專利名稱：一種呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗及其制備方法
一種呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗及其制備方法發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及一種呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗(RS VLP疫苗) 及其制備方法，特別涉及一種核心來(lái)自新城疫病毒、表面蛋白來(lái)自合胞病毒的病毒樣顆粒 疫苗(NDV/RSV VLP疫苗)及其制備方法。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)，是在世界范圍存在并引 起嬰幼兒下呼吸道感染的主要原因之一，RSV感染可以引起一系列的呼吸道疾病，從簡(jiǎn)單的 感冒癥狀到嚴(yán)重的下呼吸道感染及并發(fā)癥。RSV的首次感染多發(fā)生于2月齡嬰兒，感染率高 達(dá)83 %，且感染后不會(huì)產(chǎn)生持久的免疫力，有50%的嬰幼兒會(huì)在首次感染后的1 2年再 次感染。同時(shí)，RSV在青少年、老年人以及免疫缺陷人群中也是一種常見(jiàn)而重要的病原體。 RSV屬于副粘病毒科、肺炎病毒屬的單股負(fù)鏈非節(jié)段性RNA病毒，其核心是由核衣殼包裹的 RNA、外層包被有出芽時(shí)來(lái)自宿主的脂質(zhì)雙分子層、以及穿越其中的跨膜蛋白組成。RSV的 RNA共編碼10種蛋白質(zhì)三個(gè)跨膜蛋白(G、F、SH)、兩個(gè)基質(zhì)蛋白(Μ、M2)、三個(gè)核衣殼蛋白 (N、P、L)和兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2)。其中三種跨膜糖蛋白與免疫保護(hù)及致病毒力密切 相關(guān)，分別是融合蛋白(F)、黏附蛋白(G)、以及小疏水蛋白(SH)。研究顯示，抗F抗體可以 阻止RSV與宿主細(xì)胞融合，而抗G抗體可以阻止RSV向宿主細(xì)胞的貼附，這使得F蛋白和G 蛋白被認(rèn)為是RSV的主要保護(hù)性抗原。F蛋白是RSV的一個(gè)重要保護(hù)性抗原，它是中和性抗 體及保護(hù)性的一個(gè)重要靶位點(diǎn)。同時(shí)有證據(jù)表明，F(xiàn)蛋白還是⑶8+T細(xì)胞的一個(gè)重要靶位 點(diǎn)。G蛋白有一個(gè)疏水的N末端，通過(guò)該N末端把G蛋白錨定在病毒脂質(zhì)包膜上，根據(jù)所暴 露的胞外區(qū)蛋白序列的差異，可將RSV分為A和B兩個(gè)亞型。同時(shí)G蛋白還存在另外一種 分泌型G蛋白，分泌型G蛋白缺少了 N末端的65個(gè)氨基酸殘基，只留高度糖基化的胞外區(qū)， 有研究表明，該分泌型片斷有可能導(dǎo)致免疫應(yīng)答向Th2方向發(fā)展。由此，RSV感染宿主誘發(fā) 異常天然免疫及獲得免疫應(yīng)答是導(dǎo)致Thl/Th2平衡失調(diào)并造成免疫損傷的危險(xiǎn)信號(hào)。
眾所周知，疫苗是防控傳染病最有效的手段，至今還沒(méi)有被批準(zhǔn)的疫苗用于RSV 免疫預(yù)防。近年研究顯示，RSV感染對(duì)固有免疫應(yīng)答能力弱，使得Th2免疫應(yīng)答強(qiáng)，造成 Thl/Th2平衡失調(diào)，產(chǎn)生大量炎性分子與趣化因子，且產(chǎn)生中和性抗體不成熟，引起免疫損 傷是RSV疫苗研究的科學(xué)問(wèn)題。在上世紀(jì)70年代，美國(guó)首次推出的福爾馬林滅活RSV疫苗 (F1-RSV疫苗)，接種2 7個(gè)月的嬰幼兒，有80%的嬰幼兒出現(xiàn)了病情加重，且有兩例死 亡，由此發(fā)現(xiàn)死者肺部出現(xiàn)了大量的嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性分子與趨化因子，使得Thl/Th2 平衡紊亂。因?yàn)镕I-RSV引起了過(guò)高的Th2免疫應(yīng)答，⑶4+T細(xì)胞激活和增殖后分泌一些炎 性與趣化因子，且加速了肺部的嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生和浸潤(rùn)、產(chǎn)生低親和力保 護(hù)性抗體，另外損傷了 CD8+T細(xì)胞活性和功能，最終導(dǎo)致了 RSV清除過(guò)程緩慢、肺部損傷及 病毒開(kāi)始大量傳播，由此Fl-RSV疫苗以失敗而告終。由此克服這幾個(gè)難點(diǎn)，是開(kāi)發(fā)RSV疫 苗的基本原則。近年美國(guó)學(xué)者報(bào)道的一種溫度敏感型RSV弱毒苗和一種攜帶RSV的F蛋白 的重組人/牛副流感病毒活疫苗進(jìn)入I期臨床研究，有學(xué)者開(kāi)展的RSV重組亞單位疫苗在臨床前研究階段，都面臨潛在免疫病理?yè)p傷的潛在危險(xiǎn)。因此，尋找新的技術(shù)策略、研發(fā)RSV 疫苗，是安全、有效免疫防控RSV的重大科學(xué)前提。
病毒樣顆粒(Virus-like pratical，VLP)是由病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白組成不含病毒核 酸的病毒粒子空殼。由于VLP大小、結(jié)構(gòu)及表面抗原和多肽表位與真正的病毒幾乎沒(méi)有區(qū) 別，因此能被宿主抗原提呈細(xì)胞所識(shí)別，引起免疫應(yīng)答和效應(yīng)，且無(wú)潛在的副作用。與有良 好口碑的病毒體(Virosome)相比，VLP不是由活病毒制備而來(lái)，沒(méi)有潛在的危險(xiǎn)性；與亞單 位疫苗相比，VLP是多個(gè)抗原蛋白組成，具有很強(qiáng)的免疫原性，由此VLP疫苗被當(dāng)今譽(yù)為病 毒類疫苗發(fā)展的新里程碑。目前的乙肝VLP疫苗(Recombivax HB，Merck)、乳頭瘤VLP疫 苗(GardisiLMerck)和流感VLP疫苗已上市，戊型VLP疫苗等多個(gè)品種在臨床研究中。已 有研究表明，至今RSV形成VLP機(jī)之不明，有學(xué)者利用RSV蛋白進(jìn)行VLP形成研究，結(jié)果表 明自身蛋白VLP形成效率低，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；苽?。由此，如借用其它VLP形成分子，并攜 帶RSV —個(gè)或者多個(gè)表面抗原分子，是創(chuàng)新發(fā)展RSV形成VLP的增長(zhǎng)點(diǎn)。眾所知，新城疫病 毒(Newcastle Disease Virus,NDV)與RSV同屬于附粘病毒科，主要宿主為禽類。NDV可以 感染人類，但不會(huì)在人與人之間傳播。對(duì)于NDV形成VLP的機(jī)制，現(xiàn)在已研究比較明確，NDV 的基質(zhì)蛋白(M)、核衣殼蛋白(NP)、融合蛋白(F)、以及血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(NH)四種 主要結(jié)構(gòu)蛋白可形成獲得率高、結(jié)構(gòu)和功能完整的新城疫病毒樣顆粒(ND VLP)。另外，ND VLP還表現(xiàn)出許多理想的特點(diǎn)首先，ND VLP可以激發(fā)理想的體液和細(xì)胞雙重免疫應(yīng)答；其 次，產(chǎn)生的抗體主要是成熟的中和性抗體，由此ND VLP有可能成為一個(gè)良好的攜帶外源抗 原分子的理想載體；第三，NDV是一種禽類疾病，人類沒(méi)有免疫本底，如果利用ND VLP來(lái)攜 帶RSV免疫保護(hù)抗原分子，將會(huì)對(duì)RSV疫苗發(fā)展成為新的里程碑。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于公開(kāi)一種呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗(RS VLP疫苗)，特別是核 心來(lái)自新城疫病毒的呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗(NDV/RSV VLP疫苗)，本發(fā)明目的還在于 公開(kāi)該疫苗的制備方法。
本發(fā)明目的是通過(guò)如下方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明RS VLP疫苗含有合胞病毒M、F、NP、G四種結(jié)構(gòu)蛋白組成的VLP。
本發(fā)明RS VLP疫苗涉及以下核酸序列①RSV M蛋白的核酸序列；②RSV NP蛋白 的核酸序列；③RSV G蛋白的核酸序列；④RSV F蛋白的核酸序列；其中，所述G蛋白核酸 序列包括來(lái)自RSV A亞型( 及RSV B亞型Gb。
本發(fā)明RS VLP疫苗涉及以下氨基酸序列①RSV M蛋白的氨基酸序列；②RSV NP 蛋白的氨基酸序列；③RSV G蛋白的氨基酸序列；④RSV F蛋白的氨基酸序列；其中，所述G 蛋白核酸序列包括來(lái)自RSV A亞型( 及RSV B亞型(Λ。
本發(fā)明RS VLP疫苗含有呼吸道合胞病毒樣顆粒(RS VLP)，并攜帶有以下表面蛋 白①RSV的G蛋白；②RSV的F蛋白；其中，所述RSV G蛋白包括來(lái)自RSV A亞型的fei和 來(lái)自B亞型的(Λ。
本發(fā)明RS VLP疫苗包含一個(gè)攜帶有RSV及NDV主要結(jié)構(gòu)蛋白的重組真核表達(dá)載 體、雞成纖維細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞；其中，所述真核表達(dá)載體選自①PHWD2000 ； ②p0PI3CAT ；③pCAGGS ；④pcDNA6/TR ；⑤pCMV-HA ；所述雞成纖維細(xì)胞選自①UMNSAH/DF-I細(xì)胞；②分離9-10齡禽成纖維細(xì)胞；所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自①VERO細(xì)胞；②293細(xì) 胞；③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤；BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦M(jìn)DCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì) 胞；所述昆蟲(chóng)細(xì)胞選自①Tn5細(xì)胞；②SF9 Cell細(xì)胞。
其中，本發(fā)明pHWD2000載體是由pHW2000載體改造得到，包括去掉pHW2000載體 上游的PCMV啟動(dòng)子，并用雞β-actin蛋白啟動(dòng)子替換，同時(shí)在雞β-actin蛋白啟動(dòng)字上 游插入hCMV-IE增強(qiáng)子，改造后的PCWD2000可以在真核系統(tǒng)中高效表達(dá)外源基因，同時(shí) PCWD2000有著較小的分子量，可以攜帶較大的外源基因片段。
本發(fā)明NDV/RSV VLP疫苗含有新城疫病毒M、F、NP、NH四種結(jié)構(gòu)蛋白，以及新城疫 病毒F蛋白與合胞病毒F組成的NDV F/RSV F融合蛋白、新城疫病毒HN蛋白與合胞病毒G 蛋白組成的NDV HN/RSV G融合蛋白兩種表面蛋白組成的VLP。
本發(fā)明NDV/RSV VLP疫苗涉及以下核酸序列①NDV M蛋白的核酸序列；②NDV NP 蛋白的核酸序列；③NDV HN蛋白的核酸序列；④NDV F蛋白的核酸序列；⑤NDV HN/RSV G 融合蛋白核酸序列；⑥NDV F/RSV F融合蛋白核酸序列；其中，所述G蛋白核酸序列包括來(lái) 自RSV A亞型Ga及RSV B亞型(Λ。
本發(fā)明NDV/RSV VLP疫苗涉及以下氨基酸序列①NDV M蛋白的氨基酸序列； ②NDV NP蛋白的氨基酸序列；③NDV HN蛋白的氨基酸序列；④NDV F蛋白的氨基酸序列； ⑤NDV HN/RSV G融合蛋白的氨基酸序列；⑥NDV F/RSV F融合蛋白的氨基酸序列；其中，所 述G蛋白核酸序列包括來(lái)自RSV A亞型( 及RSV B亞型(Λ。
本發(fā)明NDV/RSV VLP疫苗包含有一種新城疫病毒核心，并攜帶有以下表面蛋白 ①NDV HN/RSV G融合蛋白；②NDV F/RSV F融合蛋白；其中，所述RSV G蛋白包括來(lái)自RSV A亞型的( 和來(lái)自B亞型的Gb。
本發(fā)明NDV/RSV VLP疫苗包含一個(gè)攜帶有RSV及NDV主要結(jié)構(gòu)蛋白的重組真 核表達(dá)載體、雞成纖維細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞；其中，所述真核表達(dá)載體選自 ①PHWD2000 ；②p0PI3CAT ；③pCAGGS ；④pcDNA6/TR ；⑤pCMV-HA ；所述雞成纖維細(xì)胞選自 ①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②分離9_10齡禽成纖維細(xì)胞；所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自①VERO細(xì) 胞；②293細(xì)胞；③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤；BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦M(jìn)DCK細(xì)胞； ⑧H印-G2細(xì)胞；所述昆蟲(chóng)細(xì)胞選自①Tn5細(xì)胞 ’②SF9 Cell細(xì)胞。
其中，本發(fā)明pHWD2000載體是由pHW2000載體改造得到，包括去掉pHW2000載體 上游的PCMV啟動(dòng)子，并用雞β-actin蛋白啟動(dòng)子替換，同時(shí)在雞β-actin蛋白啟動(dòng)字上 游插入hCMV-IE增強(qiáng)子，改造后的PCWD2000可以在真核系統(tǒng)中高效表達(dá)外源基因，同時(shí) PCWD2000有著較小的分子量，可以攜帶較大的外源基因片段。
其中，本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗可不含有佐劑，也可以含有如下佐 劑中的一種或幾種①鋁鹽氫氧化鋁或磷酸鋁；②SPOl佐劑由2%角鯊烯、0. 聚氧乙 烯蓖麻油、0. 聚醚組成水包油佐劑；③SP02佐劑在SPOl佐劑中加一定量(20 60ug) 重組細(xì)菌鞭毛蛋白；P3BSK4 (N-palmitoyl-S-[2，3-bis (palmitoyloxy) - (2RS) -propul]-[R ]-propyl-[R] -cysteinyl-[S] -seryl-[S] - (Iysyl) 3-lysine)；⑤水凝膠佐劑季胺化的殼 聚糖、⑥r(nóng)LT 重組不耐熱性腸毒素。
本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗可制成多種臨床適用的劑型，包含但不限 于注射劑型、噴鼻劑型、舌下含片、透皮貼劑或微針劑型。
本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗包括如下幾種RS VLP疫苗、NDV-HNF/ RSV-GF VLP 疫苗、NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP 疫苗、NDV-NH/RSV-G+NDV-F/ RSV-F VLP 疫苗。
本發(fā)明RS VLP疫苗的制備方法包括如下步驟
①構(gòu)建pHWD2000真核表達(dá)載體；②含有編碼RSV M蛋白核酸序列的重組真核表 達(dá)載體；③含有編碼RSV NP蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；④含有編碼重組RSV G 蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；⑤含有編碼重組RSV F蛋白的核酸序列的重組真核 表達(dá)載體；⑥提供一種用于表達(dá)的細(xì)胞系，經(jīng)轉(zhuǎn)染后可以釋放RS VLP ；⑦提供用于純化RS VLP的方法，方法包括蔗糖梯度離心純化方法以及柱層析純化方法。
本發(fā)明NDV/RSV VLP疫苗的制備方法包括如下步驟
將含有編碼NDV M、NDV NP的核酸序列的重組真核表達(dá)載體與含有NDV-HN/RSV-G 融合蛋白、NDV F/RSV F融合蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化用于表達(dá)的細(xì) 胞系，形成具有NDV核心并攜帶有RSV表面抗原G、F的NDV-NHF/RSV-GF VLP ；
或?qū)⒑芯幋aNDV M、NDV NP、NDV F蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體與含有 NDV-HN/RSV-G融合蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化用于表達(dá)的細(xì)胞系，形成 具有NDV核心并攜帶有RSV表面抗原G的NDV-NH/RSV-G VLP ；
或?qū)⒑芯幋aNDV M、NDV NP、NDV HN蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體與含 有NDV F/RSV F融合蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化用于表達(dá)的細(xì)胞系，形 成具有NDV核心并攜帶有RSV表面抗原F的NDV-F/RSV-F VLP ；
其中該方法所述NDV-HNF/RSV-GF VLP, NDV-NH/RSV-G VLP, NDV-F/RSV-F VLP 及 NDV-NH/RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP均可激發(fā)體液與細(xì)胞雙重的免疫應(yīng)答；其中所述RSV G蛋 白包括來(lái)自RSV A亞型( 和來(lái)自B亞型(Λ。
其中，該方法所述以NDV 為核心的 VLP (NDV-HNF/RSV-GF VLP、NDV-NH/RSV-G VLP、 NDV-F/RSV-F VLP)包括①NDV M蛋白；②NDV NP蛋白；③NDV NH蛋白；④NDV F蛋白； ⑤NDV F蛋白胞與RSV F蛋白的融合蛋白NDV-F/RSV-F ；⑥NDV HN蛋白與RSV G蛋白的融 合蛋白 NDV HN/RSV G。
本發(fā)明NDV/RSV VLP疫苗的制備方法還可以為如下步驟
①構(gòu)建PHWD2000真核表達(dá)載體；②含有編碼NDV M蛋白核酸序列的重組真核表達(dá) 載體；③含有編碼NDV NP蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；④含有編碼重組NDV NH蛋 白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；⑤含有編碼重組NDV F蛋白的核酸序列的重組真核表 達(dá)載體；⑥含有編碼重組NDV HN/RSV G融合蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；⑦含有 編碼重組NDV F/RSV F融合蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；⑧提供一種用于表達(dá)的 細(xì)胞系，經(jīng)轉(zhuǎn)染后可以高效率釋放NDV/RSV VLP ；⑨提供用于純化NDV/RSV VLP的方法，方 法包括蔗糖梯度離心純化方法以及柱層析純化方法。
其中，構(gòu)建含有重組NDV NH/RSV G以及NDV F/RSV F蛋白核酸序列的重組真核表 達(dá)載體的方法包括如下步驟①通過(guò)生物信息學(xué)，分析NDV F及HN蛋白的胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū) 核酸序列；②通過(guò)生物信息學(xué)，分析RSV F及G蛋白的胞外區(qū)核酸序列；③通過(guò)基因合成的 方法合成重組HN/G以及F/F蛋白核酸序列；④在該方法基礎(chǔ)上利用酶切與連接的手段構(gòu)建 含有編碼重組NDV NH/RSV G以及NDV F/RSV F蛋白的真核表達(dá)載體。10
其中，構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法，包括如下步驟將編碼RSV M蛋白、F蛋白、NP 蛋白、G蛋白的DNA片斷被插入到pHWD2000載體中，構(gòu)成重組pHWD2000-M、pHWD2000-F、 pHWD2000-NP、pHWD2000-G表達(dá)載體；在另一個(gè)方案中包括將編碼NDV M蛋白、NP蛋白、F蛋 白、HN蛋白、重組F/F蛋白、及重組NH/G蛋白的DNA片斷被插入到pHWD2000載體中，構(gòu)成 重組 pHWD2000-M、pHWD2000-NP, pHWD2000-F, pHWD2000-HN, pHWD2000-F/F, pHWD2000-NH/G 表達(dá)載體；所述重組NH為NDV-NH/RSV-G，即pHWD2000-NH/G ；所述重組F為NDV-F/RSV-F， 即 pHWD2000-F/F。
其中，本發(fā)明方法涉及一個(gè)RS VLP及NDV/RSV VLP表達(dá)宿主細(xì)胞系，其中，所指細(xì) 胞為雞成纖維細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，雞成纖維細(xì)胞有①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②分離9_10 齡禽成纖維細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自①VERO細(xì)胞 ’②293細(xì)胞；③COS細(xì)胞；④人二倍體 細(xì)胞；⑤BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦M(jìn)DCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；⑨Tn5細(xì)胞；⑩SF9 Cell細(xì) 胞；其中，所述NDV/RSV VLP表達(dá)宿主細(xì)胞系包含NDV-HNF/RSV-GF VLP、NDV_NH/RSV_G VLP, 及 NDV-F/RSV-F VLP。
其中，本發(fā)明制備RS VLP及NDV/RSV VLP細(xì)胞培養(yǎng)方法包括如下步驟在細(xì)胞培 養(yǎng)基中加入濃度為2-100 μ g/mL的糖胺聚糖，優(yōu)選 ομ g/mL ；其中，所指糖胺聚糖為硫酸肝 素、硫酸軟骨素B、硫酸透明質(zhì)酸或肝素，優(yōu)選肝素。
其中，本發(fā)明制備RS VLP及NDV/RSV VLP時(shí)的純化方法包括如下步驟蔗糖梯度 離心法，蔗糖濃度為30 ^35%與60%;或柱層析純化方法，用kphar0Se6FFTM分子篩并進(jìn) 行 DEAEipharoseFFTM 離子交換。
其中，蔗糖梯度離心的步驟為①收集規(guī)?；a(chǎn)的RS VLP或NDV/RSV VLP細(xì)胞 培養(yǎng)液，4°C 5000rmp離心lOmin，去除細(xì)胞及雜質(zhì)；②取上清液IOOOOOg 4°C離心2h，沉淀 用 TNE buffer 懸浮，TNE buffer 的組成為 25mM Tris-HCl pH 7. 4,150mM NaCl,5mM EDTA ； ③將懸液進(jìn)行蔗糖梯度離心，蔗糖采用TNE buffer配制，體系采用30%蔗糖ImL ；45%蔗 糖ImL ；60%蔗糖4mL ；4°C IOOOOOg離心池；④收集中間層，并用折射儀測(cè)量密度；⑤用 PH6. 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰；雜 蛋白去除可達(dá)95%以上；⑥采用DEAE-kpharoseFFTM介質(zhì)進(jìn)行離子交換層析，平衡液為 ρΗ6· 5-7. 5、含有0. 05-0. 15Μ氯化鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5Μ氯化鈉、ρΗ6· 5-7. 5的 PBS ；雜蛋白去除可達(dá)99 %以上，純化后的VLP原液為疫苗原液。
本發(fā)明產(chǎn)品及方法中所述的百分含量均為質(zhì)量體積百分含量。
本發(fā)明涉及一種呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗，包括如下幾種RS VLP疫苗、 NDV-HNF/RSV-GF VLP 疫苗、NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP 疫苗、或 NDV-NH/ RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP疫苗。經(jīng)此形成的VLP蛋白抗原加入或不加入佐劑，制備的注射 劑型、噴鼻劑型、舌下含片劑型、透皮劑型免疫不同動(dòng)物或人群后，可安全、有效預(yù)防RSV感 染，為不同年齡人群免疫防控RSV感染提供了疫苗。經(jīng)過(guò)藥效實(shí)驗(yàn)，將本發(fā)明呼吸道合胞病 毒樣顆粒疫苗分別通過(guò)注射、噴鼻、舌下含片、透皮等途徑免疫Balb/C小鼠、恒河猴敏感動(dòng) 物產(chǎn)生好的體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答及天然免疫與獲得性免疫應(yīng)答以及黏膜免疫應(yīng)答效 果，且Th2/Thl免疫應(yīng)答趨于平衡，沒(méi)有免疫肺損傷的跡象，具有安全性。用呼吸道合胞病 毒樣顆粒疫苗免疫棉鼠、恒河猴敏感動(dòng)物兩次，進(jìn)一步通過(guò)RSV野生株攻毒，均對(duì)A型標(biāo)準(zhǔn) 株RSV A2、B型標(biāo)準(zhǔn)株G8537及不同地區(qū)臨床分離A和B型RSV流行野生株有90%以上的免疫保護(hù)效果。用呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗接種不同年齡段O歲以下、3-17歲、18-59 歲、60歲以上)人群，免疫兩次，分別采用注射、噴鼻、舌下含片、透皮劑型疫苗免疫，顯示對(duì) 各年齡段人群沒(méi)有出現(xiàn)不適，具有安全性。并能產(chǎn)生好的雙重免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)力，其保 護(hù)率達(dá)85%以上，由此表明該疫苗對(duì)不同年齡人群具有好的免疫保護(hù)效果。
下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗檢定實(shí)驗(yàn)
本發(fā)明實(shí)施例8制備的RS VLP疫苗和NDV/RSV VLP疫苗的注射劑、噴鼻劑、舌下 含片、透皮劑型外觀見(jiàn)均一，無(wú)異味和染菌；通過(guò)豚鼠、家兔試驗(yàn)無(wú)熱原、異常毒性和急性毒 性反應(yīng)；通過(guò)Lorry法測(cè)定蛋白含量均在劑量范圍；通過(guò)電鏡觀察VLP直徑約140-160 μ m ； ELISA測(cè)定DNA含量均在50EU以下；通過(guò)SDS-PAGE和WB檢測(cè)抗原蛋白成分存在；通過(guò)免 疫Balb/C小鼠1次血清中和抗體效價(jià)在3200以上。
實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的Balb/C小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng) 答效果實(shí)驗(yàn)
將本發(fā)明實(shí)施例8制備的RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑 制備的注射、噴鼻、舌下含片、透皮疫苗劑型，并用？83、鋁鹽、3 01、3 02、？；^31(4、1^1\細(xì)菌 鞭毛為對(duì)照組，分別按各自途徑免疫5-6周Balb/C小鼠，其免疫劑量按實(shí)施例8疫苗低劑 量組，免疫兩次(0，21天)；末次免疫后14天將各組小鼠摘眼球取血、分離血清和免疫細(xì) 胞，采集脾淋巴細(xì)胞、肺和鼻腔灌洗液；通過(guò)ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)都在1 6400以 上，采用MTT法測(cè)定中和抗體效價(jià)都在1 3200以上，采用流式細(xì)胞儀、ELISP0T儀測(cè)定免 疫細(xì)胞與血清中重要細(xì)胞因子、炎性分子、趨化因子及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等動(dòng)態(tài)變 化使得TH2/Thl應(yīng)答平衡，采用ELISA法測(cè)定鼻腔、肺灌洗液，SIgA抗體效價(jià)都在1 160 以上。這說(shuō)明本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗不管是加入佐劑與沒(méi)有佐劑均都能產(chǎn) 生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且呈現(xiàn)出試驗(yàn)組有佐劑優(yōu)于無(wú)佐劑組、高劑量組高于低劑量組免 疫應(yīng)答效果，而對(duì)陰性照組沒(méi)有產(chǎn)生雙重免疫應(yīng)答；本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫 苗不管是注射還是噴鼻、舌下含片、透皮貼劑、微針劑型均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答， 且注射劑血清抗體效價(jià)高于微針劑型、噴鼻、舌下含片、透皮貼劑型，噴鼻、舌下含片、微針 劑型黏膜和細(xì)胞免疫效應(yīng)好于注射劑型；本發(fā)明NDV-HNF/RSV-GF VLP疫苗免疫應(yīng)答效力 與 RS VLP 疫苗相當(dāng)，但優(yōu)于 NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP+NDV-NH/RSV-G VLP疫苗。由此制備的RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗在小鼠體內(nèi)具 有好的免疫應(yīng)答效果。
實(shí)驗(yàn)例3本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的棉鼠體內(nèi)的免疫保護(hù)效果實(shí) 驗(yàn)
將本發(fā)明實(shí)施例8制備的RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑 制備的注射、噴鼻、舌下含片、透皮疫苗劑型為試驗(yàn)組，并用PBS、鋁鹽、SPOl、SP02、P3BSK4, rLT、細(xì)菌鞭毛及Fl-RSV滅活疫苗為對(duì)照組，分別按各自途徑免疫6_8周棉鼠，其免疫劑量 按實(shí)施例8疫苗低劑量組，免疫兩次(0，21天)，末次免疫后14天各試驗(yàn)組、對(duì)照組小鼠用 3 X IOf5Pfu臨床分離RSV代表株(A、B型)分別氣溶膠鼻腔攻毒觀察保護(hù)效果。結(jié)果顯示本 發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗均都能產(chǎn)生較好的保護(hù)效果，免疫保護(hù)率在90 %以 上，且RS VLP疫苗疫苗保護(hù)率達(dá)98%、NDV-HNF/RSV-GF VLP疫苗保護(hù)率達(dá)97%、NDV-HN/RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP 疫苗保護(hù)率達(dá) 96 %、NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗保護(hù)率達(dá) 94 %、 NDV-F/RSV-F VLP疫苗保護(hù)率達(dá)92 %，而對(duì)照組FI-RSV滅活疫苗保護(hù)率達(dá)60 %、其他各對(duì) 照組保護(hù)率達(dá)為0%。由此制備的RS VLP及NDV NH/RSV VLP疫苗在小鼠體內(nèi)具有高效的 免疫保護(hù)效果。
實(shí)驗(yàn)例4本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的恒河猴體內(nèi)的免疫應(yīng)答及免 疫保護(hù)效果實(shí)驗(yàn)
將本發(fā)明實(shí)施例8制備的RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP疫苗加入或不加入相應(yīng)佐 劑制備的注射、噴鼻、舌下含片、透皮疫苗劑型，并用PBS、鋁鹽、SPOU SP02、P3BSK4, rLT、 細(xì)菌鞭毛和FI-RSV滅活疫苗為對(duì)照組，分別按各自途徑免疫3歲恒河猴，其免疫劑量按實(shí) 施例8疫苗高劑量組，免疫兩次(0，21天)；末次免疫后14天將各組小鼠摘眼球取血、分 離血清和免疫細(xì)胞，采集脾淋巴細(xì)胞、肺和鼻腔灌洗液；通過(guò)ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)都 在12800以上，采用MTT法測(cè)定中和抗體效價(jià)都在6400以上，采用流式細(xì)胞儀、ELISP0T儀 測(cè)定免疫細(xì)胞與血清重要細(xì)胞因子、炎性分子、趣化因子及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等動(dòng) 態(tài)變化使得TH2/Thl應(yīng)答平衡，采用ELISA法鼻腔、肺灌洗液SIgA抗體效價(jià)在1 200以 上。這說(shuō)明本發(fā)明NDV-NH/RSV VLP疫苗不管是加入佐劑與沒(méi)有佐劑均都能產(chǎn)生滿意的雙 重免疫應(yīng)答，且試驗(yàn)組有佐劑組好于無(wú)佐劑組、高劑量高于低劑量組免疫應(yīng)答效果，而對(duì)照 組沒(méi)有產(chǎn)生雙重免疫應(yīng)答；本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗不管是注射還是噴鼻、 舌下含片、透皮貼劑、微針劑型均都能產(chǎn)生滿意的雙重免疫應(yīng)答，且注射劑血清抗體效價(jià)高 于微針劑型、噴鼻、舌下含片、透皮貼劑型，噴鼻、舌下含片、微針劑型黏膜和細(xì)胞免疫效應(yīng) 好于注射劑型；本發(fā)明NDV-HNF/RSV-GF VLP疫苗免疫應(yīng)答效力優(yōu)于RSV VLP疫苗、NDV-NH/ RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP 疫苗、NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP 疫苗。由此制備 的RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗在恒河猴體內(nèi)具有好的免疫應(yīng)答效果。
呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗末次免疫后14天各試驗(yàn)組、對(duì)照組恒河猴用 2X107pfu臨床分離RSV代表株(A、B型)分別氣溶膠鼻腔攻毒觀察保護(hù)效果。結(jié)果顯示，本 發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗均都能產(chǎn)生高水平的保護(hù)效果，免疫保護(hù)率在90%以 上，且RS VLP疫苗及NDV-HNF/RSVGF VLP疫苗保護(hù)率達(dá) 100%,NDV-F/RSV-F+NDV-NH/RSV-G VLP疫苗保護(hù)率達(dá)98%、NDV-NH/RSV-G VLP疫苗保護(hù)率達(dá)97%、NDV-F/RSV-F VLP疫苗保 護(hù)率達(dá)96%、而對(duì)照組FI-RSV滅活疫苗保護(hù)率達(dá)68%、其他各對(duì)照組保護(hù)率達(dá)為0%。由 此制備的NDV NH/RSV VLP疫苗在恒河猴體內(nèi)具有高效的免疫保護(hù)效果。
實(shí)驗(yàn)例5本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的人群體內(nèi)的免疫應(yīng)答及免疫 保護(hù)效果實(shí)驗(yàn)
實(shí)施例8制備的RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP疫苗加入或不加入相應(yīng)佐劑的注射、噴 鼻、舌下含片、透皮疫苗劑型，并用？83、鋁鹽、3 01、3 02、？；^31(4、扎1\細(xì)菌鞭毛為對(duì)照組， 分別按各自途徑接種健康不同年齡人群0歲以下、2-17歲、18-59歲、60歲以上)組，2歲 以下、2-17歲年齡組免疫劑量按實(shí)施例8疫苗低劑量、18-59歲、60歲以上年齡組免疫劑量 按實(shí)施例8疫苗高劑量，接種兩次(0，21天)，末次免疫后14天采集各組人群靜脈血、分離 血清和免疫細(xì)胞，采集鼻腔灌洗液，并全程觀察試驗(yàn)疫苗組人群生命體征變化。通過(guò)ELISA 法測(cè)定血清抗體效價(jià)在3200以上，采用MTT法測(cè)定中和抗體效價(jià)在1 1600以上，采用流 式細(xì)胞儀、ELISP0T儀測(cè)定免疫細(xì)胞與血清重要細(xì)胞因子、炎性分子、趨化因子及嗜酸性粒13細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等動(dòng)態(tài)變化TH2/Thl應(yīng)答趨于平衡，采用ELISA法鼻腔灌洗液SIgA抗體 效價(jià)在1 160以上；全過(guò)程觀察接種疫苗人群90天無(wú)明顯不適等反應(yīng)癥狀；通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)流 行病學(xué)經(jīng)過(guò)360天的跟蹤隨訪其疫苗有很好的免疫保護(hù)效果，其保護(hù)率達(dá)85%以上，且RS VLP 及 NDV-HNF/RSV-GF VLP 疫苗保護(hù)率都達(dá) 96 %、NDV-NH/RSV-G+NDV-F/RSV_F VLP 疫苗保 護(hù)率達(dá)94%、NDV-NH/RSV-G VLP疫苗保護(hù)率達(dá)92%，NDV_F/RSV_F VLP疫苗保護(hù)率達(dá)88%、 而各對(duì)照組保護(hù)率達(dá)為12%。由此制備的RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗不管是注射或 是噴鼻或是舌下含片或是透皮免疫接種在不同年齡人群中有很好的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù) 效果。
實(shí)驗(yàn)例6本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的安全性實(shí)驗(yàn)
(1)無(wú)菌、支原體試驗(yàn)將實(shí)施例8制備的RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP疫苗接種硫 乙醇酸鹽培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)14d，并以無(wú)菌生理鹽水做陰 性對(duì)照，培養(yǎng)溫度為25°C、35°C。結(jié)果顯示，RS VLP疫苗、NDV/RSV VLP兩類疫苗都未見(jiàn)細(xì) 菌生長(zhǎng)。將RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗分別用半流體和肉湯培養(yǎng)基，37°C初代培養(yǎng)21 天，次代培養(yǎng)21天，無(wú)菌生理鹽水做陰性對(duì)照，結(jié)果顯示RS VLP及NDV/RSV VLP兩類疫苗 都無(wú)支原體生長(zhǎng)；用DNA染色法將毒種接種Vero細(xì)胞培養(yǎng)3天，傳代一次，用二苯甲酰胺熒 光染料染色。結(jié)果顯示，RS VLP及NDV/RSV VLP兩類疫苗都無(wú)支原體生長(zhǎng)。
(2)溶血性試驗(yàn)選取體重為350g左右的豚鼠，采集新鮮豚鼠血1ml，用PBS洗滌 3次，再將血細(xì)胞體積恢復(fù)并稀釋10倍。PBS稀釋RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗(由實(shí)施例 8制備)，分別為2倍、4倍、8倍，將豚鼠血細(xì)胞加入到稀釋的待檢佐劑中，8小時(shí)后，評(píng)價(jià)血 球溶解以目測(cè)或者上清濃度檢測(cè)為準(zhǔn)，并在570nm處檢測(cè)吸光度。結(jié)果顯示，沒(méi)有發(fā)生血球 破裂，無(wú)溶血現(xiàn)象。說(shuō)明RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗中的成分不能使紅細(xì)胞裂解。因此， RS VLP及NDV/RSV VLP兩類疫苗都無(wú)溶血反應(yīng)。
(3)急性毒性試驗(yàn)取實(shí)施例8制備的RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗0. 5ml腹腔注 射體重為12 18g Balb/C小鼠，每組10只，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀察小鼠的 活動(dòng)狀態(tài)、體重變化和存活率。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活，沒(méi)有出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、行 動(dòng)遲緩等不良癥狀，而體重呈現(xiàn)增加，由此證明RS VLP及NDV/RSV VLP兩類疫苗在試驗(yàn)的 濃度下對(duì)動(dòng)物是安全的，且14天后處死進(jìn)行大體解剖檢查，未見(jiàn)臟器有病理改變。在體重 為8 IOkg的Beagle狗體內(nèi)的急性毒性結(jié)果取實(shí)施例8制備的RS VLP及NDV/RSV VLP 疫苗肌肉注射15mL，每組10只，同時(shí)設(shè)PBS陰性對(duì)照組，連續(xù)2周觀察行為、體重和存活率 變化。結(jié)果可見(jiàn)，Beagle狗未見(jiàn)毒性反應(yīng)，行為正常，沒(méi)有死亡，與對(duì)照組狗比較無(wú)差異，各 狗體重有所增加，并處死大體解剖未見(jiàn)臟器有明顯的病理改變。因此，RS VLP及NDV/RSV VLP兩類疫苗都無(wú)急性毒性反應(yīng)，使用是安全的。
(4)過(guò)敏試驗(yàn)研究取實(shí)施例8制備的RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗分別皮下接種 體重為250 350g Hartley豚鼠，每個(gè)樣品接種豚鼠5只，每只接種0. 5ml，隔日一次，共3 次。第3次注射后21天，耳靜脈分別給予相同RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗0. 5ml，并用人 血白蛋白和生理鹽水以同樣的方法分別接種3只豚鼠作為陽(yáng)性、陰性對(duì)照。注射后30分鐘 及3天觀察動(dòng)物，陽(yáng)性、陰性對(duì)照均成立，RS VLP及NDV/RSV VLP兩類疫苗組豚鼠無(wú)死亡， 且無(wú)鼻癢、噴嚏、煩躁不安、呼吸困難、休克、痙攣等過(guò)敏癥狀。因此，RS VLP及NDV/RSV VLP 兩類疫苗在動(dòng)物體內(nèi)都無(wú)過(guò)敏反應(yīng)。
(5)兔熱源質(zhì)試驗(yàn)取預(yù)檢合格的體重為2 3kg家兔3只固定，30分鐘后測(cè) 量體溫，共測(cè)2次，間隔30分鐘，要求2次溫差不大于0. 2°C，各家兔2次平均溫度在 38. 6-39. 5 0C。將實(shí)施例8制備的RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗預(yù)熱至38 °C，于第2次測(cè)溫后 15分鐘內(nèi)，自家兔耳邊靜脈分別緩緩注入0. 5ml/只。注射后每隔30分鐘測(cè)量體溫1次，連 測(cè)6次。結(jié)果顯示RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗給予家兔個(gè)體升溫均未超過(guò)0. 2°C，3只家 兔升溫總和未超過(guò)0.4°C，沒(méi)有引起家兔的發(fā)熱反應(yīng)。因此，制備的RS VLP及NDV/RSV VLP 兩類疫苗都無(wú)熱源質(zhì)。
(6)免疫病理?yè)p傷試驗(yàn)由實(shí)施例8制備的RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗通過(guò)小鼠、 恒河猴和人群外周血抗體亞型、趣化因子、炎性因子、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性細(xì) 胞及氣管、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，RS VLP及NDV/RSV VLP兩類疫苗 免疫接種不管在大小動(dòng)物，或是在人體內(nèi)Th2/Thl免疫應(yīng)答趨于平衡，沒(méi)有免疫器官損傷 的跡象，因此具有安全性。
實(shí)驗(yàn)例7本發(fā)明RS VLP疫苗及NDV/RSV VLP疫苗的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
由實(shí)施例8制備的RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗，分別置于2_8°C、室溫O0_25°C )、 37°C 1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月和M個(gè)月，取樣觀察外觀、PH值、 無(wú)菌、電鏡觀察粒徑、免疫動(dòng)物觀察安全性。結(jié)果顯示RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗放置 2-80C 24個(gè)月內(nèi)均無(wú)變色分層等現(xiàn)象，PH值在7. 0-7. 2之間無(wú)變化，電鏡觀察粒徑大小保 持一致，且注射或滴鼻或透皮給Balb/c小鼠表現(xiàn)正常；RS VLP及NDV/RSVVLP疫苗放置室 溫25 °C 3個(gè)月內(nèi)均有好的穩(wěn)定性；RS VLP及NDV/RSV VLP疫苗放置室溫37 °C 1個(gè)月內(nèi)均 有好的穩(wěn)定性效果。由結(jié)果說(shuō)明，RS VLP及NDV/RSV VLP兩類疫苗放置2_8°C理化性質(zhì)、生 物學(xué)性能穩(wěn)定，有效期至少M(fèi)個(gè)月。
下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例所述的效果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 本發(fā)明呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗的基因及蛋白構(gòu)成
以RSV的M蛋白核酸與蛋白序列、RSV的NP蛋白的核酸與蛋白序列、RSV的F蛋白 的核酸與蛋白序列、RSV的G蛋白的核酸與蛋白序列、NDV的M蛋白核酸序列與蛋白序列、 NDV的NP蛋白核酸序列與蛋白序列、NDV的HN蛋白核酸序列與蛋白序列、NDV的F蛋白核 酸序列與蛋白序列，見(jiàn)表1-20所示。
實(shí)施例2.本發(fā)明呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗的表達(dá)載體構(gòu)建
以構(gòu)建重組pHWD2000表達(dá)載體為例利用PCR的方法擴(kuò)增RSV M基因白核酸序 列、F蛋白基因序列、G蛋白基因序列、NP蛋白基因序列并插入到PHWD2000載體中，構(gòu)成重 組 pHWD2000-M、pHWD2000-F、pHWD2000-G、pHWD2000-NP 表達(dá)載體。在另一個(gè)方案中 NDVM 基因白核酸序列、F蛋白基因序列、NP蛋白基因序列并插入到PHWD2000載體中，構(gòu)成重組 PHWD2000-M、pHWD2000-F、pHWD2000-NP 表達(dá)載體。
pHWD2000-NH/G表達(dá)載體構(gòu)建通過(guò)生物信息學(xué)方法，分析NDV HN蛋白基因序列 胞內(nèi)區(qū)(CT)與跨膜區(qū)(TM)，同時(shí)分析RSV G蛋白基因序列胞外區(qū)，通過(guò)基因合成的方法合 成重組HN/G蛋白基因序列，然后利用酶切與連接的方法構(gòu)建重組表達(dá)載體pHWD2000-NH/ G，并包含Bsa I酶切為點(diǎn)。
pHWD2000-F/F表達(dá)載體構(gòu)建通過(guò)生物信息學(xué)方法，分析NDV F蛋白基因序列胞 內(nèi)區(qū)(CT)與跨膜區(qū)(TM)，同時(shí)分析RSV F蛋白基因序列胞外區(qū)，通過(guò)基因合成的方法合成 重組F/F蛋白基因序列，然后利用酶切與連接的方法構(gòu)建重組表達(dá)載體pHWD2000-F/F，并 包含Bsa I酶切為點(diǎn)。
實(shí)施例3.細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞批庫(kù)建立
以UMNSAH/DF-1細(xì)胞培養(yǎng)并建庫(kù)為例UMNSAH/DF_1細(xì)胞來(lái)源于American Type Culture Collection(ATCC)。培養(yǎng)基采用 Dulbecco，s modified Eagle medium(DMEM)，添 加青霉素及鏈霉素，不加或加入一定量胎牛血清(10-2% )在細(xì)胞工廠或細(xì)胞發(fā)酵罐進(jìn)行 培養(yǎng)，建立細(xì)胞工作種子批庫(kù)，并及對(duì)傳代后的外援源因子、致瘤性及穩(wěn)定性等全面檢定， 細(xì)胞使用代數(shù)控制在60代以內(nèi)，均符合疫苗生產(chǎn)介質(zhì)的要求。
所述細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞批庫(kù)建立包括但不限于①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②人二倍體 細(xì)胞；③Vero細(xì)胞；④CHO細(xì)胞；⑤H印-2細(xì)胞；⑥MDCK細(xì)胞。
實(shí)施例4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞系篩選與建庫(kù)
RS VLP疫苗選用實(shí)施例3細(xì)胞庫(kù)中UMNSAH/DF-1細(xì)胞，采用脂質(zhì)體法將實(shí)施 例2構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染UMNSAH/DF-1細(xì)胞，并篩選穩(wěn)定高表達(dá)RS VLP的細(xì)胞系，具體 是①在:35mm 孔中，加入 pHWD2000_NP 1. 0 μ g、pHWD2000_M 1. 0 μ g、pHWD2000_G 1. 0 μ g、 PHWD2000-F 0. 75yg;②加入5yL OptiMEM配置的脂質(zhì)體，室溫孵育45min。然后加入到 被OptiMEM潤(rùn)洗過(guò)的宿主細(xì)胞中，孵育證；③離心去除載體-脂質(zhì)體混合物，并向細(xì)胞中加 入 DMEM 進(jìn)行培養(yǎng)；④ pHWD2000-M、pHWD2000-F、pHWD2000-NP、pHWD2000-G 四種重組載體在 細(xì)胞系中共表達(dá)，可自組裝RS VLP ；⑤通過(guò)加壓篩選表達(dá)RS VLP的UMNSAH/DF-1細(xì)胞株。 結(jié)果顯示，在UMNSAH/DF-1細(xì)胞23代時(shí)篩選到穩(wěn)定高表達(dá)RS VLP的細(xì)胞株，經(jīng)細(xì)胞系穩(wěn)定 表達(dá)與產(chǎn)量、VLP大小與結(jié)構(gòu)、外源因子與致瘤性、染色體完整性等傳代至40代沒(méi)有表型改 變。由此，建立了穩(wěn)定高表RS VLP的UMNSAH/DF-1細(xì)胞系。進(jìn)一步建立具有RS VLP的三 級(jí)細(xì)胞種子批庫(kù)，經(jīng)對(duì)全面檢定符合疫苗生產(chǎn)要求，放置液氮中保存?zhèn)溆谩?br> NDV/RSV VLP疫苗選用實(shí)施例3細(xì)胞庫(kù)中UMNSAH/DF-1細(xì)胞，采用脂質(zhì)體法將 實(shí)施例2構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染UMNSAH/DF-1細(xì)胞，并篩選穩(wěn)定高表達(dá)NDV/RSV VLP的細(xì)胞 系，具體是①在 35mm 孔中，加入 pHWD2000-NP 1. 0 μ g、pHWD2000_M 1. 0 μ g、pHWD2000-NH 0. 75 μ g、pHWD2000-F 0. 75 μ g、pHWD2000-F/F 0. 75 μ g ；pHWD2000-NH/G 0. 75 μ g ②加入 5 μ LOptiMEM配置的脂質(zhì)體，室溫孵育45min。然后加入到被OptiMEM潤(rùn)洗過(guò)的宿主細(xì)胞中， 孵育證；③離心去除載體-脂質(zhì)體混合物，并向細(xì)胞中加入DMEM進(jìn)行培養(yǎng)；④pHWD2000-M、 PHWD2000-NP、分別與 pHWD2000-F/F 及 pHWD2000-NH/G、或 pHWD2000-F 及 pHWD2000-NH/G、 或pHWD2000-F/F及pHWD2000-NH、重組載體在細(xì)胞系中共表達(dá)，可自組裝NDV-NHF/RSV-GF VLP、NDV-NH/RSV-G VLP、NDV-F/RSV-F VLP ；⑤通過(guò)加壓篩選表達(dá) NDV/RSV VLP 的 UMNSAH/ DF-I細(xì)胞株。結(jié)果顯示，在UMNSAH/DF-1細(xì)胞21代時(shí)就篩選到穩(wěn)定高表達(dá)NDV/RSVVLP的 細(xì)胞株，經(jīng)細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)與產(chǎn)量、VLP大小與結(jié)構(gòu)、外源因子與致瘤性、染色體完整性等傳 代至40代沒(méi)有表型改變。由此，建立了穩(wěn)定高表NDV/RSV VLP的UMNSAH/DF-1細(xì)胞系。進(jìn) 一步建立具有NDV/RSV-G VLP的三級(jí)細(xì)胞種子批庫(kù)，經(jīng)對(duì)全面檢定符合疫苗生產(chǎn)要求，放置 液氮中保存?zhèn)溆谩?br> 所述穩(wěn)定高表RS VLP及NDV/RSV VLP的細(xì)胞系包括但不限于①UMNSAH/DF-1細(xì)16胞；②人二倍體細(xì)胞；③Vero細(xì)胞；④CHO細(xì)胞；⑤H印-2細(xì)胞；⑥MDCK細(xì)胞。
實(shí)施例5 =RS VLP或NDV/RSV VLP規(guī)?；a(chǎn)
取穩(wěn)定表達(dá)RS VLP或NDV/RSV VLP的UMNSAH/DF-1工作批庫(kù)細(xì)胞，用DMEM細(xì)胞 培養(yǎng)液(不加入或加入10-2%胎牛血清、加入10μ g/mL的肝素)通過(guò)20L細(xì)胞工廠或加入 微載體30L細(xì)胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)生產(chǎn)使得細(xì)胞密度達(dá)到1 X ΙΟ7"8以上時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)RS VLP或NDV/RSV VLP疫苗原液。
RS VLP或NDV/RSV VLP規(guī)?；a(chǎn)方法包括如下方法
①人二倍體細(xì)胞取穩(wěn)定表達(dá)RS VLP或NDV/RSV VLP的二倍體細(xì)胞工作批庫(kù)細(xì) 胞，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(不加入或加入10-2%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通過(guò)20L 細(xì)胞工廠放大培養(yǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)RS VLP或NDV/RSV VLP疫苗原液。
②Vero細(xì)胞取穩(wěn)定表達(dá)RS VLP或NDV/RSV VLP的Vero細(xì)胞工作批庫(kù)細(xì)胞，用 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通過(guò)20L細(xì)胞 工廠或加入微載體的30L細(xì)胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)RS VLP或 NDV/RSV VLP疫苗原液。
③CHO細(xì)胞取穩(wěn)定表達(dá)RS VLP或NDV/RSV VLP的CHO細(xì)胞工作批庫(kù)細(xì)胞，用DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通過(guò)20L細(xì)胞工廠或 加入微載體的30L細(xì)胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)RS VLP或NDV/ RSV VLP疫苗原液。
④H印-2細(xì)胞取穩(wěn)定表達(dá)RS VLP或NDV/RSV VLP的H印_2細(xì)胞工作批庫(kù)細(xì)胞， 用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通過(guò)20L細(xì) 胞工廠或加入微載體的30L細(xì)胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)RS VLP 或NDV/RSV VLP疫苗原液。
⑤MDCK細(xì)胞取穩(wěn)定表達(dá)RS VLP或NDV/RSV VLP的MDCK細(xì)胞工作批庫(kù)細(xì)胞，用 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(不加入或加入2-10%胎牛血清、加入10 μ g/mL的肝素)通過(guò)20L細(xì)胞 工廠或加入微載體的30L細(xì)胞發(fā)酵罐放大培養(yǎng)至適當(dāng)細(xì)胞密度時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)RS VLP或 NDV/RSV VLP疫苗原液。
實(shí)施例6 =RS VLP或NDV/RSV VLP疫苗的純化
①收集規(guī)?；a(chǎn)的RS VLP或NDV/RSV VLP細(xì)胞培養(yǎng)液，4°C 5000rmp離心 lOmin，去除細(xì)胞及雜質(zhì)；②取上清液IOOOOOg 4°C離心濁，沉淀用少量TNE buffer (25mM Tris-HCl pH 7. 4,150mM NaCl,5mM EDTA)懸浮。③將懸液進(jìn)行蔗糖梯度離心，蔗糖采用TNE buffer配制，體系采用20%蔗糖3. 5mL ；65%蔗糖0. 5mL。4°C IOOOOOg離心2h ；；④收集 中間層，并用折射儀測(cè)量密度；⑤用PH6. 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM介質(zhì)進(jìn)行凝膠 層析純化，收集外水體積流穿峰。雜蛋白去除可達(dá)95%以上；⑥采用DEAE-kpharoseFFTM 介質(zhì)進(jìn)行離子交換層析，平衡液為PH6. 5-7. 5、含有0. 05-0. 15M氯化鈉的PBS，洗脫液為含 0. 2-0. 5M氯化鈉、pH6. 5-7. 5的PBS。雜蛋白去除可達(dá)99%以上，純化后的VLP原液為疫苗 原液。
實(shí)施例7 =RS VLP或NDV/RSV VLP疫苗原液的檢定
RS VLP及NDV/RSV VLP原液的外觀為澄清液體；pH值為7. 0-7. 2 ；通過(guò)血平板進(jìn) 行雜菌鑒定結(jié)果為陰性；通過(guò)半流體和肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行支原體鑒定結(jié)果為陰性；通過(guò)PAGE-SDS電泳檢測(cè)結(jié)果顯示目的條帶清晰、無(wú)其他雜帶；采用Reed&Muench法計(jì)算抗血清 中和效價(jià)均高于1 2800。
實(shí)施例8 =RS VLP或NDV/RSV VLP疫苗劑型配制
①注射劑型配制將純化RS VLP或NDV/RSV VLP不加佐劑，配制10ug/0. 5ml、 20ug/l. Oml無(wú)佐劑注射劑型；將純化RS VLP或NDV/RSV VLP蛋白加入氫氧化鋁或磷酸鋁 配置7. 5ug(蛋白)/0. 5mg(鋁鹽)/0. 5ml、15 μ g(蛋白)/1. Omg(鋁鹽)/0. 5ml有佐劑疫 苗劑型；將純化RS VLP或NDV/RSV VLP蛋白加入SPOl佐劑0%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖 麻油、0. 聚醚)、SP02佐劑角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug細(xì)菌鞭 毛)、SP03佐劑0%角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、IOug P3BSK4)混勻水包油 樣，分別配制5. 0ug/0. 5ml、10ug/l. Oml有佐劑注射呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗劑型。以上 注射疫苗溶液裝入吸頂瓶，放2-8°C備用。
②噴鼻劑型配制將純化RS VLP或NDV/RSV VLP不加佐劑吸附，配制7. 5ug μ g/0. 2ml、15ug/0. 2ml無(wú)佐劑噴鼻疫苗劑型；將純化RS VLP或NDV/RSV VLP蛋白加入等體 積季胺化殼聚糖水凝膠黏膜佐劑與傳遞系統(tǒng)，配制5. 0 μ g/0. 2mlU0 μ g/0. 2ml有佐劑噴 鼻疫苗劑型；將純化RS VLP或NDV/RSV VLP蛋白加入等體積季胺化殼聚糖水凝膠與10 μ g 細(xì)菌鞭毛或10 μ g P3BSK4黏膜佐劑及傳遞系統(tǒng)，配制4. 0 μ g/0. 2ml,8 μ g/0. 2ml有佐劑噴 鼻呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗劑型。以上噴鼻疫苗溶液裝入定量噴鼻裝置，放2-8°C備用。
③舌下含片劑型配制將純化RS VLP或NDV/RSV VLP 10 μ g、20 μ g分別加入 0.5%明膠、5%蔗糖、0.2%維生素C、0. 谷維素和0. 脫脂奶粉，用磷酸鹽緩沖液調(diào) PH7. 2，壓片冷凍干燥，配制10 μ g/片、20 μ g/片無(wú)佐劑舌下含片劑型；將純化RS VLP或 NDV/RSV VLP 蛋白 7. 5μ g、15y g 與 15 μ gP;3BSK4 或 Flagellin 分別加入 0. 5% 明膠、5% 蔗 糖、0. 2 %維生素C、0. 1 %谷維素和0. 1 %脫脂奶粉，用磷酸鹽緩沖液調(diào)PH7. 2，壓片冷凍干 燥，配制7. 5 μ g/片、15 μ g/片有佐劑呼吸道合胞病毒樣顆粒疫苗舌下含片劑型；以上舌下 含片疫苗裝入密封板片內(nèi)，放2-8 °C備用。
④透皮貼劑劑型配制將純化RS VLP或NDV/RSV VLP 75 μ g、100 μ g分別加入類 脂C，配置75 μ g/貼片、100 μ g/貼片無(wú)佐劑透皮貼劑劑型；將純化RS VLP或NDV/RSV VLP 蛋白50 μ g、100 μ g分別加入油酸促滲劑和LT佐劑，配置50 μ g/貼片、100 μ g/貼片有佐劑 舌下含片透皮貼劑劑型。放2-8°C備用。
⑤透皮微針劑型配制將純化RS VLP或NDV/RSV VLP不加佐劑，配制5 μ g/0. 5ml、 10 μ g/微針劑無(wú)佐劑劑型；將純化RS VLP或NDV/RSV VLP蛋白加入SPOl佐劑角鯊 烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚)或SP02佐劑角鯊烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、 0. 聚醚、IOyg細(xì)菌鞭毛)或SP03佐劑角鯊烯、0. 1 %聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚、 IOug P3BSK4)混勻水包油樣，分別配制3. 0 μ g/微針劑、5 μ g/劑有佐劑舌下含片微針劑劑 型。放2-8°C備用。18
權(quán)利要求
1.一種RS VLP疫苗，其特征在于該疫苗含有合胞病毒M、F、NP、G四種結(jié)構(gòu)蛋白組成的VLP。
2.如權(quán)利要求1所述的RSVLP疫苗，其特征在于該疫苗涉及以下核酸序列①RSVM蛋 白的核酸序列；②RSV NP蛋白的核酸序列；③RSV G蛋白的核酸序列；④RSV F蛋白的核 酸序列；其中，所述G蛋白核酸序列包括來(lái)自RSV A亞型( 及RSV B亞型(Λ。
3.如權(quán)利要求1所述的RSVLP疫苗，其特征在于該疫苗涉及以下氨基酸序列①RSV M蛋白的氨基酸序列；②RSV NP蛋白的氨基酸序列；③RSV G蛋白的氨基酸序列；④RSV F 蛋白的氨基酸序列；其中，所述G蛋白核酸序列包括來(lái)自RSV A亞型( 及RSV B亞型(Λ。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的RSVLP疫苗，其特征在于該疫苗含有呼吸道合胞病毒樣 顆粒(RS VLP)，并攜帶有以下表面蛋白①RSV的G蛋白；②RSV的F蛋白；其中，所述RSV G蛋白包括來(lái)自RSV A亞型的( 和來(lái)自B亞型的(Λ。
5.如權(quán)利要求1-3任一述的RSVLP疫苗，其特征在于該疫苗包含一個(gè)攜帶有RSV及 NDV主要結(jié)構(gòu)蛋白的重組真核表達(dá)載體、雞成纖維細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞；其中，所 述真核表達(dá)載體選自①PHWD2000 ；②p0PI3CAT ；③pCAGGS ；④pcDNA6/TR ；⑤pCMV-HA ；所 述雞成纖維細(xì)胞選自①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②分離9_10齡禽成纖維細(xì)胞；所述哺乳動(dòng)物 細(xì)胞選自①VERO細(xì)胞；②293細(xì)胞；③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤；BHK細(xì)胞；⑥CHO 細(xì)胞 ’⑦M(jìn)DCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；所述昆蟲(chóng)細(xì)胞選自①Tn5細(xì)胞；②SF9 Cell細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的RSVLP疫苗，其特征在于其中所述的pHWD2000載體是由 PHW2000載體改造得到，包括去掉pHW2000載體上游的pCMV啟動(dòng)子，并用雞β -actin蛋白 啟動(dòng)子替換，同時(shí)在雞β -actin蛋白啟動(dòng)字上游插入hCMV-IE增強(qiáng)子，改造后的pCWD2000 可以在真核系統(tǒng)中高效表達(dá)外源基因，同時(shí)PCWD2000有著較小的分子量，可以攜帶較大的 外源基因片段。
7.如權(quán)利要求1-6任一所述的RSVLP疫苗，其特征在于該疫苗不含有佐劑，或含有如 下佐劑中的一種或幾種①鋁鹽氫氧化鋁或磷酸鋁；②SPOl佐劑由2%角鯊烯、0. 聚 氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚組成水包油佐劑；③SP02佐劑在SPOl佐劑中加一定量(20 60ug)重組細(xì)菌鞭毛蛋白；P;3BSK4 (N-palmitoyl-S-[2, 3-bis (palmitoyloxy) - (2RS) -prop ul]-[R]-propyl-[R]-cysteinyl-[S]-seryl-[S]-(Iysyl) 3-lysine)；⑤水凝膠佐劑季胺 化的殼聚糖、⑥r(nóng)LT 重組不耐熱性腸毒素。
8.如權(quán)利要求1-6任一所述的RSVLP疫苗，其特征在于該疫苗制成多種臨床適用的劑 型注射劑型、噴鼻劑型、舌下含片、透皮貼劑或微針劑型。
9.如權(quán)利要求1-6任一所述的RSVLP疫苗，其特征在于該疫苗包括如下幾種RS VLP 疫苗、NDV-HNF/RSV-GF VLP 疫苗、NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP 疫苗、NDV-NH/ RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP 疫苗。
10.如權(quán)利要求1-6任一所述的RSVLP疫苗的制備方法，其特征在于該方法包括如下 步驟①構(gòu)建PHWD2000真核表達(dá)載體；②含有編碼RSV M蛋白核酸序列的重組真核表達(dá)載 體；③含有編碼RSV NP蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；④含有編碼重組RSV G蛋白 的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；⑤含有編碼重組RSV F蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá) 載體；⑥提供一種用于表達(dá)的細(xì)胞系，經(jīng)轉(zhuǎn)染后可以釋放RS VLP;⑦提供用于純化RS VLP的方法，方法包括蔗糖梯度離心純化方法以及柱層析純化方法。
11.如權(quán)利要求10所述的RSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中構(gòu)建含有重組RSV G以及RSV F蛋白核酸序列的重組真核表達(dá)載體的方法包括如下步驟①通過(guò)生物信息學(xué)， 分析NDV F及HN蛋白的胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)核酸序列；②通過(guò)生物信息學(xué)，分析RSV F及G蛋 白的胞外區(qū)核酸序列；③通過(guò)基因合成的方法合成重組HN/G以及F/F蛋白核酸序列；④在 該方法基礎(chǔ)上利用酶切與連接的手段構(gòu)建含有編碼重組NDV NH/RSV G以及NDV F/RSV F 蛋白的真核表達(dá)載體。
12.如權(quán)利要求10所述的RSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中構(gòu)建重組表達(dá)載 體的方法包括如下步驟將編碼RSV M蛋白、F蛋白、NP蛋白、G蛋白的DNA片斷被插入到 PHWD2000 載體中，構(gòu)成重組 pHWD2000-M、pHWD2000-F、pHWD2000-NP、pHWD2000-G 表達(dá)載 體；在另一個(gè)方案中包括將編碼NDV M蛋白、NP蛋白、F蛋白、HN蛋白、重組F/F蛋白、及重 組NH/G蛋白的DNA片斷被插入到pHWD2000載體中，構(gòu)成重組pHWD2000_M、pHWD2000-NP、 PHWD2000-F、pHWD2000-HN、pHWD2000-F/F、pHWD2000-NH/G 表達(dá)載體；所述重組 NH 為 NDV-NH/RSV-G,即 pHWD2000-NH/G ；所述重組 F 為 NDV-F/RSV-F，即 pHWD2000_F/F。
13.如權(quán)利要求10所述的RSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中所述的表達(dá)宿主 細(xì)胞系中所指細(xì)胞為雞成纖維細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，雞成纖維細(xì)胞有①UMNSAH/DF-1細(xì) 胞；②分離9-10齡禽成纖維細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自①VERO細(xì)胞 ’②293細(xì)胞；③COS細(xì) 胞；④人二倍體細(xì)胞 ’⑤BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦M(jìn)DCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；⑨Tn5細(xì)胞； ⑩SF9Cell細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求10所述的RSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中細(xì)胞培養(yǎng)方法包括 如下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃度為2-100 μ g/mL的糖胺聚糖；其中，所指糖胺聚糖為硫 酸肝素、硫酸軟骨素B、硫酸透明質(zhì)酸或肝素。
15.如權(quán)利要求10所述的RSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中所述的純化方 法包括如下步驟蔗糖梯度離心法，蔗糖濃度為30%、45%與60% ；或柱層析純化方法，用 Sepharose6FFTM分子篩并進(jìn)行DEAE-S印haroseFFTM離子交換。
16.如權(quán)利要求15所述的RSVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中所述的蔗糖梯度 離心的步驟為①收集規(guī)模化生產(chǎn)的RS VLP細(xì)胞培養(yǎng)液，4°C 5000rmp離心lOmin，去除細(xì) 胞及雜質(zhì)；②取上清液IOOOOOg 4°C離心2h，沉淀用TNE buffer懸浮，TNE buffer的組成 為25mM Tris-HCl pH 7. 4,150mM NaCl,5mM EDTA ；③將懸液進(jìn)行蔗糖梯度離心，蔗糖采用 TNE buffer 配制，體系采用 30% 蔗糖 lmL;45% 蔗糖 ImL ;60 % 蔗糖 4mL ;4°C IOOOOOg 離 心；④收集中間層，并用折射儀測(cè)量密度；⑤用PH6. 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM 介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰；雜蛋白去除可達(dá)95%以上；⑥采用 DEAE-SepharoseFFTM介質(zhì)進(jìn)行離子交換層析，平衡液為pH6. 5-7. 5、含有0. 05-0. 15M氯化 鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5M氯化鈉、pH6. 5-7. 5的PBS ；雜蛋白去除可達(dá)99%以上，純化 后的VLP原液為疫苗原液。
17.—種NDV/RSV VLP疫苗，其特征在于該疫苗含有新城疫病毒M、F、NP、NH四種結(jié)構(gòu) 蛋白，以及新城疫病毒F蛋白與合胞病毒F組成的NDV F/RSV F融合蛋白、新城疫病毒HN 蛋白與合胞病毒G蛋白組成的NDV HN/RSV G融合蛋白兩種表面蛋白組成的VLP。
18.如權(quán)利要求17所述的NDV/RSVVLP疫苗，其特征在于該疫苗涉及以下核酸序列①NDV M蛋白的核酸序列；②NDV NP蛋白的核酸序列；③NDV HN蛋白的核酸序列；④NDVF 蛋白的核酸序列；⑤NDV HN/RSV G融合蛋白核酸序列；⑥NDV F/RSV F融合蛋白核酸序列； 其中，所述G蛋白核酸序列包括來(lái)自RSV A亞型( 及RSV B亞型(Λ。
19.如權(quán)利要求17所述的NDV/RSVVLP疫苗，其特征在于該疫苗涉及以下氨基酸序列 ①NDV M蛋白的氨基酸序列；②NDV NP蛋白的氨基酸序列；③NDV HN蛋白的氨基酸序列；④NDVF蛋白的氨基酸序列；⑤NDV HN/RSV G融合蛋白的氨基酸序列；⑥NDV F/RSVF融合 蛋白的氨基酸序列；其中，所述G蛋白核酸序列包括來(lái)自RSV A亞型( 及RSV B亞型(Λ。
20.如權(quán)利要求17-19任一所述的NDV/RSVVLP疫苗，其特征在于該疫苗包含有一種新 城疫病毒核心，并攜帶有以下表面蛋白①NDV HN/RSV G融合蛋白；②NDV F/RSV F融合蛋 白；其中，所述RSV G蛋白包括來(lái)自RSV A亞型的( 和來(lái)自B亞型的(Λ。
21.如權(quán)利要求17-19任一所述的NDV/RSVVLP疫苗，其特征在于該疫苗包含一個(gè)攜 帶有RSV及NDV主要結(jié)構(gòu)蛋白的重組真核表達(dá)載體、雞成纖維細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì) 胞；其中，所述真核表達(dá)載體選自①PHWD2000 ；②p0PI3CAT ；③pCAGGS ；④pcDNA6/TR;⑤pCMV-HA；所述雞成纖維細(xì)胞選自①UMNSAH/DF-1細(xì)胞；②分離9_10齡禽成纖維細(xì)胞； 所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自①VERO細(xì)胞 ’②293細(xì)胞；③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤；BHK 細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦M(jìn)DCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；所述昆蟲(chóng)細(xì)胞選自①Tn5細(xì)胞；②SF9 Cell細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21所述的NDV/RSVVLP疫苗，其特征在于共中所述的pHWD2000載體 是由pHW2000載體改造得到，包括去掉pHW2000載體上游的pCMV啟動(dòng)子，并用雞β -actin 蛋白啟動(dòng)子替換，同時(shí)在雞β -actin蛋白啟動(dòng)字上游插入hCMV-IE增強(qiáng)子，改造后的 PCWD2000可以在真核系統(tǒng)中高效表達(dá)外源基因，同時(shí)pCWD2000有著較小的分子量，可以攜 帶較大的外源基因片段。
23.如權(quán)利要求17-22任一所述的NDV/RSVVLP疫苗，其特征在于該疫苗不含有佐劑， 或含有如下佐劑中的一種或幾種①鋁鹽氫氧化鋁或磷酸鋁；②SPOl佐劑由2%角鯊 烯、0. 聚氧乙烯蓖麻油、0. 聚醚組成水包油佐劑；③SP02佐劑在SPOl佐劑中加一 定量(20 60ug)重組細(xì)菌鞭毛蛋白；P3BSK4(N-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propul]-[R]-propyl-[R] -cysteinyl-[S] -seryl-[S] - (Iysyl) 3-lysine)；⑤水凝膠佐劑季胺化的殼聚糖、⑥ rLT 重組不耐熱性腸毒素。
24.如權(quán)利要求17-22任一所述的NDV/RSVVLP疫苗，其特征在于該疫苗制成多種臨床 適用的劑型注射劑型、噴鼻劑型、舌下含片、透皮貼劑或微針劑型。
25.如權(quán)利要求17-22任一所述的NDV/RSVVLP疫苗，其特征在于該疫苗包括如下幾 種:RS VLP 疫苗、NDV-HNF/RSV-GF VLP 疫苗、NDV-NH/RSV-G VLP 疫苗、NDV-F/RSV-F VLP 疫 苗、NDV-NH/RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP 疫苗。
26.如權(quán)利要求17-22任一所述的NDV/RSVVLP疫苗的制備方法，其特征在于該方法包 括如下步驟將含有編碼NDV M、NDV NP的核酸序列的重組真核表達(dá)載體與含有NDV-HN/RSV-G融合 蛋白、NDV F/RSV F融合蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化用于表達(dá)的細(xì)胞系， 形成具有NDV核心并攜帶有RSV表面抗原G、F的NDV-NHF/RSV-GF VLP ；或?qū)⒑芯幋aNDV M、NDV NP, NDV F蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體與含有 NDV-HN/RSV-G融合蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化用于表達(dá)的細(xì)胞系，形成 具有NDV核心并攜帶有RSV表面抗原G的NDV-NH/RSV-G VLP ；或?qū)⒑芯幋aNDV M、NDV NP,NDV HN蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體與含有NDV F/RSV F融合蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化用于表達(dá)的細(xì)胞系，形成具有 NDV核心并攜帶有RSV表面抗原F的NDV-F/RSV-F VLP ；其中該方法所述 NDV-HNF/RSV-GF VLP、NDV-NH/RSV-G VLP、NDV-F/RSV-F VLP 及 NDV-NH/RSV-G+NDV-F/RSV-F VLP均可激發(fā)體液與細(xì)胞雙重的免疫應(yīng)答；其中所述RSV G蛋 白包括來(lái)自RSV A亞型( 和來(lái)自B亞型(Λ。
27.如權(quán)利要求沈所述的NDV/RSVVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中該方法所述 以 NDV 為核心的 VLP (NDV-HNF/RSV-GF VLP、NDV-NH/RSV-G VLP、NDV-F/RSV-F VLP)包括 ①NDV M蛋白；②NDV NP蛋白；③NDV NH蛋白；④NDV F蛋白；⑤NDV F蛋白胞與RSV F 蛋白的融合蛋白NDV-F/RSV-F ；⑥NDV HN蛋白與RSV G蛋白的融合蛋白NDV HN/RSVG。
28.如權(quán)利要求17-22任一所述的NDV/RSVVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中該方 法包括如下步驟①構(gòu)建pHWD2000真核表達(dá)載體；②含有編碼NDV M蛋白核酸序列的重組真核表達(dá)載 體；③含有編碼NDV NP蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；④含有編碼重組NDV NH蛋白 的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；⑤含有編碼重組NDV F蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá) 載體；⑥含有編碼重組NDV HN/RSV G融合蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；⑦含有編 碼重組NDV F/RSV F融合蛋白的核酸序列的重組真核表達(dá)載體；⑧提供一種用于表達(dá)的細(xì) 胞系，經(jīng)轉(zhuǎn)染后可以高效率釋放NDV/RSV VLP ；⑨提供用于純化NDV/RSV VLP的方法，方法 包括蔗糖梯度離心純化方法以及柱層析純化方法。
29.如權(quán)利要求觀所述的NDV/RSVVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中構(gòu)建含有重 組NDV NH以及NDV F蛋白核酸序列的重組真核表達(dá)載體的方法包括如下步驟①通過(guò)生 物信息學(xué)，分析NDV F及HN蛋白的胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)核酸序列；②通過(guò)生物信息學(xué)，分析RSV F及G蛋白的胞外區(qū)核酸序列；③通過(guò)基因合成的方法合成重組HN/G以及F/F蛋白核酸序 列；④在該方法基礎(chǔ)上利用酶切與連接的手段構(gòu)建含有編碼重組NDV NH/RSV G以及NDV F/ RSV F蛋白的真核表達(dá)載體。
30.如權(quán)利要求觀所述的NDV/RSVVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中構(gòu)建重組表 達(dá)載體的方法，包括如下步驟將編碼RSV M蛋白、F蛋白、NP蛋白、G蛋白的DNA片斷被插 入到 pHWD2000 載體中，構(gòu)成重組 pHWD2000-M、pHWD2000-F、pHWD2000-NP, pHWD2000-G 表達(dá) 載體；在另一個(gè)方案中包括將編碼NDV M蛋白、NP蛋白、F蛋白、HN蛋白、重組F/F蛋白、及 重組NH/G蛋白的DNA片斷被插入到pHWD2000載體中，構(gòu)成重組pHWD2000-M、pHWD2000-NP、 PHWD2000-F、pHWD2000-HN、pHWD2000-F/F、pHWD2000-NH/G 表達(dá)載體；所述重組 NH 為 NDV-NH/RSV-G,即 pHWD2000-NH/G ；所述重組 F 為 NDV-F/RSV-F，即 pHWD2000_F/F。
31.如權(quán)利要求觀所述的NDV/RSVVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中所述的表 達(dá)宿主細(xì)胞系中所指細(xì)胞為雞成纖維細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，雞成纖維細(xì)胞有①UMNSAH/ DF-I細(xì)胞；②分離9-10齡禽成纖維細(xì)胞；哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自①VERO細(xì)胞；②293細(xì)胞； ③COS細(xì)胞；④人二倍體細(xì)胞；⑤BHK細(xì)胞；⑥CHO細(xì)胞；⑦M(jìn)DCK細(xì)胞；⑧H印-G2細(xì)胞；⑨Tn5細(xì)胞；⑩SF9Ce 11細(xì)胞；其中，所述NDV/RSV VLP表達(dá)宿主細(xì)胞系包含NDV-HNF/ RSV-GF VLP, NDV-NH/RSV-G VLP、及 NDV-F/RSV-F VLP。
32.如權(quán)利要求觀所述的NDV/RSVVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中細(xì)胞培養(yǎng)方 法包括如下步驟在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入濃度為2-100 μ g/mL的糖胺聚糖；其中，所指糖胺聚 糖為硫酸肝素、硫酸軟骨素B、硫酸透明質(zhì)酸或肝素。
33.如權(quán)利要求觀所述的NDV/RSVVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中純化方法 包括如下步驟蔗糖梯度離心法，蔗糖濃度為30 %、45 %與60 % ；或柱層析純化方法，用 Sepharose6FFTM分子篩并進(jìn)行DEAE-S印haroseFFTM離子交換。
34.如權(quán)利要求觀所述的NDV/RSVVLP疫苗的制備方法，其特征在于其中蔗糖梯度離 心的步驟為①收集規(guī)?；a(chǎn)的NDV/RSV VLP細(xì)胞培養(yǎng)液，4°C 5000rmp離心lOmin，去除 細(xì)胞及雜質(zhì)；②取上清液IOOOOOg 4°C離心2h，沉淀用TNE buffer懸浮，TNE buffer的組 成為25mM Tris-HCl pH 7. 4,150mM NaCl,5mM EDTA ；③將懸液進(jìn)行蔗糖梯度離心，蔗糖采 用TNE buffer配制，體系采用30%蔗糖ImL ；45%蔗糖ImL ；60%蔗糖4mL ；4°C IOOOOOg離 心；④收集中間層，并用折射儀測(cè)量密度；⑤用PH6. 5-7. 5的PBS平衡kphar0Se6FFTM 介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析純化，收集外水體積流穿峰；雜蛋白去除可達(dá)95%以上；⑥采用 DEAE-SepharoseFFTM介質(zhì)進(jìn)行離子交換層析，平衡液為pH6. 5-7. 5、含有0. 05-0. 15M氯化 鈉的PBS，洗脫液為含0. 2-0. 5M氯化鈉、pH6. 5-7. 5的PBS ；雜蛋白去除可達(dá)99%以上，純化 后的VLP原液為疫苗原液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種核心來(lái)自新城疫病毒、表面蛋白來(lái)自合胞病毒的病毒樣顆粒疫苗(NDV/RSV VLP疫苗)及其制備方法。本發(fā)明RS VLP疫苗含有合胞病毒M、F、NP、G四種結(jié)構(gòu)蛋白組成的VLP；NDV/RSV VLP疫苗含有新城疫病毒M、F、NP、NH四種結(jié)構(gòu)蛋白，以及新城疫病毒F蛋白與合胞病毒F組成的NDV F/RSV F融合蛋白、新城疫病毒HN蛋白與合胞病毒G蛋白組成的NDV HN/RSV G融合蛋白兩種表面蛋白組成的VLP。藥效實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)此形成的VLP蛋白抗原加入或不加入佐劑，制備的各種劑型免疫不同動(dòng)物或人群后，可安全、有效預(yù)防RSV感染，為不同年齡人群免疫防控RSV感染提供了疫苗。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102028943SQ20101058931
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者曹政, 楊鵬輝, 段躍強(qiáng), 王希良, 王鋮, 羅德炎, 趙忠鵬, 邢麗, 高嘯 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所