專利名稱：以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及益生菌制劑的制備方法，具體涉及一種以凹土為載體的益生菌制劑的 制備方法。
背景技術(shù)：
益生菌又稱為益生素、利生菌、活菌劑或微生態(tài)制劑。是指能促進腸道內(nèi)菌群平 衡、對宿主起到有益作用的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物，臨床上，益生菌制劑主要用于預(yù)防和治 療各種胃腸道疾病，也可用于肝病的輔助治療，為肝細(xì)胞的再生和修復(fù)創(chuàng)造良好的內(nèi)環(huán)境。益生菌包括雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、 枯草芽孢桿菌、糞鏈球菌、腸球菌、明串珠菌、片球菌、蠟樣芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌等。益生菌的研究與運用，在日本、法國、美國、德國、俄羅斯等十多個國家研究較為專 業(yè)化和系統(tǒng)性。目前國際上對乳酸菌等益生菌的研究顯得非常活躍，產(chǎn)品消費成績驚人，據(jù) 粗略估計，全球的年產(chǎn)品生產(chǎn)總值約為300億美元左右，其中使用益生菌生產(chǎn)的乳制品總 產(chǎn)值超過50億美元，且增長指數(shù)在逐年上升，呈上升發(fā)展態(tài)勢。如日本利用益生菌制作的 乳制品已成功打入了國際奶品飲料市場，已在13個國家建造了 18家加工廠，目前全球每天 至少2500萬人在飲用這種產(chǎn)品。凹土又稱凹凸棒石粘土、凹凸棒土等，是以凹凸棒石(Attapulgite)為主要成分 的一種粘土礦物，主要成分為坡縷石(Palygorskite)或坡縞石，是一種富鎂硅酸鹽，屬于 2 1型層鏈狀晶體結(jié)構(gòu)，由于其本身獨特的微觀結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，賦予凹土許多優(yōu)良性能，如 吸附性、膠體性、粘結(jié)性、催化性等，因而被廣泛應(yīng)用于化工、建材、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和環(huán)境保護等 領(lǐng)域。但至今未見到利用凹土作為益生菌載體的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法，利用凹土 吸附益生菌制備活菌制劑，提高益生菌到達(dá)腸道的存活率，并大大延長活菌的存活時間。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是首先是純化凹土，然后將益生菌菌懸液在一定的條件 下吸附至凹土表面，最后真空冷凍干燥制備成益生菌制劑。本發(fā)明的制備方法包括以下具體步驟第一步，凹土的純化將凹土采用電導(dǎo)率低于5 μ s/cm的去離子水浸泡20 28h， 凹土與去離子水的質(zhì)量比為10 20 1，攪拌器以1000 1500rpm轉(zhuǎn)速再攪拌20 28h， 靜置分層，取中間層凹土懸液，以凹土懸液質(zhì)量的5 20%的量繼續(xù)加入上述去離子水，攪 拌、分層同樣操作重復(fù)2 3次，于105 120°C烘干，研磨，過篩，取200目至140目凹土細(xì) 粉備用；第二步，益生菌菌懸液的制備將雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳 桿菌、鼠李糖乳桿菌、糞鏈球菌或地衣芽胞桿菌由常規(guī)手段培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，收集菌 體，采用無菌生理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，并用無菌生理鹽水將菌體濃度調(diào)節(jié)至IO9 IOltlCFU/
3ml備用；第三步，凹土吸附益生菌IOL益生菌菌懸液添加100 IOOOg凹土細(xì)粉構(gòu)成吸附 體系，調(diào)節(jié)吸附體系pH3 6、溫度20 35°C，吸附20 50分鐘，吸附時采用震蕩法增加 凹土與益生菌的接觸，震蕩速度為90 ISOrpm ；第四步，真空冷凍干燥步驟三的吸附體系于-40 -75°C預(yù)凍2 3小時，再迅 速移入冷凍干燥機冷凍干燥20 28小時，得益生菌制劑，制劑含水量< 2%，檢測活菌劑中 活菌數(shù)為IO9 10"CFU/g。其中，雙歧桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g，NaCl 5g，Na2HP042. 5g，蒸 餾水1000ml, pH7 ；35°C靜置培養(yǎng)22小時。其中，嗜酸乳桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g，葡萄糖20g，吐 溫-801ml, CH3COONa · 3H20 5g, K2HPO4 · 3H20 2g, MgSO4 · 7H20 0. 58g, MnSO4 · H2O 0. 25g,蒸 餾水1000ml，調(diào)ρΗ6· 2-6. 4 ；37°C靜置培養(yǎng)20小時。其中，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；40°C靜置培養(yǎng)20小時。其中，保加利亞乳桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；37°C靜置培養(yǎng)20小時。其中，鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌。37°C靜置培養(yǎng)20小時。其中，糞鏈球菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸餾水1000ml，pH6. 8 ;37°C振蕩培養(yǎng)6h， 搖床轉(zhuǎn)速為lOOrpm。其中，地衣芽胞桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基葡萄糖5g，蛋白胨 5g，K2HP042g，MgS042g，蒸餾水 1000ml，pH 7. 0 ；37°C振 蕩培養(yǎng)40h，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。本發(fā)明的制備方法簡單，生產(chǎn)成本低，益生菌在腸道的存活率高，活菌的存活時間 長，人體吸收效果良好。


圖1是以嗜酸乳桿菌為例凹土益生菌制劑和以脫脂乳粉為保護劑的益生菌制劑 在人工模擬腸環(huán)境中活菌數(shù)比較。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，這些實施例不能理解為 是對技術(shù)方案的限制。實施例1 依以下具體步驟制備益生菌制劑第一步，凹土的純化將凹土采用電導(dǎo)率低于5μ s/cm的去離子水以質(zhì)量比 10 1浸泡28h，攪拌器以IOOOrpm轉(zhuǎn)速再攪拌28h，靜置分層，取中間層凹土懸液，以凹土 懸液質(zhì)量的5%的量繼續(xù)加入上述去離子水，攪拌、分層同樣操作重復(fù)2次，于105°C烘干， 研磨，過篩，取200目至140目凹土細(xì)粉備用；第二步，益生菌菌懸液的制備將雙歧桿菌由常規(guī)手段培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，收集菌體，采用無菌生理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，并用無菌生理鹽水將菌體濃度調(diào)節(jié)至IO9 1010CFU/ml備用；其中，雙歧桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛 肉膏 4g，NaCl 5g，Na2HP042. 5g，蒸餾水 1000ml, pH7 ； 35 °C 靜置培養(yǎng) 22 小時；第三步，凹土吸附益生菌IOL益生菌菌懸液添加IOOg凹土細(xì)粉構(gòu)成吸附體系，調(diào) 節(jié)吸附體系PH3、溫度35°C，吸附20分鐘，吸附時采用震蕩法增加凹土與益生菌的接觸，震 蕩速度為180rpm ；第四步，真空冷凍干燥步驟三的吸附體系于_75°C預(yù)凍2小時，再迅速移入冷 凍干燥機冷凍干燥20小時，得益生菌制劑，制劑含水量< 2%，檢測活菌劑中活菌數(shù)為 109CFU/g。實施例2 依以下具體步驟制備益生菌制劑第一步，凹土的純化將凹土采用電導(dǎo)率低于5μ s/cm的去離子水以質(zhì)量比 15 1浸泡24h，攪拌器以1250rpm轉(zhuǎn)速再攪拌24h，靜置分層，取中間層凹土懸液，以凹土 懸液質(zhì)量的12. 5%的量繼續(xù)加入上述去離子水，攪拌、分層同樣操作重復(fù)3次，于112°C烘 干，研磨，過篩，取200目至140目凹土細(xì)粉備用；第二步，益生菌菌懸液的制備將嗜酸乳桿菌由常規(guī)手段培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期， 收集菌體，采用無菌生理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，并用無菌生理鹽水將菌體濃度調(diào)節(jié)至IO9 1010CFU/ml備用；其中，嗜酸乳桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g， 檸檬酸氫二銨 2g，葡萄糖 20g，吐溫-801ml，CH3COONa · 3H20 5g，K2HPO4 · 3H202g, MgSO4 · 7H20 0. 58g, MnSO4 · H2O 0. 25g，蒸餾水 1000ml，調(diào) pH6. 2-6. 4 ；37°C靜置培養(yǎng) 20 小時；第三步，凹土吸附益生菌IOL益生菌菌懸液添加550g凹土細(xì)粉構(gòu)成吸附體系，調(diào) 節(jié)吸附體系PH4. 5、溫度27. 5°C，吸附時間為35分鐘，吸附時采用震蕩法增加凹土與益生菌 的接觸，震蕩速度為135rpm;第四步，真空冷凍干燥步驟三的吸附體系于-58 V預(yù)凍2. 5小時，迅速移入冷 凍干燥機冷凍干燥24小時，得益生菌制劑，制劑含水量< 2%，檢測活菌劑中活菌數(shù)為 1010CFU/g。實施例3 依以下具體步驟制備益生菌制劑第一步，凹土的純化將凹土采用電導(dǎo)率低于5μ s/cm的去離子水以質(zhì)量比 20 1浸泡28h，攪拌器以IOOOrpm轉(zhuǎn)速再攪拌28h，靜置分層，取中間層凹土懸液，以凹土 懸液質(zhì)量的20%的量繼續(xù)加入上述去離子水，攪拌、分層同樣操作重復(fù)3次，于120°C烘干， 研磨，過篩，取200目至140目凹土細(xì)粉備用；第二步，益生菌菌懸液的制備將嗜熱鏈球菌由常規(guī)手段培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期， 收集菌體，采用無菌生理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，并用無菌生理鹽水將菌體濃度調(diào)節(jié)至IO9 1010CFU/ml備用；其中，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；40°C靜置培養(yǎng)20小 時。第三步，凹土吸附益生菌10L益生菌菌懸液添加IOOOg凹土細(xì)粉構(gòu)成吸附體系， 調(diào)節(jié)吸附體系PH6、溫度為20°C，吸附50分鐘，吸附時采用震蕩法增加凹土與益生菌的接 觸，震蕩速度為90rpm;第四步，真空冷凍干燥步驟三的吸附體系于_40°C預(yù)凍3小時，再迅速移入冷 凍干燥機冷凍干燥28小時，得益生菌制劑，制劑含水量< 2%，檢測活菌劑中活菌數(shù)為10"CFU/g。實施例4 益生菌制劑的制備過程同實施例2，其中，益生菌為保加利亞乳桿菌，保加利亞乳 桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；37°C靜置培養(yǎng)20小時。實施例5 益生菌制劑的制備過程同實施例2，其中，益生菌為鼠李糖乳桿菌，鼠李糖乳桿菌 培養(yǎng)條件培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌，37°C靜置培養(yǎng)20小時。實施例6 益生菌制劑的制備過程同實施例1，其中，益生菌為糞鏈球菌，糞鏈球菌培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸餾水1000ml，pH6. 8 ；37°C振蕩培養(yǎng)6h，搖床轉(zhuǎn)速 為 IOOrpm0實施例7 益生菌制劑的制備過程同實施例3，其中，益生菌為地衣芽胞桿菌，地衣芽胞桿菌 培養(yǎng)條件培養(yǎng)基葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HP042g，MgS042g，蒸餾水1000ml, pH 7. 0 ；37°C 振蕩培養(yǎng)40h，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。實驗結(jié)果表明，添加凹土制得的益生菌制劑比用常規(guī)脫脂乳粉制得的活菌制劑在 真空冷凍過程中和在人工模擬胃環(huán)境中的存活率要高得多，在人工腸環(huán)境中能較長時間地 維持高活菌水平。部分實驗數(shù)據(jù)如表1、表2和圖1所示。表1凹土益生菌制劑和以脫脂乳粉益生菌制劑存活率比較 表2凹土益生菌制劑和以脫脂乳粉為保護劑的益生菌制劑在人工模擬胃環(huán)境(3h)存活率比較
權(quán)利要求
以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法，首先是純化凹土，然后將益生菌菌懸液在一定的條件下吸附至凹土表面，最后真空冷凍干燥制備成益生菌制劑；其特征在于該制備方法包括以下具體步驟第一步，凹土的純化將凹土采用電導(dǎo)率低于5μs/cm的去離子水浸泡20～28h，凹土與去離子水的質(zhì)量比為10～201，攪拌器以1000～1500rpm轉(zhuǎn)速再攪拌20～28h，靜置分層，取中間層凹土懸液，以凹土懸液質(zhì)量的5～20％的量繼續(xù)加入上述去離子水，攪拌、分層同樣操作重復(fù)2～3次，于105～120℃烘干，研磨，過篩，取200目至140目凹土細(xì)粉備用；第二步，益生菌菌懸液的制備將雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、糞鏈球菌或地衣芽胞桿菌由常規(guī)手段培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，收集菌體，采用無菌生理鹽水洗滌去培養(yǎng)基，并用無菌生理鹽水將菌體濃度調(diào)節(jié)至109～1010CFU/ml備用；第三步，凹土吸附益生菌10L益生菌菌懸液添加100～1000g凹土細(xì)粉構(gòu)成吸附體系，調(diào)節(jié)吸附體系pH3～6、溫度20～35℃，吸附20～50分鐘，吸附時采用震蕩法增加凹土與益生菌的接觸，震蕩速度為90～180rpm；第四步，真空冷凍干燥步驟三的吸附體系于 40～ 75℃預(yù)凍2～3小時，再迅速移入冷凍干燥機冷凍干燥20～28小時，得益生菌制劑，制劑含水量≤2％，檢測活菌劑中活菌數(shù)為109～1011CFU/g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法，其特征在于其 中，雙歧桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基蛋白胨15g，葡萄糖15g，酵母膏4g，牛肉膏4g，NaC15g, Na2HP042. 5g，蒸餾水 1000ml, pH7 ；35°C靜置培養(yǎng) 22 小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法，其特征在于其中， 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g，葡萄 糖 20g,吐溫-801ml, CH3COONa · 3H20 5g, K2HPO4 · 3H20 2g, MgSO4 · 7H20 0. 58g, MnSO4 · H2O 0. 25g，蒸餾水1000ml，調(diào)pH6. 2-6. 4 ；37°C靜置培養(yǎng)20小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法，其特征在于 其中，嗜熱鏈球菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；40°C靜置培養(yǎng)20小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法，其特征在于 其中，保加利亞乳桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌；37°C靜置培養(yǎng)20小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法，其特征在于 其中，鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基同嗜酸乳桿菌。37°C靜置培養(yǎng)20小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法，其特征在于其中， 糞鏈球菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基蛋白胨2g，牛肉膏2g，乳糖2g，蒸餾水1000ml，pH6. 8 ；37°C振 蕩培養(yǎng)6h，搖床轉(zhuǎn)速為lOOrpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法，其特征在于其中， 地衣芽胞桿菌培養(yǎng)條件培養(yǎng)基葡萄糖5g，蛋白胨5g，K2HP042g，MgS042g，蒸餾水1000ml， pH 7. 0 ；37°C振蕩培養(yǎng)40h，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以凹土為載體的益生菌制劑的制備方法，首先是純化凹土，然后將益生菌菌懸液在一定的條件下吸附至凹土表面，最后真空冷凍干燥制備成益生菌制劑；本發(fā)明利用凹土吸附益生菌制備活菌制劑，制備方法簡單，益生菌在冷凍干燥過程中菌體存活率高，在腸道中存活率高，存活時間長，人體吸收效果好。
文檔編號A61K35/74GK101919879SQ20101024883
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者趙玉萍 申請人:淮陰工學(xué)院