專利名稱：一種蹄甲多肽的復(fù)合水解制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬多肽類生物藥物制備方法，特別涉及一種以豬蹄甲為原料，通過水解制備蹄甲多肽的方法。
背景技術(shù)：
蹄甲多肽是從豬蹄甲中經(jīng)水解獲取的具有生物活性的多肽組分，具有顯著的止血、抗炎、調(diào)整內(nèi)分泌、提高機(jī)體免疫等功能，對功能性子宮出血癥、月經(jīng)不調(diào)等婦科疾病， 具有獨特的治療作用，而且未出現(xiàn)任何毒副作用，臨床上已廣泛應(yīng)用。目前，生產(chǎn)蹄甲多肽的方法主要是酸水解法或堿水解法，堿水解法的報道占多數(shù)。最近的相關(guān)報道為2010年5月19日中國專利CN 101709076A公開的“一種蹄甲多肽的制備方法”。該方法是一種改進(jìn)的堿水解生產(chǎn)蹄甲多肽的方法，主要步驟是在PH為 8-12、溫度為90-100°C的NaOH水溶液中，對豬蹄甲進(jìn)行水解，以期提高蹄甲多肽的收率和純度。但是，該方法與傳統(tǒng)的酸或堿水解法相同，在單純追求提高蹄甲水解率的同時，忽略了對藥物組分和活性的綜合考察，盡管水解率有一定的提高，但并沒有帶來藥物效果的提高，相反，由于其產(chǎn)品中氨基氮占總氮含量高達(dá)4%以上，意味著過多的多肽分子被過度水解為對治療效果沒有多大貢獻(xiàn)的氨基酸，反而對實際療效不利。因此，改進(jìn)和篩選優(yōu)化豬蹄甲的水解工藝，使其在將大分子蛋白質(zhì)水解為多肽的同時，能夠有效控制多肽組分的過度水解，是當(dāng)前蹄甲多肽生產(chǎn)過程中急需解決的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有蹄甲多肽生產(chǎn)技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種采用堿液和蛋白水解酶雙重復(fù)合水解法生產(chǎn)蹄甲多肽的方法。為了合理篩選工藝路線和工藝條件，本發(fā)明人參照前人對蹄甲多肽的藥理研究， 結(jié)合本發(fā)明人實際臨床應(yīng)用試驗結(jié)果，進(jìn)行綜合分析對比后確認(rèn)，蹄甲多肽成分中，具有藥效功能的成分為多肽，特別是相對分子質(zhì)量范圍為10000 3500的多肽組分的實際臨床應(yīng)用試驗效果最好，應(yīng)盡力提高該相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)的多肽組分，同時，摒棄相對分子質(zhì)量高于30000的組分，并控制其過度水解為相對分子質(zhì)量低于3500的組分，以最大限度的提高產(chǎn)品藥物的凝血、抗炎作用，降低其興奮子宮的負(fù)面功能。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案如下將經(jīng)過干燥和粉碎后的蹄甲原料，先在堿溶液中進(jìn)行溫和的部分水解；然后使用蛋白水解酶進(jìn)一步水解，并控制氨基氮含量不超過總氮含量的3%。本發(fā)明所述方法的具體操作步驟和條件如下1.將原料蹄甲進(jìn)行洗滌、熱解、干燥和粉碎，制得原料粉末；2.將原料粉末置于重量為原料干粉的20 22倍、pH為8. 4 8. 6的NaOH溶液中，在溫度為84 86°C下，均勻攪拌，堿解11-12小時；3.將水解混合液過濾濾出粗渣后，再將濾液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，兩次濾出的濾渣返回NaOH溶液中再進(jìn)行堿解；所得濾液進(jìn)行酶解；4.向超濾所得的濾液中，添加重量為原料干粉0. 15 0.2%的木瓜蛋白酶(酶活 1000 μ/mg)和重量為原料干粉0. 15 0.2%的枯草桿菌蛋白酶(酶活30萬μ/g)，調(diào)整溶液pH為6. 5 7，在溫度為M 56°C下，酶解3. 5 4小時，酶解終止時間以酶解液中氨基氮含量不超過總氮含量的3%為準(zhǔn)；5.將所得酶解液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行過濾，濾除酶等大分子雜質(zhì)，所得濾液即為蹄甲多肽產(chǎn)品；經(jīng)濃縮、干燥、粉碎，用于制備蹄甲多肽口服片劑；或?qū)⑺脼V液經(jīng)濃縮、醇提取、再濃縮后，用于制備注射水針劑或凍干粉針劑。采用上述復(fù)合水解方法中制得的蹄甲多肽的收率為觀％左右，產(chǎn)品中總氮含量為 16. 5-16. 8%，與現(xiàn)有技術(shù)基本相近，但產(chǎn)品中氨基氮占總氮量的比例，僅為2. 9-3. 0%，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有技術(shù)的4. 2-4. 3%，說明多肽的過度水解問題得到了有效地控制，有效多肽成分相對提高，相應(yīng)的臨床應(yīng)用效果也相應(yīng)提高。采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用對本發(fā)明及現(xiàn)有技術(shù)(CN 101709076)所制得的蹄
甲多肽分別進(jìn)行分離、檢測，所得的統(tǒng)計對比數(shù)據(jù)如下
本發(fā)明CN 101709076
相對分子質(zhì)量80000-30000組分15%
相對分子質(zhì)量30000-10000組分 30%25%
相對分子質(zhì)量10000-3500組分 50%35%
相對分子質(zhì)量3500以下組分20%25%
其中氨基氮占總氮量不大于 3%4.3%由上述分離檢測結(jié)果可以看出，本發(fā)明所制得的蹄甲多肽中具有明顯凝血、抗炎效果的多肽含量高于現(xiàn)有技術(shù)水平，特別是具有明顯藥效的相對分子質(zhì)量10000-3500的組分含量高于現(xiàn)有技術(shù)50%，而過度水解所生成的氨基氮含量則低于現(xiàn)有技術(shù)的30%。本發(fā)明所述方法達(dá)到了預(yù)期的發(fā)明目的。
具體實施例方式實施例1.1)將原料蹄甲進(jìn)行洗滌、熱解、干燥和粉碎，制得原料粉末；2)將原料粉末置于重量為原料干粉的20倍、pH為8. 6的NaOH溶液中，在溫度為 86°C下，均勻攪拌，堿解11小時；3)將水解混合液過濾濾出粗渣后，再將濾液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，所得濾液進(jìn)行酶解；兩次濾出的濾渣返回NaOH溶液中再進(jìn)行堿解；
4)向超濾所得的濾液中，添加重量為原料干粉0. 15%的木瓜蛋白酶(酶活 1000 μ /mg)和重量為原料干粉0. 2%的沙雷肽酶(酶活30萬μ /g)，調(diào)整溶液pH為7，在溫度為下，酶解4小時，酶解終止后，酶解液中氨基氮含量為總氮含量的2. 9% ；5)將所得酶解液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行過濾，濾除酶等大分子雜質(zhì)，所得濾液即為蹄甲多肽產(chǎn)品；經(jīng)濃縮、醇提取、再濃縮后，用于制備注射液；或干燥、粉碎后，制備口服片劑。采用上述復(fù)合水解方法中制得的蹄甲多肽的收率為觀％，產(chǎn)品中總氮含量為 16.8%，與現(xiàn)有技術(shù)基本相近，但產(chǎn)品中氨基氮占總氮量的比例，僅為2.9%，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有技術(shù)的4. 3% ；，采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用對本實施例所制得的蹄甲多肽分別進(jìn)行分離、檢測，其中相對分子質(zhì)量為10000-3500的多肽組分含量為50%。使用本實施例所制得的蹄甲多肽注射液與采用現(xiàn)有技術(shù)CN 101709076制得的蹄甲多肽所制成的同等劑量的注射液，分別給試驗家兔注射用藥三天，然后進(jìn)行體外凝血試驗對比，注射本發(fā)明蹄甲多肽的家兔的體外凝血時間，比現(xiàn)有技術(shù)縮短了 30%。實施例2.1)將原料蹄甲進(jìn)行洗滌、熱解、干燥和粉碎，制得原料粉末；2)將原料粉末置于重量為原料干粉的22倍、pH為8. 4的NaOH溶液中，在溫度為 84°C下，均勻攪拌，堿解12小時；3)將水解混合液過濾濾出粗渣后，再將濾液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，所得濾液進(jìn)行酶解；兩次濾出的濾渣返回NaOH溶液中再進(jìn)行堿解；4)向超濾所得的濾液中，添加重量為原料干粉0.2%的木瓜蛋白酶(酶活1000 μ/ mg)和重量為原料干粉0. 15%的沙雷肽酶(酶活30萬μ /g)，調(diào)整溶液pH為6. 5，在溫度為56°C下，酶解3. 5小時，酶解終止后，酶解液中氨基氮含量不超過總氮含量的3. 0% ；5)將所得酶解液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行過濾，濾除酶等大分子雜質(zhì)，所得濾液即為蹄甲多肽產(chǎn)品；經(jīng)濃縮、醇提取、再濃縮后，用于制備注射液；或干燥、粉碎后，制備口服片劑。采用上述復(fù)合水解方法中制得的蹄甲多肽的收率為四％，產(chǎn)品中總氮含量為 16.5%，與現(xiàn)有技術(shù)基本相近，但產(chǎn)品中氨基氮占總氮量的比例，僅為2.8%，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有技術(shù)的4.3%，采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用對本實施例所制得的蹄甲多肽分別進(jìn)行分離、檢測，其中相對分子質(zhì)量為10000-3500的多肽組分含量為51%，使用本實施例所制得的蹄甲多肽注射液與采用現(xiàn)有技術(shù)CN 101709076制得的蹄甲多肽所制成的同等劑量的注射液，分別給血小板減少的試驗用小鼠注射用藥七天，然后分別進(jìn)行血小板數(shù)量檢測，注射本發(fā)明蹄甲多肽的小鼠的血小板數(shù)量，與使用現(xiàn)有技術(shù)的小鼠的血小板數(shù)量均有增加，但使用本發(fā)明蹄甲多肽的小鼠的血小板所增加的數(shù)量比現(xiàn)有技術(shù)高出了 50%。
權(quán)利要求
1.一種蹄甲多肽的制備方法，其特征在于采用堿液和蛋白水解酶雙重復(fù)合水解方法制備蹄甲多肽。
2.如權(quán)利要求1所述蹄甲多肽的制備方法，其特征在于所述的復(fù)合水解方法是將經(jīng)過干燥和粉碎后的蹄甲原料，先在堿溶液中進(jìn)行水解；然后使用蛋白水解酶進(jìn)一步水解，并控制氨基氮含量不超過總氮含量的3%。
3.如權(quán)利要求1所述蹄甲多肽的制備方法，其特征在于所述的復(fù)合水解方法的具體操作步驟和條件如下1)將原料蹄甲進(jìn)行洗滌、熱解、干燥和粉碎，制得原料粉末；2)將原料粉末置于重量為原料干粉的20 22倍、pH為8.4 8. 6的NaOH溶液中，在溫度為84 86°C下，均勻攪拌，堿解11-12小時；3)將水解混合液過濾濾出粗渣后，再將濾液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，兩次濾出的濾渣返回NaOH溶液中再進(jìn)行堿解；所得濾液進(jìn)行酶解；4)向超濾所得的濾液中，添加重量為原料干粉0.15 0.2%的木瓜蛋白酶和重量為原料干粉0. 15 0. 2%的枯草桿菌蛋白酶，調(diào)整溶液pH為6. 5 7，在溫度為M 56°C下， 酶解3. 5 4小時，酶解終止時間以酶解液中氨基氮含量不超過總氮含量的3%為準(zhǔn)；5)將所得酶解液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行過濾，濾除酶及大分子雜質(zhì)，所得濾液即為蹄甲多肽液體產(chǎn)品；經(jīng)濃縮、干燥、粉碎，用于制備蹄甲多肽口服片劑；或?qū)⑺脼V液經(jīng)濃縮、醇提取、再濃縮后，用于制備注射水針劑或凍干粉針劑。
4.如權(quán)利要求1所述蹄甲多肽的制備方法，其特征在于所述的復(fù)合水解方法的具體操作步驟和條件如下1)將原料蹄甲進(jìn)行洗滌、熱解、干燥和粉碎，制得原料粉末；2)將原料粉末置于重量為原料干粉的20倍、PH為8.6的NaOH溶液中，在溫度為86°C 下，均勻攪拌，堿解11小時；3)將水解混合液過濾濾出粗渣后，再將濾液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，兩次濾出的濾渣返回NaOH溶液中再進(jìn)行堿解；所得濾液進(jìn)行酶解；4)向超濾所得的濾液中，添加重量為原料干粉0.15%的木瓜蛋白酶(酶活1000 μ/mg) 和重量為原料干粉0.2%的沙雷肽酶(酶活30萬μ/g)，調(diào)整溶液pH為7，在溫度為下，酶解4小時，酶解終止后，酶解液中氨基氮含量為總氮含量的2. 9% ；5)將所得酶解液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行過濾，濾除酶等大分子雜質(zhì)，所得濾液即為蹄甲多肽液體產(chǎn)品；經(jīng)濃縮、醇提取、再濃縮后，用于制備注射液；或干燥、粉碎后，制備口服片劑。
5.如權(quán)利要求1所述蹄甲多肽的制備方法，其特征在于所述的復(fù)合水解方法的具體操作步驟和條件如下1)將原料蹄甲進(jìn)行洗滌、熱解、干燥和粉碎，制得原料粉末；2)將原料粉末置于重量為原料干粉的22倍、pH為8.4的NaOH溶液中，在溫度為84°C 下，均勻攪拌，堿解12小時；3)將水解混合液過濾濾出粗渣后，再將濾液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，兩次濾出的濾渣返回NaOH溶液中再進(jìn)行堿解；所得濾液進(jìn)行酶解；4)向超濾所得的濾液中，添加重量為原料干粉0.2%的木瓜蛋白酶(酶活ΙΟΟΟμ/mg)和重量為原料干粉0. 15 %的沙雷肽酶(酶活30萬μ /g)，調(diào)整溶液pH為6. 5，在溫度為 56°C下，酶解3. 5小時，酶解終止后，酶解液中氨基氮含量不超過總氮含量的3. 0% ；5)將所得酶解液用分子量不大于30000道爾頓的超濾膜進(jìn)行過濾，濾除酶等大分子雜質(zhì)，所得濾液即為蹄甲多肽產(chǎn)品；經(jīng)濃縮、醇提取、再濃縮后，用于制備注射液；或干燥、粉碎后，制備口服片劑。
6.應(yīng)用權(quán)利要求1所述的復(fù)合水解方法所制備的蹄甲多肽，其特征在于蹄甲多肽產(chǎn)品中，相對分子質(zhì)量30000-10000的組分含量為30% ；相對分子質(zhì)量10000-3500的組分含量為50% ；相對分子質(zhì)量3500以下的組分含量為20%。
7.應(yīng)用權(quán)利要求1所述的復(fù)合水解方法所制備的蹄甲多肽，其特征在于蹄甲多肽產(chǎn)品中，氨基氮占總氮量不大于3 %。
全文摘要
本發(fā)明為一種蹄甲多肽的復(fù)合水解制備方法，是將經(jīng)過干燥和粉碎后的蹄甲原料，在堿溶液中進(jìn)行溫和的部分水解；然后使用蛋白水解酶進(jìn)一步水解；制得蹄甲多肽產(chǎn)品。本發(fā)明所制得的蹄甲多肽產(chǎn)品中，相對分子質(zhì)量10000-3500的組分含量達(dá)50％；氨基氮含量不超過總氮含量的3％。與現(xiàn)有技術(shù)相比較其凝血、抗炎效果具有明顯的提高。
文檔編號A61P37/04GK102191305SQ20111008464
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者楊紅霞, 王克柳, 王美海, 顏丙輝 申請人:山東魯北藥業(yè)有限公司