專利名稱：一種治療免疫疾病的藥物組合物、其制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥制劑領(lǐng)域，具體的說是涉及一種治療免疫疾病的藥物組合物、其 制備及用途。
背景技術(shù)：
免疫抑制藥物是具有免疫有抑制效應(yīng)的藥物，可以抑制機(jī)體異常的免疫反應(yīng)。臨 床上主要用于治療自身免疫性疾病和防止臟器移植排斥。不同的具體藥物分別作用于免疫 反應(yīng)及調(diào)節(jié)的不同環(huán)節(jié)，自身免疫病患者的免疫系統(tǒng)認(rèn)已為敵而發(fā)生反應(yīng)，有損于組織和 臟器，有害健康，這種免疫反應(yīng)是有害無益的，所以必需要抑制它，器官移植后，機(jī)體的免疫 系統(tǒng)識(shí)別出植入物是異物，會(huì)發(fā)生程度不同的排斥反應(yīng)，有損于植入器官，有悖于移植療法 的目的，必須用免疫抑制劑來抑制這種排斥反應(yīng)，免疫治療通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，糾正免 疫反應(yīng)異常，達(dá)到治病的目的。隨著重癥感染性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)等免 疫相關(guān)性疾病發(fā)病率的顯著升高，免疫抑制劑藥物應(yīng)用較為廣泛，同時(shí)，近幾年器官移植技 術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)上的迅速發(fā)展，由于現(xiàn)有的免疫抑制劑在臨床應(yīng)用中還存在不同程度的毒副 作用，因此，繼續(xù)尋找高效、低毒的免疫抑制劑藥物受到國(guó)內(nèi)外藥學(xué)研究領(lǐng)域的廣泛重視。風(fēng)濕性疾病(rheumatic diseases)泛指影響骨、關(guān)節(jié)及周圍軟組織、肌肉、滑囊、 肌腱、筋膜及免疫系統(tǒng)等的一組疾病，其發(fā)病原因可以是感染性的，免疫性的，代謝性的，退 行性的。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)被認(rèn)為某些遺傳背景的人，在內(nèi)分泌及環(huán)境因素影響下，在外來抗原刺 激下產(chǎn)生免疫反應(yīng)后而發(fā)生，屬于自身免疫性疾病。目前治療這方面疾病的藥物主要有非 甾體抗炎藥，慢作用抗風(fēng)濕藥(環(huán)孢素、環(huán)磷酰胺)，糖皮質(zhì)激素，生物制劑，抗生素和中藥。 但它們副作用較大，肝、腎的毒性較大，骨髓抑制，生殖系統(tǒng)損害，胃腸道反應(yīng)，甚至誘發(fā)腫 瘤。但自身免疫疾病病程長(zhǎng)，長(zhǎng)期服用這些藥物的毒副作用較大，在治療過程引起很多不良 反應(yīng)及并發(fā)癥，其治療不能消除病因，只能改善癥狀，實(shí)際上，沒有從根本上糾正免疫異常， 僅僅是一種非特異性的治療方法，不能有效地從根本上控制疾病的發(fā)生、發(fā)展，并因它廣泛 的副作用難于堅(jiān)持長(zhǎng)期用藥。豨薟草為常用中藥，始載于《新修本草》，《中國(guó)藥典》(2005年版)規(guī)定豨薟為菊 科植物腺梗豨薟Sigesbeckia pubescens Makino，東方豨薟S. orientalis L.和毛梗豨薟 S. glabrescens Makino的干燥地上部分。豨薟草，味苦性寒，入肝腎經(jīng)。具有祛風(fēng)濕，利筋 骨的功能，臨床常用其治療四肢麻痹、筋骨疼痛、風(fēng)濕痹痛，半身不遂、風(fēng)疹濕瘡等癥。從化學(xué)成分的研究來看豨薟草植物的成分主要為二萜類化合物，從文獻(xiàn)資料可知 有關(guān)豨薟草藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)沒有明確闡明，特別近年來的藥理實(shí)驗(yàn)及我們對(duì)豨薟草的 化學(xué)和藥理研究的結(jié)果，其毒性小，在臨床未見報(bào)道其毒副作用，這正是我們進(jìn)一步研究該 項(xiàng)目的切入點(diǎn)和立題的基礎(chǔ)，其中發(fā)現(xiàn)奇壬醇(kirenol，其結(jié)構(gòu)如下所示)，為有活性的二 萜類先導(dǎo)化合物，由于它的植物資源廣泛且目標(biāo)化合物含量較高，同時(shí)化學(xué)結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜 而且較穩(wěn)定。這不僅從細(xì)胞水平、分子水平和整體動(dòng)物揭示中藥活性的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作 用有重要意義，而且對(duì)創(chuàng)制具有中國(guó)特色，擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，開發(fā)新的免疫抑制劑治療藥物有著重要的基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用研究意義。
專利申請(qǐng)02116909. 8公開了一種提取純化奇壬醇的方法使用石油醚或環(huán)己烷 回流提取，過濾后的濾渣再用醇、氯仿或丙酮等水溶液滲漉提取。溶液濃縮后得到的提取物 加水溶解，使用石油醚和二氯甲烷等萃取，萃取液濃縮后進(jìn)行色譜法純化，最后再重結(jié)晶得 到奇壬醇結(jié)晶。純度為95%，其并沒有公開詳細(xì)的重結(jié)晶過程。但是根據(jù)其公開的資料，其 提取得到的化合物中甲基和羥甲基構(gòu)型與上述結(jié)構(gòu)完全相反。鑒于上述原因，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一發(fā)明目的在于提供一種奇壬醇的提取方法，所提供的提取方法收率 高，制備的奇壬醇純度高。本發(fā)明第二發(fā)明目的在于提供含有所述提取方法提取出來的奇壬醇提取物藥物 組合物，所述的藥物組合物中奇壬醇提取物純度高，其它雜質(zhì)含量低。本發(fā)明第三發(fā)明目的在于提供所述藥物組合物的用途。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案一種奇壬醇提取物的提取方法所述奇壬醇提取物經(jīng)過1)醇提取、2)有機(jī)酸酯萃 取、3)柱色譜和4)重結(jié)晶過程得到，從生藥計(jì)收率為0. 3 1%;所述奇壬醇提取物中奇壬 醇含量為90 100 %，優(yōu)選為95 99. 8 %，更優(yōu)選為98. 5 99. 5 %。這里所述的生藥為本領(lǐng)域技術(shù)常用術(shù)語，即為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知曉的生藥。根據(jù)前面所述的提取方法1)醇提取將原料藥材菊科植物豨薟草，加入醇溶液回流提取，提取液過濾并減 壓濃縮至無醇味，得提取液；現(xiàn)有技術(shù)出采用的是石油醚進(jìn)行提取，然而石油醚沸點(diǎn)極低，工業(yè)生產(chǎn)危險(xiǎn)性極 強(qiáng)。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用醇溶液更加便于奇壬醇的提取。2)有機(jī)酸酯萃取將步驟1)得到的提取液，以水飽和過的有機(jī)酸酯進(jìn)行萃取，合 并萃取液，減壓濃縮，得浸膏狀物；3)柱色譜將步驟2)得到的浸膏狀物，加入熱水溶解，將此水溶液進(jìn)行大孔樹脂 柱色譜，以水洗脫至流出液無色，再以醇溶液進(jìn)行洗脫，收集含奇壬醇部分的洗脫液，合并 含奇壬醇部分的洗脫液，減壓濃縮，得浸膏；
將所得浸膏，進(jìn)行硅膠柱色譜，以有機(jī)酸酯和醇或鹵代烴和醇洗脫，合并含奇壬醇 部分的洗脫液，將洗脫液減壓濃縮，得濃縮物； 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)提取物采取大孔樹脂色譜和硅膠柱色譜聯(lián)用的方法可以在和 現(xiàn)有技術(shù)比較不降低收率的前提下，最大程度的提高提取物中奇壬醇含量。而具體柱色譜 的操作可以參考現(xiàn)有技術(shù)相類似的柱色譜操作方法。4)重結(jié)晶將步驟3)硅膠柱色譜后得到的濃縮物溶于醇中，加入有機(jī)酸酯，密閉 放置，析出晶體，過濾得到奇壬醇晶體。將得到的奇壬醇晶體，加入醇或脂肪酮，加熱溶解，重結(jié)晶，得到無色透明晶體，干 燥得到奇壬醇提取物。現(xiàn)有技術(shù)使用石油醚提取后，收率非常低，又采用丙酮等溶液進(jìn)行滲漉提取，然而 滲漉過程往往需要若干天時(shí)間，生產(chǎn)效率非常低。本發(fā)明經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，特定用量的醇溶液 可以在很短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)奇壬醇的提取，大大提高了收率和生產(chǎn)效率。因此，本發(fā)明優(yōu)選步驟1)所述回流提取為提取2 4次，每次回流1 5小時(shí)，每 次加入的提取溶劑體積量與生藥的體積比為5 1 15 1 ；更優(yōu)選為提取3次，每次2 3小時(shí)，每次加入的提取溶劑體積量與生藥的體積比為8 1 12 1。所述的醇溶液可以優(yōu)選為體積濃度為40 80 %的醇水溶液，更優(yōu)選為50 70 % 的醇水溶液。此外，還可優(yōu)選步驟2)所述萃取為2 4次，每次使用的萃取溶劑量與提取液的 比例為0.1 2.0 1.0，濃縮至所得浸膏狀物比重為1.0 1.4;優(yōu)選為萃取3次，每次使 用的萃取溶劑量與提取液的比例為0.3 1.0 1.0，濃縮至所得浸膏狀物比重為1.1 1. 2。為了提高奇壬醇的純度，本發(fā)明經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大孔樹脂和硅膠色譜采取梯度洗脫 的方法能夠再進(jìn)一步提高收率和奇壬醇含量。因此，本發(fā)明可以優(yōu)選步驟3)所述大孔樹脂柱色譜中以醇溶液洗脫為按照濃度 為25 35 %、45 65 %，68 75 %的順序進(jìn)行梯度洗脫，更優(yōu)選為按照濃度為30 %、50 %， 70%的順序進(jìn)行梯度洗脫。所述硅膠色譜中以有機(jī)酸酯和醇洗脫或鹵代烴和醇洗脫均為洗脫液中兩種溶劑 比例27 32 1、18 22 1和8 12 1進(jìn)行梯度洗脫，優(yōu)選為30 1,20 1和 10 1。上述梯度洗脫以薄層色譜法檢測(cè)，當(dāng)板層上無奇壬醇樣品點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)，即可換下一 梯度進(jìn)行洗脫。色譜柱填料用量也對(duì)提取具有一定影響，如果填料較少，則雜質(zhì)難以分離，如果填 料過多，洗脫液用量勢(shì)必大大增加。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明前面所公開的內(nèi)容，并結(jié)合 現(xiàn)有色譜柱技術(shù)，可以大致確定一個(gè)合理的范圍。但本發(fā)明為了更進(jìn)一步減少工作量和試劑用量，從而降低對(duì)試劑對(duì)人體的危害， 優(yōu)選如下方法步驟3)大孔樹脂柱色譜中所述熱水溫度為30 90°C，所述熱水用量與浸膏的體 積比為1 6 1，所述大孔樹脂填料為AB-8、D201、HP20或DlOl樹脂，浸膏狀物與大孔樹 脂的重量比例為1 15 1 200 ；更優(yōu)選為所述熱水溫度為50 60°C，所述熱水用量與
6浸膏的體積比為2 4 1，所述大孔樹脂填料為AB-8樹脂，浸膏狀物與大孔樹脂的重量比 例為 1 25 1 100 ；所述硅膠柱色譜為先將經(jīng)大孔樹脂柱色譜得到的浸膏與硅膠拌勻，浸膏與硅膠重 量比為1 1 1 3，浸膏與柱色譜硅膠重量比為1 4 1 30;更優(yōu)選為浸膏與硅膠 重量比為1 1.2 1 2. 5，浸膏與柱色譜硅膠重量比為1 6 1 20。根據(jù)前面所述的提取方法步驟4)中溶解濃縮物的醇和有機(jī)酸酯體積用量均為濃縮物質(zhì)量的2 3倍，析出 晶體并過濾后所得母液繼續(xù)放置析出晶體并過濾，重復(fù)上述操作3 5次，合并析出的晶 體；溶解奇壬醇晶體的醇或脂肪酮體積用量均為奇壬醇晶體質(zhì)量的2 3倍。上述重結(jié)晶方法中，使用溶劑溶解了奇壬醇后自然析晶或采用本領(lǐng)域常用的重結(jié) 晶方法都可得到純度較高奇壬醇結(jié)晶。但本發(fā)明為了更進(jìn)一步提高奇壬醇純度，可以更優(yōu) 選采取如下操作將濃縮物用2 3倍的醇或有機(jī)酸酯溶解后，加熱至55°C，然后將反應(yīng)容器下半 部置于溫度為-10°C的環(huán)境中，保持?jǐn)嚢杷俣葹?0 80轉(zhuǎn)/min，迅速降溫至室溫，然后停 止攪拌，將所述-10°C的環(huán)境調(diào)整為0°C，靜置3小時(shí)，過濾，母液繼續(xù)0°C下靜置3小時(shí)，過 濾，母液重復(fù)3 5次，合并晶體；將得到的晶體加入2 3倍醇或脂肪酮，加熱至40°C溶解，自然降溫至10°C，保溫 靜置5小時(shí)，過濾即得奇壬醇晶體。上述優(yōu)選的重結(jié)晶操作可以將提取物中奇壬醇高效液相純度提高至99. 7 99. 8%左右。根據(jù)前面所述的提取方法步驟2) 步驟4)所述有機(jī)酸酯SR1COOR2，其中R1和R2分別為相同或不同的直 鏈烷烴，優(yōu)選為1 4個(gè)碳的直鏈烷烴，更優(yōu)選為乙酸乙酯；步驟1) 步驟4)所述醇為直鏈烷烴醇，優(yōu)選為1 4個(gè)碳的直鏈烷烴醇，更優(yōu)選 為甲醇或乙醇；所述醇溶液濃度為20 90%，優(yōu)選為30 80% ；步驟3)所述鹵代烴為直鏈烷基鹵代烴，優(yōu)選為直鏈烷基氯代烴，更優(yōu)選為1 4 個(gè)碳的直鏈烷基氯代烴，最優(yōu)選為氯仿；步驟4)所述脂肪酮為R3COR4,其中R3和R4分別為相同或不同的直鏈烷烴，優(yōu)選為 1 4個(gè)碳的直鏈烷烴，更優(yōu)選所述脂肪酮為丙酮。一種含有前面所述提取方法提取的奇壬醇的治療免疫系統(tǒng)疾病的藥物組合物， 所述藥物組合物含有奇壬醇提取物和可藥用輔料，奇壬醇提取物中奇壬醇含量為90 100%，優(yōu)選為95 99. 8%，更優(yōu)選為98. 5 99. 5% ；所述奇壬醇提取物按照前面所述提 取方法提取。根據(jù)前面所述的治療免疫系統(tǒng)疾病的藥物組合物，所述的藥物組合物劑型為片 劑、膠囊、微丸、顆粒劑、緩釋劑、口服液、凍干粉針或小水針注射劑。所述的劑型可以在本發(fā)明所公開的基礎(chǔ)上結(jié)合制劑領(lǐng)域中上述劑型常用的制備 方法制備，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常知曉上述劑型的制備方法，或者在現(xiàn)有公知方法的基礎(chǔ)上 進(jìn)行簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)以調(diào)整至適合。
然而可以優(yōu)選采用如下方法制備向奇壬醇中加入輔料(微晶纖維素；泊洛沙姆； 95%乙醇；羥丙基纖維素；微晶纖維素；25%淀粉漿；硬質(zhì)酸鎂)，制粒，制成顆粒劑、膠囊劑 或壓成片劑?；蛘邇?yōu)選采用如下方法制備向奇壬醇中加入輔料(微晶纖維素；泊洛沙姆；95% 乙醇；羥丙基纖維素；25%淀粉漿；硬質(zhì)酸鎂)，制粒，制成緩釋片劑或膠囊劑。所述微丸劑優(yōu)選采用如下方法制備向奇壬醇中加入輔料(微晶纖維素；泊洛沙 姆；95%乙醇；羥丙基纖維素；淀粉漿)，制成微丸劑。所述小水針注射劑優(yōu)選采用如下方法制備向奇壬醇中加入助溶劑，再加入注射 用水，加熱溶解，稀釋至IOOOml，過濾，濾液超濾，灌裝，封口制成1000只，滅菌，檢驗(yàn)，即得。所述凍干粉針優(yōu)選采用如下方法制備向奇壬醇中加入助溶劑，再加入支架劑和 注射用水，加熱過濾，濾液超濾，分裝，冷凍干燥后壓蓋即得。上述冷凍干燥分為四個(gè)階段⑴預(yù)凍3-4小時(shí)，溫度在-30 -45°C; (2)減壓干 燥14小時(shí)，溫度在-30 -45°C ； (3)升溫干燥4小時(shí)，溫度在-15 _10°C ；⑷二次升溫 干燥4小時(shí)，溫度在30°C。本發(fā)明中，所述的助溶劑可以優(yōu)選為泊洛沙姆和氨基酸或其鹽酸鹽，泊洛沙姆即 能溶于也能溶于有機(jī)溶劑，無論是固體制劑還是液體制劑都具有良好助溶作用，氨基酸或 其鹽酸鹽優(yōu)選天門冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、絡(luò)氨酸、纈氨酸、組氨 酸或L-半胱氨酸鹽酸鹽，更優(yōu)選天門冬氨酸。本發(fā)明中選用泊洛沙姆和氨基酸或其鹽酸鹽 作為助溶劑，增加了奇壬醇在水中的溶解性。本發(fā)明中，所述的支架劑可以優(yōu)選為甘露醇、甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐、 葡萄糖或右旋糖酐，優(yōu)選甘露醇-葡萄糖、甘露醇-右旋糖酐，更優(yōu)選比例為5 1的甘露 醇-葡萄糖或4 1的甘露醇-右旋糖酐。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在制備凍干劑時(shí)，選用甘露醇-葡 萄糖、甘露醇_右旋糖酐能更好地解決河豚毒素在制劑中的穩(wěn)定性問題。所述的藥物組合物中優(yōu)選奇壬醇的劑量為每制劑單位含有5_200mg奇壬醇。前面所述藥物組合物在制備治療自身免疫性疾病和防止器官移植排斥藥物的用 途。優(yōu)選其中奇壬醇的劑量為每制劑單位含有5_200mg奇壬醇。本發(fā)明中，所述的制劑單位是指片劑的每片、膠囊劑的每粒膠囊、顆粒劑的每袋等 藥學(xué)上常規(guī)制劑的劑型單位。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明所提供的藥物組合物，不僅水溶性良好，而且穩(wěn)定性良好，安全可靠，質(zhì) 量穩(wěn)定，不需在特定溫度下的冰箱中保存，室溫下貯存期可達(dá)5年以上，大大節(jié)約了貯藏、 運(yùn)輸成本，方便醫(yī)療使用。(2)本發(fā)明提取方法所提供的原料藥，奇壬醇純度大于98%，其穩(wěn)定性良好，所制 備的制劑穩(wěn)定性優(yōu)良，療效好，治療效果明顯。(3)本發(fā)明所提供的提取方法制備奇壬醇，損耗少、收率高、純度高、穩(wěn)定性好；(4)本發(fā)明所提供的奇壬醇的提取方法中不需采用活性炭吸附，采用兩次柱層析， AB-8大孔樹脂富集奇壬醇，同時(shí)除雜質(zhì)；脫色的作用。不僅能有效地除去雜質(zhì)，還減少了提 取時(shí)間，使奇壬醇的損失減少到最低限度。
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(5)本發(fā)明所提供的奇壬醇的制備方法中的提取分離過程中保持較低溫度處理， 避免了溫度對(duì)奇壬醇造成的破壞。
具體實(shí)施例方式以下為本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，所述的實(shí)施例是為了進(jìn)一步描述本發(fā)明，而不是 限制本發(fā)明。實(shí)施例1原料藥奇壬醇的提取將原料藥材菊科植物豨薟草(腺梗、東方或毛梗豨薟草)100kg，加入12倍量的 70%乙醇回流提取，提取3次，每次2-3小時(shí)，將提取液合并過濾，濾液減壓回收醇，至無醇 味，得提取液；藥渣棄去。獲得的提取液，以水飽和過的乙酸乙脂進(jìn)行萃取，萃取三次，每次 使用的萃取溶劑量與提取液的比例為0.3-1.0 1.0。合并萃取液，減壓回收溶劑，得浸膏 狀物，其比重為1. 1-1.2。將浸膏狀物，加入50-60°C熱水，攪拌溶解，加入的水量與浸膏的 體積比為4 1，將此液進(jìn)行AB-8大孔樹脂為填料的柱色譜，浸膏狀物與大孔樹脂的比例為 1 25，以水洗脫至流出液無色，再以30% ;50%;70%甲醇或乙醇液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫中 以TLC示樣品點(diǎn)消失為進(jìn)行下一梯度的標(biāo)志。收集含奇壬醇部分的洗脫液，以HPLC或TLC 檢測(cè)，合并含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得浸膏。硅膠柱色譜將獲得的浸膏，與 60-100目的硅膠拌樣，浸膏與硅膠的比例為1 2;浸膏與柱色譜硅膠的比例為1 10，以 乙酸乙脂和甲醇溶劑系統(tǒng)按照乙酸乙酯和甲醇比例為30 1,20 UlO 1順序梯度洗 脫，以TLC檢測(cè)，合并含奇壬醇部分的洗脫液。含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得粘 稠物，進(jìn)行如下重結(jié)晶將粘稠物溶于2倍甲醇中，加入2. 4倍乙酸乙脂，密閉放置，有大量 無色透明晶體析出，濾出晶體，母液繼續(xù)放置，晶體析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇幾乎 全部析出，合并析出的奇壬醇晶體。將析出的奇壬醇晶體，加入1.5倍丙酮，加熱溶解，重結(jié) 晶，得到無色透明晶體，干燥得到450g ；純度> 98%的奇壬醇?；蛘邔⒄吵砦镉萌缦轮亟Y(jié)晶方法將濃縮的粘稠物用3倍的甲醇溶解后，加熱至 55 °C，然后將反應(yīng)容器下半部置于溫度為-10°C的環(huán)境中，保持?jǐn)嚢杷俣葹?0 80轉(zhuǎn)/ min，迅速降溫至室溫，然后停止攪拌，將所述-10°C的環(huán)境調(diào)整為0°C，靜置3小時(shí)，過濾，母 液繼續(xù)0°C下靜置3小時(shí)，過濾，母液重復(fù)3 5次，合并晶體；將得到的晶體加入3倍甲醇，加熱至40°C溶解，自然降溫至10°C，保溫靜置5小 時(shí)，過濾即得430g奇壬醇晶體，純度為99. 8%。實(shí)施例2原料藥奇壬醇的提取將原料藥材豨薟草(腺梗、東方或毛梗豨薟草)100kg，加入11倍量的50%甲醇回 流提取，提取3次，每次2-3小時(shí)，將提取液合并過濾，濾液減壓回收醇，至無醇味，得提取 液；藥渣棄去。獲得的提取液，以水飽和過的乙酸乙脂進(jìn)行萃取，萃取三次，每次使用的萃取 溶劑量與提取液的比例為0.4 1.0。合并萃取液，減壓回收溶劑，得浸膏狀物，其比重為 1.1-1.2。將浸膏狀物，加入60°C熱水，攪拌溶解，加入的水量與浸膏的體積比為4 1，將 此液進(jìn)行AB-8大孔樹脂為填料的柱色譜，浸膏狀物與大孔樹脂的比例為1 100，以水洗脫 至流出液無色，再以30% ；50% ；70%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫中以TLC示樣品點(diǎn)消失 為進(jìn)行下一梯度的標(biāo)志。收集含奇壬醇部分的洗脫液，以HPLC或TLC檢測(cè)，合并含奇壬醇 部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得浸膏。硅膠柱色譜將獲得的浸膏，與60-100目的硅膠拌樣，浸膏與硅膠的比例為1 2;浸膏與柱色譜硅膠的比例為1 10，以乙酸乙脂和甲醇溶 劑系統(tǒng)按照乙酸乙酯和甲醇比例為30 1,20 UlO 1順序梯度洗脫，以TLC檢測(cè)，合并 含奇壬醇部分的洗脫液。含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得粘稠物，進(jìn)行如下重結(jié) 晶將粘稠物溶于3倍乙醇中，加入3倍乙酸乙脂，密閉放置，有大量無色透明晶體析出，濾 出晶體，母液繼續(xù)放置，晶體析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇幾乎全部析出，合并析出的 奇壬醇晶體。將析出的奇壬醇晶體，加入3倍甲醇，加熱溶解，重結(jié)晶，得到無色透明晶體， 干燥得到458g ；純度彡98. 5%的奇壬醇。或者將粘稠物用如下重結(jié)晶方法將濃縮的粘稠物用3倍的乙醇溶解后，加熱至 55 °C，然后將反應(yīng)容器下半部置于溫度為-10°C的環(huán)境中，保持?jǐn)嚢杷俣葹?0 80轉(zhuǎn)/ min，迅速降溫至室溫，然后停止攪拌，將所述-10°C的環(huán)境調(diào)整為0°C，靜置3小時(shí)，過濾，母 液繼續(xù)0°C下靜置3小時(shí)，過濾，母液重復(fù)3 5次，合并晶體；將得到的晶體加入3倍乙醇，加熱至40°C溶解，自然降溫至10°C，保溫靜置5小 時(shí)，過濾即得450g奇壬醇晶體，純度為99. 9%。實(shí)施例3原料藥奇壬醇的提取將原料藥材菊科植物豨薟草(腺梗、東方或毛梗豨薟草)100kg，加入10倍量的 60%乙醇回流提取，提取2次，每次2. 5小時(shí)，將提取液合并過濾，濾液減壓回收醇，至無醇 味，得提取液；藥渣棄去。獲得的提取液，以乙酸乙脂進(jìn)行萃取，萃取2次，每次使用的萃取 溶劑量與提取液的比例為0.3 1.0。合并萃取液，減壓回收溶劑，得浸膏狀物，其比重為 1.1-1. 2。將浸膏狀物，加入50°C熱水，攪拌溶解，加入的水量與浸膏的體積比為2 1，將此 液進(jìn)行AB-8大孔樹脂為填料的柱色譜，浸膏狀物與大孔樹脂的比例為1 50，以水洗脫至 流出液無色，再以30% ；50% ；70%甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫中以TLC示樣品點(diǎn)消失為 進(jìn)行下一梯度的標(biāo)志。收集含奇壬醇部分的洗脫液，以HPLC或TLC檢測(cè)，合并含奇壬醇部 分的洗脫液，減壓回收溶劑，得浸膏。硅膠柱色譜將獲得的浸膏，與60-100目的硅膠拌樣， 浸膏與硅膠的比例為1 2. 5;浸膏與柱色譜硅膠的比例為1 20，以乙酸乙脂和甲醇溶劑 系統(tǒng)按照乙酸乙酯和甲醇比例為30 1,20 UlO 1順序梯度洗脫，以TLC檢測(cè)，合并 含奇壬醇部分的洗脫液。含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得粘稠物，進(jìn)行如下重結(jié) 晶將粘稠物溶于3倍乙醇中，加入2倍乙酸乙脂，密閉放置，有大量無色透明晶體析出，濾 出晶體，母液繼續(xù)放置，晶體析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇幾乎全部析出，合并析出的 奇壬醇晶體。將析出的奇壬醇晶體，加入3倍乙醇，加熱溶解，重結(jié)晶，得到無色透明晶體， 干燥得到490g ；純度彡98. 7%的奇壬醇?；蛘邔⒄吵砦镉萌缦轮亟Y(jié)晶方法將濃縮的粘稠物用3倍的乙酸乙酯溶解后，加 熱至55°C，然后將反應(yīng)容器下半部置于溫度為-10°C的環(huán)境中，保持?jǐn)嚢杷俣葹?0 80轉(zhuǎn) /min，迅速降溫至室溫，然后停止攪拌，將所述-10°C的環(huán)境調(diào)整為0°C，靜置3小時(shí)，過濾， 母液繼續(xù)0°C下靜置3小時(shí)，過濾，母液重復(fù)3 5次，合并晶體；將得到的晶體加入2倍丙酮，加熱至40°C溶解，自然降溫至10°C，保溫靜置5小 時(shí)，過濾即得437g奇壬醇晶體，純度為99. 9%。實(shí)施例4原料藥奇壬醇的提取將原料藥材菊科植物豨薟草(腺梗、東方或毛梗豨薟草)100kg，加入9倍量的 50%甲醇回流提取，提取2次，每次2小時(shí)，將提取液合并過濾，濾液減壓回收醇，至無醇味，得提取液；藥渣棄去。獲得的提取液，以水飽和過的乙酸乙脂進(jìn)行萃取，萃取3次，每次使用 的萃取溶劑量與提取液的比例為0.5-1.0 1.0。合并萃取液，減壓回收溶劑，得浸膏狀物， 其比重為1.2-1.4。將浸膏狀物，加入55°C熱水，攪拌溶解，加入的水量與浸膏的體積比為
3 1，將此液進(jìn)行AB-8大孔樹脂為填料的柱色譜，浸膏狀物與大孔樹脂的比例為1 40， 以水洗脫至流出液無色，再以30% ；50% ；70%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫中以TLC示樣品 點(diǎn)消失為進(jìn)行下一梯度的標(biāo)志。收集含奇壬醇部分的洗脫液，以HPLC或TLC檢測(cè)，合并含 奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得浸膏。硅膠柱色譜將獲得的浸膏，與60-100目的 硅膠拌樣，浸膏與硅膠的比例為1 2;浸膏與柱色譜硅膠的比例為1 15，以氯仿和甲醇 溶劑系統(tǒng)按照氯仿和甲醇比例為30 1,20 UlO 1順序梯度洗脫，以TLC檢測(cè)，合并 含奇壬醇部分的洗脫液。含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得粘稠物，進(jìn)行如下重結(jié) 晶將粘稠物溶于2倍甲醇中，加入2倍乙酸乙脂，密閉放置，有大量無色透明晶體析出，濾 出晶體，母液繼續(xù)放置，晶體析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇幾乎全部析出，合并析出的 奇壬醇晶體。將析出的奇壬醇晶體，加入2倍丙酮，加熱溶解，重結(jié)晶，得到無色透明晶體， 干燥得到532g ；純度彡98. 9%的奇壬醇。或者將粘稠物用如下重結(jié)晶方法將濃縮的粘稠物用3倍的乙醇溶解后，加熱至 55 °C，然后將反應(yīng)容器下半部置于溫度為-10°C的環(huán)境中，保持?jǐn)嚢杷俣葹?0 80轉(zhuǎn)/ min，迅速降溫至室溫，然后停止攪拌，將所述-10°C的環(huán)境調(diào)整為0°C，靜置3小時(shí)，過濾，母 液繼續(xù)0°C下靜置3小時(shí)，過濾，母液重復(fù)3 5次，合并晶體；將得到的晶體加入3倍乙醇，加熱至40°C溶解，自然降溫至10°C，保溫靜置5小 時(shí)，過濾即得486g奇壬醇晶體，純度為99. 5%。實(shí)施例5原料藥奇壬醇的提取將原料藥材菊科植物豨薟草(腺梗、東方或毛梗豨薟草)100kg，加入8倍量的 80%乙醇回流提取，提取3次，每次3小時(shí)，將提取液合并過濾，濾液減壓回收醇，至無醇味， 得提取液；藥渣棄去。獲得的提取液，以水飽和過的乙酸乙脂進(jìn)行萃取，萃取3次，每次使用 的萃取溶劑量與提取液的比例為0.8 1.0。合并萃取液，減壓回收溶劑，得浸膏狀物，其 比重為1.0-1. 1。將浸膏狀物，加入50-60°C熱水，攪拌溶解，加入的水量與浸膏的體積比為
4 1，將此液進(jìn)行HP20大孔樹脂為填料的柱色譜，浸膏狀物與大孔樹脂的比例為1 75， 以水洗脫至流出液無色，再以30% ；50% ；70%甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫中以TLC示樣 品點(diǎn)消失為進(jìn)行下一梯度的標(biāo)志。收集含奇壬醇部分的洗脫液，以HPLC或TLC檢測(cè)，合并 含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得浸膏。硅膠柱色譜將獲得的浸膏，與60-100目 的硅膠拌樣，浸膏與硅膠的比例為1 1.2;浸膏與柱色譜硅膠的比例為1 6，以二氯甲烷 和甲醇溶劑系統(tǒng)按照二氯甲烷和甲醇比例為30 1,20 UlO 1順序梯度洗脫，以TLC 檢測(cè)，合并含奇壬醇部分的洗脫液。含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得粘稠物，進(jìn)行 如下重結(jié)晶將粘稠物溶于3倍甲醇中，加入2倍乙酸乙脂，密閉放置，有大量無色透明晶體 析出，濾出晶體，母液繼續(xù)放置，晶體析出，上述操作3-5次，直至奇壬醇幾乎全部析出，合 并析出的奇壬醇晶體。將析出的奇壬醇晶體，加入2倍甲醇，加熱溶解，重結(jié)晶，得到無色透 明晶體，干燥得到920g ；純度彡98. 3%的奇壬醇?；蛘邔⒄吵砦镉萌缦轮亟Y(jié)晶方法將濃縮的粘稠物用2倍的乙酸乙酯溶解后，加 熱至55°C，然后將反應(yīng)容器下半部置于溫度為-10°C的環(huán)境中，保持?jǐn)嚢杷俣葹?0 80轉(zhuǎn)/min,迅速降溫至室溫，然后停止攪拌，將所述-10°C的環(huán)境調(diào)整為0°C，靜置3小時(shí)，過濾， 母液繼續(xù)0°C下靜置3小時(shí)，過濾，母液重復(fù)3 5次，合并晶體；將得到的晶體加入2倍甲醇，加熱至40°C溶解，自然降溫至10°C，保溫靜置5小 時(shí)，過濾即得800g奇壬醇晶體，純度為99. 4%。實(shí)施例6原料藥奇壬醇的提取將原料藥材菊科植物豨薟草(腺梗、東方或毛梗豨薟草)100kg，加入5倍量的 40%甲醇回流提取，提取3次，每次5小時(shí)，將提取液合并過濾，濾液減壓回收醇，至無醇味， 得提取液；藥渣棄去。獲得的提取液，以水飽和過的甲酸丙脂進(jìn)行萃取，萃取2次，每次使 用的萃取溶劑量與提取液的比例為2.0 1.0。合并萃取液，減壓回收溶劑，得浸膏狀物， 其比重為1. 1-1.2。將浸膏狀物，加入30-40°C熱水，攪拌溶解，加入的水量與浸膏的體積 比為1.5 1，將此液進(jìn)行DlOl大孔樹脂為填料的柱色譜，浸膏狀物與大孔樹脂的比例為 1 15 1 20，以水洗脫至流出液無色，再以25% ;65%;73%甲醇或乙醇液進(jìn)行梯度洗 脫，洗脫中以TLC示樣品點(diǎn)消失為進(jìn)行下一梯度的標(biāo)志。收集含奇壬醇部分的洗脫液，以 HPLC或TLC檢測(cè)，合并含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得浸膏。硅膠柱色譜將獲 得的浸膏，與60-100目的硅膠拌樣，浸膏與硅膠的比例為1 1 ；浸膏與柱色譜硅膠的比例 為1 4，以乙酸乙脂和乙醇溶劑系統(tǒng)按照乙酸乙酯和乙醇比例為27 1、18 1、8 1順 序梯度洗脫，以TLC檢測(cè)，合并含奇壬醇部分的洗脫液。含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收 溶劑，得粘稠物，進(jìn)行如下重結(jié)晶將粘稠物溶于3倍甲醇中，加入3倍乙酸乙脂，密閉放置， 有大量無色透明晶體析出，濾出晶體，母液繼續(xù)放置，晶體析出，上述操作3-5次，直至奇壬 醇幾乎全部析出，合并析出的奇壬醇晶體。將析出的奇壬醇晶體，加入3倍甲醇，加熱溶解， 重結(jié)晶，得到無色透明晶體，干燥得到550g ；純度彡98%的奇壬醇。實(shí)施例7原料藥奇壬醇的提取將原料藥材菊科植物豨薟草(腺梗、東方或毛梗豨薟草)100kg，加入15倍量的 60 %乙醇回流提取，提取2次，每次1小時(shí)，將提取液合并過濾，濾液減壓回收醇，至無醇 味，得提取液；藥渣棄去。獲得的提取液，以乙酸丙脂進(jìn)行萃取，萃取4次，每次使用的萃 取溶劑量與提取液的比例為0.3-1.0 1.0。合并萃取液，減壓回收溶劑，得浸膏狀物， 其比重為1. 1-1.2。將浸膏狀物，加入70-90°C熱水，攪拌溶解，加入的水量與浸膏的體積 比為6 1，將此液進(jìn)行D201大孔樹脂為填料的柱色譜，浸膏狀物與大孔樹脂的比例為 1 150-1 180，以水洗脫至流出液無色，再以25 35%;45 65%;68 75%甲醇或乙 醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫中以TLC示樣品點(diǎn)消失為進(jìn)行下一梯度的標(biāo)志。收集含奇壬醇 部分的洗脫液，以HPLC或TLC檢測(cè)，合并含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回收溶劑，得浸膏。硅 膠柱色譜將獲得的浸膏，與柱層析硅膠拌樣，浸膏與硅膠的比例為1 3;浸膏與柱色譜硅 膠的比例為1 30，以氯仿和乙醇溶劑系統(tǒng)按照氯仿和乙醇比例為32 1、22 1、12 1 順序梯度洗脫，以TLC檢測(cè)，合并含奇壬醇部分的洗脫液。含奇壬醇部分的洗脫液，減壓回 收溶劑，得粘稠物，進(jìn)行如下重結(jié)晶將粘稠物溶于2倍甲醇中，加入2倍甲酸乙脂，密閉放 置，有大量無色透明晶體析出，濾出晶體，母液繼續(xù)放置，晶體析出，上述操作3-5次，直至 奇壬醇幾乎全部析出，合并析出的奇壬醇晶體。將析出的奇壬醇晶體，加入3倍丙酮，加熱 溶解，重結(jié)晶，得到無色透明晶體，干燥得到437g ；純度> 98. 0%的奇壬醇。實(shí)施例8奇壬醇片劑的制備
12
奇壬醇IOOg ；微晶纖維素70g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羥丙基纖維素15g ； 25%淀粉漿120ml ；硬酸鎂5g，制粒，60°C干燥，12目篩整粒，壓成片劑；1000片；每片含 IOOmg奇壬醇實(shí)施例9奇壬醇膠囊劑的制備奇壬醇IOOg ；微晶纖維素80g ；；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羥丙基纖維素25g ； 25%淀粉漿120ml ；12目篩制粒，60°C干燥，14目篩整粒，填入空膠囊；得1000粒膠囊；每粒 膠囊含IOOmg奇壬醇實(shí)施例10奇壬醇顆粒劑的制備奇壬醇IOOg ；淀粉120g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羥丙基纖維素15g ；25% 淀粉漿120ml;糖粉20g;硬酸鎂5g，14目篩制粒，60°C干燥，14目篩整粒，分裝成袋；1000 袋；每袋含IOOmg奇壬醇。實(shí)施例11奇壬醇緩釋片劑的制備奇壬醇IOOg ；微晶纖維素70g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羥丙基纖維素150g ； 25%淀粉漿100ml;微粉硅膠20g;硬酸鎂5g，滑石粉20g;14目制粒，60°C干燥，12目篩整 粒，壓成片劑；1000片；每片含IOOmg奇壬醇。實(shí)施例12奇壬醇微丸劑的制備奇壬醇IOOg ；微晶纖維素180g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羥丙基纖維素20g ； 25%淀粉漿IOOml ；微粉硅膠20g ；滾動(dòng)制丸，60°C干燥，制成微丸，填入空膠囊；1000粒；每 粒含IOOmg奇壬醇。實(shí)施例13奇壬醇緩釋膠囊劑的制備奇壬醇IOOg ；微晶纖維素80g ；泊洛沙姆IOg ；95%乙醇50ml ；羥丙基纖維素150g ； 25%淀粉漿IOOml ；微粉硅膠20g;硬酸鎂5g，14目制粒，60°C干燥，12目篩整粒，壓成片劑； 1000片；每片含IOOmg奇壬醇。實(shí)施例14奇壬醇凍干粉針劑的制備奇壬醇IOOg ；泊洛沙姆2g ；加入5. Og谷氨酸，加入10. Og甘露醇，加入注射用水， 加熱溶解，稀釋至2000ml，過濾、濾液超濾，分裝、冷凍干燥，完畢后壓蓋。制成1000只，每只 含奇壬醇lOOmg。上述冷凍干燥分為四個(gè)階段(1)預(yù)凍3.6小時(shí)，溫度在_331 ； (2)減壓干燥14 小時(shí)，溫度在_36°C ； (3)升溫干燥4小時(shí)，溫度在-13°C ； (4) 二次升溫干燥4小時(shí)，溫度在 30 "C。實(shí)施例15奇壬醇注射劑的制備奇壬醇IOOg ；泊洛沙姆2g ；加入5. Og谷氨酸，加入注射用水，加熱溶解，稀釋至 2000ml，過濾、濾液超濾，灌裝、滅菌。制成1000只，每只含奇壬醇lOOmg。試驗(yàn)例1本發(fā)明 對(duì)奇壬醇(kirenol)進(jìn)行了藥效學(xué)試驗(yàn)。(一)奇壬醇對(duì)小鼠的急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)和最大耐受量測(cè)定目的測(cè)定奇壬醇的LD50和TMD。試驗(yàn)材料①受試動(dòng)物ICR小鼠，只，體重18g-22g，6_8周齡，雌雄各半，②受試藥品奇壬醇，蒸餾水溶解。
(2)LD50 測(cè)定動(dòng)物分組按體重將小鼠隨機(jī)分成5組，每組6只，雌雄各半10①藥物的劑量和配制設(shè)5個(gè)劑量組，分別為0.64、0.8、l、1.25、1.56g/kg，組間劑量比值為1 0. 8。給 藥前以蒸餾水調(diào)配成所需濃度，②實(shí)驗(yàn)方法給藥前小鼠禁食12小時(shí)，自由飲水。給藥(0. 2ml/10g體重)后立即觀察和記錄 動(dòng)物的中毒癥狀及死亡情況，對(duì)死亡動(dòng)物作尸檢，如有異常病變進(jìn)行組織學(xué)檢查。觀察期為 7天，計(jì)算LD50值及95%可信限。7天后解剖動(dòng)物肉眼觀察重要臟器顏色、大小、質(zhì)地等。最大耐受量試驗(yàn)(TMD)若LD50值不能測(cè)出，按照《新藥審批辦法》的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行最大耐受量試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法按照最大濃度最大容積原則，奇壬醇劑最大濃度為，給藥體積為 0. 4ml/10克體重，每日2次，每次間隔10h，，給藥后立即觀察和記錄動(dòng)物的狀況、中毒癥狀 及死亡情況，觀察期為7天，觀察內(nèi)容如下 ( 二)奇壬醇大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)報(bào)告(1)試驗(yàn)?zāi)康陌础吨兴幮滤幯芯恐改?藥學(xué)，藥理學(xué)，毒理學(xué))》的要求，檢測(cè)奇壬醇對(duì)大鼠的經(jīng) 口急性毒性。(2)受試動(dòng)物及藥物①藥物奇壬醇②溶劑蒸餾水③動(dòng)物大白鼠(3)材料與方法奇壬醇(豨薟草)生藥臨床擬用劑量為15g/天/人，人體重量按60kg計(jì)。Ig奇 壬醇相當(dāng)于豨薟草生藥lOOOg。①試驗(yàn)組設(shè)置測(cè)定半數(shù)致死量按《中藥新藥研究指南(藥學(xué)，藥理學(xué)，毒理學(xué))》的要求，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物科學(xué)部提供二級(jí)健康SD種大鼠體重170g-200g，雌雄各半。試驗(yàn)前檢疫7天，大鼠分 為4組，每組各15只，雌雄各半。采用臨床擬用途徑，經(jīng)口給藥。劑量分別以5. 00，3. 25， 2. ll，1.37g/kg體重，組距0.65。最高劑量相當(dāng)于人臨床擬用劑量的100倍?？崭?2小時(shí) 后，等容量一次灌胃，灌胃容量2ml/100g體重。未見大鼠異常和死亡。未得到半數(shù)致死量。②最大耐受量試驗(yàn)根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，取大鼠40只，雌雄各半一次灌胃，灌胃容量5. Og/kg體重。灌 胃容量2ml/100g體重。相當(dāng)于人臨床用藥量的200倍。給藥后每日觀察一次，注意觀察動(dòng) 物中毒癥狀、死亡數(shù)和死亡時(shí)間。共觀察14天。對(duì)試驗(yàn)內(nèi)死亡和試驗(yàn)結(jié)束處死的動(dòng)物進(jìn)行 尸檢。奇壬醇按上述劑量經(jīng)口給藥，觀察14天，未見大鼠異常和死亡。試驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物 進(jìn)行尸檢，未發(fā)現(xiàn)異常。③觀察方法奇壬醇按上述劑量經(jīng)口給藥，給藥后每日觀察一次，觀察動(dòng)物中毒癥狀、死亡數(shù)和 死亡時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物進(jìn)行尸檢。④結(jié)果奇壬醇按上述劑量經(jīng)口給藥，觀察14天，解剖觀察肝臟、心臟、脾臟、胃等內(nèi)臟器 官，顏色質(zhì)地未見異常。未見大鼠異常和死亡。試驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物進(jìn)行尸檢，未發(fā)現(xiàn)異常。⑤結(jié)論奇壬醇大鼠急性經(jīng)口最大耐受量為5g/kg體重，相當(dāng)于人臨床擬用劑量的200倍。
(三)奇壬醇對(duì)不同致炎物質(zhì)所致大鼠足趾腫脹的研究1.試驗(yàn)?zāi)康挠^察奇壬醇對(duì)蛋清、甲醛、角叉菜膠等不同致炎物質(zhì)所致的大鼠足趾腫脹的影響。2.試驗(yàn)材料2.1藥品及試劑奇壬醇取140mg奇壬醇溶于700mL蒸餾水中，從中取出200mL加入200mL蒸餾水； 再從剩下的500mL藥液中取出IOOmL加入300mL蒸餾水，配出0. 2mg/ml，0. lmg/ml，0. 05mg/ ml藥液各400mLo強(qiáng)的松天津力生制藥股份有限公司，規(guī)格5mg/片。批號(hào)030618。取出20片溶 入400mL蒸餾水中。配成0. 25mg/mL藥液。新鮮蛋清購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，取出蛋清ImL加入9mL生理鹽水， 制成10%濃度。甲醛北京化工廠生產(chǎn)。取出0. 3mL甲醛加入9. 7mL生理鹽水，配置成3%濃度。角叉菜膠Sigma公司，取出0. Ig角叉菜膠加入生理鹽水10mL，配置成濃度。2. 2試驗(yàn)儀器游標(biāo)卡尺2. 3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠50只，雌雄各半，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。3.試驗(yàn)方法3.1動(dòng)物分組與給藥大鼠按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為①模型對(duì)照組，②強(qiáng)的松組5mg/kg體重③奇壬醇低劑量組(QRCL) :lmg/kg體重④奇壬醇中劑量組(QRCM) :2mg/kg體重，⑤奇壬醇高劑量組(QRCH) :4mg/kg體重。奇壬醇各劑量組和強(qiáng)的松組每日灌胃給藥一次，給藥體積為2ml/100g體重，共給 藥一周。模型對(duì)照組給予同體積蒸餾水灌胃。3. 2試驗(yàn)方法3.2. 1最后一次給藥Ih后，各鼠右后足趾內(nèi)注入0. ImL新鮮蛋清致炎，分別于致炎 后1、4、6小時(shí)測(cè)定注射足的腫脹程度。3. 2. 2最后一次給藥Ih后，各鼠右后足趾內(nèi)注入0. lmL3%甲醛致炎，分別于致炎 后2、24、48、72、96小時(shí)測(cè)定注射足的腫脹程度。3. 2. 3最后一次給藥Ih后，各鼠右后足趾內(nèi)注入0. ImLl %角叉菜膠致炎，分別于 致炎后1、4、6小時(shí)測(cè)定注射足的腫脹程度。3. 3統(tǒng)計(jì)方法SpSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。t檢 驗(yàn)進(jìn)行組間比較。4.試驗(yàn)結(jié)果4. 1蛋清致炎結(jié)果與模型對(duì)照組相比，QRCH在0. 5h、2h、4h均能夠抑制蛋清引起 的足趾腫脹(P < 0. 05，0. 05，0. 05)。QRCL和QRCM也能降低腫脹度，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >
160. 05)；強(qiáng)的松組能夠抑制蛋清引起的足趾腫脹(P < 0. 05,0. 01,0. 01)。見表1表1奇壬醇對(duì)蛋清所致大鼠足趾腫脹的影響(η = 10)
組別 _致炎后不同時(shí)間腫脹度值(X士SD)_
__0. 5h2h4h
模型0. 577±0. 06440. 490±0. 06730. 434±0. 0644
強(qiáng)的松0. 478±0. 0721*0. 426±0. 0720林0. 361 ±0. 0651** 與模型對(duì)照組相比*P < 0. 05，**P < 0. 01。4. 2甲醛致炎結(jié)果與模型對(duì)照組相比，強(qiáng)的松組在第2h、4h、48h、72h、96h均能抑 制甲醛所致足趾腫脹(P < 0.01,0. 05,0.01,0. 05,0. 05). QRCL組在2h顯示了一定的抑制 作用(P <0.05)后續(xù)時(shí)間里與模型組無顯著性差異(P>0。05)。QRCM組能夠抑制右足 的腫脹(與模型對(duì)照組相比P < 0. 05，0. 05，0. 05，0. 01，0. 05)。QRCH組的抑制作用更強(qiáng) (與模型對(duì)照組相比，P < 0. 01,0. 001,0. 001,0. 001,0. 001)結(jié)果見表2。表2奇壬醇對(duì)甲醛所致大鼠足趾腫脹的影響(X士SD，N = 10)
腫脹度
致炎后不同時(shí)間腫脹度值 與模型組相比*P < 0. 05，**P < 0. 01，_P < 0. 001。4.3角叉菜膠與模型對(duì)照組相比，QRCL組在4h、6h對(duì)腫脹足有明顯抑制(P <0.05，0.05)，QRCM組能夠抑制角叉菜膠所致足腫脹(P < 0. 05,0. 01,0. 01) QRCH組在 測(cè)量的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能明顯抑制足腫脹(P < 0. 001,0. 001)結(jié)果見表3。
表3奇壬醇對(duì)角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的影響(X士SD)
QRCM 100.205土 0.0518*0.254士 0.0388** 0.171 士 0.0533**
QRCII 100.203土 0.0572** 0.247士 0.0391*** 0.161土 0. 0337*林與模型對(duì)照組相比*P < 0. 05，**P < 0. 01，_P < 0. 001。(四)奇壬醇對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫功能的影響1.試驗(yàn)?zāi)康挠^察奇壬醇對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫功能的影響2.試驗(yàn)材料(同試驗(yàn)1)3.動(dòng)物分組與給藥(同試驗(yàn)1)4.方法4. INK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)將60只雄性大鼠按體重隨機(jī)分成6組(1)正常組(NOR)；⑵模型組(AA) ； (3) 氫化可的松預(yù)防組(C0RP，2mg/kg iv) ； (4)氫化可的松治療組(CORT，2mg/kgiv) ； (5)奇壬 醇預(yù)防組(KIRP，4mg/kg，ig) ； (6)奇壬醇治療組(KIRT，4mg/kg，ig)。各預(yù)防組注射佐劑當(dāng) 日開始給藥，各治療組第8天開始給藥。連續(xù)21天，正常組和模型組給予同體積蒸餾水ig。 除正常組外，各組均以弗氏完全佐劑0. ImL注射于右后足趾。末次給藥后，將大鼠全部處死 取脾細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞備用。1.NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)制備脾淋巴細(xì)胞，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按以下方案加樣效應(yīng)細(xì)胞孔脾細(xì)胞100 μ 1/孔(5\106/1111) +細(xì)胞培養(yǎng)基10(^1/孔靶細(xì)胞孔YAC-I細(xì)胞 100 μ 1/孔(1 X 105/ml) + 培養(yǎng)基 100 μ 1/孔實(shí)驗(yàn)孔YAC-I細(xì)胞100 μ 1/孔+脾細(xì)胞100 μ 1/孔放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)。取出離心15分鐘。棄上清，加ΜΤΤ100 μ 1/孔，震蕩混 勻。繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。離心，棄上清，加鹽酸-異丙醇ΙΟΟμΙ/孔，震蕩混勻。在酶標(biāo)儀上 選擇檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm的條件下測(cè)定OD值。計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性，公式如 下NK細(xì)胞殺傷活性=1_(實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)孔OD值)/靶細(xì)胞孔OD值X 100%2. AA大鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清和血清中細(xì)胞因子測(cè)定2. 1 IL-2的誘生制備的脾細(xì)胞ImL加入24孔培養(yǎng)板中，加入終濃度為5ug/mL的 ConA,培養(yǎng)24h，離心取上清，凍存待測(cè)。
2. 2 IL-I的誘生大鼠腹腔注入5ml Hank' s液，打開腹膜，用尖吸管抽取腹腔液， 離心。調(diào)整細(xì)胞濃度為2X106。加入24孔培養(yǎng)板中。30分鐘搖動(dòng)一次。培養(yǎng)2小時(shí)，使 細(xì)胞充分貼壁，棄去未貼壁的細(xì)胞，用不完全培養(yǎng)液洗兩次，加入完全培養(yǎng)液至Iml/孔。加 入LPS(終濃度為lOug/ml)于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24小時(shí)，離心收獲上清，-20°C凍存待測(cè)。2. 3細(xì)胞因子的測(cè)定實(shí)驗(yàn)前將反應(yīng)板置于室溫平衡，每孔各加入待測(cè)樣品 100 μ L ；將反應(yīng)板置37oC 120min ；用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4_6次，濾紙上印干。每孔中 加入第一抗體工作液50 μ L，混勻后置37oC 60min,洗板，每孔加底物工作液100 μ L，37oC 暗處反應(yīng)5-10min。加入1滴終止液混勻。492nm處測(cè)定OD值。3.統(tǒng)計(jì)采用spss 10. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果用(χ士 s)表示。4 結(jié)果4. 1奇壬醇對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響AA大鼠與正常大鼠相比NK細(xì)胞殺傷活性降低(P < 0. 001)。可的松治療組和預(yù) 防組對(duì)AA大鼠降低的NK活性沒有影響(與AA組相比，P>0. 05)。奇壬醇治療組和預(yù)防 組可以升高AA大鼠NK活性(與AA組相比P < 0. 01，P < 0. 001)。見表4。表4奇壬醇對(duì)AA大鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響
(五)奇壬醇對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)性反應(yīng)的影響
1.試驗(yàn)?zāi)康?br> 觀察奇壬醇對(duì)二硝基氯苯所致小鼠遲發(fā)型變態(tài)性反應(yīng)的影響。
2.試驗(yàn)材料
2. 1藥品及試劑 奇壬醇同試驗(yàn)一。
乙酰水楊酸(阿斯匹林)水溶片同試驗(yàn)一。
2，4-二硝基氯苯北京化工廠生產(chǎn)，批號(hào)760422，取0. 125g2，4-二硝基氯苯溶于
IOmL丙酮溶液中，配置成1.25%二硝基氯苯丙酮溶液。丙酮北京化工廠生產(chǎn)，批號(hào)20030320。2. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠50只，雌雄各半，體重18_22g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。3.試驗(yàn)方法3. 1動(dòng)物分組小鼠按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為①模型對(duì)照組②阿斯匹林組0. lg/kg體重
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③奇壬醇低劑量組(QRCL) :lmg/kg體重④奇壬醇中劑量組(QRCM) :2mg/kg體重⑤奇壬醇高劑量組(QRCH) :4mg/kg體重。奇壬醇各劑量組和阿司匹林組每日灌胃給藥一次，給藥體積為0.2ml/10g體重， 共給藥三天。模型對(duì)照組給予同體積蒸餾水灌胃。3. 2試驗(yàn)方法各組動(dòng)物背部注射1. 25%二硝基氯苯丙酮溶液0. 02ml/只，24小時(shí)后喂藥，喂藥 9天后，右耳涂布1.25% 二硝基氯苯丙酮溶液0. 03ml，左耳涂布同體積丙酮，38小時(shí)后，用
沖耳器沖下兩耳稱重。右耳片重量減去左耳片重量(mg)為腫脹度，并計(jì)算抑腫率(同試驗(yàn)一)。3. 3統(tǒng)計(jì)方法SpsslO. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。t_檢驗(yàn)進(jìn)行組 間比較。4.試驗(yàn)結(jié)果與模型對(duì)照組相比，奇壬醇各劑量組均能能明顯抑制二硝基氯苯所致遲發(fā)性變態(tài) 性反應(yīng)的耳廓腫脹(與模型對(duì)照組比，均P < 0. 001)。阿司匹林組也明顯抑制二硝基氯苯 所致遲發(fā)性變態(tài)性反應(yīng)的耳廓腫脹，與模型對(duì)照組比，P < 0. 01 (結(jié)果見表5)。表5奇壬醇對(duì)二硝基氯苯所致小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響 QRCM91.5士 0.241 林*39.75% QRCH 9 1.4士 0.420*** 42.17%注均與模型對(duì)照組比**Ρ < 0. 01，_Ρ < 0. 001。(六)奇壬醇對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎炎性因子的影響1.試驗(yàn)?zāi)康?. 1觀察奇壬醇對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞C0X-2、Bcl_2、Fas-L的影響1. 2觀察奇壬醇對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-I β、IL_2、IL_6、PGE等炎性因子的 影響2.實(shí)驗(yàn)方法制備大鼠AA模型將50只雄性大鼠隨機(jī)分成5組(1)正常組(normal,NOR) ； (2)模型組(AA) ； (3) 奇壬醇組(kirenol，KIR，2mg/kg，ig) ； (4)氫化可的松組(Cortisol，CORT，2mg/kg，ip) ； (5) 阿司匹林加環(huán)磷酰胺組(aspirin，cyclophosphamide, ASA+CTX, 100mg/kg, 7mg/kg, ig)。除正常組外，各組均以弗氏完全佐劑0. ImL注射于右后足跖皮下。各治療組第3天開始給藥， 連續(xù)21天，正常組和模型組給予同體積蒸餾水灌胃。注射佐劑前及末次給藥結(jié)束后分別測(cè) 量測(cè)左、右兩側(cè)足跖周長(zhǎng)，測(cè)量三次取平均值。末次給藥后將大鼠全部處死，取股動(dòng)脈血， 3000rpm離心，取上層血清并分裝于1. 5mLEP管中，置于-20°C冰箱凍存待用。取踝關(guān)節(jié)、肝、 脾、胃、胸腺、腎上腺以10 %甲醛固定，組織脫水，備用。制備大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片取方法1中的踝關(guān)節(jié)組織，以lmol/L EDTA液脫鈣3周后常規(guī)石蠟包埋、切片、做 HE染色，顯微鏡觀察。右踝關(guān)節(jié)切片做免疫組化染色。測(cè)定大鼠血清PGEC0X-2免疫組化染色測(cè)定大鼠血清細(xì)胞因子IL-I β、IL-2、IL-6Bcl-2免疫組化染色Fas-L免疫組化染色統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)值采用SPSS 12. 0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行，多組間比較采用One-Way ANONA分析。 統(tǒng)計(jì)結(jié)果以IT ±s形式表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.奇壬醇對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的影響1. 1奇壬醇對(duì)大鼠足腫脹指數(shù)的影響右側(cè)AA與NOR相比，足腫脹指數(shù)升高(P < 0. 01)，KIR、CORT、ASA+CTX與AA相比 降低(P < 0. 01)。左側(cè)=AA與NOR相比，足腫脹指數(shù)升高(P < 0. 01)，KIR、CORT、ASA+CTX 與AA相比降低(P < 0. 05)。見表6。表6奇壬醇對(duì)大鼠足腫脹指數(shù)的影響(η = 10，了 ±s) 注與正常組比較*ρ < 0. 05，**Ρ < 0. 01 ；與模型組比較ΔΡ < 0. 05，ΔΔΡ < 0.01 (下表同)1. 2奇壬醇對(duì)AA大鼠滑膜病理學(xué)改變的影響NOR 見圖6滑膜邊緣光滑，滑膜襯里層1 2層；襯里下層未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、成 纖維細(xì)胞及膠原纖維；軟骨細(xì)胞數(shù)目較多，陷窩密集。AA 右側(cè)滑膜細(xì)胞增生、肥大，呈絨毛狀突起，滑膜襯里層4 5層；襯里下層見
大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，脂肪空泡融合，可見大量成纖維細(xì)胞及膠原纖維，個(gè)別見纖維素樣壞死。左側(cè)滑膜細(xì)胞少量增生，滑膜襯里層2 3層；襯里下層見巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì) 胞浸潤(rùn)；軟骨細(xì)胞、陷窩細(xì)胞數(shù)目減少。KIR 右側(cè)滑膜細(xì)胞少量增生、肥大，個(gè)別處呈絨毛狀突起，滑膜襯里層2 3層； 襯里下層見少量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，脂肪空泡融合，見少量成纖維細(xì)胞、膠原纖維。左 側(cè)滑膜細(xì)胞增生不明顯，滑膜襯里層1 2層；襯里下層見少量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)， 未見血管新生。CORT 右側(cè)滑膜細(xì)胞少量增生、肥大，滑膜襯里層2 3層；襯里下層見少量巨噬 細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及少量成纖維細(xì)胞、膠原纖維，血管新生不明顯；軟骨細(xì)胞、陷窩細(xì)胞數(shù) 目減少。左側(cè)滑膜細(xì)胞增生、肥大，滑膜襯里層2 3層；襯里下層見少量巨噬細(xì)胞、淋巴 細(xì)胞浸潤(rùn)，少量成纖維細(xì)胞、膠原纖維；軟骨細(xì)胞、陷窩細(xì)胞數(shù)目改變不明顯。Asp+CTX 右側(cè)滑膜細(xì)胞少量增生、肥大，滑膜襯里層2 3層；襯里下層見少量 巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，血管新生不明顯；軟骨細(xì)胞、陷窩細(xì)胞數(shù)目減少不明顯。左側(cè)滑 膜細(xì)胞肥大，但增生不明顯；襯里下層見少量巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；軟骨細(xì)胞、陷窩細(xì) 胞數(shù)目減少不明顯。2.奇壬醇的抗炎作用2. 1奇壬醇對(duì)AA大鼠血清PGE2的影響AA 大鼠血清 PGE2OD 值 AA 與 NOR 相比升高(P < 0. 01) ；KIR, CORT、ASA+CTX 與 AA 相比降低(P < 0. 01)，且各給藥組之間無顯著性差異(P > 0. 05)。見表7。表7奇壬醇對(duì)AA大鼠血清PGE2的影響(η = 10，1 士 s ) 2. 1. 2奇壬醇對(duì)AA大鼠右踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞C0X-2表達(dá)的影響AA大鼠右踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞C0X-2平均積分光密度值A(chǔ)A與NOR相比升高(P < 0.01)；與AA相比，KIR、CORT均降低(P < 0.05，P < 0. 01)，兩組間比較無顯著性差異 (P > 0. 05)，ASA+CTX與AA相比降低，但無顯著性差異(ρ > 0. 05)。見表8。表8奇壬醇對(duì)AA大鼠滑膜細(xì)胞C0X-2表達(dá)的影響(η = 10，了 ±s ) 2. 1. 3奇壬醇對(duì)AA大鼠血清細(xì)胞因子IL-I β、IL_2、IL_6影響對(duì)AA大鼠血清IL-I β、IL-6的影響與NOR相比，AA IL-1 β、IL-60D值均升高 (P < 0. 01)；與 AA 相比，KIR、CORT、ASA+CTX IL-I β OD 值均降低(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01，ρ < 0. 05)，IL-60D值均降低(ρ < 0. 05)，且三組間無顯著性差異(ρ > 0. 05)對(duì)AA大鼠血清IL-2的影響ΑΑ與NOR相比，IL-20D值降低(P < 0. 01)；與AA相 比，KIR升高(ρ < 0. 01)，與NOR相比無顯著性差異(P > 0. 05)，CORT,ASA+CTX與AA相比 無顯著性差異(P > 0.05)，與NOR相比降低(ρ < 0.01)。見表9。表9奇壬醇對(duì)AA大鼠血清細(xì)胞因子的影響(η = 10，了 土S) 2. 2奇壬醇對(duì)AA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡蛋白Bcl_2、Fas-L表達(dá)的影響見表10。與NOR相比，AA Bcl_2平均積分光密度值升高(ρ < 0. 05)，F(xiàn)as-L降低(ρ < 0. 05)；與 AA 相比，KIR, ASA+CTX Bcl-2 平均積分光密度值降低(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01)， Fas-L升高(ρ < 0. 05，ρ < 0. 01)，且兩組間無顯著性差異(ρ > 0. 05)，CORTBc 1-2平均積 分光密度值降低(P < 0. 05), Fas-L平均積分光密度值降低，但無顯著性差異(ρ > 0. 05)。表10奇壬醇對(duì)AA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響(η= 10，了 ±s) (七)奇壬醇對(duì)大鼠體重及重要器官的影響1.奇壬醇對(duì)AA大鼠體重增長(zhǎng)的影響見表11。AA與NOR大鼠相比，體重增長(zhǎng)率降低(P < 0. 01) ；KIR與NOR相比，體重 增長(zhǎng)率無顯著變化(P > 0. 05) ；C0RT、ASA+CTX與NOR相比，體重增長(zhǎng)率降低(P < 0. 05)。表11奇壬醇對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)的影響(I 士S) 2.奇壬醇對(duì)AA大鼠重要器官的影響2. 1奇壬醇對(duì)AA大鼠胸腺、脾、腎上腺的影響鏡下見NOR大鼠胸腺皮質(zhì)區(qū)內(nèi)細(xì)胞密集，染色較深，髓質(zhì)區(qū)染色較淺。AA與NOR相 比，未見明顯改變。各給藥組與NOR相比，未見淋巴細(xì)胞數(shù)目減少。鏡下見NOR大鼠紅髓區(qū)大量染成深紅色的紅細(xì)胞，白髓區(qū)見大量染成藍(lán)紫色的淋 巴細(xì)胞。AA與NOR相比，未見明顯改變。各給藥組與NOR相比，未見淋巴細(xì)胞數(shù)目減少。鏡下見NOR大鼠腎上腺胞膜完整，細(xì)胞密集，胞膜外可見脂肪空泡。AA與NOR相 比，未見明顯改變。各給藥組與NOR相比，未見腺體細(xì)胞數(shù)目減少。2. 2奇壬醇對(duì)AA大鼠胃、肝臟的影響鏡下見NOR大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)正常，AA與NOR相比未見異常。各給藥組與NOR相比， 未見黏膜有出血點(diǎn)或水腫，未見黏膜變薄、腺體萎縮或數(shù)目減少，固有膜內(nèi)未見大量淋巴細(xì) 胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)。鏡下見NOR大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，門管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，小膽管未見增生。AA與NOR相 比未見明顯異常。各給藥組與NOR相比未見明顯異常。本發(fā)明上述試驗(yàn)例所述的奇壬醇為本發(fā)明實(shí)施例1所制備的奇壬醇，本發(fā)明其他 實(shí)施例制備的奇壬醇也進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)，并得出了具有相同趨勢(shì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明不
再一一復(fù)述。
權(quán)利要求
一種奇壬醇提取物的提取方法，其特征在于所述奇壬醇提取物經(jīng)過1)醇提取、2)有機(jī)酸酯萃取、3)柱色譜和4)重結(jié)晶過程得到，從生藥計(jì)收率為0.3～1％；所述奇壬醇提取物中奇壬醇含量為90～100％，優(yōu)選為95～99.8％，更優(yōu)選為98.5～99.5％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于1)醇提取將原料藥材菊科植物豨薟草，加入醇溶液回流提取，提取液過濾并減壓濃 縮至無醇味，得提取液；2)有機(jī)酸酯萃取將步驟1)得到的提取液，以水飽和過的有機(jī)酸酯進(jìn)行萃取，合并萃 取液，減壓濃縮，得浸膏狀物；3)柱色譜將步驟2)得到的浸膏狀物，加入熱水溶解，將此水溶液進(jìn)行大孔樹脂柱色 譜，以水洗脫至流出液無色，再以醇溶液進(jìn)行洗脫，收集含奇壬醇部分的洗脫液，合并含奇 壬醇部分的洗脫液，減壓濃縮，得浸膏；將所得浸膏，進(jìn)行硅膠柱色譜，以有機(jī)酸酯和醇或商代烴和醇洗脫，合并含奇壬醇部分 的洗脫液，將洗脫液減壓濃縮，得濃縮物；4)重結(jié)晶將步驟3)硅膠柱色譜后得到的濃縮物溶于醇中，加入有機(jī)酸酯，密閉放置， 析出晶體，過濾得到奇壬醇晶體。將得到的奇壬醇晶體，加入醇或脂肪酮，加熱溶解，重結(jié)晶，得到無色透明晶體，干燥得 到奇壬醇提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于步驟1)所述回流提取為提取2 4次，每次回流1 5小時(shí)，每次加入的提取溶劑體 積量與生藥的體積比為5 1 15 1 ；優(yōu)選為提取3次，每次2 3小時(shí)，每次加入的提 取溶劑體積量與生藥的體積比為8 1 12 1。步驟2)所述萃取為2 4次，每次使用的萃取溶劑量與提取液的比例為0. 1 2.0 1.0，濃縮至所得浸膏狀物比重為1.0 1.4;優(yōu)選為萃取3次，每次使用的萃取溶劑 量與提取液的比例為0.3 1.0 1.0，濃縮至所得浸膏狀物比重為1.1 1.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于步驟3)所述大孔樹脂柱色譜中以醇溶液洗脫為按照濃度為25 35%、45 65%， 68 75%的順序進(jìn)行梯度洗脫，優(yōu)選為按照濃度為30%、50%，70%的順序進(jìn)行梯度洗脫。所述硅膠色譜中以有機(jī)酸酯和醇洗脫或鹵代烴和醇洗脫均為洗脫液中兩種溶劑比例 27 32 1、18 22 1和8 12 1進(jìn)行梯度洗脫，優(yōu)選為30 1,20 1和10 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提取方法，其特征在于步驟3)大孔樹脂柱色譜中所述熱水溫度為30 90°C，所述熱水用量與浸膏的體積比 為1 6 1，所述大孔樹脂填料為AB-8、D201、HP20或DlOl樹脂，浸膏狀物與大孔樹脂的 重量比例為1 15 1 200;優(yōu)選為所述熱水溫度為50 60°C，所述熱水用量與浸膏的 體積比為2 4 1，所述大孔樹脂填料為AB-8樹脂，浸膏狀物與大孔樹脂的重量比例為 1 25 1 100 ；所述硅膠柱色譜為先將經(jīng)大孔樹脂柱色譜得到的浸膏與硅膠拌勻，浸膏與硅膠重量比 為1 1 1 3，浸膏與柱色譜硅膠重量比為1 4 1 30 ；優(yōu)選為浸膏與硅膠重量比 為1 1.2 1 2. 5，浸膏與柱色譜硅膠重量比為1 6 1 20。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取方法，其特征在于步驟4)中溶解濃縮物的醇和有機(jī)酸酯體積用量均為濃縮物質(zhì)量的2 3倍，析出晶體 并過濾后所得母液繼續(xù)放置析出晶體并過濾，重復(fù)上述操作3 5次，合并析出的晶體；溶解奇壬醇晶體的醇或脂肪酮體積用量均為奇壬醇晶體質(zhì)量的2 3倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求2 6任意一項(xiàng)所述的提取方法，其特征在于步驟2) 步驟4)所述有機(jī)酸酯為R1COOR2，其中R1和R2分別為相同或不同的直鏈烷 烴，優(yōu)選為1 4個(gè)碳的直鏈烷烴，更優(yōu)選為乙酸乙酯；步驟1) 步驟4)所述醇為直鏈烷烴醇，優(yōu)選為1 4個(gè)碳的直鏈烷烴醇，更優(yōu)選為甲 醇或乙醇；所述醇溶液濃度為20 90%，優(yōu)選為30 80% ；步驟3)所述商代烴為直鏈烷基商代烴，優(yōu)選為直鏈烷基氯代烴，更優(yōu)選為1 4個(gè)碳 的直鏈烷基氯代烴，最優(yōu)選為氯仿；步驟4)所述脂肪酮為R3COR4，其中民和禮分別為相同或不同的直鏈烷烴，優(yōu)選為1 4個(gè)碳的直鏈烷烴，更優(yōu)選所述脂肪酮為丙酮。
8.一種含有權(quán)利要求1 7任意一項(xiàng)所述提取方法提取的奇壬醇的治療免疫系統(tǒng)疾病 的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有奇壬醇提取物和可藥用輔料，奇壬醇提取 物中奇壬醇含量為90 100%，優(yōu)選為95 99. 8%，更優(yōu)選為98. 5 99. 5% ；所述奇壬 醇提取物按照權(quán)利要求1 8任意一項(xiàng)所述提取方法提取。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的治療免疫系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物 組合物劑型為片劑、膠囊、微丸、顆粒劑、緩釋劑、口服液、凍干粉針或小水針注射劑。
10.權(quán)利要求8或9所述藥物組合物在制備治療自身免疫性疾病和防止器官移植排斥 藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療自身免疫性疾病和防止臟器移植排斥的免疫抑制劑的藥物活性成份奇壬醇制備的技術(shù)方法以及制劑。該制劑包括作為藥物活性成份的奇壬醇及其相關(guān)的制劑。本發(fā)明所用的奇壬醇采用本發(fā)明特定的方法制備，操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)成本低，環(huán)境污染低，所制備的奇壬醇純度高達(dá)98％以上，收率高。采用本發(fā)明所提供的方法所制備的奇壬醇和制劑不僅穩(wěn)定性良好，安全可靠，而且質(zhì)量穩(wěn)定，治療效果顯著，特別是用于治療自身免疫性疾病和防止臟器移植排斥的藥物。
文檔編號(hào)A61P37/00GK101880217SQ20101016852
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者付宏征, 歐志強(qiáng), 錢瑞琴 申請(qǐng)人:北京大學(xué)