專利名稱：低免疫原性鏈霉抗生物素蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫原性降低的鏈霉抗生物素蛋白突變體及其應(yīng)用。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)向氨基酸導(dǎo)入突變來(lái)降低免疫原性的鏈霉抗生物素蛋白突變體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗生物素蛋白與生物素、或鏈霉抗生物素蛋白與生物素之間的親和性非常高 (Kd=10 —15 10 —14M),作為生物體二分子之間的相互作用，其為最強(qiáng)的相互作用之一?，F(xiàn)在，抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白-生物素相互作用廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中(Green, (1975), Adv. Protein Chem. , 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymo 1. , 184: 51-67)?？股锼氐鞍诪閬?lái)源于卵白的堿性糖蛋白，等電點(diǎn)超過(guò)10。另一方面，鏈霉抗生物素蛋白來(lái)源于放線菌(阿維丁氏鏈霉菌(Sti^ptomyces avidinii))，等電點(diǎn)在中性附近，不含有糖鏈。這兩種蛋白質(zhì)都形成4聚物，每1個(gè)亞基與 1分子的生物素結(jié)合。分子量為60kDa左右。近年，提出了該抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白與生物素的高結(jié)合能力和抗體分子組合而成的藥物輸送方法預(yù)定位(Pretargeting)法(Hnatowich，(1987)，J. Nuc 1. Med., 28，1294-1302)。但是，由于來(lái)源于雞的抗生物素蛋白、來(lái)源于微生物的鏈霉抗生物素蛋白對(duì)于人體表現(xiàn)出高的免疫原性，在給予人體后，早期產(chǎn)生抗抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白抗體成為問(wèn)題，成為阻礙預(yù)定位法的實(shí)用化的原因之一(Paganelli，(1991)， Cancer Res.，51，5960-5966)。為了解決上述問(wèn)題，過(guò)去發(fā)表了對(duì)于鏈霉抗生物素蛋白的低免疫原性化進(jìn)行敘述的論文(Subramanian, (1998)，Bioch. and Mol. biol. Int. , 43，；357_82)，但鏈霉抗生物素蛋白對(duì)于人體的免疫原性的問(wèn)題仍然未解決。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1 美國(guó)專利第5，672，691號(hào)。專利文獻(xiàn)2 美國(guó)專利第6，022，951號(hào)。非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) 1 :Green, (1975)，Adv. Protein Chem. , 29: 85-133; 非專利文獻(xiàn) 2 :Green, (1990)，Methods Enzymol. , 184: 51-67; 非專利文獻(xiàn) 3 :Hnatowich, (1987)，J. Nuc 1. Med.，28，1294-1302 ； 非專利文獻(xiàn) 4 :Paganelli, (1991)， Cancer Res. , 51，5960-5966)。__ 專禾1J 文獻(xiàn) 5 :Mapping the common antigenic determinants in avidin and streptavidin. Subramanian, N 等人，Biochemistry and Molecular biology International. 1997， 43， 357—82。__ 專禾Il 文獻(xiàn) 6 :Reduced antibody response to streptavidin through site-directed mutagenesis Meyer, DL 等人，Protein Science. 2001, 10,491-503。7 :Biotin Reagents for Antibody Pretargeting. 4. Wilbur DS 等人，Bioconjugate Chemistry. 2000，11(4), 569—583。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的課題在于，提供作為來(lái)源于屬于微生物的阿維丁氏鏈霉菌的蛋白質(zhì)的鏈霉抗生物素蛋白所具有的對(duì)于哺乳動(dòng)物的免疫原性(抗原性)得到降低，動(dòng)物體內(nèi)的抗鏈霉抗生物素蛋白抗體產(chǎn)生得到抑制，且維持對(duì)于生物素的結(jié)合能力的可以用于藥物及其它的工業(yè)中的各種目的的鏈霉抗生物素蛋白突變體(低免疫原性鏈霉抗生物素蛋白)。進(jìn)一步地，本發(fā)明要解決的課題在于，提供使用上述鏈霉抗生物素蛋白突變體的診斷藥物、治療藥物，使用上述鏈霉抗生物素蛋白突變體的診斷試劑盒、治療試劑盒。本發(fā)明人為了解決上述問(wèn)題而精心研究，由鏈霉抗生物素蛋白的立體結(jié)構(gòu)和五肽出現(xiàn)頻率分析，選擇在人體內(nèi)形成抗原位點(diǎn)的氨基酸，選出形成低免疫原性化的低免疫原性化候選氨基酸。接著，在以野生型鏈霉抗生物素蛋白作為模板的基因序列中形成點(diǎn)突變， 向低免疫原性化候選氨基酸轉(zhuǎn)換，實(shí)施蛋白質(zhì)表達(dá)并實(shí)施蛋白純化。進(jìn)一步地，對(duì)于這些突變體鏈霉抗生物素蛋白，使用野生型鏈霉抗生物素蛋白對(duì)食蟹猴進(jìn)行免疫，使用實(shí)施了制備的抗鏈霉抗生物素蛋白抗血清對(duì)反應(yīng)性進(jìn)行分析后，鑒定出發(fā)現(xiàn)與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比抗血清的反應(yīng)性降低約40%以上的突變體鏈霉抗生物素蛋白，從而完成本發(fā)明。即，根據(jù)本發(fā)明，提供以下的發(fā)明。[1]鏈霉抗生物素蛋白突變體，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸殘基的酪氨酸、第71位氨基酸殘基的酪氨酸、第89位氨基酸殘基的谷氨酸、第91位氨基酸殘基的精氨酸、和第104位氨基酸殘基的谷氨酸中的任一個(gè)以上置換為其它的氨基酸，與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比，該突變體的免疫原性降低。[2] [1]記載的鏈霉抗生物素蛋白突變體，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第71位氨基酸殘基的酪氨酸和第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸殘基的酪氨酸、 第89位氨基酸殘基的谷氨酸、第91位氨基酸殘基的精氨酸、第104位氨基酸殘基的谷氨酸中的任一個(gè)置換為其它的氨基酸。[3] [1]或[2]記載的鏈霉抗生物素蛋白突變體，其在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一個(gè)以上的突變
(1)第10位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸或蘇氨酸的突變，
(2)第71位氨基酸殘基的酪氨酸置換為丙氨酸或絲氨酸的突變，
(3)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，
(4)第89位氨基酸殘基的谷氨酸置換為天冬氨酸的突變，
(5)第91位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，
(6)第104位氨基酸殘基的谷氨酸置換為谷氨酰胺或天冬酰胺的突變。[4]鏈霉抗生物素蛋白突變體，其含有在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一個(gè)以上的突變的氨基酸序列，與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比，該突變體的免疫原性降低
(1)第10位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸或蘇氨酸的突變，
(2)第71位氨基酸殘基的酪氨酸置換為丙氨酸或絲氨酸的突變，
(3)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，
(4)第89位氨基酸殘基的谷氨酸置換為天冬氨酸的突變，
(5)第91位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，
(6)第104位氨基酸殘基的谷氨酸置換為谷氨酰胺或天冬酰胺的突變。[5]鏈霉抗生物素蛋白突變體，其含有在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下突變的氨基酸序列，與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比，該突變體的免疫原性降低
(2)第71位氨基酸殘基的酪氨酸置換為丙氨酸或絲氨酸的突變，
(3)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，
(4)第89位氨基酸殘基的谷氨酸置換為天冬氨酸的突變，
(6)第104位氨基酸殘基的谷氨酸置換為谷氨酰胺或天冬酰胺的突變。[6] [5]中記載的鏈霉抗生物素蛋白突變體，其進(jìn)一步具有以下的突變 (1)第10位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸或蘇氨酸的突變，
(5)第91位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變。[7]鏈霉抗生物素蛋白突變體，其在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下的全部突變
(1)第10位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸的突變，
(2)第71位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸的突變，
(3)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，
(4)第89位氨基酸殘基的谷氨酸置換為天冬氨酸的突變，
(5)第91位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，以及
(6)第104位氨基酸殘基的谷氨酸置換為谷氨酰胺或天冬酰胺的突變。[8] DNA，其編碼[1] [7]中的任意一項(xiàng)記載的鏈霉抗生物素蛋白突變體。[9]用抗體標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白突變體，其通過(guò)使抗體與[1] [7]中的任意一項(xiàng)記載的鏈霉抗生物素蛋白突變體結(jié)合而得到。[10]治療劑或診斷劑，其含有[9]中記載的用抗體標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白突變體。[11]治療或診斷試劑盒，其含有(a) [9]中記載的用抗體標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白突變體和(b)用對(duì)于鏈霉抗生物素蛋白具有親和性的生物素或其衍生物標(biāo)記的診斷用或治療用物質(zhì)。本發(fā)明的突變體鏈霉抗生物素蛋白的特征在于，在維持對(duì)于生物素的結(jié)合能力的同時(shí)，對(duì)于哺乳動(dòng)物的免疫原性(抗原性)降低，因此動(dòng)物體內(nèi)的抗鏈霉抗生物素蛋白抗體產(chǎn)生得到抑制。本發(fā)明的突變體鏈霉抗生物素蛋白可以用于藥物及其它工業(yè)中的各種目的中。


圖1表示Biacore分析中的傳感圖。圖2表示對(duì)于突變體鏈霉抗生物素蛋白的抗血清的反應(yīng)性。圖3表示天然型鏈霉抗生物素蛋白、mcSA040、mcSA072、mcSA314、mcSA414的熱變化(thermal shift)測(cè)定的結(jié)果。圖4表示B5209B小鼠scFv_mcSA414 (SA)的表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)。圖5表示B5209B scFv_mcSA414通過(guò)Ni2 +親和柱純化的結(jié)果。圖6表示通過(guò)尺寸排阻色譜將B5209B scFv-mcSA414最終純化的結(jié)果。圖7表示B5209B scFv_mcSA414和R0B01的等溫滴定量熱測(cè)定(ITC)的結(jié)果。圖8表示B5209B scFV-mcSA414和生物素的等溫滴定量熱測(cè)定(ITC)的結(jié)果。圖9表示B5209B scFv_mcSA414的差示掃描量熱測(cè)定(DSC)的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明。本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體的特征在于，在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中，具有規(guī)定的氨基酸的突變，與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比免疫原性降低。野生型(天然)的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列在序列表的序列編號(hào)2中示出，編碼它的堿基序列在序列表的序列編號(hào)1中示出。根據(jù)第一方式，本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體含有如下形成的氨基酸序列， 在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸殘基的酪氨酸、第71位氨基酸殘基的酪氨酸、第89位氨基酸殘基的谷氨酸、第91位氨基酸殘基的精氨酸、和第104位氨基酸殘基的谷氨酸中的任意一個(gè)以上置換為其它的氨基酸。根據(jù)第二方式，本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體含有在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一個(gè)以上的突變的氨基酸序列
(1)第10位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸或蘇氨酸的突變，
(2)第71位氨基酸殘基的酪氨酸置換為丙氨酸或絲氨酸的突變，
(3)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，
(4)第89位氨基酸殘基的谷氨酸置換為天冬氨酸的突變，
(5)第91位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，
(6)第104位氨基酸殘基的谷氨酸置換為谷氨酰胺或天冬酰胺的突變。在第10位氨基酸殘基的酪氨酸置換為其它的氨基酸的情況下，作為其它的氨基酸的具體例，可以舉出甘氨酸、絲氨酸或蘇氨酸，特別優(yōu)選地，可以舉出絲氨酸或蘇氨酸。在第71位氨基酸殘基的酪氨酸置換為其它的氨基酸的情況下，作為其它的氨基酸的具體例，可以舉出甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸，特別優(yōu)選地，可以舉出丙氨酸或絲氨酸。在第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為其它的氨基酸的情況下，作為其它的氨基酸的具體例，可以舉出甘氨酸或賴氨酸，特別優(yōu)選地，可以舉出賴氨酸。在第89位氨基酸殘基的谷氨酸置換為其它的氨基酸的情況下，作為其它的氨基酸的具體例，可以舉出甘氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，特別優(yōu)選地，可以舉出天冬氨酸。在第91位氨基酸殘基的精氨酸置換為其它的氨基酸的情況下，作為其它的氨基酸的具體例，可以舉出甘氨酸或賴氨酸，特別優(yōu)選地，可以舉出賴氨酸。在第104位氨基酸殘基的谷氨酸置換為其它的氨基酸的情況下，作為其它的氨基酸的具體例，可以舉出絲氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺，特別優(yōu)選地，可以舉出谷氨酰胺或天冬酰胺。本發(fā)明中所稱的與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比免疫原性降低指的是，在將鏈霉抗生物素蛋白突變體給予人等哺乳動(dòng)物的情況下免疫原性降低。例如，可以用以下的方法確認(rèn)免疫原性降低。即，對(duì)于本發(fā)明的突變體鏈霉抗生物素蛋白，使用野生型鏈霉抗生物素蛋白免疫食蟹猴，分析對(duì)于得到的抗鏈霉抗生物素蛋白抗血清的反應(yīng)性，若對(duì)于上述抗鏈霉抗生物素蛋白抗血清的反應(yīng)性與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比降低，則可以判斷與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比免疫原性降低。在用上述方法判斷免疫原性降低的情況下，與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比，本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體的免疫原性優(yōu)選降低為 80%以下，進(jìn)一步優(yōu)選降低為60%以下，進(jìn)一步優(yōu)選降低為20%以下，進(jìn)一步優(yōu)選降低為15% 以下，進(jìn)一步優(yōu)選降低為10%以下，特別優(yōu)選降低為5%以下。根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供編碼上述本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體的DNA。本發(fā)明的DNA可以通過(guò)對(duì)編碼野生型(天然)鏈霉抗生物素蛋白的DNA進(jìn)行位點(diǎn)定向誘變來(lái)制備。編碼上述本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體的DNA可以整合到載體中來(lái)使用。特別地，為了制備本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體，將編碼本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體的DNA整合到表達(dá)載體中，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主中，由此可以表達(dá)本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體。在以大腸桿菌作為宿主的情況下，作為本發(fā)明中使用的載體，優(yōu)選具有復(fù)制起點(diǎn) (ori)，進(jìn)一步具有用于選擇所轉(zhuǎn)化的宿主的基因(例如對(duì)于氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素或氯霉素等藥物的耐藥性基因等)。此外，在表達(dá)載體的情況下，優(yōu)選具有可以在宿主中有效地表達(dá)本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體的啟動(dòng)子，例如IacZ啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子等。 作為這種載體，作為載體的例子，可以舉出M13系載體、pUC系載體、pBR322、pBluescript、 pCR-Script, pGEX-5X-l ( 7 τ -y r )、“QIAexpress 系統(tǒng)”(今了欠 > )、pEGFP、或 PET(此時(shí)，宿主優(yōu)選使用表達(dá)T7 RNA聚合酶的BL21)等。此外，在載體中也可以附加用于提高本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體的產(chǎn)量的信號(hào)序列等。載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入例如可以使用氯化鈣法、電穿孔法來(lái)進(jìn)行。此外，可以附加編碼用于提高可溶性的標(biāo)簽，例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、硫氧還蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)的序列。此外，也可以附加編碼以容易純化作為目的而設(shè)計(jì)的標(biāo)簽，例如多組氨酸標(biāo)簽、Myc表位、血凝素(HA)表位、T7表位、Xpress標(biāo)簽、FLAG肽標(biāo)簽、其它公知的標(biāo)簽序列的序列。除了大腸桿菌之外，可以舉出來(lái)源于哺乳動(dòng)物的表達(dá)載體(例如pcDNA3( 4 > ^ 卜口 Y > 社制)、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17)，p5322)、pEF、pCDM8)、來(lái)源于昆蟲(chóng)細(xì)胞的表達(dá)載體(例如“Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”(￥ 二 BRL社制)、 pBacPAK8)、來(lái)源于植物的表達(dá)載體(例如ρΜΗ1、ρΜΗ2)、來(lái)源于動(dòng)物病毒的表達(dá)載體(例如 pHSV、pMV、pAdexLcw)、來(lái)源于逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體(例如pZIPneo)、來(lái)源于酵母的表達(dá)載體(例如“畢赤酵母表達(dá)試劑盒(Pichia Expression Kit)”( 4 > '卜口 y >社制)、 pNVll、SP-QO1)、來(lái)源于枯草菌的表達(dá)載體(例如pPL608、pKTH50)。在以CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)為目的的情況下，具有用于細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所必需的啟動(dòng)子，例如SV40啟動(dòng)子(Mulligan等人，Nature (1979) 277， 108)、MMLV-LTR啟動(dòng)子、EFl α 啟動(dòng)子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322)、CMV啟動(dòng)子等是不可欠缺的，若具有用于選擇向細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的基因(例如通過(guò)藥物 (新霉素、G418等)可以判別的耐藥性基因)則進(jìn)一步優(yōu)選。作為具有這種特性的載體，可以舉出例如 pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK_CMV、pOPRSV、p0P13 等。對(duì)導(dǎo)入了載體的宿主細(xì)胞不作特別限定，其可以為原核生物和真核生物中的任意一種。例如可以使用大腸桿菌、各種動(dòng)物細(xì)胞等。在使用真核細(xì)胞的情況下，宿主例如可以使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞。作為動(dòng)物細(xì)胞，可以使用諸如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、3T3細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Vero細(xì)胞的哺乳類(lèi)細(xì)胞，或諸如Sf9、Sf21、Tn5等昆蟲(chóng)細(xì)胞。在動(dòng)物細(xì)胞中，在以大量表達(dá)為目的的情況下，特別優(yōu)選CHO細(xì)胞。載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入例如可以通過(guò)磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTAP(《一 U〉為一 >〃< A社制)的方法、電穿孔法、脂轉(zhuǎn)染法等方法來(lái)進(jìn)行。作為植物細(xì)胞，例如來(lái)源于煙草(Nicotiana tabacum)的細(xì)胞作為蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)是已知的，可以將其進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。作為真菌細(xì)胞，酵母、例如酵母屬 (Saccharomyces)、例如酸酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),絲狀菌、例如曲霄屬 (Aspergillus)、例如黑曲霉(Aspergillus Niger)是已知的。在使用原核細(xì)胞的情況下，可以舉出大腸桿菌(E. coli)，例如JM109、DH5a、 HBlOl等，此外枯草桿菌是已知的。通過(guò)本發(fā)明的DNA轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞，將所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在體外培養(yǎng)，由此得到本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體。培養(yǎng)可以根據(jù)公知的方法進(jìn)行。例如作為動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)液，例如可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此時(shí)，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清補(bǔ)充液，也可以進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)的PH優(yōu)選約為6 8。培養(yǎng)通常在約30 40°C下進(jìn)行約15 200小時(shí)，根據(jù)需要附加培養(yǎng)基的更換、通氣、攪拌。此外，可以添加用于促進(jìn)細(xì)胞的增殖的生長(zhǎng)因子。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明，提供通過(guò)將抗體結(jié)合于本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體而得到的鏈霉抗生物素蛋白突變體-抗體結(jié)合物、以及含有鏈霉抗生物素蛋白突變體-抗體結(jié)合物的治療劑或診斷劑。進(jìn)一步地，可以將上述鏈霉抗生物素蛋白突變體-抗體結(jié)合物與用對(duì)于鏈霉抗生物素蛋白具有親和性的生物素或其衍生物標(biāo)記的診斷用或治療用物質(zhì)組合，提供為治療或診斷試劑盒。S卩，本發(fā)明中，制備癌抗原特異性抗體分子與本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體的融合體，給予患者，由此可以對(duì)于癌細(xì)胞特異性地聚集本發(fā)明的鏈霉抗生物素蛋白突變體。接著，將與對(duì)于鏈霉抗生物素蛋白具有親和性的生物素或其衍生物結(jié)合的診斷用或治療用物質(zhì)(放射性同位素、低分子化合物、蛋白質(zhì)等)給予患者，由此可以準(zhǔn)確地使物質(zhì)向癌細(xì)胞聚集。本發(fā)明中，通過(guò)低免疫原性化，抗體產(chǎn)生得到抑制，可以防止由于抗體所導(dǎo)致的早期從體內(nèi)清除、過(guò)敏反應(yīng)等休克。
與鏈霉抗生物素蛋白突變體結(jié)合的抗體可以使用各種分子?？梢允褂枚嗫寺】贵w、單克隆抗體中的任意一種。對(duì)抗體的亞型不特別限定，優(yōu)選使用IgG，特別適合使用 IgG10此外，“抗體”含有全部的改變抗體和抗體片段。可以舉出人化抗體、人型抗體、人抗體，來(lái)源于小鼠、兔、大鼠、豚鼠、猴等各種動(dòng)物的抗體，人抗體與來(lái)源于各種動(dòng)物的抗體的嵌合抗體，雙抗體、scFv、Fd、Fab、Fab，、F (ab)，2，但是不限于此。鏈霉抗生物素蛋白突變體與抗體的結(jié)合物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法得到。例如，可以通過(guò)化學(xué)結(jié)合方法(US5，608，060)得到，也可以通過(guò)將編碼鏈霉抗生物素蛋白突變體的DNA與編碼抗體的DNA連接、使用表達(dá)載體等在宿主細(xì)胞表達(dá)而作為融合蛋白得到。編碼鏈霉抗生物素蛋白突變體的DNA與編碼抗體的DNA的連接可以通過(guò)編碼稱為接頭的適當(dāng)?shù)碾牡腄NA進(jìn)行。期望的是，保留抗體與靶分子的特異結(jié)合力來(lái)制備鏈霉抗生物素蛋白突變體-抗體結(jié)合物。通過(guò)以下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的說(shuō)明，但是本發(fā)明不被實(shí)施例所限定。 實(shí)施例棚列1 低車(chē)·十
基于序列編號(hào)1和2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的基因序列和氨基酸序列，對(duì)具有滿足以下條件的突變的突變體鏈霉抗生物素蛋白的序列進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)了具有表1中記載的突變的突變體鏈霉抗生物素蛋白。(1)預(yù)測(cè)與抗體的融合蛋白在人體內(nèi)免疫原性盡可能減小的序列， (2)盡可能維持對(duì)于生物素分子的高親和力的序列。[表 1]
表1 突變一覽表
權(quán)利要求
1.鏈霉抗生物素蛋白突變體，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸殘基的酪氨酸、第71位氨基酸殘基的酪氨酸、第89位氨基酸殘基的谷氨酸、第91位氨基酸殘基的精氨酸、和第104位氨基酸殘基的谷氨酸中的任一個(gè)以上置換為其它的氨基酸，與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比，該突變體的免疫原性降低。
2.權(quán)利要求1所述的鏈霉抗生物素蛋白突變體，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第71位氨基酸殘基的酪氨酸和第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸殘基的酪氨酸、第89位氨基酸殘基的谷氨酸、第91位氨基酸殘基的精氨酸、第104位氨基酸殘基的谷氨酸中的任一個(gè)以上置換為其它的氨基酸。
3.權(quán)利要求1或2所述的鏈霉抗生物素蛋白突變體，其在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一個(gè)以上的突變(1)第10位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸或蘇氨酸的突變，(2)第71位氨基酸殘基的酪氨酸置換為丙氨酸或絲氨酸的突變，(3)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，(4)第89位氨基酸殘基的谷氨酸置換為天冬氨酸的突變，(5)第91位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，(6)第104位氨基酸殘基的谷氨酸置換為谷氨酰胺或天冬酰胺的突變。
4.鏈霉抗生物素蛋白突變體，其含有在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一個(gè)以上的突變的氨基酸序列，與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比，該突變體的免疫原性降低(1)第10位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸或蘇氨酸的突變，(2)第71位氨基酸殘基的酪氨酸置換為丙氨酸或絲氨酸的突變，(3)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，(4)第89位氨基酸殘基的谷氨酸置換為天冬氨酸的突變，(5)第91位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，(6)第104位氨基酸殘基的谷氨酸置換為谷氨酰胺或天冬酰胺的突變。
5.鏈霉抗生物素蛋白突變體，其含有在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下突變的氨基酸序列，與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比，該突變體的免疫原性降低(2)第71位氨基酸殘基的酪氨酸置換為丙氨酸或絲氨酸的突變，(3)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，(4)第89位氨基酸殘基的谷氨酸置換為天冬氨酸的突變，(6)第104位氨基酸殘基的谷氨酸置換為谷氨酰胺或天冬酰胺的突變。
6.權(quán)利要求5所述的鏈霉抗生物素蛋白突變體，其進(jìn)一步具有以下的突變(1)第10位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸或蘇氨酸的突變，(5)第91位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變。
7.鏈霉抗生物素蛋白突變體，其在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下的全部突變(1)第10位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸的突變，(2)第71位氨基酸殘基的酪氨酸置換為絲氨酸的突變，(3)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，(4)第89位氨基酸殘基的谷氨酸置換為天冬氨酸的突變，(5)第91位氨基酸殘基的精氨酸置換為賴氨酸的突變，以及(6)第104位氨基酸殘基的谷氨酸置換為谷氨酰胺或天冬酰胺的突變。
8.DNA，其編碼權(quán)利要求1至7中的任意一項(xiàng)所述的鏈霉抗生物素蛋白突變體。
9.鏈霉抗生物素蛋白突變體-抗體結(jié)合物，其通過(guò)使抗體與權(quán)利要求1至7中的任意一項(xiàng)所述的鏈霉抗生物素蛋白突變體結(jié)合而得到。
10.治療劑或診斷劑，其含有權(quán)利要求9所述的鏈霉抗生物素蛋白突變體-抗體結(jié)合物。
11.治療或診斷試劑盒，其含有(a)權(quán)利要求9所述的鏈霉抗生物素蛋白突變體-抗體結(jié)合物；和(b)用對(duì)于鏈霉抗生物素蛋白具有親和性的生物素或其衍生物標(biāo)記的診斷用或治療用物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于，提供降低鏈霉抗生物素蛋白所具有的對(duì)于哺乳動(dòng)物的免疫原性(抗原性)的鏈霉抗生物素蛋白突變體。根據(jù)本發(fā)明，提供了鏈霉抗生物素蛋白突變體，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列編號(hào)2中記載的核心鏈霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第72位氨基酸殘基的精氨酸置換為其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸殘基的酪氨酸、第71位氨基酸殘基的酪氨酸、第89位氨基酸殘基的谷氨酸、第91位氨基酸殘基的精氨酸和第104位氨基酸殘基的谷氨酸中的任意一個(gè)以上置換為其它的氨基酸，與野生型鏈霉抗生物素蛋白相比，該突變體的免疫原性降低。
文檔編號(hào)A61K38/00GK102325884SQ20108000828
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2010年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者兒玉龍彥, 土居洋文, 杉山曉, 津本浩平, 浜洼隆雄 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué), 株式會(huì)社英仙蛋白質(zhì)科學(xué)