專利名稱：骨修復組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包括超細化脫礦質骨基質、非超細化脫礦質骨基質和保濕材料的骨修復組合物。
背景技術：
脫礦質骨基質(DBM)是指通過將骨 加入到酸中而除去其中礦物質的骨。脫礦質骨基質主要由高度交聯(lián)的膠原蛋白組成，包括其余的非膠原蛋白如TGF-P、TOGF、骨質素、骨連接素、骨形成蛋白(BMP)等。當脫礦質骨基質被并入(填充到)小鼠肌肉中，在并入位點觀察到異位成骨。該實驗證明，為了使骨生長，骨基質中應存在能誘導成骨細胞群中未分化的細胞進行分化的材料。BMP是這樣一種存在于骨基質中的蛋白物質(Urist，MR, Strates, BS，骨形成蛋白(bonemorphogenetic protein), J. Dental Res. 50 :1392-1406,1971)。BMP 可以從骨豁中分離出來，或通過基因重組技術制備。BMP是一組屬于TGF-P超家族的蛋白，并基于它誘導骨形成的能力進行分類(ffozney, JM,科學(Science) 242 :1528-1534,1988)。BMP 家族可分為 BMPs，如 BMP-2 和BMP-4 ;成骨蛋白(OPs)，如 0P-1 (或 BMP-7)、0P_2 (或 BMP-8)、BMP_5、BMP_6 和 Vgr-I ;軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白(CDMPs)，如CDMP-I、BMP-14和⑶F-5，生長/分化因子(⑶Fs)，如⑶F-I、⑶F-3、⑶F-8、⑶F-II、⑶F-12和⑶F-14 ;以及亞家族，如BMP-3、成骨素、BMP-9、⑶F-2和BMP-10。各種組合物已被用于醫(yī)治受損的骨組織。它們可作為框架支持新骨生長，并提供誘導新骨生長的生長因子。美國專利No. 4，394，370，Jefferies公開了一種包括重組膠原蛋白、脫礦質骨基質和BMP的組織愈合組合物。美國專利No. 4，440，750，Glowacki等公開了一種由重組膠原蛋白和脫礦質骨基質組成的保濕組合物。然而，這些組合物的骨修復療效差，因為骨生長因子在早期階段不釋放，而是陷在脫礦質骨基質的高度交聯(lián)的膠原蛋白網中，并隨著膠原蛋白成分的降解而緩慢釋放。作為這種緩慢釋放的替代方案，(美國專利No. 7，132，110)提出一種從脫礦質骨基質中分離骨生長因子的方法。然而，該分離方法需要如提取、純化、與分散溶劑混合或與另一種載體結合等諸多步驟。此外，它的缺點是在分離過程中造成骨生長因子和膠原蛋白的損壞。此外，當單獨使用粉末狀態(tài)的脫礦質骨基質時，它不可能被注入，且難以保持和修飾(modify)其形狀，因此，處理存在問題。因此，為了提供更好的可注射性以及保型和修飾屬性，已提出與其它物質組合使用。到現(xiàn)在為止，已報道與有機聚合物的組合產品如明膠、甘油、泊洛沙姆和透明質酸，但它們并沒有滿足全部的可注射性、保型(處理(handling))、含量和生物相容性。因此，亟需開發(fā)出能在早期階段釋放骨生長因子，對人體無害且可提高脫礦質骨基質的可注射性和保型(處理)的骨修復組合物。

發(fā)明內容
技術問題本發(fā)明人對可解決上述常規(guī)組合物所引起問題的新型骨修復組合物進行持續(xù)研究。結果，他們發(fā)現(xiàn)如果向非超細化脫礦質骨基質中加入超細化脫礦質骨基質和保濕材料制備組合物，由此制備的組合物與常規(guī)的僅含非超細化脫礦質骨基質的組合物相比，由于超細化脫礦質骨基質較大的表面積和骨生長因子的較早釋放，本發(fā)明的骨修復組合物更易于注射和保型(處理)，并顯示出優(yōu)異的骨修復效果，由此完成本發(fā)明。技術方案為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種包 括超細化脫礦質骨基質、非超細化脫礦質骨基質和保濕材料的骨修復組合物。有益效果本發(fā)明的骨修復組合物。與常規(guī)的僅含非超細化脫礦質骨基質的組合物相比，由于超細化脫礦質骨基質較大的表面積和骨生長因子的較早釋放，其更易于注射和保型(處理)，并顯示出優(yōu)異的骨修復效果。由于未使用合成材料，它還顯示出生物相容性和對人體無害的優(yōu)勢。此外，由于不需要另外從脫礦質骨基質中分離骨生長因子，無需考慮在常規(guī)分離過程中可能對骨生長因子和膠原蛋白造成的損害。


圖I顯示了對本發(fā)明實施例I和對比例1-3的堿性磷酸酶(ALP)的測定結果。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種包括超細化脫礦質骨基質、非超細化脫礦質骨基質和保濕材料的骨修復組合物。如果本文中使用術語“脫礦質骨基質”用來代替術語“超細化脫礦質骨基質”與“非超細化脫礦質骨基質”，那么它指的是超細化脫礦質骨基質和非超細化脫礦質骨基質這兩者。對于可用于本發(fā)明骨修復組合物的脫礦質骨基質種類沒有限制。脫礦質骨基質可從商業(yè)獲得和使用，或可以根據已知的方法由來自哺乳動物的骨骼制備獲得脫礦質骨基質(Russell 等，骨科(Orthopedics) ,22(5)524-531，1999)，然后使用。根據已知的制備脫礦質骨基質的方法，從去除軟組織的骨中收集密質骨。使用有機溶劑或表面活性劑去除骨中的蛋白和脂類，用酸除去礦物質。所得骨經凍干。已知如果制備脫礦質骨基質的過程在冷藏(1-10°C)條件下進行，可減少對骨生長因子的損害。又已知如果骨基質經酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或木瓜蛋白酶處理，則可以去除骨基質膠原蛋白的端肽區(qū)，已知其為免疫應答觸發(fā)區(qū)且已知形成鏈間交聯(lián)。經這樣的酶處理后，可降低免疫應答并可增加膠原蛋白的溶解度(G. Khang,聚合物(Polymer),33(2) 104-110,2009)。因此，用于本發(fā)明骨修復組合物的脫礦質骨基質優(yōu)選經酶處理。用于處理的酶優(yōu)選地選自胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一種或多種。此外，優(yōu)選在l-10°c冷藏條件下制備脫礦質骨基質。
在用于本發(fā)明骨修復組合物的脫礦質骨基質中，殘余的鈣含量一般為0.01-8%。如果含量超過8%，可能會導致抑制生長因子從脫礦質骨中釋放的問題。因此，殘余的鈣含量優(yōu)選8%或以下，更優(yōu)選2%或以下。本文中使用的術語“超細化(micro-pulverized) ”是指研磨顆粒,使50%或以上的顆粒粒徑為約250 y m或以下。因此，本文中使用的術語“超細化脫礦質骨基質”是指已被粉碎的脫礦質骨基質，使50%或以上的粒徑為約250 或以下。另一方面，術語“非超細化脫礦質骨基質”是指50%或以上的粒徑為約250 u m或以上的脫礦質骨基質。在本發(fā)明的骨修復組合物中，超細化脫礦質骨基質的合適粒徑是0. 05-500 U m，優(yōu)選0. 05-250 u m。非超細化脫礦質骨基質的合適粒徑是100-2000 u m,優(yōu)選250-2000 y m，更優(yōu)選 250-710 iim。
本發(fā)明骨修復組合物的特征在于，除了所述超細化脫礦質骨基質和非超細化脫礦質骨基質以外，還包括保濕材料。任何可商業(yè)獲得的保濕材料均可用于本發(fā)明的組合物中。優(yōu)選地，選自蒸餾水、鹽溶液、濃鹽溶液和離子溶液中的一種或多種可用于保濕材料。在一個實施方案中，所述保濕材料可含有液態(tài)多羥基化合物，其實例包括甘油或甘油酯。在另一個實施方案中，所述保濕材料可含有生物相容性粘合劑。生物相容性粘合劑的優(yōu)選實例為選自纖維蛋白膠、纖維蛋白原、凝血酶、貽貝粘合蛋白、蠶絲、彈力蛋白、膠原蛋白、酪蛋白、明膠、白蛋白、角蛋白、甲殼素和殼聚糖中的一種或多種。生物相容性粘合劑的其它優(yōu)選實例為選自淀粉、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚二氧環(huán)己酮、聚己內酯、聚碳酸酯、聚氧酯(polyoxoester)、聚氨基酸、聚酐、聚輕基丁酯、聚輕基戍酯、聚(丙二醇-富馬酸共聚物)、基于酪氨酸的聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、乙基纖維素和羧甲基纖維素中的一種或多種。在另一個實施方案中，保濕材料可另外含有選自抗生素、維生素、葡萄糖胺、細胞因子和生長因子中的一種或多種。在本發(fā)明的骨修復組合物中，所述超細化脫礦質骨基質非超細化脫礦質骨基質保濕材料的重量比為0. 1-20 I 0. 1-20，優(yōu)選0. 1-3 I 1-10，更優(yōu)選0.5-1 I 3-5。如果基于I重量份的非超細化脫礦質骨基質，超細化脫礦質骨基質的含量低于0. I重量份，那么所述組合物粘度會下降，導致易碎且成形差。然而，如果該含量大于20重量份，那么組合物會迅速降解，導致骨形成不完全。此外，如果基于I重量份的非超細化脫礦質骨基質，保濕材料的含量低于I重量份，那么所述組合物粘度會下降，導致易碎且成形差。然而，如果該含量大于20重量份，那么組合物變得不粘稠，導致成型差且易流動。除了所述超細化脫礦質骨基質、非超細化脫礦質骨基質和保濕材料以外，本發(fā)明的骨修復組合物可進一步包含有助于骨修復的輔料。任何可商業(yè)獲得的有助于骨修復的輔料均可用于本發(fā)明的組合物中。特別優(yōu)選地選自松質骨片、密質骨片、羥基磷灰石(HA，Ca10(PO4)6(OH)2)、碳酸磷灰石(CA，Caltl(PO4)6CO3)、磷酸三鈣(TCP, Ca3 (PO4)2)、焦磷酸鈣(Ca2P2O7)、無機骨、牙釉質、文石、方解石、珍珠質、石墨、熱解碳、基于硅酸鈣的生物玻璃、Al2O3和ZrO2中的一種或多種。堿性磷酸酶(ALP)分布于全身許多器官，如肝、骨、腎、小腸和胎盤中，除孕婦除夕卜，血清ALP主要來自于骨骼和肝臟。骨ALP由成骨細胞分泌，是骨形成中最普遍使用的標記。由于ALP與成骨細胞的活化有關，它隨骨修復的發(fā)生而增加，如骨生長期和骨折恢復期。為了確定本發(fā)明骨修復組合物的骨修復效果，本發(fā)明人將所述組合物加入到C2C12細胞系(cell lines)(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，美國)，即小鼠成肌細胞系中。采用相同方法培養(yǎng)后，測定ALP的濃度。結果觀察到在培養(yǎng)的早期階段(第3天和第5天)，本發(fā)明組合物的ALP值顯著高于對比例組合物的值。該高ALP值表示成肌細胞已分化為成骨樣細胞。根據這一結果認為，脫礦質骨基質的超細化粉碎過程以及用保濕材料進行保濕的過程可以使骨生長因子較早地從脫礦質骨基質中釋放，同時加大了脫礦質骨基質的表面積，從而使骨修復效果得到 改善?；谝陨厦枋?，本發(fā)明的骨修復組合物可用于各種骨折、骨壞死病或骨修復。常規(guī)脫礦質骨粉在移植之前需另行再保濕，而本發(fā)明的骨修復組合物無需再保濕的過程，可直接注入到骨質流失區(qū)或用手聚集(mass)并填充該區(qū)。下面將參考以下實施例和實驗例詳細描述本發(fā)明。所述實施例和實驗例僅用于幫助理解本發(fā)明而不應解釋為對本發(fā)明范圍的限制。實施例實施例I從I月齡兔中分離得到大腿骨，并根據Russel等人的方法制備(Russell等，骨科(Orthopedics) 22 (5) 524-531,1999)獲得脫礦質骨基質。在脫礦質骨基質中，以其中粒徑為250-710 的作為非超細化脫礦質骨基質。此外，粉碎所述脫礦質骨基質，以其中粒徑為1-250 u m的作為超細化脫礦質骨基質。以蒸餾水作為保濕材料。1-250 u m的脫礦質骨基質、250-710 iim的脫礦質骨基質和蒸餾水以0.8 I 3. 8的重量比混合，制備組合物。實施例2將實施例I中制備的1-250 u m的脫礦質骨基質和250-710 u m的脫礦質骨基質與蒸餾水按0.1 I I的重量比混合，制備組合物。實施例3將實施例I中制備的1-250 U m的脫礦質骨基質和250-710 U m的脫礦質骨基質與蒸餾水按0.3 I 3. 8的重量比混合，制備組合物。實施例4將實施例I中制備的1-250 U m的脫礦質骨基質和250-710 U m的脫礦質骨基質與蒸餾水按0.3 I 5的重量比混合，制備組合物。實施例5將實施例I中制備的1-250 U m的脫礦質骨基質和250-710 U m的脫礦質骨基質與蒸餾水按0.8 I I的重量比混合，制備組合物。實施例6將實施例I中制備的1-250 U m的脫礦質骨基質和250-710 U m的脫礦質骨基質與蒸餾水按0.8 I 5的重量比混合，制備組合物。實施例7
將實施例I中制備的1-250 u m的脫礦質骨基質和250-710 u m的脫礦質骨基質與蒸餾水按3 I 5的重量比混合，制備組合物。實施例8將實施例I中制備的1-250 U m的脫礦質骨基質和250-710 U m的脫礦質骨基質與蒸餾水按3 I 10的重量比混合，制備組合物。對比例I將實施例I中制備的1-250 u m的脫礦質骨基質和250-710 u m的脫礦質骨基質按0.8 I的重量比混合，制備組合物。對比例2將實施例I中制備的1-250 U m的脫礦質骨基質和250-710 U m的脫礦質骨基質按I 3. 8的重量比混合，制備組合物。對比例3將對比例I中獲得的組合物在121°C高壓滅菌20min，制備組合物。實驗例I制備實施例1-8和對比例1-2的各組合物共十份樣品。每種組合物以相同的量置于注射器中，用手指將活塞推入注射管，擠出組合物。根據擠出的難易以及擠出的組合物的形狀來確定可注射性。此外，用手聚集(mass)該擠出的組合物后，確定保型(處理)。根據下表I中所示的5個級別對可注射性和保型(處理)進行評價，結果如下表2所示。表I[表]
權利要求
1.一種骨修復組合物，其包括超細化脫礦質骨基質、非超細化脫礦質骨基質和保濕材料。
2.根據權利要求I所述的骨修復組合物，其中所述超細化脫礦質骨基質的粒徑為0.05-250u m。
3.根據權利要求I所述的骨修復組合物，其中所述非超細化脫礦質骨基質的粒徑為250-2000u m。
4.根據權利要求I所述的骨修復組合物，其中所述保濕材料為選自蒸餾水、鹽溶液、濃鹽溶液和離子溶液中的ー種或多種。
5.根據權利要求4所述的骨修復組合物，其中所述保濕材料含有液態(tài)多羥基化合物。
6.根據權利要求5所述的骨修復組合物，其中所述液態(tài)多羥基化合物為甘油或甘油酷。
7.根據權利要求4所述的骨修復組合物，其中所述保濕材料含有生物相容性粘合剤。
8.根據權利要求7所述的骨修復組合物，其中所述生物相容性粘合劑為選自纖維蛋白膠、纖維蛋白原、凝血酶、貽貝粘合蛋白、蠶絲、弾力蛋白、膠原蛋白、酪蛋白、明膠、白蛋白、角蛋白、甲殼素和殼聚糖中的ー種或多種。
9.根據權利要求7所述的骨修復組合物，其中所述生物相容性粘合劑為選自淀粉、聚乳酸、聚こ醇酸、聚乳酸-こ醇酸共聚物、聚ニ氧環(huán)己酮、聚己內酷、聚碳酸酷、聚氧酯、聚氨基酸、聚酐、聚羥基丁酷、聚羥基戊酷、聚(丙ニ醇-富馬酸共聚物)、基于酪氨酸的聚碳酸酷、聚こ烯吡咯烷酮、纖維素、こ基纖維素和羧甲基纖維素中的ー種或多種。
10.根據權利要求4所述的骨修復組合物，其中所述保濕材料含有選自抗生素、維生素、葡萄糖胺、細胞因子和生長因子中的ー種或多種。
11.根據權利要求1-10任一項所述的骨修復組合物，其中所述超細化脫礦質骨基質非超細化脫礦質骨基質保濕材料的重量比為0.1-3 I 1-10。
12.根據權利要求11所述的骨修復組合物，其中所述超細化脫礦質骨基質非超細化脫礦質骨基質保濕材料的重量比為0.5-1 I 3-5。
13.根據權利要求1-10任一項所述的骨修復組合物，其進ー步包括選自松質骨片、密質骨片、羥基磷灰石(HA，Caltl(PO4)6 (OH)2)、碳酸磷灰石(CA，Caltl (PO4)6C03)、磷酸三鈣(TCP，Ca3(PO4)2).焦磷酸鈣(Ca2P2O7).無機骨、牙釉質、文石、方解石、珍珠質、石墨、熱解碳、基于硅酸鈣的生物玻璃、Al2O3和ZrO2中的ー種或多種。
14.根據權利要求1-10任一項所述的骨修復組合物，其中所述超細化脫礦質骨基質和非超細化脫礦質骨基質為經過酶處理的。
15.根據權利要求14所述的骨修復組合物，其中用于處理的酶選自胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和木瓜蛋白酶中的ー種或多種。
16.根據權利要求1-10任一項所述的骨修復組合物，其中所述超細化脫礦質骨基質和非超細化脫礦質骨基質是在i-io°c的冷藏條件下制備的。
17.根據權利要求1-10任一項所述的骨修復組合物，其中所述超細化脫礦質骨基質和非超細化脫礦質骨基質中殘留的鈣含量為8%或以下。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包括超細化脫礦質骨基質、非超細化脫礦質骨基質和保濕材料的骨修復組合物。與常規(guī)的僅含非超細化脫礦質骨基質的組合物相比，本發(fā)明的骨修復組合物由于超細化脫礦質骨基質較大的表面積和骨生長因子的較早釋放，更易于注射和保型(處理)，并顯示出優(yōu)異的骨修復效果。由于未使用合成材料，它還顯示出生物相容性和對人體無害的優(yōu)勢。
文檔編號A61F2/28GK102802684SQ201080028222
公開日2012年11月28日 申請日期2010年1月27日 優(yōu)先權日2009年6月26日
發(fā)明者宋錫范, 蘇怔援, 柳眩承, 金炳爽 申請人:Cg生物技術有限公司