElA ElB (S0CS3-Linker-IL-24)。本發(fā)明構(gòu)建的Ad AFP ElA A ElB-(IL-24)，雖只單獨(dú)使用普通的抗癌基因，而未使用肝癌特異性抗癌基因，但是它由于使用了 AElB及IL-24，特異性抗肝癌效果極好，可全部消滅肝癌，故也能作為CTGVT-LC。此外，Ad AFP ElA E1B( A55)-(S0CS3)中，加上 microRNA 或 RNAi 與之聯(lián)用，構(gòu)成Ad (microRNA) AFP ElA ElB ( A 55) - (S0CS3)，也會大大提高其抗癌效果。Ad ElA中的ElA的天然啟動子用肝癌特異性啟動子如AFP所替換等，即Ad AFP E1A，這也是一種溶瘤腺病毒，但能特異性地在肝癌中表達(dá)并感染復(fù)制，Ad .AFP .ElA中的ElA可改為ElA ( A 24)，A為刪除符號，即從Ad的923-946間的24bp刪除掉，即Ad .AFP *E1A ( A 24)，它靶向Rb缺乏的腫瘤，但非肝癌特異性。Ad .AFP .ElA .ElB中的ElB可改為ElB ( A 55)，即ElB中55KD蛋白質(zhì)的基因也被刪除了，ElB也可改為A ElB (即ElB中的55KD及19KD兩個蛋白質(zhì)基因全部刪除了)，則為Ad -AFP -ElA AElB JnElB的天然啟動子，也可改HIF (低氧誘導(dǎo)因子)，則為Ad AFP ElA HIF ElB,上述其它(指除AFP -ElA外)這些構(gòu)建都可使之更靶向癌細(xì)胞，但均無肝癌特異性。綜上所述，ElB可任意改造，獲得Ad AFP ElA M ElB ( M ElB表示ElB可任意改造)。
在Ad AFP ElA ^ ElB中加入肝癌特異性抗癌基因，如S0CS3、HCCS-UTSLC-I 等，構(gòu)成如 Ad AFP ElA ElB ( A 55) (S0CS3)，S0CS3 在括號內(nèi)表示為 S0CS3的表達(dá)框，如Ad AFP ElA ElB ( A 55) (S0CS3)的抗癌作用還不夠強(qiáng)，則可構(gòu)建Ad AFP ElA ElB ( A 55) (TRAIL)與之共用，可大大加強(qiáng)其抗肝癌的功能，即一個抗癌作用很強(qiáng)的普通抗癌基因構(gòu)成的重組子與上述CTGVT-LC合用，上面所用TRAIL也可改用IL-24、MnSOD, CD、Smac, GM-CSF, IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase 3、Bax 等。以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1CTGVT-LC 具體構(gòu)建方法 I Ad enAFP ElA D55_(gene)的構(gòu)建I.如圖2所示，Ad5 (ffT)為野牛型(即正常)腺病毒5(Wild Type)腺病毒(Adenovirus, Ad，現(xiàn)在所用Ad大都為5型，故5字不特別標(biāo)出)，其中ElA及ElB均正常，未經(jīng)任何改造，市場有賣，本課題組有儲備； 2. ZD55 為溶瘤病毒(Oncolytic Adenovirus, OncoAd),其 ElB 區(qū)的 55K 蛋白質(zhì)的基因被刪除(deletion 55K或稱A 55K, D55)，Z為研究者的姓Zou,為一種0V,即能靶向癌細(xì)胞，并最后把它溶解掉，但無肝癌特異性，ZD55的構(gòu)建為本實(shí)驗(yàn)室專利(ZL 02157662.9及ZL 200510026151. 5)，已經(jīng)介紹得清清楚楚了，不用多敘述；3. ZD55~(gene)(即 Ad ElA ElB ( A 55) - (gene))ZD55為OncoAd載體，其中有限制酶切點(diǎn)Bgl II。(gene):括號中的gene，代表基因表達(dá)框，它的兩端也有Bgl II切點(diǎn)，用此基因表達(dá)框Bgl II位點(diǎn)插入到ZD55的Bgl II切點(diǎn)中，則構(gòu)成ZD55- (gene)，括號內(nèi)加基因，代表一個基因的表達(dá)框。每一個基因表達(dá)框，均含三個元件(I)啟動子(promoter)，其作用為啟動子基因表達(dá)出蛋白質(zhì)，本專利使用的CMV啟動子,無專利,大家都可用，沒有promoter,基因不會表達(dá)；(2)基因(gene)，任何基因均可；(3)終止訊號，即polyA訊號，體內(nèi)有很多蛋白質(zhì)要表達(dá)，但不能連成一片，而是一個一個蛋白質(zhì)要分開表達(dá)，才能構(gòu)成生命，這就要在基因表達(dá)
終止密碼子UGA、UAA或UAG之后，加polyA終止訊號順序，在翻譯時生成以AAAAA......為
主的順序，這樣基因的表達(dá)才算告一個段落，由polyA訊號指導(dǎo)完成這個AAAA......加入
的步驟。4. Ad enAFP ElA D55~(gene) D55 即 ElB 中刪除 55KD 蛋白基因，即ElB ( A 55) (A代表刪除ElB中的55KD基因之意)，與ZD55意義同，ZD55_(gene)已是CTGVT 了，但為加強(qiáng)其肝癌特異性，故在Ad ElA ElB ( A 55) - (gene)的ElA之前的XhoI-SnaBI酶切位點(diǎn)與帶有同樣XhoI-SnaBI位點(diǎn)的肝癌特異性啟動子enAFP結(jié)合，構(gòu)成Ad enAFP ElA D55_(gene)，即其只靶向肝癌而不或極少靶向其它癌細(xì)胞，即CTGVT-LC。Ad enAFP ElA D55- (gene)中的gene,若為肝癌特異性的抗癌基因，則構(gòu)成 Ad enAFP ElA ElB ( A 55) - (S0CS-3)，在 ElB ( A 55)后面有一個 Bgl II 切點(diǎn)，而(S0CS-3)表達(dá)的5’和3’兩端也有Bgl II切點(diǎn)，利用(S0CS-3)的Bgl II切點(diǎn)裝入Ad enAFP ElA D55 的 Bgl II 位點(diǎn)，則得到 Ad enAFP ElA D55_(S0CS_3)。實(shí)施例2 =CTGVT-LC具體構(gòu)建方法2如上述Ad MnAFP ElA ^dSS-(SOCS-S),—個抗癌基因效果還不佳，可加一個抗癌作用特別強(qiáng)的，但非組織特異性的抗癌基因，如TRAIL加到上述同一個(LC)OncoAd中，而構(gòu)成Ad .enAFP *E1A .DSS-(TRAIl),其方法是TRAIL表達(dá)框(兩端均帶Bgl II切點(diǎn))裝入D55的 Bgl II 位點(diǎn)中即可，將 Ad .enAFP .ElA .D55-(S0CS-3)與 Ad enAFP .ElA *D55-(TRAIL)兩者共用如圖3所示，則可取得極好的抗癌效果。兩個基因前面為分別構(gòu)建不同的重組子，然后合用使用，則可大大增強(qiáng)其抗癌作用，因?yàn)閮蓚€基因可能有互補(bǔ)性或協(xié)同效應(yīng)。如將兩個基因用Linker連起來裝入Ad ^enAFP-ElA- D55- (TRAIL-Linker-S0CS-3)中亦可取得很好抗癌效果，也屬于本專利范圍。實(shí)施例3 =CTGVT-LC具體構(gòu)建方法3用enAFP啟動子控制E1A，所用基因?yàn)榭拱┳饔煤軓?qiáng)的普通基因IL-24，放入Ad enAFP *E1A AElB中，也取得意想不到的抗肝癌效果，其構(gòu)建方法的柜架如圖4所示。
I.如圖4所示，Ad-Wt同實(shí)施例I中Ad5 (ffT)。2.構(gòu)建Ad enAFP .ElA AElB :先用 PCR從D55 中切除 19KD 構(gòu)成 Ad .ElA AE1B，然后與刪除ElA的天然啟動子的Ad *E1A (ANat. p)，構(gòu)成Ad *E1A (ANat. p) AE1B，再在Ad ElA ( A Nat. p)中加上 enAFP 構(gòu)成 Ad enAFP ElA A ElB ；3. Ad enAFP ElA AE1B-(IL~24) Ad enAFP ElA A ElB 已是一種溶瘤病毒了，有抗癌作用，但不強(qiáng)，如加一個抗癌作用很強(qiáng)的IL-24基因表達(dá)框，S卩(IL-24)，其抗癌作用更強(qiáng)，其方法是將IL-24表達(dá)框(兩端都帶Bgl II，裝入D55的Bgl II中)，則可構(gòu)成Ad enAFP ElA A ElB-(IL-24)，它可把肝癌全部消滅光(圖7之C)。此CTGVT-LC 建構(gòu)方案，只申請 Ad enAFP ElA A ElB-(X)(如 X 為 IL-24)，Ad enAFP ElA AE1B_(IL_24)取得極好的抗癌效果，可把肝癌全部消滅光，甚至遠(yuǎn)端肝癌也能抑制80%以上，故特此申請專利。X也可為抗癌作用極強(qiáng)的TRAIUMnSOD等等均可，也可用雙基因如TRAIL-IETD-IL-24等，或用RNAi+IL-24也是一種雙基因。具體的構(gòu)建步驟如5A、圖5B所示，用PCR方法除去ElB中的19KD，先合成一對引物上游引物-xbal(此序列在 ElA 序列中)cgacatcacctgtgtctagagaatgca ；下游引物-Bgl II :agatctgaggtcagatgtaaccaagatt。以p ZD55為模板，用上述合成引物PCR出390bp左右的片段a，連接到pMD18-T載體上，構(gòu)成P MD18-T_a,經(jīng)測序鑒定正確。進(jìn)一步用xhaI,Bgl II雙酶切p MD18-T_a,回收小片段a。用xhaI，Bgl II雙酶切p ZD55，回收大片段b，連接a，b片段，即可得到pAd-AElB。用xbal，EcoR I 雙酶切 pAd-AElB、pAd-ElA ( A Nat. p)，連接片段得到pAd-ElA( A Nat. p)- AE1B。用xhoI,SnaB I 雙酶切 pAd-ElA ( A Nat. p) - A ElB,片段 Xho I-enAFP-SnaBI,連接得到 pAd enAFP-ElA-AE1B。采用Bgl II 酶切 pAd enAFP-ElA-AElB，片段 Bgl II-mCMV-IL-24-polyA-BglII，連接得至Ij pAd enAFP-ElA-AElB-(IL-24)。pAd enAFP-ElA-A ElB-(IL-24)與 pBHGE3 在 HEK293 細(xì)胞中重組，得到Ad enAFP-ElA-A ElB-(IL-24)。本領(lǐng)域技術(shù)人員在以上描述內(nèi)容的基礎(chǔ)上，采用常規(guī)的分子生物學(xué)等試驗(yàn)技術(shù)手段即可獲得本發(fā)明的治療肝癌特異性的基因-病毒。因此此處不再贅述。
實(shí)施例4 =CTGVT-LC具體構(gòu)建方法1、2的體外(in vitro)抗癌效果。將癌細(xì)胞及正常細(xì)胞接種于96孔板(細(xì)胞數(shù)為6 X IO3)，當(dāng)細(xì)胞生長至接近飽和時(如80%飽和)(飽和指細(xì)胞長滿了全孔)。對不同細(xì)胞包括正常細(xì)胞(A)、宮頸癌細(xì)胞(B)、AFP陰性的BEL7404肝癌(C)、AFP陽性的肝癌細(xì)胞H印G2 (D)、AFP陽性的肝癌細(xì)胞Huh7 (E)、AFP 陽性的肝癌細(xì)胞 PLC (F)，分別用 PBS、AFD D55_(S0CS_3)、AFD D55-(TRAIL)及 AFD *D55-(SC0S-3)加 AFD *D55-(TRAIL)等不同 MOI 處理，然后對每一個孔加 MTT (5mg/ml) 20 u I再繼續(xù)在37°C培養(yǎng)4小時，倒掉上清，沉淀用DMSO溶解，在370nm測光吸收(儀器為Multiskan MK-3微板閱讀器,美國，麻省,Thermo Scientific公司生產(chǎn))以測定細(xì)胞生存率(Cell Viability，殺傷力強(qiáng)，則生存率小)。
給藥組OD57Q-培養(yǎng)液OD570
細(xì)胞生存率=-X 100%
未給藥組OD57Q-培養(yǎng)液OD570結(jié)果如圖6所示。所有藥物對正常細(xì)胞組(A)、腸癌細(xì)胞組(非肝癌)(B)及AFP陰性(非陽性)的肝癌細(xì)胞組(C)均無抗癌作用，而對所有AFP陽性肝癌細(xì)胞組(D、E、F)均有抗癌作用，其抗癌強(qiáng)度為AFP D55-(S0CS3)+AFP D55-(TRAIL) > AFP D55-(TRAIL)；或AFP D55-(S0CS3) > AFP D55 > PBS。實(shí)施例5 =CTGVT-LC具體構(gòu)建方法1、2的體內(nèi)(in vivo)抗癌效果。選用4周齡的雌裸鼠(nude mice)，購自上海實(shí)驗(yàn)動物中心，所有的實(shí)驗(yàn)操作符合美國國家衛(wèi)生研究院關(guān)于實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)和使用的指導(dǎo)原則，使用6X IO3在150 u IDMEM培養(yǎng)中將Huh7ce 11 s皮下接種于每個小鼠的背側(cè)，等候腫瘤生長到80-150mm3，將小鼠隨機(jī)分成4組，對照組(打生理鹽水，PBS)及不同藥物組為Ad AFP ElA ElB ( A 55)(即 AFP D55 組)、Ad AFP ElA ElB ( A 55) (S0CS3) ( BP AFP D55_(S0CS3)組)、Ad AFP ElA ElB ( A 55) (TRAIL)(即 AFP D55- (TRAIL)組)及 AFP D55- (S0CS3)與AFP D55-(TRAIL)合用組，每天腫瘤內(nèi)注射治療一次，每次0. 5 X 108pfu連續(xù)4次，總共劑量各組均為2X 109pfu,然后每周用caliper尺測量腫瘤的長與寬,腫瘤的大小(volume, V)按下面公式計(jì)算，V = 1/2長X寬2，最后把小鼠殺死，切下腫瘤拍照，并將瘤塊大小繪成柱狀圖。結(jié)果如圖7所示，其中A為各種物質(zhì)的抗癌作用，橫坐標(biāo)為時間，縱坐標(biāo)為腫瘤體積的大小。瘤體積越小，抗癌作用越強(qiáng)，其抗癌強(qiáng)弱次序AFP D55-(TRAIL)+AFP D55-(SC0S_3) > AFP D55-(SC0S_3)或 AFP D55-(TRAIL) >AFP D55 >> PBS。B 為小鼠存活率曲線圖，在 AFP D55-(SC0S-3)+AFP D55-(TRAIL)聯(lián)合使用組，無一小鼠死亡。C為試驗(yàn)結(jié)束后，切下瘤子，拍照的圖片，根據(jù)測量獲得的瘤塊大小，繪成柱狀圖D，柱狀圖中最矮最小者，抗癌作用最好，故兩個CTGVT共用時，抗癌作用最好，最差的是單用的溶瘤病毒，當(dāng)然PBS最最差，無抗癌作用。實(shí)施例6 =CTGVT-LC的具體構(gòu)建方法3的體外(in vitro)抗癌效果方法同實(shí)施例4。結(jié)果如圖8所示。結(jié)果為Ad enAFP ElA A ElB-(IL-24)在正常細(xì)胞QSG-7701中抗癌作用其抗癌效果與Ad AFP ElA AElB同，即對正常細(xì)胞無傷害作用，但在肝癌細(xì)胞H印G2、Hep3B、Huh 7等的抗癌作用，均比Ad AFP ElA AElB強(qiáng)。實(shí)施例7 =CTGVT-LC的具體構(gòu)建方法3的體內(nèi)(in vivo)抗癌效果方法同實(shí)施例5。結(jié)果如圖9所示。做動物抗癌實(shí)驗(yàn)，起始時瘤子的體積大小很重要，與藥物的抗癌效果成反比，起始瘤塊太大，則抗癌藥物很難抑制腫瘤生長，抗癌效果差。故一般規(guī)定它在80-130mm3之間，最大不能超過200mm3。如圖8A所示，結(jié)果腫瘤長到了 390mm3才開始給藥，其抗癌結(jié)果較差，但仍可觀察到不同藥物的其抗癌效果不同，在圖8中的抗癌效果強(qiáng)弱，依次為Ad enAFP .ElA AE1B-(IL_24) > Ad enAFP .ElA AElB >> Ad .Wt > PBS。圖8B表示小鼠死亡曲線，注射Ad enAFP AE1B_IL_24組，全部小鼠均存活無死 亡，表示實(shí)際上它有很好的抗癌作用。如果在腫瘤長至90mm3時就開始給藥，結(jié)果如圖8C所示，效果極好。Ad enAFP ElA AE1B-(IL_24)可很快將瘤塊全部消滅掉。圖8D表明Ad enAFP ElA AE1B-(IL_24)對遠(yuǎn)端腫瘤也產(chǎn)生很好的殺傷作用，即在nude mice兩處都接種腫瘤，一處注射抗腫瘤藥物，全部瘤塊消滅了，另一遠(yuǎn)端處不給藥，但對腫瘤生長也有80-90%的抑制作用。說明我們的CTGV-LC抗癌效果好極了，故申請專利。本發(fā)明通過上述實(shí)驗(yàn)，證實(shí)本發(fā)明的肝癌靶向基因-病毒可以用于制備治療肝癌的藥物。肝癌靶向基因-病毒組合物也可以用于制備治療肝癌的藥物，所述肝癌靶向基因-病毒組合物含有肝癌靶向基因-病毒以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑、如溶劑、稀釋劑等，肝癌靶向基因-病毒與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合、如溶劑、稀釋劑等，從而形成肝癌靶向基因-病毒組合物，這些對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說都是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.一種肝癌特異性基因-病毒，其特征在于，所述基因-病毒是由肝癌特異性啟動子替換腺病毒最關(guān)鍵的ElA基因的天然啟動子，調(diào)控ElA表達(dá)，構(gòu)成一種肝癌特異性溶瘤腺病毒，然后在其中插入肝癌特異性的抗癌基因而構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求I所述的肝癌特異性基因-病毒，其特征在于，所述肝癌特異性啟動子為肝癌特異性的甲胎蛋白啟動子AFP。
3.如權(quán)利要求I所述的肝癌特異性基因-病毒，其特征在于，所用肝癌特異性的抗癌基因選自S0CS3、HCCS-I 或 TSLC-I。
4.如權(quán)利要求I所述的肝癌特異性基因-病毒，其特征在于，所述基因-病毒還可加入抗癌作用很強(qiáng)的基因以加強(qiáng)其抗癌能力，所述抗癌作用很強(qiáng)的基因選自IL-24、MnS0D、CD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase 3、Bax 或 TRAIL 中的一個或兩個。
5.如權(quán)利要求4所述的肝癌特異性基因-病毒，其特征在于，加入兩個抗癌作用很強(qiáng)的基因的，兩個基因采用聯(lián)接子聯(lián)接，如TRAIL-linker-IL-24。
6.一種肝癌特異性基因-病毒，其特征在于，所述基因-病毒是在肝癌特異性啟動子-甲胎蛋白啟動子AFP的調(diào)控下，將腺病毒的AElB與IL-24相配合，構(gòu)建而成的基因-病毒 Ad AFP ElA A ElB IL-24。
7.如權(quán)利要求I所述的肝癌特異性基因-病毒，其特征在于，腺病毒還可以被進(jìn)行如下改造 1)3認(rèn)刪除2仙？，或 2)、ElB刪除55KD或同時刪除19KD和55KD 3)啟動子被HIF所取代。
8.—種藥物組合物，其特征在于，包含權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的肝癌特異性基因-病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種肝癌特異性基因-病毒及其應(yīng)用。該病毒為溶瘤腺病毒，其早期基因E1分為E1A、E1B，所述E1A的啟動子被肝癌特異性啟動子取代，優(yōu)選為被肝癌特異甲胎蛋白啟動子取代，且該病毒攜帶抗癌基因。所抗癌基因?yàn)镾OCS3、HCCS-1、TSLC-1、IL-24、MnSOD、或TRAIL。優(yōu)選為所抗癌基因?yàn)镮L-24。本發(fā)明的肝癌特異性基因-病毒，用于肝癌的特異性治療藥物，具有很高的靶向抗肝癌作用，對正常細(xì)胞基本無影響，對多數(shù)其它癌癥細(xì)胞作用也很小。
文檔編號A61K48/00GK102796709SQ20111014210
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者劉新垣, 韋睿成, 章康健, 曹欣 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院