專利名稱：腦膜炎球菌fHBP多肽的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域，具體涉及奈瑟球菌H因子結(jié)合蛋白(fHBP)的表達(dá)。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟球菌是革蘭陰性的有莢膜細(xì)菌病原體。在開發(fā)對(duì)抗血清組B腦膜炎球菌的廣譜疫苗中一種感興趣的抗原是fHBP，也稱為蛋白質(zhì)‘741’ [I]、‘NMB1870’、‘GNA1870’ [2-4]、‘P2086’、‘LP2086’ 或‘0RF2086’ [5-7] 這種脂蛋白在所有腦膜炎球菌血清組中表達(dá)，并在多種菌株中發(fā)現(xiàn)。已將fHBP序列分為三個(gè)家族[2](在本文中稱為家族1、11和III)，又給定家族產(chǎn)生的血清對(duì)同一家族產(chǎn)生殺細(xì)菌活性，但對(duì)表達(dá)其它家族之一的菌株無活性，即存在家族內(nèi)、而非家族間交叉保護(hù)。對(duì)于疫苗接種目的，fHBP蛋白已用作大腸桿菌(E. coll)中表達(dá)的重組蛋白[8]或已經(jīng)在腦膜炎球菌中過度表達(dá)，以至于從過度表達(dá)菌株中純化的外膜囊泡將展示大量免疫原性fHBP[9]。然后，這些囊泡可用于疫苗，以提供強(qiáng)大的保護(hù)性抗-fHBP應(yīng)答。本發(fā)明的ー個(gè)目的是提供提高腦膜炎球菌中fHBP表達(dá)的額外的改良方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，fhbp基因由兩種差異調(diào)控的啟動(dòng)子從兩種獨(dú)立轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。在一個(gè)轉(zhuǎn)錄物中，它與相鄰上游基因(nmbl869)由Pnmbl869啟動(dòng)子共同表達(dá)。另ー轉(zhuǎn)錄物是單順反子，并由其自身專用啟動(dòng)子Pfhbp表達(dá)，它由全局調(diào)控蛋白FNR(已知的厭氧激活物蛋白質(zhì)、延胡索酸和硝酸還原酶調(diào)節(jié)物)因氧限制條件而激活。為了提高單順反子轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，采用FNR的突變形式。該突變形式是組成型活化的，甚至在有氧條件下也是如此，因此內(nèi)源性Pfhbp啟動(dòng)子組成型激活，導(dǎo)致fHBP過度表達(dá)。可采用相同方法過度表達(dá)任何其它具有FNR激活的啟動(dòng)子的腦膜炎球菌基因，包括經(jīng)工程改造處于這種啟動(dòng)子控制下的基因。因此，本發(fā)明提供一種腦膜炎球菌，其(a)具有其轉(zhuǎn)錄處于FNR激活的啟動(dòng)子控制下的基因，和(b)表達(dá)FNR的組成型活性形式。FNR的表達(dá)導(dǎo)致FNR活化基因的組成型表達(dá)。轉(zhuǎn)錄處于FNR激活的啟動(dòng)子控制下的基因最好是fhbp基因。雖然不是必需，但腦膜炎球菌最好不表達(dá)FNR的非組成型活性形式。本發(fā)明也提供一種制備腦膜炎球菌突變體的方法，該方法包括修飾其內(nèi)源性fnr基因的步驟，以使編碼的FNR蛋白組成型活化。本發(fā)明也提供一種制備腦膜炎球菌突變體的方法，該方法包括引入編碼FNR的組成型活性形式的基因的步驟。該方法也可包括修飾腦膜炎球菌中任何內(nèi)源性fnr基因的步驟以抑制或防止其表達(dá)。因此，本發(fā)明還提供一種提高轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的方法，該轉(zhuǎn)錄物在腦膜炎球菌中的轉(zhuǎn)、錄受FNR激活的啟動(dòng)子控制，該方法包括為腦膜炎球菌提供FNR的組成型活性形式。然后，轉(zhuǎn)錄物表達(dá)增加可提高腦膜炎球菌中編碼蛋白的水平。因此，本發(fā)明還提供一種在腦膜炎球菌中提高轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的方法，該轉(zhuǎn)錄物含有其表達(dá)受至少兩個(gè)不同啟動(dòng)子控制的基因，這兩個(gè)啟動(dòng)子中ー個(gè)是FNR激活的啟動(dòng)子，另一個(gè)不是，所述方法包括向所述腦膜炎球菌提供FNR的組成型活性形式，從而提高該轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。在包含該基因的多種轉(zhuǎn)錄物中，相對(duì)于不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄物，F(xiàn)NR活化啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄物增加。本發(fā)明還提供一種制備脂蛋白體腦膜炎球菌囊泡的方法，該方法包括處理本發(fā)明腦膜炎球菌的步驟，以破壞其外膜，從而由其形成包含外膜的蛋白質(zhì)組分(如fHBP)的囊泡。所述囊泡可用作免疫原性組合物中的免疫原性組分(例如，作為對(duì)抗腦膜炎球菌的疫苗)。該方法可包括從任何活的和/或完整的細(xì)菌分離囊泡的又ー步驟，例如，通過大小分離(如過濾，使用允許囊泡通過但不允許完整細(xì)菌通過的濾器)，或通過離心以使細(xì)胞相對(duì)于囊泡優(yōu)先沉淀(例如低速離心)。
本發(fā)明還提供一種制備免疫原性組合物(如疫苗)的方法，該方法包括將由上述囊泡制備方法制備的囊泡與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體(如緩沖液)和/或免疫佐劑和/或一種或多種其它免疫原性組分配制在一起的步驟。本發(fā)明還提供表達(dá)FNR的組成型活性形式的腦膜炎球菌。本發(fā)明還提供腦膜炎球菌FNR的組成型活性形式，此外還提供編碼這一 FNR的核酸。特別有用的FNR的組成型活性形式包含SEQ ID NO :5，與野生型FNR序列(來自菌株MC58的SEQ ID NO :4)相比該序列在Asp-148上有突變，如D148A，其中野生型Asp 148被Ala代替。與現(xiàn)有策略相比，本發(fā)明提供在腦膜炎球菌中過度表達(dá)外膜蛋白(如fHBP)的優(yōu)勢(shì)。雖然已提示通過異源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)以過度表達(dá)蛋白質(zhì)，但這些策略只有在異源啟動(dòng)子的基礎(chǔ)活性高于內(nèi)源性啟動(dòng)子時(shí)才導(dǎo)致過度表達(dá)。本文所述的策略通過增加或提高FNR活化基因的內(nèi)源表達(dá)直接作用，在無需啟動(dòng)子修飾的條件下實(shí)現(xiàn)過度表達(dá)。腦膜炎球菌本發(fā)明提供各種腦膜炎球菌，其表達(dá)組成型活性FNR。因此，與正常的野生型菌株不同，F(xiàn)NR活化基因可高水平表達(dá)，即使在不限制氧水平吋。這類基因包括fhbp基因，因此本發(fā)明腦膜炎球菌可在其外膜中過度表達(dá)fHBP蛋白。本發(fā)明的腦膜炎球菌可由野生型菌株通過定點(diǎn)誘變制備，或者通過隨機(jī)誘變后篩選所需修飾制備，或者通過敲除和敲入技術(shù)制備。例如，可利用定位誘變技術(shù)修飾編碼內(nèi)源性FNR的基因，以引入提供組成型活性的突變。在其它實(shí)施方式中，可敲除內(nèi)源性fnr基因(例如，通過缺失或用標(biāo)記物替換)，并可引入新的fnr基因(例如位于與缺失相同的位點(diǎn)上、整合到染色體上但位于不同于缺失的位點(diǎn)上，或在質(zhì)粒上)。在其它實(shí)施方式中，引入新的fnr基因而保持內(nèi)源性fnr基因。實(shí)現(xiàn)這些和相似目標(biāo)的各種方式是顯而易見的?；騈MB1428和NMB1429之間的整合是方便的。與正常野生型菌株相比，本發(fā)明腦膜炎球菌表達(dá)組成型活性FNR。除此種修飾之夕卜，腦膜炎球菌與野生型菌株相比還可具有至少ー種其它修飾，例如通過遺傳操作引入的修飾[10-13]。例如，可修飾腦膜炎球菌以提高免疫原性(例如，以高表達(dá)免疫原，包括FNR未激活的免疫原)，以降低毒性、抑制莢膜多糖合成、下調(diào)PorA表達(dá)等。本發(fā)明腦膜炎球菌可具有修飾的fur基因[14]。參考文獻(xiàn)21教導(dǎo)，應(yīng)當(dāng)通過伴隨的porA和cps的敲除上調(diào)nspA的表達(dá),可以使用這些修飾。腦膜炎球菌可表達(dá)多種不同的PorA亞型[15]。本發(fā)明腦膜炎球菌可具有低內(nèi)毒素水平，例如通過敲除參與LPS生物合成的酶實(shí)現(xiàn)[16，17]。這些或其它突變體均可以與本發(fā)明一起使用。本發(fā)明腦膜炎球菌可表達(dá)ー種以上PorA亞型。之前已構(gòu)建出6價(jià)和9價(jià)PorA菌株。菌株可表達(dá) 2、3、4、5、6、7、8 或 9 種 PorA 亞型P1. 7,16 ；P1. 5-1,2-2 ；P1. 19,15-1 ；PL 5-2，10 ；P1. 12-1. 13 ；P1. 7-2,4 ；P1. 22，14 ；P1. 7-1,1 和/或 PL 18_1，3，6。在其它實(shí)施方式中，可以下調(diào)菌株中PorA的表達(dá)，例如，PorA的量相對(duì)于野生型水平(例如相對(duì)于H44/76菌株)減少了至少20% (例如，彡30%、彡40%、彡50%、彡60%、彡70%、彡80%、彡90%、彡95%等)，或甚至被敲除。本發(fā)明腦膜炎球菌可以高表達(dá)(相對(duì)于相應(yīng)的野生型菌株)某些蛋白質(zhì)。例如， 菌株可以高表達(dá)NspA、蛋白287 [18]、TbpA和/或TbpB[19]，銅、鋅超氧化物歧化酶[19]、HmbR 等。在一些實(shí)施方式中，腦膜炎球菌可以包括一個(gè)或多個(gè)參考文獻(xiàn)20-23描述的敲除和/或高表達(dá)突變。下調(diào)和/或敲除的優(yōu)選基因包括(a) Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA, LbpB, LpxK、Opa, Opc, PilC、PorB, SiaA, SiaB, SiaC、SiaD, TbpA 和/ 或 TbpB [20] ； (b) CtrA、CtrB> CtrC、CtrD> FrpB> GalE、HtrB/MsbB> LbpA、LbpB> LpxK、Opa>Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和 / 或 TbpB[21] ； (c)ExbB,ExbD,rmpM、CtrA> CtrB> CtrD> GalE、LbpA> LpbB> Opa> Opc> PilC、PorB> SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA 和/或 TbpB[22];和(d)CtrA、CtrB, CtrD, FrpB, OpA、OpC, PilC、PorB, SiaD、SynA、SynB 和/或 SynC [23]?？汕贸景l(fā)明腦膜炎球菌中的MltA(NMB0033) [24]，這會(huì)提高該菌株在正常生長過程中釋放的囊泡。這種“高出泡”菌株是免疫原性囊泡，例如含有高水平外膜蛋白的囊泡的有用來源，所述外膜蛋白來自過度表達(dá)的FNR-活化基因如fhbp。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明腦膜炎球菌可具有以下特征中的ー種或多種或全部⑴LgtB和/或GalE下調(diào)或敲除，以截短腦膜炎球菌LOS ; (ii) TbpA上調(diào)；(iii) NhhA上調(diào)；(iv)0mp85 上調(diào);(v) LbpA 上調(diào)；(vi)NspA 上調(diào)；(vii)PorA 敲除；(viii)FrpB 下調(diào)或敲除；(ix) Opa下調(diào)或敲除；(X) Opc下調(diào)或敲除；(xii) cps基因復(fù)合體缺失。截短的LOS可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以為半乳糖缺陷型L0S。所述LOS可以沒有α鏈。腦膜炎球菌可包含導(dǎo)致脂質(zhì)A的毒性活性降低或檢測(cè)不到的遺傳修飾，特別是在它們用于制備脂蛋白體囊泡吋。已知用于降低毒性脂質(zhì)A活性的各種修飾。例如，腦膜炎球菌中可能敲除了 IpxLl和/或lpxL2基因，例如得到四-或五-?；闹|(zhì)Α。脂質(zhì)A4/ -激酶基因(IpxK)中的突變也降低了脂質(zhì)A的毒性活性。優(yōu)選LpxLl敲除菌株，特別是當(dāng)fHBP表達(dá)上調(diào)時(shí)[25]。也可通過將突變引入?yún)⑴c多粘菌素B抗性的基因/基因座如pmrE和/或pmrF，改變LPS毒性活性。PhoP-PhoQ調(diào)節(jié)系統(tǒng)(磷酸-接替雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng))中的突變也可產(chǎn)生刺激E選擇素表達(dá)和TNF分泌的能力降低的修飾脂質(zhì)A。腦膜炎球菌可含有ー種以上fhbp基因。例如，它們可包括fHBP家族1、11和III中的ー個(gè)以上家族的fhbp基因。例如，參考文獻(xiàn)26公開了表達(dá)內(nèi)源家族I和異源家族II變體的內(nèi)毒素減毒的突變菌株。由這ー菌株制備的囊泡提供更廣的抗-fHBP抗體應(yīng)答譜。各fhbp基因可受其自身的FNR活化啟動(dòng)子調(diào)控，但也可能在多順反子轉(zhuǎn)錄物(単一 FNR調(diào)節(jié)子)中包括各fhbp基因?？尚揎棻景l(fā)明腦膜炎球菌，以破壞Pnmbl869啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄終止。本發(fā)明腦膜炎球菌可以屬于任何血 清組，例如A、B、C、W135、Y。它們通常是血清組B菌株。該菌株可以是任何血清型(如l、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亞型和任何免疫型(如LI ；L2 ；L3 ;L3，3，7 ；L10 ;等)。腦膜炎球菌可以來自任何適當(dāng)譜系，包括高侵襲性與超毒カ譜系，如以下7種超毒力譜系中任ー種亞組I、亞組III、亞組IV-1、ET 5復(fù)合物、ET-37復(fù)合物、A4簇、譜系3。組成型活性FNRFNR是全局厭氧調(diào)節(jié)物，其在厭氧條件下的活性需要[4Fe_4S]簇。在有氧和無氧生長過程中合成FNR多肽，但在有氧培養(yǎng)中相關(guān)鐵-硫中心降解，半衰期約為2分鐘。在厭氧生長過程中[4Fe-4S]鐵-硫中心的組件促進(jìn)ニ聚化，這是FNR結(jié)合FNR依賴性啟動(dòng)子上的反向重復(fù)靶序列的先決條件。本發(fā)明腦膜炎球菌表達(dá)組成型活性FNR。已知可修飾來自大腸桿菌的FNR，以使其[4Fe-4S]簇對(duì)O2穩(wěn)定，從而產(chǎn)生組成型活性蛋白，即它激活FNR依賴性基因的轉(zhuǎn)錄，即使在不限制氧氣吋。大腸桿菌序列中合適的突變包括[27] Asp-22 (如D22G) >Leu-28 (如L28H)、His-93 (如 H93R)、Glu-150 (如 E150K)和/或 Asp 148 (如 D148A、D148G、D148V)上的修飾。突變可具有各種潛在功能效果，例如，防止改變cAMP與FNR的結(jié)合、防止[4Fe-4S]簇的氧化、促進(jìn)FNR ニ聚化等。公開文獻(xiàn)已對(duì)淋球菌FNR(如參考文獻(xiàn)28確認(rèn)淋球菌殘基22和148上的L28H和D148A突變體即使在O2存在下也有活性)作出類似修飾，其中的實(shí)施例顯示可以相似方式修飾腦膜炎球菌FNR。實(shí)施例中示出了大腸桿菌和腦膜炎球菌FNR氨基酸序列(SEQ ID N0:4和6)的比對(duì)，以幫助選擇腦膜炎球菌FNR的其它有效突變。本發(fā)明的組成型活性腦膜炎球菌FNR可驅(qū)動(dòng)FNR活化的腦膜炎球菌基因以氧氣依賴方式表達(dá)。優(yōu)選的組成型活性FNR也對(duì)氮氧化物滅活作用(可使野生型蛋白的[4Fe-4S]簇亞硝化)有抗性。制備野生型腦膜炎球菌FNR蛋白的突變形式(如SEQ ID NO 4的突變體)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，例如定位誘變或易錯(cuò)PCR。因此，可修飾腦膜炎球菌中表達(dá)O2依賴性FNR的內(nèi)源性fnr基因，造成編碼的FNR蛋白反而組成型激活。本發(fā)明腦膜炎球菌表達(dá)組成型活性FNR吋，優(yōu)選(但不一定)不表達(dá)FNR的非組成型活性形式。因此，所述組成型活性FNR可能是腦膜炎球菌表達(dá)的唯一 FNR。這可通過以下方式實(shí)現(xiàn)修飾內(nèi)源fnr基因，或者作為替代方式，滅活內(nèi)源fnr基因并引入編碼組成型活性蛋白的修飾的fnr基因，或者將fnr基因引入FNR空菌株“MC-fnrKO” (參考文獻(xiàn)29中公開)。本發(fā)明還提供組成型活性腦膜炎球菌FNR。與野生型FNR序列(來自菌株MC58的SEQ ID NO :4)相比，這可以在殘基Leu-22(如L22H)、Glu-144(如E144K)和/或Asp-148 (如D148A、D148G、D148V)中的一個(gè)或多個(gè)上產(chǎn)生突變。例如，本發(fā)明的組成型活性腦膜炎球菌FNR可包含SEQ ID NO :5，其中野生型Asp 148被Ala取代(即對(duì)應(yīng)于大腸桿菌D148A突變體的腦膜炎球菌突變)。本發(fā)明還提供可驅(qū)動(dòng)從腦膜炎球菌FNR活化啟動(dòng)子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其中所述因子包含與SEQ ID NO :4具有至少序列相同性的氨基酸序列，條件是氨基酸序列的殘基148 (根據(jù)SEQ ID NO 4編號(hào))不是Asp (例如是Ala、Gly或Val)。本發(fā)明還提供編碼這些FNR蛋白的核酸。可以多種方式制備本發(fā)明中的核酸，例如，完全或部分化學(xué)合成(例如DNA的亞磷酰胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化較長核酸、連接較短核酸或核苷酸(例如使用連接酶或聚合酶)、由基因組或cDNA文庫制備等。本發(fā)明核酸可采取各種形式，例如，單鏈、雙鏈、載體、引物、探針、標(biāo)記、未標(biāo)記等。本發(fā)明中的核酸優(yōu)選地采取分離或基本分離的形式。術(shù)語“核酸”包括DNA和RNA，還有其類似物，如含有修飾主鏈的類似物，以及肽核酸(PNA)等。本發(fā)明所述核酸可以被標(biāo)記，例如，使用放射性或熒光標(biāo)記。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明核苷酸序列(如克隆或表達(dá)載體)的載體(如質(zhì)粒)和用這種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。FNR活化的基因和啟動(dòng)子腦膜炎球菌中多種基因由FNR依賴性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。例如，參考文獻(xiàn)29報(bào)道由微陣列實(shí)驗(yàn)鑒定的各種FNR依賴性基因和操縱子175種基因的轉(zhuǎn)錄差異超過2倍。FNR活化基因包括但不限于nmbl806、mapA、pgm β、ΝΜΒ0388、galM、nmb0363、nmbl805、nosR、nmbl677、aniA和fhbp。在具有組成型活性FNR的腦膜炎球菌中，即使在有氧條件下，也能増加任何這些基因(相對(duì)于野生型)的表達(dá)。任何這些基因均可用作天然FNR活化啟動(dòng)子的來源，從而可聯(lián)系于和驅(qū)動(dòng)下游感興趣基因的表達(dá)。本發(fā)明也可與修飾的FNR活化啟動(dòng)子一起使用。例如，實(shí)施例顯示匪117菌株具有Pfhbp啟動(dòng)子，其具有無效-10啟動(dòng)子元件,不顯示由組成型活性FNR過度表達(dá)。因此，可用于本發(fā)明的修飾的FNR活化啟動(dòng)子可具有作為δ 70啟動(dòng)子共有序列的-10和/或-35六聚體(如 SEQ ID NO :20 是-10 且SEQ ID NO :21 是-35 ;或者 SEQ ID Ν0:31 是-10且SEQ ID NO :32是-35)，因此可對(duì)其進(jìn)行修飾以使其序列更接近(或完全接近)該共有序列。相似地，用于本發(fā)明的修飾的FNR活化啟動(dòng)子可具有來自基因如腦膜炎球菌aniA的對(duì)FNR有高親和カ的FNR結(jié)合位點(diǎn)(FNR框)，例如SEQ ID NO :30，或者可具有使其序列更接近(或完全接近)FNR框共有序列SEQ ID NO 19的修飾的FNR結(jié)合位點(diǎn)。因此，通常來看，可構(gòu)建存在FNR時(shí)有高度活性的啟動(dòng)子，如通過連接來自已知FNR活化啟動(dòng)子的啟動(dòng)子元件(-10、-35和FNR框),包括野生型或優(yōu)化元件。雖然本發(fā)明腦膜炎球菌可具有組成型活性FNR，但在翻譯后水平控制這種組成型活性。因此，為了最大程度提高組成型活性FNR的胞漿水平，應(yīng)該在FNR積極轉(zhuǎn)錄和翻譯的條件下培養(yǎng)腦膜炎球菌。 在本發(fā)明腦膜炎球菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)的FNR活化基因可以是內(nèi)源性FNR活化啟動(dòng)子控制下的內(nèi)源性基因(如內(nèi)源性fhbp基因)，引入的FNR活化啟動(dòng)子控制下的內(nèi)源性基因，內(nèi)源性FNR活化啟動(dòng)子控制下的引入基因，或引入的FNR活化啟動(dòng)子控制下的引入基因。因此，本發(fā)明可用于過度表達(dá)內(nèi)源性或外源性蛋白質(zhì)(例如，作為參考文獻(xiàn)10所述方法的替代方式)，例如將編碼外膜蛋白的基因與FNR活化啟動(dòng)子連接，從而提高這些蛋白質(zhì)在外膜中(因而在囊泡中)的水平。本發(fā)明尤其可用于由FNR依賴性啟動(dòng)子表達(dá)外膜蛋白。所述蛋白質(zhì)如fHBP可在外膜中過度表達(dá)(相對(duì)于野生型菌株)，并保留在由腦膜炎球菌制備的脂蛋白體囊泡中。所述外膜蛋白可以是囊泡中的免疫可及形式，即可結(jié)合本發(fā)明純化多肽的抗體也可結(jié)合存在于囊泡中的所述多肽。轉(zhuǎn)錄在FNR激活的啟動(dòng)子控制下，因而可提高其表達(dá)的最優(yōu)選的基因是編碼H因子結(jié)合蛋白的fhbp。H因子結(jié)合蛋白
全長fHBP具有氨基酸序列SEQ ID NO 1(菌株MC58)。成熟脂蛋白(N-末端半胱氨酸)缺少SEQ ID NO 1的前19個(gè)氨基酸，fHBP的人工AG形式缺少前26個(gè)氨基酸。MC58序列屬于fHBP家族I。家族II和III的示范性序列是SEQ ID NO 2 (家族II ;菌株2996)和SEQ ID NO :3 (家族III ;菌株M1239)，在野生型腦膜炎球菌中，它們類似地在N末端半胱氨酸上脂化。fhbp基因的啟動(dòng)子被FNR激活，因此本發(fā)明可用于在腦膜炎球菌中表達(dá)任何這些fHBP序列。更常見的是，本發(fā)明可用于表達(dá)編碼包含以下序列的氨基酸序列的fhbp基因SEQ ID NO :1、2或3之一；(a)與SEQ ID NO :1、2或3中任一序列有至少x%序列相同性的氨基酸序列，其中 X 值為 65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99 或更高；和/或(b) SEQ IDNO :1，2或3中任一序列的至少η個(gè)氨基酸的片段，其中η值為7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100 或更高。(b)的片段優(yōu)選包含所述 SEQ ID NO 的表位。給予宿主動(dòng)物吋，fhbp基因編碼的蛋白質(zhì)最好有能力誘導(dǎo)殺細(xì)菌性抗腦膜炎球菌抗體。關(guān)于殺細(xì)菌反應(yīng)的其它信息在下文中給出。fhbp基因和/或其編碼的氨基酸序列可能是天然產(chǎn)生的序列或是人工序列。例如，已知制備人工fHBP序列，其摻入來自多種不同天然fHBP序列的特征，參見例如，參考文獻(xiàn)30-33。也了解產(chǎn)生不同家族的fHBP序列的融合物，參見例如，參考文獻(xiàn)33-36。本發(fā)明可用于任何這些人工fHBP序列。這些方法可用于提供可引發(fā)識(shí)別ー個(gè)以上fHBP家族的抗體的fHBP蛋白。因此，給予宿主動(dòng)物吋，fhbp基因編碼的蛋白質(zhì)可有能カ誘導(dǎo)殺細(xì)菌性抗腦膜炎球菌抗體，該抗體識(shí)別SEQ ID NO :I、2和/或3中兩種或三種序列。例如，fhbp基因可能編碼下述任何氨基酸序列參考文獻(xiàn)8的SEQ ID NO :1_45中的各序列；參考文獻(xiàn)8的SEQ ID NO : 79、82、83、85、87、88、89和90 ;參考文獻(xiàn)8的SEQ IDNO =123-142 ;參考文獻(xiàn)5的SEQ ID NO 1-329內(nèi)各氨基酸序列；參考文獻(xiàn)37的SEQ ID NO
2、4、6、8、10 或 12 ;參考文獻(xiàn) 31 的 SEQ ID NO :43、44、52、53、62、63、64 或 65 ;參考文獻(xiàn) 32的 SEQ ID NO :46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、58、59、60、63、64、65、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95 ;參考文獻(xiàn)30的SEQ ID NO :4_80中的各序列；參考文獻(xiàn)38的SEQID NO 4-78中的各序列；參考文獻(xiàn)38的SEQ ID NO =103-138中的各序列。例如，fhbp基因可能編碼包含本文所述SEQ ID N0:12、13和14 (稱為9C、IOA和8B)中任一項(xiàng)的氨基酸序列。脂蛋白體囊泡
本發(fā)明腦膜炎球菌尤其可用于制備保留來自細(xì)菌的外膜蛋白的脂蛋白體囊泡。例如，可通過使用組成型活性FNR過度表達(dá)fHBP來提供富含fHBP的囊泡。這些脂蛋白體囊泡可通過外膜破壞或出泡、形成包含外膜蛋白組分的囊泡而獲得。因此，該術(shù)語包括0MV、出泡、微囊泡(MV[39])和“天然OMV” ( “N0MV” [40])。出泡、MV 和NOMV是天然產(chǎn)生的膜囊泡，在細(xì)菌生長時(shí)自發(fā)形成，釋放到培養(yǎng)基中。MV可以通過以下方法獲得在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)奈瑟球菌，將全細(xì)胞與肉湯培養(yǎng)基中較小的MV分離(例如，通過過濾或低速離心，只沉淀細(xì)胞而不沉淀較小囊泡)，然后從細(xì)胞耗盡的培養(yǎng)基中收集MV (例如，通過過濾、差速離心或MV聚集，通過高速離心沉淀MV)。通?？筛鶕?jù)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的MV的量選擇用于生產(chǎn)MV的菌株，例如文獻(xiàn)41和42描述了具有高M(jìn)V產(chǎn)量的奈瑟氏菌。高出泡菌株可參見參考文獻(xiàn)43。破壞mltA基因[24]也可提供在培養(yǎng)期間自發(fā)釋放合適囊泡的菌株。從細(xì)菌人工制備0MV，可以利用去污劑處理(例如用脫氧膽酸鹽)或通過非去污劑方式(例如參見參考文獻(xiàn)44)進(jìn)行制備。形成OMV的技術(shù)包括用膽酸鹽去污劑(例如，石膽酸、鵝脫氧膽酸、烏索脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、烏索膽酸等的鹽，優(yōu)選用脫氧膽酸鈉[45和46]處理奈瑟球菌)在不會(huì)沉淀去污劑的充分高的pH下[47]處理細(xì)菌。其它技術(shù)基本可以在沒有去污劑存在的情況下[44]利用如超聲、均化、微流化、空化、滲透壓休克、研磨、法式壓制(French press)、混合等技術(shù)進(jìn)行。不使用或使用低去污劑的方法可以保留有用的抗原，如NspA[44]。因此ー種方法可以使用含有O. 5%或更低如約O. 2%、約O. 1%,
<O. 05%或O濃度的脫氧膽酸鹽的OMV提取緩沖液。參考文獻(xiàn)48描述了ー種制備OMV的有用過程，涉及對(duì)粗OMV進(jìn)行超濾，代替高速離心。該過程可以涉及在超濾后進(jìn)行超離心的步驟。如果LOS存在于囊泡中，可以對(duì)囊泡進(jìn)行處理，以將其LOS與蛋白質(zhì)組分聯(lián)系起來(“內(nèi)泡”偶聯(lián)[23])。所述脂蛋白體囊泡可用作免疫原性組合物中的免疫原性組分。形成囊泡的方法可包括從任何活的和/或完整的細(xì)菌分離囊泡的又ー步驟，例如，通過大小分離(如過濾，使用允許囊泡通過但不允許完整細(xì)菌通過的濾器)，或通過離心以使細(xì)胞相對(duì)于囊泡優(yōu)先沉淀(例如低速離心)。免疫原性組合物本發(fā)明提供包含本發(fā)明脂蛋白體囊泡的免疫原性組合物。這些組合物可通過將所述囊泡與藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體和/或免疫佐劑和/或一種或多種其它免疫原性組分配制在一起制備得到。所述免疫原性組合物可包括藥學(xué)上可接受的載體，其可以是本身不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受所述組合物的患者有害的抗體的任何物質(zhì)，且可以實(shí)現(xiàn)無異常毒性的給藥。藥學(xué)上可接受的載體可以包括液體，如水、鹽水、甘油和こ醇。輔助物質(zhì)也可以存在于該類載體中，如濕潤劑或乳化剤、PH緩沖物質(zhì)等。關(guān)于合適載體的充分討論見參考文獻(xiàn)49。奈瑟球菌感染會(huì)影響身體的各個(gè)部分，因此本發(fā)明中的組合物可以制備成各種形式。例如，可將所述組合物制備為液體溶液或懸浮液形式的注射劑。也可制備適合在注射前溶解或懸浮于液體運(yùn)載體的固體形式?？芍苽渌鼋M合物用于局部給藥，例如油膏、乳膏或粉劑?？蓪⑺鼋M合物制備為用于ロ服的制劑，例如，片劑、膠囊或糖漿(任選調(diào)味)?？蓪⑺鼋M合物制備為采用細(xì)粉或噴霧的用于肺部給藥的制劑，例如吸入劑?？蓪⑺鼋M合物制備為栓劑或陰道栓。所述組合物可以制成鼻部、耳部或眼部給藥制劑，例如滴劑。該組合物優(yōu)選無菌。其優(yōu)選無熱原。優(yōu)選用緩沖液處理使其處于例如pH6_pH 8，通常為約pH 7。當(dāng)組合物包含氫氧化鋁鹽時(shí)，有用的是包括組氨酸緩沖劑[50]。本發(fā)明中的組合物可以與人體等張。免疫原性組合物包含免疫有效量的免疫原，以及任何其它所需的其它特定組分?！懊庖哂行Я俊敝冈谝淮蝿┝炕蛞幌盗袆┝康囊徊糠种薪o予個(gè)體的對(duì)治療或預(yù)防有效的量。該量根據(jù)所治療個(gè)體的健康和身體狀況、年齡、所治療個(gè)體的分類組(例如，非人的靈長動(dòng)物、靈長動(dòng)物等)、個(gè)體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護(hù)程度、疫苗配方、治療醫(yī)生對(duì)醫(yī)學(xué)情況的評(píng)估和其它相關(guān)因素而變化。預(yù)計(jì)所述量將落入可通過常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定的較寬范圍內(nèi)。以前有關(guān)腦膜炎球菌囊泡疫苗的工作為本發(fā)明提供了藥學(xué)、生理學(xué)和制劑方面的指南。例如，VA-MENG0C-BC 是可注射懸液，其在O. 5ml中包含吸附于2mg氫氧化鋁凝膠的50μ g菌株Cu-385-83的OMV和50 μ g血清組C莢膜多糖，再加O. 01%硫柳汞和磷酸鹽緩沖 液。MeNZB 也是O. 5ml懸液，并含有吸附于I. 65mg氫氧化鋁佐劑的25 μ g菌株NZ98/254的0MV，以及組氨酸緩沖液和氯化鈉。MenBvac類似于MeNZB ，但由菌株44/76制備得到。各亞型的OMV濃度要足夠高，以便在通過單ー劑量方案或多劑量方案(例如，包括加強(qiáng)劑量)給予患者后提供保護(hù)性免疫。本發(fā)明組合物的OMV濃度通常為10至500yg/ml，優(yōu)選為25至200 μ g/ml，更優(yōu)選為約50 μ g/ml或約100 μ g/ml (用OMV中的總蛋白表示)。所述組合物可與其它免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合給藥?？梢杂糜诒景l(fā)明組合物的佐劑包括但不限于A.含礦物質(zhì)的組合物本發(fā)明中適合用作佐劑的含有礦物質(zhì)的組合物包括礦物鹽，例如鋁鹽和鈣鹽。本發(fā)明包括礦物鹽，如氫氧化物(例如羥基氧化物)、磷酸鹽(例如，羥基磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等，[參見，例如參考文獻(xiàn)54的第8章和第9章]，或不同礦物化合物的混合物，其中的化合物可采取任何合適形式(例如凝膠、晶體、無定形等)，優(yōu)選吸附。也可將含有礦物質(zhì)的組合物制成金屬鹽的顆粒。稱為"氫氧化鋁"的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽(通常至少部分為晶體)?？刹捎眉t外(IR)光譜將式AlO (OH)代表的羥基氧化鋁與其它鋁化合物，如氫氧化鋁Al (OH)3區(qū)別開，具體區(qū)別是lOTOcnr1處存在吸收條帶和3090-3100( ^處存在強(qiáng)肩[參考文獻(xiàn)54的第9章]。半峰高處衍射帶的寬度(WHH)反映了氫氧化鋁佐劑的結(jié)晶程度，結(jié)晶不佳的顆粒因晶體尺寸較小而顯示更強(qiáng)的譜線增寬。表面積隨WHH的増加而增加，WHH值較大的佐劑顯示吸附抗原的能力較強(qiáng)。氫氧化鋁佐劑通常呈纖維形態(tài)(例如，如電子透射顯微圖中所見)。氫氧化鋁佐劑的Pl通常約11，即在生理pH下佐劑本身具有表面正電荷。據(jù)報(bào)道，pH 7. 4時(shí)氫氧化鋁佐劑的吸附容量為I. 8-2. 6毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。稱為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷酸鋁，也常常含有少量硫酸鹽(即羥基磷酸硫酸鋁)?？赏ㄟ^沉淀獲得這些佐劑，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度影響磷酸根取代所述鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽的？04“1摩爾比通常為0.3-1.2。羥基磷酸鹽因存在羥基而有別于嚴(yán)格的A1P04。例如，3164CHT1處的條帶(例如在200°C下)表明存在結(jié)構(gòu)性羥基[參考文獻(xiàn)54的第9章]。磷酸鋁佐劑的P04/A13+摩爾比通常為O. 3-1. 2，優(yōu)選為O. 8-1. 2，更優(yōu)選為0.95±0.1。磷酸鋁通常是無定形的，尤其是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P04/A1摩爾比為O. 84-0. 92的無定形的羥基磷酸鋁，包含O. 6mg Al3Vml0磷酸鋁通常是顆粒(如在透射電子顯微圖上觀察到的板狀形態(tài))?？乖胶箢w粒直徑一般是O. 5-20 μ m(如約5-10 μ m)。據(jù)報(bào)道，pH 7. 4時(shí)磷酸鋁佐劑的吸附容量為O. 7-1. 5毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。磷酸鋁的零電點(diǎn)(PZC )與磷酸對(duì)羥基的取代程度逆相關(guān)，這種取代程度可能取決于用于通過沉淀制備鹽的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度。也通過改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸根=更多酸性PZC)或加入緩沖劑如組氨酸緩沖劑(使PZC堿性更強(qiáng))改變PZC0本發(fā)明所用的磷酸鋁的PZC通常為4. 0-7. 0，更優(yōu)選為5. 0-6. 5，例如約為5. 7。用于制備本發(fā)明組合物的鋁鹽懸浮液可以，但不一定含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸或Tris緩沖液)。該懸浮液優(yōu)選無菌且無熱原。懸浮液可含有游離的水性磷酸根離子，如存在濃度為I. 0-20mM，優(yōu)選5-15mM，更優(yōu)選約10mM。該懸浮液也可含有氯化鈉。在一個(gè)實(shí)施方式中，佐劑組分包括氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。在這種情況下，磷酸鋁多于氫氧化鋁，例如重量比為至少2 1，例如，彡5 : I、彡6 : I、彡7 : I、彡8 : I、彡9 I等。給予患者的組合物中Al+++的濃度優(yōu)選小于10mg/ml,例如< 5mg/ml、< 4mg/ml、
<3mg/ml、< 2mg/ml、< lmg/ml 等。優(yōu)選范圍是 0. 3-lmg/ml。優(yōu)選最大值是< O. 85mg/齊 。B.油乳劑適合用作本發(fā)明佐劑的油乳劑組合物包含鯊烯-水乳剤，如MF59 [參考文獻(xiàn)54的第10章；也參見參考文獻(xiàn)51] (5%鯊烯、O. 5%吐溫80和O. 5%司盤85，用微流化床配制成亞微米顆粒)。也可以使用完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)。已知各種水包油乳剤，它們通常包括至少ー種油和至少ー種表面活性剤，所述油和表面活性劑是可生物降解(可代謝)和生物相容的。乳劑中的油滴直徑通常小于5 μ m，有利地乳液包含具有亞微米直徑的油滴，通過微流化床實(shí)現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定乳剤。優(yōu)選尺寸小于220nm的液滴，因?yàn)槠淇蛇M(jìn)行過濾滅菌。本發(fā)明可使用的油諸如來自動(dòng)物(如魚)或植物的油。植物油的來源包括堅(jiān)果、種籽和谷物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅(jiān)果油的示例。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用其它谷類的油，如小麥、燕麥、黒麥、稻、畫眉草、黑小麥等?？蓮膱?jiān)果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適物質(zhì)制備甘油和1，2_丙ニ醇的6-10碳脂肪酸酷，其不是種籽油中天然產(chǎn)生。來自哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可以用于實(shí)施本發(fā)明。獲得動(dòng)物來源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法的過程為本領(lǐng)域熟知。大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和諸如鯨蠟的鯨油是可以用于本發(fā)明的幾種魚油的示例。通過生化途徑用5-碳異戊ニ烯單位合成許多支鏈油，其總稱為萜類。鯊魚肝油含有稱為鯊烯的支鏈不飽和萜類化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-ニ十四碳六烯。其它優(yōu)選油是生育酚(見下)。包含鯊烯的水包油乳液是特別優(yōu)選的。可以使用油的混合物。
表面活性劑可以按其‘HLB’ (親水/親脂平衡)分類。本發(fā)明優(yōu)選的表面活性劑的HLB為至少10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16?？梢耘c本發(fā)明一起使用的表面活性劑包括但不限于聚氧こ烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80 ;以商品名D0WFAX 出售的環(huán)氧こ烷(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；重復(fù)的こ氧基(氧-1，2-こニ基)數(shù)量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚こ氧基こ醇)；(辛基苯氧基)聚こ氧基こ醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油 醇的聚氧こ烯脂肪醚(稱為芐澤表面活性剤)，如三こニ醇單月桂基醚(芐澤30);以及去水山梨糖醇酯(總稱為司盤)，如去水山梨糖醇三油酸酷(司盤85)和去水山梨糖醇單月桂酸酷。乳液中包含的優(yōu)選表面活性劑是吐溫80 (聚氧こ烯脫水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85 (脫水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，吐溫80等去污劑可提供下文實(shí)施例所見的熱穩(wěn)定性。可使用表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物。聚氧こ烯去水山梨糖醇酯如聚氧こ烯去水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚こ氧基こ醇(曲通X-100)的組合也適合。另ー種有用的組合包含月桂醇聚醚_9加聚氧こ烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。優(yōu)選的表面活性劑的含量(重量％ )為聚氧こ烯去水山梨糖醇酯(如吐溫80) O. 01-1%,特定是約O. I %;辛基-或壬基-苯氧基聚氧こ醇(如曲通XlOO或曲通系列的其它去污劑)0. 001-0. 1%，特定是O. 005-0. 02%;聚氧こ烯醚(如月桂醇聚醚9)0. 1-20%,優(yōu)選O. 1-10 %，特定是O. 1-1 %或約0.5%。本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于 角藍(lán)烯、吐溫80 (Tween 80)和司盤(Span)85的亞微米乳液。所述乳液的體積組成可以是約5%角鯊烯、約O. 5%聚山梨酯80和約O. 5%司盤85。以重量計(jì)，這些比例為4. 3%鯊烯、O. 5%聚山梨酯80和O. 48%司盤85。這種佐劑稱為‘MF59’ [51-53]，參考文獻(xiàn)54的第10章和參考文獻(xiàn)55的第12章更詳細(xì)地描述了該佐劑。.MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如IOmM檸檬酸鈉緩沖液。 包含鯊烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。這些乳液可含有2_10 %鯊烯、2-10%生育酚和O. 3-3%吐溫80，鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選彡I (例如O. 90)，因?yàn)檫@能使乳液更穩(wěn)定。鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5 2，或者重量比約為11 5?？赏ㄟ^將吐溫80溶解于PBS產(chǎn)生2%溶液，然后將90ml該溶液與5g DL- α -生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，隨后使該混合物微流體化來制備ー種這類乳液。得到的乳液可含有如平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴。 鯊烯、生育酚和曲通去污劑(如曲通X-100)的乳液。該乳液也可包含3d-MPL(見下)。所述乳液可包含磷酸鹽緩沖液。 含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污劑(如曲通X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸鹽)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75 11 10(如750 μ g/ml聚山梨酯80、110 μ g/ml曲通X-100和100 μ g/ml琥珀酸α -生育酚)，這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。所述乳液還可包含鯊烯。該乳液也可包含3d-MPL(見下)。所述水相可包含磷酸鹽緩沖液。
鯊?fù)椤⒕凵嚼骢?0和泊洛沙姆401 ( “普流羅尼克 L121，，(" Plur0nicTMLI21"))的乳液。所述乳液可用pH 7. 4的磷酸鹽緩沖鹽水配制。該乳液是ー種有用的胞壁酰ニ肽遞送載體，且已與含蘇氨?；?MDP的“ SAF-1”佐劑[56](O. 05-1% Thr-MDP、5%鯊?fù)椤?. 5%普流羅尼克L121和O. 2%聚山梨酸酯80) —起使用。也可不與Thr-MDP —起使用，例如用“ AF”佐劑[57] (5 %鯊?fù)?、I. 25 %普流羅尼克L121和O. 2%聚山梨酸酯80)。優(yōu)選微流體化。 含有鯊烯、水溶劑、聚氧こ烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(如聚氧こ烯(12)十六十八醚)和疏水性非離子型表面活性劑(如去水山梨糖醇酯或ニ縮甘露醇酯，如去水山梨糖醇單油酸酯或‘司盤80’)的乳液。該乳液優(yōu)選為熱可逆的和/或其中至少90%油滴(以體積計(jì))的尺寸小于200nm[58]。該乳液也可含有以下一種或多種物質(zhì)糖醇；低溫保護(hù)劑(例如，糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。這類乳液可凍干。 含有O. 5-50%油、O. 1-10%磷脂和O. 05_5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻(xiàn)59所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰こ醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌 醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴尺寸。 不可代謝油(如輕質(zhì)礦物油)和至少ー種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液?？砂砑觿?，例如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫?；碥丈隙a(chǎn)生的GPI-0100，如參考文獻(xiàn)60所述)、ニ甲基雙十八烷基溴化銨和/或N，N-雙十八烷基-N，N-雙(2-羥こ基)丙ニ胺。 包含礦物油、非離子親脂性こ氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如，こ氧基化脂肪醇和/或聚氧こ烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[61]。 包含礦物油、非離子親水性こ氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如，こ氧基化脂肪醇和/或聚氧こ烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[61]。 皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[62]。通常在傳遞給病人時(shí)混合組合物中的抗原和佐劑?？梢栽谏a(chǎn)時(shí)或在遞送時(shí)將該乳液與抗原臨時(shí)混合。因此，在包裝或出售的疫苗中該佐劑和抗原可分開保存，使用時(shí)配制成最終制劑。所述抗原通常是水性形式，從而最終通過混合兩種液體制備疫苗。所述兩種液體的混合體積比可變(例如5 1-1 5)，但通常約為I : I。C.皂苷制劑[參考文獻(xiàn)54的第22章]皂苷制劑也可以用作本發(fā)明的佐劑。皂苷是在許多種類植物的樹皮、葉、莖干、根甚至花中發(fā)現(xiàn)的留醇糖苷和三萜糖苷的異質(zhì)群體。已廣泛研究了作為佐劑的得自皂皮樹(Quillaia saponaria Molina)樹皮的阜苷。阜苷也可商品化獲自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥阜草(Saponariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21，以及脂質(zhì)制劑如ISC0M。QS21以商標(biāo)Stimulon 出售。已采用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術(shù)純化的特定組分，包括037、0317、0318、0321、0!^、0!1-8和職-(。所述皂苷優(yōu)選QS21。制備QS21的方法參見參考文獻(xiàn)63。皂苷制劑也可包含留醇，如膽固醇[64]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒[參考文獻(xiàn)54第23章，還參見參考文獻(xiàn)65和66]。ISCOM通常還包含磷脂，如磷脂酰こ醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM優(yōu)選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[67]。開發(fā)基于皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻(xiàn)68和69。D.細(xì)菌或微生物衍生物適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，如腸細(xì)菌的脂多糖(LPS)的無毒衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的無毒衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A (MPL)和3_0_脫?；鵐PL (3dMPL)。3dMPL是3脫-O-?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A與4、5或6酰化鏈的混合物。3脫-O-?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A的優(yōu)選“小顆粒”形式見參考文獻(xiàn)70中所述。3dMPL的這種“小顆粒”小到足以在過濾除菌時(shí)通過O. 22 μ m膜[70]。其它無毒LPS衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A模擬物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物，例如RC-529[71，72]。 脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌的脂質(zhì)A衍生物，如0M-174。例如，參考文獻(xiàn)73和74中描述了 0M-174。適合用作本發(fā)明佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通過磷酸鍵與鳥苷連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文結(jié)構(gòu)或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激作用。CpG可以包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或單鏈。參考文獻(xiàn)75、76和77公開了可能的類似物取代，例如用2’-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻(xiàn)78-83中進(jìn)ー步討論了 CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可能導(dǎo)向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT [84]。CpG序列可特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，如CpG-A 0DN，或更特異地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，如CpG-B ODN0參考文獻(xiàn)85-87中討論了 CpG-A 和 CpG-B ODN。優(yōu)選 CpG 為 CpG-A ODN。CpG寡核苷酸優(yōu)選構(gòu)建成5’末端可被受體識(shí)別。任選將兩個(gè)CpG寡核苷酸序列的3’端相連接形成“免疫聚體”。參見例如，參考文獻(xiàn)88-90。基于免疫刺激性寡核苷酸的特別有用的佐劑被稱為IC-31 [91-93]。因此，本發(fā)明使用的佐劑可以包含(i)和(ii)的混合物(i)含有至少ー個(gè)(優(yōu)選多個(gè))CpI基序(即胞嘧啶與肌苷相連形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40個(gè)核苷酸)，和(ii)聚陽離子聚合物，如含有至少ー個(gè)(優(yōu)選多個(gè))Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5_20個(gè)氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚體序列5' -(IC)13-3' (SEQ ID NO 7)的脫氧核苷酸。聚陽離子聚合物可以是含有l(wèi)l-聚體氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO 8)的肽。這種SEQID NO :7和8的組合提供IC-31 佐劑。細(xì)菌ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物可以用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選所述蛋白衍生自大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素“LT”)、霍亂菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。參考文獻(xiàn)94中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑,參考文獻(xiàn)95中描述了將其用作胃腸道外佐劑。所述毒素和類毒素優(yōu)選全毒素形式，包含A和B亞單位。A亞單位優(yōu)選含有脫毒突變；B亞單位優(yōu)選不突變。所述佐劑優(yōu)選脫毒的LT突變體，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。參考文獻(xiàn)96-103中描述了將ADP-核糖基化毒素及其脫毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐劑。ー種有用的CT突變體是CT_E29H[104]。優(yōu)選根據(jù)參考文獻(xiàn)105中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亞單位的排列對(duì)比對(duì)氨基酸取代基編號(hào)，該參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容特別納入本文作為參考。E.人免疫調(diào)節(jié)劑適合用作本發(fā)明佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[106]等)[107]、干擾素(如干擾素_ Y )、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是IL-12。F.生物粘著劑和粘膜粘著劑生物粘著劑和粘膜粘著劑也可以用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘著劑包括酷化透明質(zhì)酸微球[108]或粘膜粘著劑如聚(丙烯酸)交聯(lián)衍生物、聚こ烯醇、聚こ烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纖維素。殼聚糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑[109]。G.微粒微粒也可以用作本發(fā)明的佐劑。微粒(即直徑為 IOOnm至 150 μ m,更優(yōu)選直徑 200nm至 30 μ m,最優(yōu)選直徑 500nm至 10 μ m的顆粒)由生物可降解的無毒材料(例如，聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酷、聚酐、聚己內(nèi)酯等)形成，優(yōu)選聚丙交酯こ交酯共聚物，并任選經(jīng)處理而具有帶負(fù)電表面(例如用SDS處理)或帶正電表面(例如用陽離子去污劑如CTAB處理)。H.脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)54第13和14章)。適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子見參考文獻(xiàn)110-112所述。I.咪唑并喹諾酮化合物。適合用作本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，"瑞喹莫德3Μ")，見參考文獻(xiàn)113和114所述。本發(fā)明也可包含以上鑒定的一種或多種佐劑各方面的組合。例如，可將以下佐劑組合物用于本發(fā)明(1)皂苷和水包油乳劑[115] ；(2)皂苷(如QS21) +無毒LPS衍生物(如3dMPL)[116] ；(3)皂苷(如QS21)+無毒LPS衍生物(如3dMPL) +膽固醇；(4)皂苷(如QS21) +3dMPL+IL12 (任選+固醇)[117] ； (5) 3dMPL與(例如)QS21和/或水包油乳劑的組合[118] ;(6)SAF，含有10%鯊烯、O. 4%吐溫80 、5%普朗尼克-嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP，或微流體化成為亞微米乳液或渦旋振蕩產(chǎn)生粒度較大的乳液。(7) Ribi 佐劑系統(tǒng)(RAS) (RI公司(Ribi Immunochem))，含有2%鯊烯、O. 2%吐溫80和一種或多種細(xì)菌細(xì)胞壁組分，所述組分選自單磷酰脂質(zhì)A (MPL)、海藻糖ニ霉菌酸酯(TDM)或細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS(Detox );和(8) —種或多種無機(jī)鹽(如鋁鹽)+LPS的無毒衍生物(如3dMPL)。用作免疫刺激劑的其它物質(zhì)可參見參考文獻(xiàn)54的第7章。可用氫氧化鋁佐劑，抗原一般吸附在該鹽上。還優(yōu)選具有包含鯊烯，具有亞微米油滴的水包油乳液是優(yōu)選的，尤其是在年長者中。有用的佐劑組合包括Thl和Th2佐劑的組合，如CpG和鋁鹽，或雷西莫特和鋁鹽?？梢允褂昧姿徜X和3dMPL的組合。除囊泡外，免疫原性組合物可包含一種或多種其它免疫原性組分。這類組分包括但不限于其它腦膜炎球菌抗原和/或非腦膜炎球菌抗原。腦膜炎球菌抗原除了包括上述囊泡外，本發(fā)明組合物還可包括一種或多種其它腦膜炎球菌抗原來提高菌株覆蓋范圍。因此，組合物可以包含多肽或糖，在給予哺乳動(dòng)物時(shí)可以引發(fā)對(duì)腦膜炎球菌具有殺菌作用的抗體應(yīng)答。組合物可包含純化的腦膜炎球菌抗原。下面給出有關(guān)腦膜炎球菌抗原的其它詳情。例如，它可包括腦膜炎球菌抗原287、NadA> NspA、HmbR、NhhA> App>936> Omp85或額外fHBPo 一種組合物(參見參考文獻(xiàn)119和120)可包含以下的ー種或多種包含SEQ ID NO 9的多肽；包含SEQ ID NO 10的多肽；和/或包含SEQ ID NO 11的多肽(或包含SEQ IDNO 11的氨基酸24-350的多肽)。這些多肽優(yōu)選在異源宿主中重組表達(dá)，然后純化，以便(例如)與所述囊泡混合。組合物可包含腦膜炎球菌莢膜糖抗原，例如以偶聯(lián)物形式。本發(fā)明的組合物可包含287抗原。287抗原作為基因NMB2132包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號(hào)GI :7227388 ;本文的SEQID N0:23)。之后已出版了來自許多菌株的287抗原序列。例如，287的等位基因形式如文獻(xiàn)122的圖5和15所示，以及例如文獻(xiàn)123的實(shí)施例13和圖21 (其中的SEQ ID 3179到3184)。已報(bào)導(dǎo)了許多287抗原的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選287抗原包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :23具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、 80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高);和/或(b)包含SEQ IDN0:23的至少'n'個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是7個(gè)或更多個(gè)(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個(gè))。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID N0:23的表位。本發(fā)明最有用的287抗原可在施給對(duì)象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO :23組成的腦膜炎多肽結(jié)合。有利的用于本發(fā)明的287抗原可在施給對(duì)象后引發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。
本發(fā)明的組合物可包含NadA抗體。NadA抗原作為基因NMB1994包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號(hào)GI =7227256 ;本文的SEQID N0:24)。迄今已來自許多菌株的NadA抗原序列，已經(jīng)詳細(xì)公開了作為奈瑟氏菌粘附素的蛋白活性。已報(bào)導(dǎo)了許多NadA的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選Nad多肽包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID勵(lì)24具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO :24的至少'n'個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是7個(gè)或更多個(gè)(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個(gè))。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID N0:24的表位。本發(fā)明最有用的NadA抗原可在施給對(duì)象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO :24組成的腦膜炎多肽結(jié)合。有利的用于本發(fā)明的NadA抗原可在施給對(duì)象后弓丨發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。一個(gè)這種片段是SEQID NO 11 的氨基酸 24-350。
本發(fā)明的組合物可包含NspA抗原。NspA抗原作為基因NMB0663包括在腦膜炎B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號(hào)GI =7225888 ;本文中的SEQID N0:25)。先前文獻(xiàn)124和125提到該抗原。之后已出版了來自許多菌株的NspA抗原序列。已報(bào)導(dǎo)了許多NspA的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選NspA多肽包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :25具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高);和/或(b)包含SEQ IDN0:25的至少'n'個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是7個(gè)或更多個(gè)(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個(gè))。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID N0:25的表位。本發(fā)明最有用的NspA抗原可在施給對(duì)象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO :25組成的腦膜炎多肽結(jié)合。有利的用于本發(fā)明的NspA抗原可在施給對(duì)象后引發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發(fā)明的組合物可包含腦膜炎HmbR抗原。全長HmbR序列作為基因NMB1668包括在腦膜炎B血清組菌株MC58 [121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號(hào)GI :727246 ;本文的SEQ ID NO :26)。本發(fā)明可使用包含HmbR全長序列的多肽，但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在ー些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可包含與SEQ ID NO :26具有序列相同性的氨基酸序列，其中i值為50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的HmbR序列可包含SEQ ID NO :26的至少j個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中j值為 7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更高。在其它實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可包含一氨基酸序列，(i)其與SEQ ID NO26具有序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO 26中至少j個(gè)連續(xù)氨基酸的片段。 優(yōu)選j個(gè)氨基酸的片段包含來自SEQ ID NO 26的表位。這些表位通常包含位于HmbR表面上的氨基酸。有用的表位包括涉及HmbR與血凝素結(jié)合的氨基酸，因?yàn)榕c這些位點(diǎn)結(jié)合的抗體能夠封閉細(xì)菌與宿主血凝素結(jié)合的能力。HmbR的拓?fù)鋵W(xué)及其關(guān)鍵功能性殘基如文獻(xiàn)126所述。本發(fā)明最有用的HmbR抗原可在施給對(duì)象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO26組成的腦膜炎多肽結(jié)合。有利的用于本發(fā)明的HmbR抗原可在施給對(duì)象后引發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發(fā)明的組合物可包含NhhA抗體。NhhA抗原作為基因NMB0992包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號(hào)GI =7226232 ;本文的SEQID N0:27)。自從例如文獻(xiàn)122和127已出版了來自許多菌株的NhhA抗原序列，也已報(bào)導(dǎo)了許多NhhA的免疫原性片段。它也稱為Hsf。本發(fā)明所用的優(yōu)選NhhA抗原包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :27具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%、75%、80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高);和/或(b)包含SEQ IDN0:27的至少'n'個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是7個(gè)或更多個(gè)(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個(gè))。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID N0:27的表位。本發(fā)明最有用的NhhA抗原可在施給對(duì)象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO :27組成的腦膜炎多肽結(jié)合。有利的用于本發(fā)明的NhhA抗原可在施給對(duì)象后引發(fā)殺菌性抗腦膜炎抗體。本發(fā)明的組合物可包含App抗原。App抗原作為基因NMB1985包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號(hào)GI :7227246 ;本文的SEQID N0:28)。之后已出版了來自許多菌株的App抗原序列。已報(bào)導(dǎo)了許多App的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選App多肽包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO : 28具有50%或更高的相同性(如 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%、99· 5%或更高);和/或(b)包含 SEQ ID N0:28 的至少,n'個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是7個(gè)或更多個(gè)(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250 或更多個(gè))。(b)的優(yōu)選片段包含來自 SEQ ID NO:28的表位。本發(fā)明最有用的App抗原可在施給對(duì)象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ IDNO 28組成的腦膜炎多肽結(jié)合。有利的用于本發(fā)明的App抗原可在施給對(duì)象后引發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發(fā)明的組合物可包含0mp85抗原。0mp85抗原作為基因NMB0182包括在奈瑟球菌B血清組菌株MC58[121]的出版的基因組序列中(GenBank登錄號(hào)GI =7225401 ;本文的SEQ ID NO :29)。之后已出版了來自許多菌株的0mp85抗原序列。0mp85的其它信息可見文獻(xiàn)128和129。已報(bào)導(dǎo)了許多0mp85的免疫原性片段。本發(fā)明所用的優(yōu)選Omp抗原包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID N0:29具有50%或更高的相同性(如60%、65%、70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID N0:29的至少'n'個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是7 個(gè)或更多個(gè)(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多個(gè))。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID N0:29的表位。本發(fā)明最有用的0mp85抗原可在施給對(duì)象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO :29組成的腦膜炎多肽結(jié)合。有利的用于本發(fā)明的0mp85抗原可在施給對(duì)象后引發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體。本發(fā)明的組合物可包含936抗原。936抗原作為基因NMB2091包括在腦膜炎B血清組菌株MC58[130]的出版的基因組序列中(本文的SEQ ID NO :22)。本發(fā)明所用的優(yōu)選 936抗原包含某氨基酸序列，該序列(a)與SEQ ID NO :22具有50%或更高的相同性(如60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%、99. 5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID N0:22的至少'n'個(gè)連續(xù)氨基酸的片段，其中'n'是 7 個(gè)或更多個(gè)(如 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多個(gè))。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO :22的表位。本發(fā)明最有用的936抗原可在施給對(duì)象后引起抗體，其能與氨基酸序列SEQ ID NO :22組成的腦膜炎多肽結(jié)合。936抗原是fHBP的良好融合伴侶(例如見文獻(xiàn)119和120)。這些抗原優(yōu)選以基本純或基本分離的形式(即基本不含其它奈瑟球菌或宿主細(xì)胞多肽)或基本分離的形式制備。一般來說，在非天然發(fā)生環(huán)境中提供所述多肽，例如，將其從非天然發(fā)生環(huán)境中分離出。在一些實(shí)施例中，目標(biāo)多肽存在于相對(duì)于對(duì)照該多肽富集的組合物中。照此提供純化多肽，其中純化指所述多肽存在于基本不含其它表達(dá)多肽的組合物中，其中基本不含指所述組合物少于90%、通常少于60%、更加通常少于50%的部分由其它表達(dá)多肽構(gòu)成。術(shù)語“多肽”指任何長度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是線性或支鏈聚合物，可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，可以被非氨基酸打斷。該術(shù)語也包括天然方式或通過人工介入修飾的氨基酸聚合物；例如，ニ硫鍵形成、糖基化、脂化、こ?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮骰蛐揎?，如與標(biāo)記組分偶聯(lián)。該定義也包括，例如，含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本領(lǐng)域已知的其它修飾。多肽可以以單鏈或結(jié)合鏈的形式產(chǎn)生。本發(fā)明組合物可包括來自腦膜炎球菌血清組A、C、W135和Y中1、2、3或4種的偶聯(lián)的莢膜糖抗原?，F(xiàn)有的血清組C 疫苗(Menjugate [131]，Meningitec11^P NeisVac-C )含有偶聯(lián)糖。Menjugate 和Meningitec 具有與CRM197載體偶聯(lián)的寡糖抗原，而NeisVac-C 使用的是與破傷風(fēng)類毒素載體偶聯(lián)的完整多糖(去-O-こ?；?。Menactra 疫苗含有血清組Y、W135、C和A各組的偶聯(lián)莢膜糖抗原。本發(fā)明中的組合物可以包含腦膜炎球菌血清組Y、W135、C和A中一組或多組的莢膜糖抗原，其中所述抗原與載體蛋白偶聯(lián)且/或其為寡糖。例如，所述組合物可以包含來自以下的莢膜糖抗原血清組C;血清組A和C;血清組A、C和W135 ;血清組A、C和Y ;血清組C、W135和Y ;或血清組A、C、W135和Y全部四組。每劑量各腦膜炎球菌糖抗原的通常量為I μ g_20l·! g，例如，約I μ g、約2. 5μ g、約4 μ g、約5 μ g或約10 μ g(以糖表達(dá))。在混合物包含血清組A和C的莢膜糖吋，MenA糖與MenC糖的比例(w/w)可以大于1(例如，2 1、3 1、4 1、5 : 1、10 : I或更高)。在混合物包含血清組Y與血清組C和W135中一組或兩組的莢膜糖時(shí)，MenY糖和MenW135糖的比例(w/w)可以大于I (例如，2 : 1、3 : 1、4 1、5 UlO I或更高)，且/或MenY糖和MenC糖的比例(w/w)可以小于I (例如，I : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5或更低)。血清組A C W135 Y的糖的優(yōu)選比例(w/w)為1 : I : I : I ;1 : I : I : 2 ;2 : I : I : I ;4 : 2 : I : I ;8 : 4 : 2 : I ; 4 2 I 2 ；8 4 I 2 ；4 2 2 I ；2 2 I I ；4 4 2 I ；2 : 2 : I : 2 ;4 : 4 : I : 2 ;和2 : 2 : 2 : I。血清組C W135 Y的糖的優(yōu)選比例(w/w)為1 : I : I ;1 : I : 2 ;1 : I : I ;2 : I : I ;4 : 2 : I ;2 : I : 2 ;4 : I : 2 ;2 : 2 : I ;和2 : I : I。優(yōu)選使用質(zhì)量基本相等的各種糖。使用的莢膜糖可以是寡糖形式。通過對(duì)純化莢膜多糖進(jìn)行片段化(例如通過水解)可以方便地形成寡糖，片段化后通常要純化所需大小的片段。可進(jìn)行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最終小于30(例如，血清組A為10到20，優(yōu)選約10 ;血清組W135和Y為15到25，優(yōu)選約15-20 ;血清組C為12到22等)?？赏ㄟ^離子交換色譜或比色測(cè)定方便地測(cè)定DP[132]。如果進(jìn)行水解，通常對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行篩分，以去除短鏈寡糖?？捎酶鞣N方法如超濾后進(jìn)行離子交換色譜達(dá)到此目的。對(duì)血清組A來說，優(yōu)選去除聚合程度小于或等于約6的寡糖；對(duì)血清組W135和Y來說，優(yōu)選去除聚合程度小于4左右的寡糖。參考文獻(xiàn)131描述了 Menjugate 中使用的優(yōu)選MenC糖抗原。所述糖抗原可以經(jīng)化學(xué)修飾。這對(duì)降低血清組A的水解特別有用[133 ;見下文]?？梢赃M(jìn)行腦膜炎球菌糖的脫-O-こ酰化。對(duì)寡糖的修飾可以在解聚之前或之后進(jìn)行。本發(fā)明中的組合物包含MenA糖抗原時(shí)，優(yōu)選所述抗原為天然糖上有ー個(gè)或多個(gè)羥基被封閉基團(tuán)取代的修飾糖[133]。該修飾可以改善耐水解性。本發(fā)明組合物中的莢膜糖通常會(huì)與載體蛋白偶聯(lián)。通常，偶聯(lián)可以增強(qiáng)糖的免疫原性，因?yàn)榕悸?lián)可以將糖由T-非依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門-依賴性抗原，由此允許免疫記憶的引發(fā)。偶聯(lián)對(duì)兒科疫苗特別有用，是ー項(xiàng)眾所周知的技木。典型的載體蛋白是細(xì)菌毒素，如白喉或破傷風(fēng)毒素，或者其類毒素或突變體。可以使用CRM197白喉毒素突變體[134]，其為PREVNAR 產(chǎn)品中的載體。其他合適的載體蛋白包括，腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[135]、合成肽[136，137]、熱激蛋白[138，139]、百日咳蛋白[140，141]、細(xì)胞因子[142]、淋巴因子[142]、激素[142]、生長因子[142]、含有各種病原體衍生抗原的多種人⑶4+T細(xì)胞表位的人造蛋白[143]如N19[144]、流感嗜血桿菌的D蛋白[145-147]、肺炎球菌溶血素[148]或其無毒衍生物[149]、肺炎球菌表面蛋白PspA[150]、鐵攝取蛋白[151]、艱難梭菌(C. difficile)的毒素A或B[152]、重組金黃色葡萄球菌胞外蛋白 A(rEPA) [153]等等。
可采用任何合適的偶聯(lián)反應(yīng)，必要時(shí)采用任何合適的接頭。一般在偶聯(lián)前活化或官能化所述糖。活化可包括例如用氰化試劑如CDAP(如I-氰基-4-ニ甲基氨基四氟硼酸吡啶[154，155等])。其它合適的技術(shù)采用碳ニ亞胺、酰肼、活性酷、降冰片烷、對(duì)硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU等?？捎萌魏我阎椒?，如參考文 獻(xiàn)156和157所述的方法通過接頭基團(tuán)進(jìn)行連接。ー種連接類型包括多糖的還原性胺化，將得到的氨基與己ニ酸接頭基團(tuán)的一端偶聯(lián)，然后將蛋白質(zhì)偶聯(lián)于該己ニ酸接頭基團(tuán)的另一端[158，159]。其它接頭包括B-丙酰胺基[160]、硝基苯基-こ基胺[161]、鹵代?；u化物[162]、配糖鍵[163]、6_氨基己酸[164]、ADH[165]、C4-C12部分[166]等。作為采用接頭的替代方法，可以采用直接連接。直接連接蛋白質(zhì)可包括氧化多糖，然后與蛋白質(zhì)進(jìn)行還原性胺化，如參考文獻(xiàn)167和168所述。優(yōu)選包括以下步驟的方法將氨基引入到糖中(例如用-NH2取代末端=O基團(tuán))，然后用己ニ酸ニ酯(例如己ニ酸N-羥基琥珀酰亞胺基ニ酷)衍生后，與載體蛋白反應(yīng)。另一種優(yōu)選的反應(yīng)采用將CDAP與蛋白D載體進(jìn)行活化，例如用于MenA或MenC。非腦膜炎球菌抗原組合物可包括非腦膜炎球菌抗原，例如來自非腦膜炎球菌病原體，如細(xì)菌或病毒的抗原。因此，組合物可以包括ー種或多種下列其它抗原-來自肺炎鏈球菌的糖抗原-來自甲型肝炎病毒如滅活病毒的抗原-來自こ型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原-白喉抗原，如白喉類毒素-破傷風(fēng)抗原，如破傷風(fēng)類毒素-來自百日咳博德特菌(Bordetellapertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，也可任選與百日咳桿菌黏附素(百日咳桿菌粘附素)和/或凝集原2和3的組合-來自こ型流感嗜血桿菌的糖抗原-脊髓灰質(zhì)炎抗原如IPV-來自粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)的抗原-來自無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae) (B組鏈球菌)的蛋白質(zhì)和/或糖抗原-來自嗜熱鏈球菌(Streptococcuspyogenes) (A組鏈球菌)的抗原-來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抗原所述組合物可以包含ー種或多種這些其它抗原。必要時(shí)，可使有毒的蛋白質(zhì)抗原脫毒(如通過化學(xué)和/或遺傳方式使百日咳毒素脫毒)。在所述組合物中包含白喉抗原時(shí)，也優(yōu)選包含破傷風(fēng)抗原和百日咳抗原。相似地，在包含破傷風(fēng)抗原時(shí)，也優(yōu)選包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包含百日咳抗原時(shí)，也優(yōu)選包含白喉和破傷風(fēng)抗原。因此，優(yōu)選DTP組合。糖抗原優(yōu)選偶聯(lián)物形式。上文中更詳細(xì)地討論所述偶聯(lián)物的載體蛋白。所述組合物中各抗原的濃度一般是至少I μ g/ml。通常，任何給定抗原的濃度將足以弓I發(fā)針對(duì)該抗原的免疫反應(yīng)。免疫除提供上述免疫原性組合物外，本發(fā)明還提供ー種在哺乳動(dòng)物中引起抗體應(yīng)答的方法，包括將本發(fā)明的免疫原性組合物給予所述哺乳動(dòng)物。所述抗體應(yīng)答優(yōu)選地為保護(hù)性和/或殺菌性抗體應(yīng)答。本發(fā)明也提供這類方法中所用的本發(fā)明組合物。
本發(fā)明還提供了一種保護(hù)哺乳動(dòng)物免受奈瑟球菌(例如腦膜炎奈瑟球菌)感染的方法，包含將本發(fā)明中的免疫原性組合物給予所述哺乳動(dòng)物。本發(fā)明提供用作藥物(例如，用作免疫原性組合物或疫苗)的本發(fā)明組合物。本發(fā)明還提供本發(fā)明囊泡在制備防止奈瑟球菌(例如腦膜炎球菌)感染哺乳動(dòng)物的藥物中的應(yīng)用。所述哺乳動(dòng)物優(yōu)選人。所述人可以是成人，或優(yōu)選是兒童。當(dāng)預(yù)防性使用疫苗吋，人優(yōu)選為兒童(如幼童或嬰兒)；當(dāng)疫苗用于治療用途時(shí)，人優(yōu)選為成人。準(zhǔn)備給予兒童的疫苗也可給予成年人，例如用以評(píng)估安全性、劑量、免疫原性等。所述用途和方法特別適用于防止/治療包括但并不限于腦膜炎(特別是細(xì)菌性的腦膜炎，如腦膜炎球菌性腦膜炎)和菌血癥的疾病。治療性措施的功效可以通過在給予本發(fā)明中的組合物后對(duì)奈瑟球菌感染進(jìn)行監(jiān)測(cè)來測(cè)試。可通過監(jiān)測(cè)在施用組合物后針對(duì)fHBP或其它抗原的免疫應(yīng)答測(cè)試預(yù)防性治療的效力。本發(fā)明組合物的免疫原性可以通過給予受試對(duì)象(例如，12-16個(gè)月大的兒童或動(dòng)物模型[169])，然后測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，包括血清殺菌抗體(SBA)和ELISA效價(jià)(GMT)來進(jìn)行測(cè)定。通常在給予該組合物后約4周測(cè)定這些免疫應(yīng)答，并與給予該組合物之前測(cè)定的值作比較。優(yōu)選至少4倍或8倍的SBA增長。給予ー個(gè)以上劑量的組合物時(shí)，可以進(jìn)行一次以上的給藥后測(cè)定。本發(fā)明中的優(yōu)選組合物可以在患者體內(nèi)產(chǎn)生優(yōu)于可接受百分比的人對(duì)象各抗原組分血清保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)的抗體效價(jià)。具有相關(guān)抗體效價(jià)的抗原是眾所周知的，高于該效價(jià)就認(rèn)為宿主針對(duì)所述抗原發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，該類效價(jià)由如WHO —類的組織公布。優(yōu)選多于80%的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的對(duì)象樣品發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，更優(yōu)選多于90%，更優(yōu)選多于93%，最優(yōu)選96-100%。本發(fā)明的組合物通常直接給予患者?？梢酝ㄟ^胃腸外注射(例如，皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或給予到組織間隙)，或通過直腸、ロ服、陰道、外用、透皮、鼻內(nèi)、眼部、耳部、肺部或其它粘膜給藥途徑完成直接遞送。優(yōu)選在大腿或上臂進(jìn)行肌肉內(nèi)給藥。注射可以通過針頭(例如皮下針頭)進(jìn)行，但也可以采用無針注射。通常的肌肉內(nèi)劑量為約O. 5ml。本發(fā)明可用來引發(fā)全身和/或粘膜免疫。劑量治療可采用單劑量方案或多劑量方案。多劑量可以用于初次免疫方案和/或加強(qiáng)免疫方案。初次給藥方案之后，可以進(jìn)行加強(qiáng)給藥方案?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法確定初次劑量之間(例如4-16周)以及初次和加強(qiáng)劑量之間的適當(dāng)時(shí)機(jī)。殺菌應(yīng)答優(yōu)選的免疫原性組合物可以弓I發(fā)對(duì)腦膜炎球菌具有殺菌作用的抗體應(yīng)答?？梢苑奖愕販y(cè)定小鼠的殺菌性抗體應(yīng)答，其為疫苗功效的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)[例如，見參考文獻(xiàn)170的尾注14]。本發(fā)明組合物可以優(yōu)選地引發(fā)對(duì)來自下列三個(gè)菌株組中至少兩組的每組的至少ー種腦膜炎奈瑟球菌菌株具有殺菌作用的抗體應(yīng)答(I)MC58、gbl85( = M01-240185)、m4030、m2197、m2937、isslOOl、NZ394/98、67/00,93/114, bzl98、ml390、nge28、lnpl7592、00_241341、f6124、205900、ml98/172、bzl33、gbl49( = M01-240149)、nm008、nm092、30/00、39/99、72/00、95330、bzl69、bz83、cu385、h44/76、ml590、m2934、m2969、m3370、m4215、m4318、n44/89、14847。(II)961-5945、2996、96217、312294、11327、 a22、 gb013( = M01-240013)、 e32、ml090、m4287、860800、599、95N477、90-18311、cll、m986、m2671、1000、ml096、m3279、bz232、dk353、m3697、ngh38、L93/4286。(III)M1239,16889，gb355 ( = M01-240355)，m3369, m3813, ngpl65。例如，組合物可以引發(fā)對(duì)血清組B腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58、961-5945和M1239中的兩個(gè)或三個(gè)菌株有效的殺菌反應(yīng)。組合物可以優(yōu)選地引發(fā)對(duì)至少50% (例如，60%、70%、80%、90%、95%或更多)的臨床相關(guān)腦膜炎球菌血清組B菌株具有殺菌作用的抗體應(yīng)答。所述組合物可引發(fā)抗體應(yīng)答，其對(duì)B血清組的腦膜炎奈瑟球菌以及血清組A、C、W135和Y中的至少ー組(例如1、2、
3、4)的菌株具有殺菌性。所述組合物可引起對(duì)淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)和/或灰色奈瑟球菌(N. cinerea)菌株具有殺菌性的抗體應(yīng)答。所述組合物可以引發(fā)對(duì)來自參考文獻(xiàn)2中圖5所示的系統(tǒng)樹的三條主分枝中的至少兩條分枝的菌株具有殺菌作用的反應(yīng)。組合物可以引發(fā)對(duì)超毒カ譜系ET-37、ET_5、A4簇、譜系3、亞組I、亞組III和亞組IV-I中至少2個(gè)(例如，2、3、4、5、6、7)譜系的腦膜炎奈瑟球菌菌株具有殺菌作用的抗體應(yīng)答[171，172]。組合物還可以誘導(dǎo)對(duì)一個(gè)或多個(gè)高侵襲性譜系的殺菌性抗體應(yīng)答。組合物可以引發(fā)對(duì)下列多基因座序列類型中至少2個(gè)(例如，2、3、4、5、6、7)類型的腦膜炎奈瑟球菌菌株具有殺菌作用的抗體應(yīng)答ST1、ST4、ST5、ST8、STlU ST32和ST41[173]。所述組合物還可以引發(fā)對(duì)ST44菌株具有殺菌作用的抗體應(yīng)答。所述組合物不需要誘導(dǎo)針對(duì)指定譜系或MLST中各個(gè)和每個(gè)MenB菌株的殺菌性抗體；相反，對(duì)具體超毒力譜系或MLST中更多個(gè)血清組B腦膜炎球菌菌株中的任何四個(gè)菌株的特定組來說，所述組合物誘導(dǎo)的抗體優(yōu)選地對(duì)所述組的至少50% (例如，60%、70%、80%、90%或更多)具有殺菌作用。優(yōu)選的菌株組包括下面的國家中至少四個(gè)所分離到的菌株:GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清優(yōu)選地具有至少為1024(例如，21Q、2n、212、213、214、215、216、217、218或更高，優(yōu)選至少為214)的殺菌效價(jià)，即所述血清可以在以I 1024稀釋后殺死ー個(gè)特定菌株中至少50%的測(cè)試細(xì)菌，如參考文獻(xiàn)170的尾注14所述。優(yōu)選的組合物可以引發(fā)小鼠中的抗體應(yīng)答，甚至在血清以I : 4096稀釋或更稀時(shí)仍保持殺菌性。概述術(shù)語“包含”涵蓋“包括”以及“由……組成”，例如，“包含”X的組合物可以僅由X組成或可以包括其它物質(zhì)，例如X+Y。與數(shù)值X相關(guān)的術(shù)語“約”是可選的并表示例如x±10%。術(shù)語“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含” Y的組合物可能完全不含Y。優(yōu)選通過MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))執(zhí)行的Smith-Waterman同源性捜索算法，利用仿射缺ロ捜索測(cè)定“序列相同性”，參數(shù)為缺ロ開放、罰分=12,缺ロ延伸罰分=I。腦膜炎球菌分類在血清組之后包括血清型、血清亞型和免疫型，標(biāo)準(zhǔn)命名法包括血清組、血清型、血清亞型和免疫型，彼此之間由冒號(hào)隔開，例如B:4:P1. 15:L3，7，9。在血清組B中，一些譜系經(jīng)常引起疾病(高侵襲性)，一些譜系引起比其它譜系更嚴(yán)重形式的疾病(超毒力)，其余的很少引起疾病。識(shí)別出7個(gè)超毒カ譜系，即亞組I、III和IV-1、ET-5復(fù)合體、ET-7復(fù)合體、A4簇和譜系3。通過多座位酶電泳(MLEE)對(duì)這些進(jìn)行了定義，但是也可以使用多座位序列分型(MLST)對(duì)腦膜炎球菌分類[參考文獻(xiàn)173]。4種主要的超毒力簇是ST32、ST44、ST8和STll復(fù)合體。附圖
簡要說明圖I顯示圍繞nmbl869基因的起始密碼子的基因組序列(SEQ ID NO 17)。圖2顯示圍繞fhbp基因的起始密碼子的基因組序列(SEQ ID NO 18)。
圖3顯示各種菌株中短和長fhbp轉(zhuǎn)錄物的northern印跡。圖4顯示多種菌株中三種不同蛋白的Western印跡。
具體實(shí)施例方式其它信息可由參考文獻(xiàn)174獲得。腦膜炎奈瑟球菌MC58菌株中fhbp基因座的分析fhbp基因側(cè)接于nmb 1869(果糖-雙磷酸醛縮酶)和nmbl871基因。轉(zhuǎn)錄終止子分析揭不出fhbp基因下游Ilnt的Rho非依賴性終止子的典型莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在nmbl869和fhbp基因的GTG起始密碼子之間有157bp的基因間區(qū)。在nmbl869基因下游20個(gè)核苷酸處的該基因間區(qū)中，存在另ー推定的Rho非依賴性轉(zhuǎn)錄終止子。這些有關(guān)基因座的初步觀察結(jié)果提示，fhbp基因可能轉(zhuǎn)錄成ー個(gè)基因并且不是操縱子成員。對(duì)MC58的總RNA進(jìn)行RT-PCR分析顯示產(chǎn)生跨上游基因間區(qū)、而不是下游基因間區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物，這提示fhbp可與上游nmbl869基因一起轉(zhuǎn)錄。對(duì)MC58野生型菌株、NMB1869無效突變體(Λ nmb 1869)和fhbp無效突變體(Afhbp)菌株的總RNA進(jìn)行Northern印跡分析顯示出> 2000nt的長轉(zhuǎn)錄物,在野生型菌株中通過fhbp和nmbl869探針檢測(cè)到,但在兩個(gè)突變株中不存在。該轉(zhuǎn)錄物的預(yù)計(jì)大小與雙順反子信使的預(yù)計(jì)大小良好對(duì)應(yīng)，并驗(yàn)證了 nmbl869和fhbp基因的共同轉(zhuǎn)錄。還在野生型和Anmbl869突變菌株中檢測(cè)到剛好低于IOOOnt的較短fhbp特異性mRNA，這提示存在fhbp單順反子轉(zhuǎn)錄物。此外,雙順反子信使的轉(zhuǎn)錄被消除時(shí)Anmbl869突變體中存在這種較短轉(zhuǎn)錄物表明較短的fhbp轉(zhuǎn)錄物是因自身專用啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的fhbp基因轉(zhuǎn)錄而來,而不是加工較長轉(zhuǎn)錄物的結(jié)果。此夕卜，nmb 1869探針在野生型菌株和fhbp無效菌株中檢測(cè)到 IlOOnt的較小的nmbl869特異性轉(zhuǎn)錄物，表明也產(chǎn)生nmbl869上游基因的單順反子轉(zhuǎn)錄物?？傊?，這些結(jié)果表明兩種不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)nmbl869和fhbp基因座的三種不同mRNA轉(zhuǎn)錄物的合成。nmb 1869和fhbp基因由其專用啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄到單順反子轉(zhuǎn)錄物上,但也由nmbl869上游的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)共同轉(zhuǎn)錄到雙順反子轉(zhuǎn)錄物上。較長的雙順反子轉(zhuǎn)錄物很可能由無效終止產(chǎn)生，導(dǎo)致NMB1869下游轉(zhuǎn)錄終止子的通讀。由生長至對(duì)數(shù)中期的腦膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)培養(yǎng)物提取的總RNA進(jìn)行引物延伸，以確定mRNA的啟動(dòng)點(diǎn)。nmbl869-特異性引物與來自MC58的總RNA雜交，并用逆轉(zhuǎn)錄酶延長。主要延長產(chǎn)物從nmbl869轉(zhuǎn)錄物的Y末端到其起始密碼子上游29個(gè)核苷酸的位置(圖I)。還用來自MC58和Λ 1869突變體的總RNA進(jìn)行fhbp特異性引物延伸，該項(xiàng)工作從fhbp單順反子轉(zhuǎn)錄物的起點(diǎn)開始,到fhbp的起始密碼子上游45個(gè)核苷酸的位置(圖2)。在每種情況下，延長引物上游的核苷酸序列顯示存在類似于大腸桿菌(E. coli)σ 70依賴性啟動(dòng)子的-10和-35六聚體的元件(圖I和2)。這些序列應(yīng)限定腦膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)Pnmb 1869 和 Pfhbp 啟動(dòng)子。 鑒定這兩個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) 合成三條mRNA后，研究它們的調(diào)節(jié)機(jī)制。在不同氧氣條件下研究fhbp基因的表達(dá)情況。由生長至對(duì)數(shù)中期后接觸微好氧條件(+)或氧氣限制條件(-)30分鐘的野生型菌株和fnr無效突變體提取總RNA。進(jìn)行Northern印跡分析，以分析兩種fHBP轉(zhuǎn)錄物的水平(圖3)。野生型在氧氣限制期間上調(diào)單順反子轉(zhuǎn)錄物(泳道2與泳道I)，但在fnr無效突變體中沒有這種現(xiàn)象(泳道3和4)，這表明在氧氣限制下FNR介導(dǎo)誘導(dǎo)。為了驗(yàn)證FNR依賴性調(diào)節(jié)，采用在染色體的異源位點(diǎn)中表達(dá)ー個(gè)拷貝的fnr基因的突變體菌株。在這種Afnr_C菌株中，fhbp單順反子mRNA的上調(diào)在氧氣限制條件下恢復(fù)(泳道5和6)。此外，在氧氣限制條件下較長的雙順反子轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平較低，但似乎不是FNR依賴性調(diào)節(jié)。組成型活性腦膜炎球菌FNR雖然參考文獻(xiàn)29已將fhbp基因鑒定為FNR調(diào)節(jié)子的可能成員，但它沒有提供實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，并且沒有意識(shí)到兩種不同fhbp轉(zhuǎn)錄物的存在，其中只有ー種是FNR活化的。為了進(jìn)ー步驗(yàn)證FNR活化活性,產(chǎn)生FNR蛋白的組成型活性形式。已知可修飾大腸桿菌的FNR，以使其[4Fe_4S]簇是O2穩(wěn)定的。實(shí)現(xiàn)此種穩(wěn)定性的ー個(gè)突變是D148A，其中Asp-148 (例如，在SEQ ID NO :6中，大腸桿菌菌株CFT073)突變?yōu)锳la。FNR的推定ニ聚化結(jié)構(gòu)域中發(fā)生此單氨基酸取代產(chǎn)生組成型活性蛋白，其可在氧氣存在下用作轉(zhuǎn)錄激活物[175]。大腸桿菌序列SEQ ID NO 6與腦膜炎球菌序列(SEQ ID NO 4)的比對(duì)為
SEQID4 MASHMTTHQMKT—----LCSSCSLRELOiPVGLLPMELSOLDAVlROSRRLKKGEYtrc 54
SEQID6· HIPEKRIIRRIQSGGCAIttCQDCSISQI.CIPFTl,NEHELOQLDNlIEMKPlQKGQTtrK 60
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SEQID^ VOEAFTSLFAIRSGFFKffWSQDGRIX}VTGFFMSGELIGMDGICSHVHSCD WALEDSE 114SEQID6MDEI,KSLraiESGTIKSrTITEQGOSQITCFfiLAGDLVGrDAIGSGHHP'SrAQALETSM 120
.* : ; *
SEQID 與 VCELPFfH lEELGaHlPSLRTMFFRMMSRElVRWVMLLLGNHM^EBlMFLLNLSaR 174 SEOX06 VCEIPFETLDDLSamPNLROOMMRLHSGEIKGDgDHILLLSKKNAEERLMFiyNLSRB ISQ
** * . # *. , , . ^ 龠知 ■* ·Λ ^ . ι * * * · ,4* 4-
SEQlM LYSEGF^KDFlIiRMSREElGSYLGLKLETVSRTLS^fBQEGLISVEHKHlKlMLQVLK 234
FhQmFsmETRhTmmmGmmhivETisBLLQBrQKsanhhmGKYijiEmuhLh 240
*■ ·* < # * * *夤#-,·· * Jk .★ t
SEQiD4i^vsgcshax 24 禮
SEQi os QLmmmm 2 so盡管這兩條序列的總體相同性低(40% )，大腸桿菌殘基D154(下劃線)也出現(xiàn)在腦膜炎球菌序列的殘基148處。利用定位誘變代替編碼腦膜炎球菌序列的Asp-148的密碼子，并用GCC丙氨酸密碼子代替它。該修飾基因和其編碼蛋白在下文中稱為“fnrD148A”。用紅霉素抗性盒取代整個(gè)編碼序列，以產(chǎn)生腦膜炎球菌的Afnr無效突變體[29]。為了補(bǔ)償fnr無效突變體，將Ptac啟動(dòng)子控制下的野生型fnr或D148A突變體fnr基因整合到Afnr的染色體中會(huì)聚的ORF NMB1428和NMB1429之間，具體是分別用pCompInd-fnr 或 pCompInd_fnrD148A 轉(zhuǎn)化 Δ fnr 菌株。pCompInd-fnr 是 pCompInd 的衍生質(zhì)粒，其中野生型fnr基因由MC58基因組擴(kuò)增而來并作為732bp NdeI/NsiI片段克隆到Ptac啟動(dòng)子下游。pCompInd_fnrD148A質(zhì)粒是編碼fnrD148A的pCompInd-fnr的衍生物。用QuickChange 試劑盒(司查塔基(Stratagene) )將突變引入pCompInd-fnr中。用pCompInd-fnr或pCompInd_fnrD148A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Δ fnr菌株。而且，為了產(chǎn)生從突變基
因的整合拷貝表達(dá)FnrD148A蛋白的重組菌株，將pCompInd-fnrD148A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到腦膜炎球菌分離物 H44/76、4243、F6124、M6190、LNP17592, M01-240345、NM117、LNP17094, B3937、M01-240013、M3153、5/99、BZ232、1000、0X99. 30304 中，產(chǎn)生各菌株的衍生物。為了轉(zhuǎn)化天然感受態(tài)的腦膜炎奈瑟球菌，將四個(gè)或五個(gè)新鮮培養(yǎng)過夜的單菌落重懸于20 μ I PBS,打點(diǎn)到GC瓊脂平板上，平板中加入5-10 μ g線性質(zhì)粒DNA，干燥，并于37°C孵育4-8小吋。然后，在含有合適抗生素的平板上選擇轉(zhuǎn)化子，將單菌落重新劃線于選擇性培養(yǎng)基以便進(jìn)ー步分析。將單菌落重懸于50μ1 PBS，放入沸水浴中5分鐘，在臺(tái)式離心機(jī)中以最大速度離心5分鐘。I μ I樣品用作PCR分析模板，以矯正雙交換轉(zhuǎn)化子。利用在微好氧或氧氣限制條件下培養(yǎng)的補(bǔ)充有突變基因的FNR敲除菌株(Λ fnr_⑶148A)的總RNA進(jìn)行Northern印跡分析，顯示即使在氧氣存在條件下，突變的FNR蛋白也能夠促進(jìn)fhbp單順反子mRNA轉(zhuǎn)錄(圖3，泳道7和8)。因此，突變FNR以不依賴氧氣的方式驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。敲除上游nmbl869基因，從而消除雙順反子RNA信使的合成，不會(huì)影響單順反子轉(zhuǎn)錄物的FNR-氧氣-依賴性調(diào)控(圖3，泳道9和10)?？傊@些數(shù)據(jù)表明，在氧氣限制條件下由專用FNR活化啟動(dòng)子誘導(dǎo)fhbp轉(zhuǎn)錄。還在菌株H44/76中研究fhbp基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)。該項(xiàng)工作也顯示兩條fhbp轉(zhuǎn)錄物，并在野生型菌株中驗(yàn)證fhbp單順反子mRNA因氧氣限制而上調(diào)，還因組成型活性FNR突變蛋白的表達(dá)而上調(diào)(圖3，泳道11-14)。利用Western印跡分析將FNR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與所有菌株中總蛋白水平相關(guān)聯(lián)。在微好氧條件下，由新鮮培養(yǎng)的過夜平板培養(yǎng)物制備總蛋白提取物，用針對(duì)NMB1869、fHBP和FNR蛋白的特異性抗體進(jìn)行免疫印跡。如圖4所示，fHBP表達(dá)在表達(dá)FNR的組成型活性形式的Λ fnr_CD148A和H44/76_CD148A菌株中明顯增加(泳道4和8)，與微好氧條件下的Northern結(jié)果相關(guān)聯(lián)。而且，與野生型菌株中的FNR表達(dá)相比，重組菌株中由異源Ptac啟動(dòng)子表達(dá)的各FNR蛋白等位基因過度表達(dá)，但只有D148A突變體能誘導(dǎo)fHBP的過度表達(dá)。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支持FNR活性，而不是其高表達(dá)在促進(jìn)fHBP表達(dá)中的重要性。將編碼野生型和突變體FNR蛋白(fnr和fnrD148A基因)的基因克隆到pET15b表達(dá)載體中，以便在大腸桿菌中重組表達(dá)。表達(dá)這些蛋白，依靠N末端組氨酸標(biāo)簽用Ni2+-親和色譜純化。
檢測(cè)兩種重組蛋白與aniA啟動(dòng)子的體外結(jié)合活性。該啟動(dòng)子已在腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌上通過DNA微陣列和DNA結(jié)合研究良好鑒定，在氧氣限制期間它在FNR的直接控制下[28，29，176]。含有MC58的aniA啟動(dòng)子的特異性探針與濃度遞增的重組蛋白一起培育，然后進(jìn)行DNA酶I消化。加入13nM FNRD148A蛋白導(dǎo)致完全保護(hù)相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)跨-30至-50且含有aniA預(yù)測(cè)的FNR-框共有序列的DNA區(qū)域。然而在這些條件下，野生型蛋白質(zhì)不產(chǎn)生保護(hù)作用。因此，該突變體在有氧條件下有結(jié)合DNA的組成型活性，并結(jié)合預(yù)測(cè)的FNR-框。加入I μ M FnrD148Α能保護(hù)相對(duì)于Pfhbp的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)跨-28位至-50位，因而重疊-35啟動(dòng)子元件的核苷酸。對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析掲示出存在正好重疊-35六聚體的推定FNR-框TTGAC-N4-CTCAT (SEQ ID NO: 16)。該序列與大腸桿菌FNR框共有序列(SEQID NO 19)相比有三個(gè)核苷酸不同。這些數(shù)據(jù)表明FNR結(jié)合fhbp啟動(dòng)子區(qū)，以促進(jìn)fHBP蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
在多種菌株中進(jìn)行研究也在其它腦膜炎球菌菌株中研究fHBP蛋白表達(dá)的FNR依賴性調(diào)節(jié)，這些菌株來自地理多變來源并代表與疾病相關(guān)的主要克隆集合體。在不同fHBP家族的菌株上進(jìn)行初歩Western印跡分析。所有菌株均表達(dá)fHBP抗原，但是如前所述[2]，菌株間的表達(dá)水平不同。利用已經(jīng)用于產(chǎn)生MC58 Δ fnrC_D148A菌株的相同構(gòu)建物制備表達(dá)組成型活性FNR的等基因突變體菌株。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)錄物和其野生型進(jìn)行Western印跡分析。在這些突變體菌株中，內(nèi)源性fnr基因沒有滅活。轉(zhuǎn)化菌株的FNR蛋白表達(dá)水平高于野生型，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)化的成功。而且，重組菌株也過度表達(dá)fHBP蛋白。唯一的例外是匪117菌株。雖然它過度表達(dá)FNR，但它不顯著過度表達(dá)fHBP。對(duì)Pfhbp啟動(dòng)子測(cè)序，雖然FNR框完全保守，但-10啟動(dòng)子元件相對(duì)于MC58序列具有2個(gè)突變，顯示不大可能用作高效-10元件的TACCGC序列(SEQ ID NO 15)?？傊?，這些結(jié)果表明fhbp基因的FNR依賴性調(diào)節(jié)不限于MC58和H44/76菌株。囊泡產(chǎn)生如上所述，編碼由其天然啟動(dòng)子(啟動(dòng)的)fhbp的菌株表達(dá)FNR的組成型活性形式吋，它們過度表達(dá)fHBP。因此，相對(duì)于相應(yīng)野生型菌株制備的囊泡，理想情況下不使用去污劑[25，44]由這些菌株制備的囊泡富含fHBP。這些囊泡可用于產(chǎn)生抗-腦膜炎球菌免疫力。各自具有不同家族fHBP的這類囊泡的ニ價(jià)或三價(jià)混合物可用于增加覆蓋譜。在其它實(shí)施方式中，工程改造表達(dá)組成型活性FNR的腦膜炎球菌，以表達(dá)兩種或三種fHBP變體，以使來自該菌株的囊泡已經(jīng)是fHBP ニ價(jià)或三價(jià)。可通過染色體的不同位點(diǎn)上整合、但各自在FNR激活的啟動(dòng)子控制下的外源基因単獨(dú)表達(dá)不同變體。應(yīng)理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，可對(duì)之進(jìn)行修改而仍在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。參考文獻(xiàn)[l]W099/57280.[2]Masignani 等(2003) J Exp Med 197 :789-799.[3]Welsch 等(2004) J Immunol 172:5605-15.[4]Hou 等(2005) J Infect Dis 192(4) :580-90.
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權(quán)利要求
1.一種腦膜炎球菌，其(a)具有其轉(zhuǎn)錄處于FNR激活的啟動(dòng)子控制下的基因，和(b)表達(dá)FNR的組成型活化形式。
2.如權(quán)利要求I所述的腦膜炎球菌，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄在FNR激活的啟動(dòng)子控制下的基因是fhbp。
3.一種制備腦膜炎球菌突變體的方法，包括(a)修飾其內(nèi)源性fnr基因，以使編碼的FNR蛋白組成型活化，或(b)引入編碼FNR的組成型活性形式的基因的步驟。
4.一種制備脂蛋白體腦膜炎球菌囊泡的方法，該方法包括處理權(quán)利要求I或2所述的或可通過權(quán)利要求3所述方法獲得的腦膜炎球菌的步驟，以破壞其外膜，從而由其形成包含外膜的蛋白質(zhì)組分的囊泡。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述脂蛋白體腦膜炎球菌囊泡包含fHBP。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其還包括從任何活的和/或完整的細(xì)菌分離所述囊泡的步驟。
7.一種腦膜炎球菌，其表達(dá)FNR的組成型活性形式。
8.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的腦膜炎球菌或方法，其特征在于，所述腦膜炎球菌不表達(dá)活性LpxLl酶。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的腦膜炎球菌或方法，其特征在于，所述腦膜炎球菌是高出泡腦膜炎球菌。
10.一種腦膜炎球菌FNR的組成型活性形式。
11.一種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括將權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述方法制備的囊泡與下述物質(zhì)配制在一起的步驟藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體；和/或免疫佐劑；和/或一種或多種其它免疫原性組分。
12.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的腦膜炎球菌、方法或FNR，其特征在于，所述FNR的組成型活性形式具有突變D148A。
13.ー種核酸，其編碼權(quán)利要求10或12所述的FNR。
14.ー種包含權(quán)利要求13所述核酸的載體。
15.—種包含權(quán)利要求14所述的載體的宿主細(xì)胞。
全文摘要
在天然情況下，腦膜炎球菌fhbp基因(編碼H因子結(jié)合蛋白)在兩種差異調(diào)控的啟動(dòng)子控制下，由兩種獨(dú)立轉(zhuǎn)錄物表達(dá)。在一個(gè)轉(zhuǎn)錄物中，它與相鄰上游基因由Pnmb1869啟動(dòng)子共同表達(dá)。另一轉(zhuǎn)錄物是單順反子，由其自身專用啟動(dòng)子Pfhbp表達(dá)，該表達(dá)由全局調(diào)控蛋白FNR應(yīng)氧氣限制條件而激活。為了提高單順反子轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，采用組成型活性FNR突變體。因此可激活Pfhbp啟動(dòng)子，導(dǎo)致FNR-激活基因如fhbp的過度表達(dá)。
文檔編號(hào)A61K35/74GK102724988SQ201080049678
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者F·奧里恩特, I·德萊尼 申請(qǐng)人:諾華有限公司