專(zhuān)利名稱(chēng)：肝移植細(xì)胞、測(cè)定及其應(yīng)用的制作方法
肝移植細(xì)胞、測(cè)定及其應(yīng)用本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US 02/19646，國(guó)際申請(qǐng)日為2002年6月21 日，進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)?zhí)枮椤?2816528. 4”，發(fā)明名稱(chēng)為“肝移植細(xì)胞、測(cè)定及其應(yīng)用” 的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。介紹機(jī)體依靠肝臟來(lái)發(fā)揮許多重要的功能，包括調(diào)節(jié)、合成以及分泌許多維持機(jī)體正 常狀態(tài)的重要物質(zhì)；存儲(chǔ)許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如糖原(葡萄糖)、維生素和礦物質(zhì)；提純、轉(zhuǎn)化和清 除廢物質(zhì)、藥物和毒素。然而，它獨(dú)特的特性和功能使得它容易受到許多因素的損害，這樣 的損害對(duì)于一個(gè)人的健康影響甚大。肝臟中最豐富和代謝最活躍的細(xì)胞是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。肝小葉是六邊形的，在周?chē)? 個(gè)門(mén)三聯(lián)體，每個(gè)包含一門(mén)靜脈分支、肝動(dòng)脈分支和膽管，它們都由一層肝細(xì)胞緊緊連接在 一起。肝細(xì)胞很少分裂，但它們具有對(duì)于合適的刺激會(huì)反應(yīng)性增殖的獨(dú)特能力，例如取走一 部分肝臟。這個(gè)過(guò)程包括限制性的增生，那通常使得肝臟恢復(fù)到在它原來(lái)重量的5-10%之 內(nèi)。肝臟具有在損傷后獨(dú)特的再生能力。這一過(guò)程開(kāi)始是“成熟”肝細(xì)胞的增殖；其他 細(xì)胞譜系包括膽管上皮細(xì)胞(BEC)和竇狀隙細(xì)胞稍后增殖。肝再生在部分肝切除術(shù)以及受 傷而損害了部分肝臟如病毒、毒素或缺血性損害之后起著重要的作用。然而，過(guò)度的損害會(huì) 達(dá)到“不可逆點(diǎn)”，然后正常組織就被疤痕組織替代。肝臟的再生能力也由于預(yù)先存在的或 重復(fù)發(fā)生的肝損害或疾病而削弱。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多表面決定簇是骨髓源性干細(xì)胞和能生長(zhǎng)為肝細(xì)胞的細(xì)胞所共有 的，包括嚙齒動(dòng)物中的c-kit、CD34和Thy-1，以及人類(lèi)中的c-kit和CD34(見(jiàn)Omori等，
(1997)HepatoloRy26 720-727 ；Lemmer 等(1998)T. Hepatol 29 450-454 ；Peterson 等
(1998)HepatoloRy27 :433_445 ；ibid(1999) Science 284 :1168_1170 ；Baumann 等(1999) Hepatology 30 :112_117 :Lagasse 等(2000) Nature Med 11:1229-1234)。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于 基因治療和肝細(xì)胞移植具有重要的臨床含義，這是兩種治療暴發(fā)性肝衰竭和肝臟遺傳代謝 紊亂的新方法。一些事實(shí)表明一些不成熟的肝細(xì)胞系可以BEC和肝細(xì)胞都不同。例如Fiorino等 (1998) In Vitro Cell Dev Biol Anim 34(3) :247_58 報(bào)導(dǎo)了分離了有條件轉(zhuǎn)化的肝祖細(xì) 胞系。Coleman 和 Presnell (1996)Hepatology 24(6) 1542-6 討論了增殖肝細(xì)胞培養(yǎng)物中 表型的轉(zhuǎn)變，這表明了成熟肝細(xì)胞有兩種不同分化的能力。卵細(xì)胞前體被認(rèn)為位于Herring 管或臨近膽管。對(duì)于卵細(xì)胞增殖來(lái)說(shuō)膽管細(xì)胞是需要的，表明它要么是前體的來(lái)源或它起 到支持或誘導(dǎo)的作用。Kubota等，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W002/28997揭示了一種ICAM-1表達(dá)前體 細(xì)胞群體。中間絲蛋白，特別是膽管特異性細(xì)胞角蛋白19(CK19)和肝細(xì)胞特異性H印Pari抗 原在肝器官形成過(guò)程中限定了肝前體細(xì)胞發(fā)展的進(jìn)程。小管肝細(xì)胞增殖共同含有肝細(xì)胞 和BEC的表型特征。在肝細(xì)胞分化的過(guò)程中，H印Pari抗原的表達(dá)增加，CK14和CK19的表 達(dá)丟失。相比之下，當(dāng)前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為管板細(xì)胞時(shí)，CK19在分化了的膽管表達(dá)增加，然而CK14和H印Pari抗原的表達(dá)丟失。所以肝前體細(xì)胞分化步驟的標(biāo)志就是獲得或丟失特異 性的表型特征。所述前體細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞譜系結(jié)果是導(dǎo)致一種標(biāo) 記的表達(dá)和其他標(biāo)記的丟失。早期的報(bào)導(dǎo)提出在活體中存在這樣兩種能力的前體細(xì)胞，見(jiàn) 于 Douarin(1975)Med. Biol. 53 :427_455 ；Shiojiri 等(1991)Cancer Res. 51 :2611_2620 ； Haruna 等(1996) Hepatology 23(3) :476_81 ;Tateno 禾口 Yoshizato(1996)Am J Pathol 149(5) : 1593-605 ；和 Haque 等(1996) Lab Invest 75(5) :699_705。白蛋白和 a-胎蛋白 的表達(dá)也是肝細(xì)胞有用的標(biāo)記。肝前體細(xì)胞的討論可見(jiàn)于Susick 等(2001)Ann. N. Y. Acad. Sci. 944 :398_419 ；美 國(guó)專(zhuān)利第5，576，207號(hào)；以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第20020016000號(hào)。為了進(jìn)一步描述肝前體細(xì)胞以及它們來(lái)源細(xì)胞的特征，關(guān)鍵是要有很好定義的模 型系統(tǒng)，它能夠解釋“環(huán)境”因素和調(diào)節(jié)細(xì)胞更新的內(nèi)在細(xì)胞因素之間復(fù)雜的相互作用，這 和特異性細(xì)胞表型的定義能夠使得成熟肝細(xì)胞生長(zhǎng)是一樣的。對(duì)于調(diào)節(jié)正在發(fā)育和成年肝 臟以及膽樹(shù)中細(xì)胞譜系的特性和分化因素的確認(rèn)和描述是有重要意義的。對(duì)于肝臟移植細(xì) 胞的進(jìn)一步描述有重要的科學(xué)和臨床意義。發(fā)明概述提供了分離和描述肝移植細(xì)胞(LEC)的方法，它是具有移植到肝臟和促進(jìn)分化肝 細(xì)胞增長(zhǎng)能力的前體細(xì)胞。所述細(xì)胞可根據(jù)前向掃描和自身熒光來(lái)分離，和/或通過(guò)特異 的細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。所述細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)的移植中有用，并可作為譜系和細(xì)胞特異 性產(chǎn)物的來(lái)源，包括對(duì)于確認(rèn)這些細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因有用的mRNA種型，以及作為發(fā) 現(xiàn)作用于它們的因子或分子的目標(biāo)。為肝移植細(xì)胞的增長(zhǎng)和分析，包括克隆分析，提供了體外和活體系統(tǒng)。促克隆形成 測(cè)定可在體外存在一飼養(yǎng)層間質(zhì)細(xì)胞時(shí)實(shí)施。所述細(xì)胞也可以在體外不存在飼養(yǎng)層時(shí)擴(kuò) 增。這些培養(yǎng)系統(tǒng)適合培養(yǎng)和描述肝移植細(xì)胞。在活體中所述細(xì)胞移植到肝臟，這種移植 可以通過(guò)FAH缺陷型動(dòng)物肝細(xì)胞的種群恢復(fù)(1 印opulation)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性的測(cè)試。已發(fā)現(xiàn)所述肝移植細(xì)胞在評(píng)價(jià)和肝特異性病毒相關(guān)的治療中有效，例如肝炎A、B、 C、D、E病毒等，尤其是人類(lèi)肝炎病毒。還發(fā)現(xiàn)所述細(xì)胞在培養(yǎng)肝細(xì)胞增殖的毒理學(xué)測(cè)試中 有用，并作為一種提供肝代謝副產(chǎn)物的方法，例如肝細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。附圖簡(jiǎn)述

圖1所示為人胎兒肝細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。圖1A顯示了人類(lèi)胎兒肝細(xì)胞前向掃 描、自身熒光和生存力(碘化丙錠)的染色，以及根據(jù)這些特征分為R1和R2群體。圖1B 顯示了 R2群體中亞群細(xì)胞抗原決定簇5E12和I型HLA的表達(dá)。圖2所示為人胎兒肝細(xì)胞群體的異質(zhì)性。圖2A和2B顯示了 R2群體白蛋白和CK19 的異類(lèi)表達(dá)，在5E12表達(dá)分類(lèi)之前。圖3所示為人胎兒肝細(xì)胞表型分析。圖3A-3D顯示了人類(lèi)胎兒肝細(xì)胞的表型分析。圖4所示為人胎兒肝臟E-鈣粘著蛋白+HLA 或EpCAM+HLA 或CD49_f+HLA<s識(shí)別與 5E12+HLA 相同的群體，顯示了來(lái)自帶有5E12、EpCAM、⑶49f、E-鈣粘著蛋白和HLA的R2群 體的細(xì)胞染色。圖4A、4D和4G顯示了 5E12對(duì)比I型HLA染色。多邊形區(qū)域表明了用來(lái)挑 選5E12+、HLA低LEC的門(mén)。圖4B、4E和4H顯示了分別利用E-鈣粘著蛋白；EpCAM和CD49f相應(yīng)的圖，如x軸。圖4C、4F和41顯示了在圖4B、4E和4H中門(mén)控表達(dá)5E12的群體分析。 數(shù)據(jù)表明5E12、EpCAM、E-鈣粘著蛋白和⑶49f之間的染色的等價(jià)。圖5所示為兩周后培養(yǎng)物中的R25E12+HLA 克隆。圖5A-5F顯示了來(lái)源于體外培 養(yǎng)兩個(gè)星期后的人類(lèi)胎兒肝LEC群體上白蛋白、a-胎蛋白(afp)和CK19的染色。圖6所示為R25E12+HLA 肝祖細(xì)胞的移植。圖6A和6B顯示了循環(huán)的人類(lèi)a -1-抗 胰蛋白酶(AAT) (9A)和來(lái)自N0D-SCID小鼠的血清白蛋白(ALB) (9B)的水平，其中這些小鼠 是接受了總肝細(xì)胞、分選的總肝細(xì)胞或分選的R25E12+HLA 細(xì)胞移植6周后的小鼠。這些數(shù) 據(jù)表明了來(lái)自LEC的功能性肝細(xì)胞的移植和發(fā)生。圖7所示為N0D/SCID肝臟中移植的huFL細(xì)胞的持續(xù)的huALB表達(dá)。圖7A-7F顯 示了在接受移植6周后的N0D-SCID小鼠肝臟里移植的人類(lèi)胎兒肝細(xì)胞中檢測(cè)到人類(lèi)ALB 或CK19蛋白質(zhì)。圖10A-10F是來(lái)自單個(gè)肝臟的連續(xù)部分。這些數(shù)據(jù)顯示LEC能夠產(chǎn)生肝 細(xì)胞。人類(lèi)白蛋白表達(dá)的地方也表達(dá)CK19。圖8所示為人成人肝臟的亞細(xì)胞群體的分離。圖8A顯示了人類(lèi)成年R1和R2群 體肝細(xì)胞的染色；以及R2群體5E12、HLA的染色。圖8B所示為分泌的人血清蛋白質(zhì)的 ELISA(BMS6上2周，每個(gè)群體分選5000細(xì)胞)顯示了在活體培養(yǎng)后白蛋白和a-1-抗胰蛋 白酶的表達(dá)。圖9所示為人成人肝臟細(xì)胞的表型分析。圖9A-9H顯示了人成年肝組織的分析， 如圖3對(duì)于胎兒細(xì)胞的描述。圖10A-10H顯示了胎兒和成年肝臟中LEC的染色。圖11所示為肝移植細(xì)胞在無(wú)基質(zhì)的培養(yǎng)物上的體外表達(dá)，顯示了培養(yǎng)兩周后的 肝移植細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，其中這些細(xì)胞成長(zhǎng)為典型的單層上皮細(xì)胞。表2所示為分選后，人肝臟移植細(xì)胞(LEC)的有限稀釋分析。表3所示為用免疫染色篩選LEC(ckl9+/Alb+)，顯示了通過(guò)免疫染色對(duì)LEC進(jìn)行篩 選。具體實(shí)施方案的描述分離和標(biāo)記肝移植細(xì)胞(LEC)，并當(dāng)活體移植時(shí)證明是能夠發(fā)展為肝細(xì)胞的前體 細(xì)胞。用作肝移植細(xì)胞的濃縮細(xì)胞群體在移植中是有用的，會(huì)提供一種恢復(fù)肝臟功能的受 體；對(duì)于藥物篩選；體外和活體中的肝發(fā)育模型；體外和活體中的篩選分析來(lái)限制生長(zhǎng)和 分化的因素，并標(biāo)記參與肝臟發(fā)育和調(diào)節(jié)的基因；等等。天然的細(xì)胞可以用于這些目的，或 它們可被遺傳的修飾而提供改變了的能力。發(fā)育為再生肝細(xì)胞的能力可以在活體中測(cè)定，例如在免疫缺陷的動(dòng)物，如RAG、 SCID、裸鼠(nude)等，在FAH-/-動(dòng)物中或被擊昏的帶有異源的、同源的或異種供體細(xì)胞的 免疫缺陷型動(dòng)物中，通過(guò)這個(gè)系統(tǒng)中這些供體細(xì)胞提供功能性的能力。FAH的表達(dá)是一種人 類(lèi)遺傳性障礙的缺陷，酪氨酸血癥類(lèi)型1。FAH的功能由所移植的肝細(xì)胞提供?；蛘?，也可 用體外法來(lái)測(cè)定生物功能，通過(guò)在肝細(xì)胞產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)合適的生長(zhǎng)因子和/或細(xì)胞活 素。當(dāng)在培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，受試細(xì)胞生長(zhǎng)為單層，有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞可根據(jù)生存力、前向掃描、自身熒光和細(xì)胞表面標(biāo)記物的 表達(dá)來(lái)富集。例如在用碘化丙錠(PI)染色后死亡的細(xì)胞染色明亮因?yàn)樗鼈儾荒芘懦緞?然而有生存能力的細(xì)胞當(dāng)用碘化丙錠染色時(shí)是陰性至很低。重要的細(xì)胞在PI 亞群中被發(fā)現(xiàn)，在非常亮和陰性之間，如圖1所示。前向掃描也可以用來(lái)對(duì)重要細(xì)胞門(mén)控，它們有較高 的前向掃描，如圖1顯示。在高前向掃描的群體中，PI 細(xì)胞、肝移植細(xì)胞是陽(yáng)性和/或陰性選擇性的表達(dá)特 異性標(biāo)記物。通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析和篩分細(xì)胞表面標(biāo)記物，如那些下面描述的，可以分 選有生存力的細(xì)胞。一種這樣的重要陽(yáng)性選擇標(biāo)記物是5E12表位。其他的標(biāo)記物，可以 和5E12交換的應(yīng)用來(lái)進(jìn)行陽(yáng)性選擇，包括ep-canue-鈣粘著蛋白和⑶49f。優(yōu)選的所述細(xì) 胞也選擇來(lái)低表達(dá)I型HLA抗原，例如HLA-A、HLA-B和HLA-C。其他的標(biāo)記物，可以和I型 HLA抗原交換的應(yīng)用，包括CD38和CD54。另外，所述細(xì)胞也可以被陰性選擇或標(biāo)記為陰性 的表達(dá)⑶117和/或⑶14。雖然不通常用來(lái)選擇，細(xì)胞質(zhì)蛋白白蛋白和CK19都表達(dá)是LEC 的特點(diǎn)。定義在對(duì)以下提供的標(biāo)記物和細(xì)胞的定義中，所述名詞典型的將按照人類(lèi)蛋白質(zhì)、細(xì) 胞等定義，其中人類(lèi)細(xì)胞優(yōu)選的是所述發(fā)明的實(shí)施方案。那些文中的技術(shù)員明白其他哺乳 動(dòng)物也可以用作細(xì)胞的來(lái)源，將利用那個(gè)群體同源的相似物和功能上相關(guān)的標(biāo)記物從這樣 的非人類(lèi)群體選擇細(xì)胞。肝臟移植。如這里所應(yīng)用的，名詞“肝臟移植細(xì)胞”指一種細(xì)胞群體，當(dāng)移植到動(dòng) 物時(shí)，成長(zhǎng)為成熟肝細(xì)胞。肝前體細(xì)胞發(fā)育的潛力可以通過(guò)功能性和表型的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)定。 功能上，肝細(xì)胞被特征性的描述為能夠彌補(bǔ)FAH缺陷，并會(huì)表達(dá)肝特異性蛋白質(zhì)，包括白蛋 白、a-1-抗胰蛋白酶、a-胎蛋白等等。肝細(xì)胞功能上還特征性的描述為能夠被肝炎病毒 感染，例如肝炎病毒A (HAV)；肝炎病毒B(HBV)；肝炎病毒C(HCV)；肝炎病毒D(HDV)；肝炎病 毒E(HEV)；等等。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞也能夠成長(zhǎng)為BEC，它在功能上被特征性的描述為 表達(dá)細(xì)胞角蛋白19，并在單層細(xì)胞間形成多細(xì)胞管道和膽小管。陽(yáng)性和陰性染色。所述受試的肝移植細(xì)胞特征性的描述為表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記物。 雖然在文中提到細(xì)胞的特定標(biāo)記物是“陽(yáng)性”或“陰性”是很普通的，但實(shí)際的表達(dá)水平是 定量的特性。所述細(xì)胞表面分子的數(shù)量可對(duì)數(shù)級(jí)的變化，但仍特征性的描述為“陽(yáng)性”。文 中那些技術(shù)人員也明白染色為陰性的細(xì)胞，例如一種標(biāo)記物特異性試劑的結(jié)合水平并沒(méi)發(fā) 現(xiàn)和對(duì)照組不同，例如一種同型匹配的對(duì)照；會(huì)表達(dá)少量標(biāo)記物。染色水平的特性使得細(xì)胞 群體之間有微妙的變化。細(xì)胞的染色密度可以通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法監(jiān)測(cè)，其中激光檢測(cè)熒光色素的定量水 平(它和被特異性試劑結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物的量是成比例的，例如抗體)。流式細(xì)胞計(jì) 數(shù)，或FACS也可以用來(lái)根據(jù)和特異性試劑結(jié)合的密度來(lái)分離細(xì)胞群體，和其他的參數(shù)一 樣，如細(xì)胞大小和光散射。雖然染色的絕對(duì)水平會(huì)和特定的熒光色素和反應(yīng)制劑不同，數(shù)據(jù) 可以標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照。為了標(biāo)準(zhǔn)化分類(lèi)為對(duì)照，每個(gè)細(xì)胞記錄為擁有特定染色密度的數(shù)據(jù)點(diǎn)。這些數(shù)據(jù) 點(diǎn)根據(jù)對(duì)數(shù)范圍顯示，其中測(cè)定的單位是任意的染色密度。在一個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)樣品中 的最亮染色細(xì)胞的密度會(huì)比未染色細(xì)胞多41og。當(dāng)以這種方式顯示時(shí)，落在染色密度最高 log中的細(xì)胞顯然是明亮的，然而那些在最低密度中的是陰性的。所述“低”陽(yáng)性染色細(xì)胞 有比同型匹配對(duì)照亮度高的染色水平，但不及通常在所述群體中發(fā)現(xiàn)的最明亮染色細(xì)胞密 集。低陽(yáng)性細(xì)胞擁有和所述樣品的陰性以及明亮染色陽(yáng)性細(xì)胞相比的獨(dú)特性質(zhì)。一種可供選擇的對(duì)照可利用一種在其表面有限定密度標(biāo)記物的底物，例如一種人造珠或細(xì)胞系，它 們提供了密度的陽(yáng)性對(duì)照。前體細(xì)胞的來(lái)源。用作細(xì)胞來(lái)源的體外細(xì)胞群體包括新鮮的或冷凍的肝細(xì)胞群 體、膽管細(xì)胞群體或胰腺細(xì)胞群體等等，它們是從胚胎、胎兒、兒童或成年人組織獲得的。所 述方法還包括細(xì)胞分離的富集或提純步驟，通過(guò)對(duì)于其他細(xì)胞特異性標(biāo)記物的陽(yáng)性選擇。 所述前體細(xì)胞可從任何哺乳動(dòng)物物種獲得，例如人類(lèi)、馬、牛、豬、狗、貓、嚙齒類(lèi)動(dòng)物例如小 鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物等等。R2群體。包含如上所述肝移植前體細(xì)胞的細(xì)胞群體可以根據(jù)前向掃描、自身熒光 和重要染劑(如碘化丙錠，7-AAD等)存在時(shí)的生存能力來(lái)分離。這里所應(yīng)用的R2群體，指 的是活的、高前向掃描、自身熒光的細(xì)胞群體，如圖1顯示。在用重要染劑碘化丙錠(PI)染 色后所述重要細(xì)胞染色不是很明亮，例如它們是(PI )。這個(gè)群體的細(xì)胞富集為肝移植前 體細(xì)胞，也包含一些污染細(xì)胞，它們可能是成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等等。5E12。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞對(duì)于5E12抗原是陽(yáng)性表達(dá)的。5E12單克隆抗體最 先是制備用來(lái)針對(duì)人神經(jīng)細(xì)胞的。認(rèn)識(shí)到所述抗體是一種大約是125kDa的蛋白質(zhì)。產(chǎn)生 5E12單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系已由美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)于1999年11月30日 保藏，登錄號(hào)為PTA-994(見(jiàn)審理中的專(zhuān)利申請(qǐng)60/119725)。Ep-cam。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)印-cam。這種抗原也已知為上皮面抗原 (ESA)和上皮糖蛋白2(EGP-2)。Ep-Cam作為媒介調(diào)節(jié)Ca2+獨(dú)立同型細(xì)胞-細(xì)胞之間的黏附。 活體中，Ep-CAM的表達(dá)和上皮增殖的增加相關(guān)聯(lián)，并和細(xì)胞分化負(fù)相關(guān)。已經(jīng)證明Ep-CAM 對(duì)于許多組織都有調(diào)節(jié)上皮組織形成的功能。所述序列由Szala等揭示(1990)Proc. Nat. Acad. Sci. 87 :3542_3546?？贵w是商業(yè)應(yīng)用的，例如來(lái)自 BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA,目錄號(hào) 347197。E_鈣粘著蛋白。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)e_鈣粘著蛋白。E-鈣粘著蛋白 是一種120kDa的位于上皮細(xì)胞黏附連接處跨膜糖蛋白。它通過(guò)5個(gè)細(xì)胞外的鈣-結(jié)合重復(fù) 區(qū)域形成鈣依賴(lài)性細(xì)胞-細(xì)胞黏附。細(xì)胞表面的表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞分選，以及由特異的細(xì)胞 外區(qū)域所產(chǎn)生的親同種抗原相互作用特異性。所述的細(xì)胞外區(qū)域?qū)⑺图?xì)胞質(zhì)成分連 接素或片球蛋白(PG)相連，結(jié)果和a-連接素以及肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相連?？贵w是商業(yè) 上可獲得的，例如來(lái)自 BD Biosciences, Pharmingen, SanDiego, CA,目錄號(hào) 610181。CD49f。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD49f。整合素a-6 (CD49f)是150kDa 的跨膜蛋白，它是由上皮細(xì)胞主要表達(dá)的整合素雜二聚體的一部分。a-6和整合素0 1鏈 相連而形成VLA-6，并和整合素3 4鏈相連而形成層粘蛋白和韁蛋白受體。CD49f主要表達(dá) 于T細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，周?chē)窠?jīng)細(xì)胞和胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞。它的序列 見(jiàn)于Tamura等(1990) J. Cell Biol. Ill :1593_1604?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來(lái)自BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA,巨錄號(hào) 557511。I型HLA.所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞低陰性表達(dá)I型HLA。I型HLA位點(diǎn)的例子 為HLA-A、-B和-C。所述I型MHC抗原是多形的2-鏈細(xì)胞表面糖蛋白。I型抗原的輕 鏈?zhǔn)?-2-微球蛋白。重鏈的分子量是44，000，并由90個(gè)氨基酸的3N-末端的細(xì)胞 外區(qū)域，一個(gè)較小的疏水膜-跨越片段和一個(gè)較小的親水細(xì)胞內(nèi)C-末端區(qū)域組成，見(jiàn) Malissen等(1982)Proc. Nat. Acad. Sci. 79 :893_897。抗體是商業(yè)上可獲得的，例如來(lái)自 BDBiosciences, Pharmingen, San Diego, CA,目錄號(hào)557349，它與人型主要組織相容性I型抗 原的單形抗原決定簇起反應(yīng)。⑶54。由成年肝組織分離而得的肝移植細(xì)胞陰性表達(dá)⑶54。從胎兒組織分離來(lái)的 細(xì)胞可能是陽(yáng)性或陰性表達(dá)⑶54，但通常沒(méi)有⑶54陽(yáng)性細(xì)胞明亮，例如5E12-群體中發(fā)現(xiàn) 的細(xì)胞。⑶54也被知道為細(xì)胞間黏附分子(ICAM-I)，90 (kDa)。所述⑶54抗原是白細(xì)胞功 能相關(guān)抗原-1(CD1 la/CD18)的配體，并同時(shí)影響白細(xì)胞LFA-I-依賴(lài)黏附到內(nèi)皮細(xì)胞和包含細(xì)胞-細(xì)胞間 接觸的免疫功能。所述CD54抗原可在成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上被誘導(dǎo)。在正常 的組織中，CD54抗原的密度在內(nèi)皮中最高，并由于各種因素而增加，例如暴露于細(xì)胞活素、 炎癥以及腫瘤轉(zhuǎn)化。ICAM-I的核苷酸序列由Simmons等揭示(1988) Nature 331:624-627， 1988?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來(lái)自BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA,目 錄號(hào) 347977。⑶117。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陰性表達(dá)⑶117。⑶117識(shí)別酪氨酸激酶c_Kit受 體。這個(gè)受體已經(jīng)特定的用干細(xì)胞包含進(jìn)來(lái)，包括造血干細(xì)胞。同樣也存在多種同源異性 的c-Kit，這是由于交替的mRNA拼接、蛋白水解以及在特定的細(xì)胞類(lèi)型中應(yīng)用隱藏的內(nèi)部 助催化劑而導(dǎo)致的結(jié)果。結(jié)構(gòu)上，c-Kit細(xì)胞外包含5個(gè)免疫球蛋白樣的區(qū)域，以及一個(gè)被 細(xì)胞內(nèi)插入的77氨基酸分為兩個(gè)部分的催化區(qū)域；所述的序列見(jiàn)于Yarden等(1987)_ J. 6(11) :3341-3351?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來(lái)自 BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA,目錄號(hào) 340529。⑶14。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陰性表達(dá)⑶14。⑶14是單-拷貝的基因編碼2種 蛋白質(zhì)形式50_至55-kD糖基磷脂酰肌醇-錨著的膜蛋白(mCD14)和單核細(xì)胞或肝來(lái)源的 缺乏錨的可溶性血清蛋白質(zhì)(SCD14)。兩種分子對(duì)于脂多糖(LPS)-依賴(lài)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是關(guān)鍵 的，s⑶14使得缺乏mCD14的細(xì)胞具有LPS敏感性。所述序列見(jiàn)于Govert等(1988) Science 239 :497-500o 抗體是商業(yè)上可獲得的，例如來(lái)自 BDBiosciences，Pharmingen，San Diego, CA。⑶34。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陰性或陽(yáng)性表達(dá)⑶34。⑶34是選擇性的表達(dá)于人 類(lèi)造血前體細(xì)胞上的分子質(zhì)量大約為IlOkD的單基因細(xì)胞表面抗原。所述基因除了由造血 前體細(xì)胞表達(dá)外還由小管內(nèi)皮表達(dá)，它是單-鏈105-120kDa重0-糖基化跨膜糖蛋白。所 述序列見(jiàn)于Simmons等(1992) J. Immun. 148 :267_271?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來(lái)自 BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA.，巨錄號(hào) 550760。⑶38。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陰性或陽(yáng)性表達(dá)⑶38，但通常沒(méi)有⑶38陽(yáng)性細(xì)胞 明亮，例如5E12-群體中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。CD38是一種帶有一條較短的N-末端細(xì)胞質(zhì)尾和 4C-末端細(xì)胞外N-糖基位點(diǎn)的300-氨基酸的II型跨膜蛋白。所述序列見(jiàn)于Jackson等 (1990) J. Immun. 144 :2811_2815。所述標(biāo)記物通常和淋巴細(xì)胞、原始粒細(xì)胞以及幼紅細(xì)胞相 關(guān)聯(lián)。抗體是商業(yè)上可獲得的，例如來(lái)自BDBiosciences，Pharmingen，San Diego, CA,目錄 號(hào) 347680。肝移植細(xì)胞的分離所述受試的肝移植細(xì)胞，通過(guò)用來(lái)富集有所述特征細(xì)胞的技術(shù)，從復(fù)雜的細(xì)胞混 合物中分離出來(lái)。例如，一種群體的細(xì)胞可以選自R2群體，來(lái)表達(dá)5E12、e_鈣粘著蛋白、印-cam和⑶49f中的一種或幾種。所述細(xì)胞任選的選擇性的低或陰性表達(dá)HLAI型抗原(這 里稱(chēng)為HLAffi)。⑶45和⑶38可與HLA交換應(yīng)用。為了將細(xì)胞從組織中分離出來(lái)，可應(yīng)用一種合適的溶液來(lái)分散或懸浮。這樣的溶 液通常是一種平衡鹽溶液，例如生理鹽水、PBS、HankS平衡鹽溶液等等，合適的用胎兒小牛 血清或其他天然的發(fā)生因子補(bǔ)充，和一種可接受的低濃度緩沖液協(xié)同作用，通常是5-25mM。 合適的緩沖液包括HEPES、磷酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液等等。所述的受試細(xì)胞是大的母細(xì)胞，所以初始分離可通過(guò)文中所知的各種方法選擇母 細(xì)胞，包括淘析、Ficoll-Hypaque或應(yīng)用前面數(shù)據(jù)和鈍散射來(lái)門(mén)控母細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù) 分析。所述受試細(xì)胞群體的分離然后將應(yīng)用親合分離以提供相當(dāng)純凈的群體。親合分 離的技術(shù)包括應(yīng)用涂上_抗體的磁珠進(jìn)行的磁分離，親合色譜法，與單克隆抗體結(jié)合的細(xì) 胞毒試劑或和單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用，例如補(bǔ)體和細(xì)胞毒素，以及用附著在固體基質(zhì)上的抗 體“淘選”例如平皿培養(yǎng)或其他合適的技術(shù)。提供精確分離的技術(shù)包括熒光活化細(xì)胞分檢 器，它可有不同程度的摻雜，例如多種顏色的通道、小角度和鈍光散射檢測(cè)通道、阻抗通道 等等。可以通過(guò)應(yīng)用和死亡細(xì)胞相關(guān)的染色(碘化丙錠，7-AAD)來(lái)篩選去除死亡細(xì)胞。任 何對(duì)于所選細(xì)胞的生存能力沒(méi)有不合適損害的技術(shù)都可以運(yùn)用。所述親和劑可以是上述細(xì)胞表面分子特定的受體或配體?？贵w配制的詳細(xì)情況以 及它們合適的應(yīng)用為特定結(jié)合成分對(duì)于文中的那些技術(shù)員來(lái)說(shuō)是熟知的。將抗體應(yīng)用為親和試劑有特定的意義。合適的，這些抗體作為標(biāo)記物在分離中應(yīng) 用。標(biāo)記物包括可以用于直接分離的磁珠，可以用和載體結(jié)合的親和素或鏈霉親和素去除 的生物素，可以用于熒光活化細(xì)胞分檢器的熒光色素等等，使得可以方便的分離特定的細(xì) 胞類(lèi)型。有用的熒光素包括藻膽蛋白，例如藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白、熒光黃和德克薩斯紅。 每種抗體常常用一種不同的熒光素標(biāo)記，這使得可以獨(dú)立的分檢每種標(biāo)記物。所述抗體加入到細(xì)胞懸浮液，保溫一段時(shí)間足以結(jié)合所應(yīng)用的細(xì)胞表面抗原。通 常保溫至少大約5分鐘，少于大約30分鐘。理想的在反應(yīng)混合物中含有足夠濃度的抗體，使 得分離的效率不為抗體的缺乏而限制。通過(guò)滴定決定合適的濃度。細(xì)胞分離的培養(yǎng)基可以 是任何維持細(xì)胞生存能力的培養(yǎng)基。一種優(yōu)選的培養(yǎng)基是包含0. 1-0. 5% BSA的磷酸緩沖 鹽溶液。多種培養(yǎng)基是商業(yè)上可獲得的，并可根據(jù)細(xì)胞的特性應(yīng)用，包括Dulbecco改良的 Eagle培養(yǎng)基(dMEM)、Hank，堿性鹽溶液(HBSS)、Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液(dPBS)、RPMI、 Iscove培養(yǎng)基、含有5mM EDTA的PBS等等，常常用小牛胎兒血清、BSA、HSA等等補(bǔ)充。所述標(biāo)記的細(xì)胞然后根據(jù)上述的表型分離。所述分離出來(lái)的細(xì)胞可以在任何合 適的保持細(xì)胞生存能力的培養(yǎng)基中收集，通常在收集試管的底部有一墊層血清。多種培養(yǎng) 基是商業(yè)上可獲得的，并可根據(jù)細(xì)胞的特性應(yīng)用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、IsC0Ve培養(yǎng) 基等等，常常用小牛胎兒血清補(bǔ)充。高度富集肝移植活性的組合物以這種方式獲得。所述受試的群體是細(xì)胞組合物的 50%或更多，通常是細(xì)胞組合物的90%或更多，可以大約是肝細(xì)胞群體的95%或更多。所 述富集的細(xì)胞群體可以直接應(yīng)用，或可以在液態(tài)氮溫度冷凍并存儲(chǔ)長(zhǎng)時(shí)間，解凍并能再使 用。所述細(xì)胞通常存儲(chǔ)在10% DMS0、50% FCS、40% RPMI 1640培養(yǎng)基。一旦解凍，所述細(xì) 胞可以通過(guò)應(yīng)用生長(zhǎng)因子和/或間質(zhì)細(xì)胞繁殖和分化來(lái)擴(kuò)增。
所述方法在肝細(xì)胞功能的體外或活體模型的發(fā)展中是有用的，在基因治療和人工 器官的構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)中也是有用的。發(fā)育中的肝細(xì)胞作為一種新的生長(zhǎng)因子和藥物的寶貴來(lái) 源，也充當(dāng)病毒或疫苗(例如肝炎病毒)產(chǎn)物，也用作研究肝寄生蟲(chóng)或在肝中有一發(fā)展階段 的寄生蟲(chóng)，(例如瘧疾生物)，也用作藥物和工業(yè)化合物的體外毒性和代謝實(shí)驗(yàn)，也用作基 因治療實(shí)驗(yàn)(由于肝臟是機(jī)體最大的脈管器官)，也用作構(gòu)建人工移植的肝臟，也用作肝誘 變和癌發(fā)生的研究。功能測(cè)定一項(xiàng)用來(lái)測(cè)定肝祖細(xì)胞在活體中能力的重要分析是遺傳性酪氨酸血癥1型的動(dòng) 物模型，這是一種嚴(yán)重的常染色體隱性代謝疾病，它會(huì)影響肝臟和腎臟，它的病因是缺乏延 胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)。用2-(2-硝基-4-三氯-甲苯基)-1，3-環(huán)己二酮(NTBC) 處理小鼠純合子被破壞的FAH基因(FAH-/-)消除了新生致死氯并恢復(fù)了肝和腎的功能。所 述的動(dòng)物模型，例如由 Grompe 等描述(1995) Nature Genetics 10 453-460 ；Overturf 等 (1996)Nat. Genet. 12(3) :266_73 ；等等。在所述發(fā)明的一種實(shí)施方案中，用肝移植細(xì)胞重構(gòu)FAH小鼠，可以用肝祖細(xì)胞或 包含檢測(cè)標(biāo)記物的小鼠細(xì)胞。例如所述細(xì)胞可以導(dǎo)入小鼠，它可以是用放射線處理過(guò)的小 鼠，使得初始重構(gòu)肝臟，然后為了選擇性的肝臟重構(gòu)將NTBC取出?；蛘?，NTBC可以在導(dǎo)入 肝移植細(xì)胞后立即取出。所述的重構(gòu)動(dòng)物對(duì)于篩選疫苗和抗肝炎病毒的藥物是有用的，例 如肝炎病毒A、B、C、D、E ；生物活性藥物的代謝和毒性試驗(yàn)；等等。體外細(xì)胞培養(yǎng)所述富集的細(xì)胞群體在體外可以在各種培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。當(dāng)在培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，所述 受試細(xì)胞生長(zhǎng)為單層，有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)基可以是液態(tài)或半液態(tài)的，例如包含瓊 脂、甲基纖維素等等。所述細(xì)胞群體可以合適的懸浮在適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基中，例如Iscove 改進(jìn)的DMEM或RPMI-1640，常常用小牛胎兒血清(大約5-10% )、L-谷氨酰胺、硫醇、特定 的是2-巰基乙醇以及抗體例如青霉素和鏈霉素來(lái)補(bǔ)充。所述受試細(xì)胞可以在含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的共培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。適合應(yīng)用為飼養(yǎng)層細(xì)胞 的間質(zhì)細(xì)胞包括骨髓間質(zhì)細(xì)胞例如SYS-I細(xì)胞系，F(xiàn)FS-I成纖維細(xì)胞系等等。其他可以用 作飼養(yǎng)層細(xì)胞的包括來(lái)源于人類(lèi)或其他動(dòng)物的成纖維細(xì)胞；來(lái)源于相同物種如肝，通過(guò)原 始培養(yǎng)的胎兒成纖維細(xì)胞；STO成纖維細(xì)胞系；等等。這些細(xì)胞層為培養(yǎng)基提供了未定義的 成分，并會(huì)抑制多能細(xì)胞的分化。存在飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)對(duì)于無(wú)性培養(yǎng)特別有用，例如其中 單個(gè)祖細(xì)胞擴(kuò)增為一群體。可應(yīng)用體外培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是克隆產(chǎn)生培養(yǎng)的細(xì)胞，進(jìn)行功能性測(cè)定。例如，評(píng) 定培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)肝特異性蛋白的能力，包括白蛋白和α-1抗胰蛋白酶。表達(dá)可利用任何合 適的形式，包括培養(yǎng)物上層清液中蛋白質(zhì)存在的RT-PCR、ELISA，等等。也可以評(píng)定培養(yǎng)細(xì) 胞表達(dá)膽道蛋白的能力，例如CK19。所述培養(yǎng)物包括細(xì)胞有反應(yīng)的生長(zhǎng)因子。生長(zhǎng)因子如這里定義的，是在培養(yǎng)物中 或在完整的組織中，通過(guò)特異性的作用于跨膜受體能夠提高細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和/或分化的 分子。生長(zhǎng)因子包括多肽和非-多肽因子?？梢詰?yīng)用于培養(yǎng)受試細(xì)胞的特異生長(zhǎng)因子括 但不局限于肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/散射因子(HGF)、EGF、TGFa、酸性FGF(見(jiàn)Block等J. Biol Chem, 1996 132 :1133_1149)。選擇特定的培養(yǎng)條件來(lái)達(dá)到特定的目的，例如保持祖細(xì)胞的活性，等等。另外，除了生長(zhǎng)因子，所述受試細(xì)胞可以在含有間質(zhì)或飼養(yǎng)層細(xì)胞的共培養(yǎng)物 中生長(zhǎng)。適合應(yīng)用于祖細(xì)胞生長(zhǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞在文中是已知的。所述受試共培養(yǎng)細(xì)胞可以用于多種途徑。例如，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，它是一種有條件的培 養(yǎng)基，可以在不同的階段和成分分析時(shí)分離。分離可通過(guò)HPLC、反相-HPLC、凝膠電泳、等電 子聚焦、透析或其他非-降解技術(shù)來(lái)完成，可通過(guò)分子量、分子體積、電荷、它們的組合等來(lái) 分離?？梢越M合一種或多種這些技術(shù)來(lái)進(jìn)一步富集特定的提高祖細(xì)胞活性的部分。所述受試細(xì)胞可以在間質(zhì)細(xì)胞-自由基培養(yǎng)物中擴(kuò)增，例如如Suzuki等描述的 (2000) HepatoloRY 32:1230-1239。這樣的培養(yǎng)物優(yōu)選的生長(zhǎng)在提供一層細(xì)胞外基質(zhì)成分 的培養(yǎng)基上，例如層粘蛋白、IV型膠原、I型膠原、纖維連結(jié)蛋白等等。所述培養(yǎng)基通常包括 生長(zhǎng)因子，例如HGF、EGF等等。所述肝移植細(xì)胞可以和一種培養(yǎng)系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用于分離和評(píng)價(jià)與肝細(xì)胞及BEC分 化和成熟相關(guān)的因素。因此，可以應(yīng)用所述細(xì)胞來(lái)測(cè)定培養(yǎng)基的活性，例如有條件的培養(yǎng) 基，評(píng)價(jià)液體所含生長(zhǎng)因子的活性，包括形成特定的結(jié)構(gòu)，等等。培養(yǎng)法也可以作為用來(lái)處 理藥物和其他化合物的方法，來(lái)測(cè)定肝代謝對(duì)于重要藥物的作用。例如，可以分離和測(cè)試肝 代謝的產(chǎn)物的毒性和效力。移植肝臟衰竭包括和嚴(yán)重的肝損傷及功能不良相關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)并發(fā)癥。它可能在沒(méi)有預(yù) 先存在肝疾病的病人中發(fā)生或是在慢性肝損傷上繼發(fā)的。急性肝臟衰竭的診斷需要存在癥 狀，包括黃疸和腦病。爆發(fā)性肝衰竭損害所有的肝臟功能，導(dǎo)致膽紅素代謝減少，氨和腸源 性蛋白質(zhì)的清除減少，凝血因子產(chǎn)物減少。它也會(huì)導(dǎo)致腎臟衰竭、休克和膿毒病。沒(méi)有肝移 植，超過(guò)50 %的病人將死亡，病因通常是來(lái)自以上疾病的組合。即使在最好的環(huán)境中死亡率 超過(guò)50%。處理的方法包括一般的支持療法直至肝可以再生和恢復(fù)功能。在沒(méi)有預(yù)先存在 疾病的急性肝衰竭中，肝移植是可以救命的。所述受試細(xì)胞可以用來(lái)恢復(fù)受者的肝臟功能。同種異體的細(xì)胞可以用于分離祖細(xì) 胞和接下來(lái)的移植。肝功能不良的多數(shù)臨床表現(xiàn)來(lái)源于細(xì)胞損害和正常肝容量的損害。例 如，病毒性肝炎導(dǎo)致肝細(xì)胞的損害和死亡。在這種情況下，表現(xiàn)可包括出血的增加、黃疸和 循環(huán)中肝細(xì)胞酶的水平增加。由于肝功能不良起源于疾病如腫瘤，所述受試細(xì)胞可以從自 體同源的肝組織分離，并在治療后應(yīng)用來(lái)恢復(fù)肝功能。肝疾病有許多原因，從微生物感染和贅生物(腫瘤)到代謝和循環(huán)的問(wèn)題。肝炎 包括肝細(xì)胞炎癥和損害。這種類(lèi)型的損傷可來(lái)自損害性藥物、毒素或免疫攻擊。然而，肝炎 最普通的原因是病毒感染。在美國(guó)三種主要的病毒導(dǎo)致肝炎肝炎病毒A、B和C。它們每 年總共感染將近500，000美國(guó)人。另外，細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物可感染肝臟，而且肝臟在某 種程度上幾乎不可避免的卷入所有的血源性感染中。許多藥物可損害肝臟，從肝臟化學(xué)輕微無(wú)癥狀的改變到肝衰竭和死亡。肝毒性可 是或不是劑量相關(guān)的。羥苯基乙酰胺(Acetominophen)是一種肝毒性的藥物；二苯乙內(nèi)酰 脲(抗驚厥藥)和異煙胼(抗結(jié)核藥)就是能引起“病毒樣”肝炎的藥物例子。環(huán)境和工 業(yè)毒素可導(dǎo)致肝臟廣泛的改變。肝損害不一定是劑量依賴(lài)的，可以是從輕微無(wú)癥狀的炎癥 到爆發(fā)性的衰竭或進(jìn)行性的纖維化和硬化。肝代謝過(guò)程的問(wèn)題可以是先天的或后天獲得的。這些病癥中的一些，如威爾遜病(肝豆?fàn)詈瞬?和血色沉著病可表現(xiàn)為肝炎或硬化。威爾遜病是少見(jiàn)的遺傳性疾病，其特 點(diǎn)為不能將銅分泌入膽汁，導(dǎo)致肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)中銅的毒性聚積。血色沉著病是一種鐵超 負(fù)荷綜合癥導(dǎo)致鐵沉積和隨之發(fā)生的各種器官的損害，包括肝、心臟、胰腺和垂體腺。這個(gè) 疾病可能是腸道吸收鐵增加或多次輸血引起的，因?yàn)槌３Ｔ谘h(huán)紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)鐵。肝可受許多疾病的影響，尤其是自身免疫的病癥，其中免疫系統(tǒng)攻擊機(jī)體自身正 常組織。一些例子包括風(fēng)濕病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以及感染性腸疾 病，例如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病(節(jié)段性回腸炎)。為了多種目的可將基因在培養(yǎng)或移植前導(dǎo)入細(xì)胞，例如預(yù)防或減少易感性，取代 失去轉(zhuǎn)變功能的基因，等等?；蛘?，表達(dá)反義mRNA或核糖酶的載體被導(dǎo)入，因此阻斷了表達(dá) 不想表達(dá)的基因。其他基因治療的方法是導(dǎo)入藥物抗性基因來(lái)使得正常祖細(xì)胞有一優(yōu)勢(shì)并 受選擇性壓力的支配，例如多種藥物抗性基因(MDR)，或抗細(xì)胞凋亡基因如bcl-2。文中所 知的多種技術(shù)可用來(lái)轉(zhuǎn)染所述靶細(xì)胞，例如電穿孔、鈣沉淀DNA、融合、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染等等。 所述DNA特殊的導(dǎo)入方式對(duì)于所述發(fā)明的實(shí)施不是關(guān)鍵的。許多對(duì)于將外源性基因轉(zhuǎn)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中去有用的載體可以利用。所述載 體可以是游離基因，例如質(zhì)粒、病毒源性載體如巨細(xì)胞病毒、腺病毒等等，或可以整合入靶 細(xì)胞基因組，通過(guò)同源重組或隨機(jī)整合，例如反轉(zhuǎn)錄病毒源性的載體，例如MMLV、HIV-U ALV 等等。祖代和干細(xì)胞遺傳改變見(jiàn) Svendsen 等，(1999) TrendsNeurosci. 22(8) :357_64 ； Krawetz等(1999)Gene 234(1) :1_9 :Pellegrini等，MedBoil Eng Comput. 36(6) :778_90 ； 以及 Alison(1998)Curr Opin Cell Biol. 10(6) :710_5。或者，所述肝祖代可以是終生免疫-非終生免疫的例如見(jiàn)Kobayashi等(2000) Science 287 1258-1262。在這樣的操作中，將終生免疫的基因序列，例如癌基因，以可以將 其容易去除的方法導(dǎo)入細(xì)胞，例如利用位點(diǎn)特異性的重組酶如cre-lox系統(tǒng)。為了證明擁有遺傳修飾的祖細(xì)胞，可以運(yùn)用各種方法。所述細(xì)胞的基因組可以用 限制性酶消化，應(yīng)用或不應(yīng)用DNA擴(kuò)增。聚合酶鏈反應(yīng)；凝膠電泳；限制性分析；Southern、 Northern和Western印跡；測(cè)序等等都可以被運(yùn)用。所述細(xì)胞可以在各種環(huán)境下生長(zhǎng)，來(lái) 保證所述細(xì)胞在保持表達(dá)導(dǎo)入DNA的能力同時(shí)也能夠分化?？梢赃\(yùn)用各種體外和活體的試 驗(yàn)來(lái)確保保持所述細(xì)胞的多種能力。所述細(xì)胞可以以任何生理上可接受的方法給藥，通常是血管內(nèi)，包括靜脈內(nèi)，例 如通過(guò)肝臟門(mén)靜脈；脾臟內(nèi)給藥等，然而它們也可以導(dǎo)入其他合適的位點(diǎn)，所述細(xì)胞可以因 此找到合適的再生和分化的位點(diǎn)。通常，至少施用lX103/Kg的細(xì)胞，更通常的是至少大約 IXioVKg的細(xì)胞，優(yōu)選IX 106/Kg或更多。所述細(xì)胞可以通過(guò)注射、導(dǎo)管或其他方法導(dǎo)入。所述受試細(xì)胞可用作培養(yǎng)細(xì)胞，可以產(chǎn)生作為生物人工肝生物反應(yīng)器的肝細(xì)胞， 其中肝細(xì)胞通過(guò)膜或其他生理屏障從灌注液分離。四種在中空-纖維膜中利用肝培養(yǎng)細(xì) 胞的裝置(Circe Biomedical HepatAssist 、Vitagen ELADTM、GerlachBELS 和 Excorp Medical BLSS)現(xiàn)在正處于臨床評(píng)價(jià)階段。雖然生物人工肝的發(fā)展協(xié)助裝置(BLADs)治療 急性肝衰竭，然而慢性肝衰竭的炎癥或急性失代償，很重要，它卻很難完成，部分是因?yàn)楦?細(xì)胞在培養(yǎng)基中很難生存。通過(guò)培養(yǎng)受試的肝移植細(xì)胞，對(duì)這樣的裝置持續(xù)提供肝細(xì)胞。生物人工肝生物反應(yīng)器提供一種或多種功能氧化解毒(主要通過(guò)細(xì)胞色素P450 酶系統(tǒng))；生物轉(zhuǎn)化(例如尿素合成、糖尿化(gluconuridation)和硫酸鹽化作用)；分泌(通過(guò)膽汁系統(tǒng))；蛋白質(zhì)和大分子合成；中間代謝(糖原異生、脂肪酸和氨基酸)；以及免 疫和激素系統(tǒng)的調(diào)節(jié)?，F(xiàn)在臨床評(píng)價(jià)中的BLADs是以應(yīng)用中空-纖維筒裝肝細(xì)胞 (hollow-fibercartridge housing h印atocyte)，它在中空纖維月空夕卜部位培養(yǎng)。灌注通過(guò) 所述中空纖維筒腔內(nèi)部分是全血，或是血漿流?？梢詫⒁环N氧合器放置在生物反應(yīng)器前來(lái) 提高灌注流中可利用氧的水平，并用柱或過(guò)濾器在到達(dá)肝細(xì)胞前減少毒素。其他的裝置可以以軸向流動(dòng)途徑越過(guò)和/或通過(guò)非紡織聚酯纖維灌注血漿；通過(guò) 處于高度多孔的用肝細(xì)胞接種的聚氨酯泡沫結(jié)構(gòu)中心的通道；通過(guò)微孔多聚砜中空_纖維 膜；微孔聚乙烯形式的樹(shù)脂材料；等等。所述祖細(xì)胞和/或后代肝細(xì)胞可以裝入膠囊。表達(dá)試驗(yàn)檢查肝移植細(xì)胞中基因的表達(dá)是特別重要的。所述的表達(dá)組基因可以和許多重要 的細(xì)胞相比較，例如如文中所知的成年肝祖細(xì)胞、干細(xì)胞、造血細(xì)胞等等。例如，可以進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)來(lái)測(cè)定在發(fā)展過(guò)程中被調(diào)節(jié)的基因。任何文中所知的用來(lái)檢測(cè)特異mRNAs的合適的定量和定性的方法都可以應(yīng)用。 mRNA可以被檢測(cè)，通過(guò)例如和微陣列雜交，在組織中原位雜交，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶-PCR，或在包 含多聚A+mRNA的Northern印跡中。本文中的一項(xiàng)技術(shù)可以容易的應(yīng)用這些方法來(lái)測(cè)定 兩個(gè)樣品之間mRNA轉(zhuǎn)錄物的大小和量的不同。例如，祖細(xì)胞中特定mRNA的水平和參考樣 品中mRNAs的表達(dá)相當(dāng)，例如肝細(xì)胞或其他分化細(xì)胞。任何適合檢測(cè)和比較樣品中mRNA表達(dá)水平的方法都可以和所述發(fā)明的方法聯(lián)合 應(yīng)用。例如，樣品中mRNA的表達(dá)水平可以通過(guò)從樣品中產(chǎn)生的一庫(kù)表達(dá)序列標(biāo)記(ESTs)測(cè) 定?；驇?kù)中ESTs相關(guān)表達(dá)的列舉可以用來(lái)估計(jì)初始樣品中基因轉(zhuǎn)錄物的相關(guān)表達(dá)。實(shí)驗(yàn) 樣品EST分析的結(jié)果然后可以和參考樣品的EST分析作比較，后者是用來(lái)測(cè)定選擇性多聚 核苷酸相關(guān)表達(dá)水平，尤其是和這里描述的一種或多種分化表達(dá)基因相關(guān)的多聚核苷酸?；蛘撸瑢?shí)驗(yàn)樣品中的基因表達(dá)可以應(yīng)用基因表達(dá)(SAGE)方法連續(xù)分析實(shí)施 (Velculescu等Science (1995)270 484)。SAGE包括從單個(gè)轉(zhuǎn)錄物中特異性位點(diǎn)分離出短 小獨(dú)特的序列標(biāo)記物。所述序列標(biāo)記物被連接、克隆和排序。初始樣品中特定轉(zhuǎn)錄物的頻 率通過(guò)相關(guān)序列標(biāo)記物和所述序列群體相遇的次數(shù)反映。試驗(yàn)樣品中的基因表達(dá)也可以應(yīng)用差別顯示(DD)方法分析。在DD中，由特異性 多聚核苷酸序列(限制性酶位點(diǎn))限定的片段應(yīng)用為獨(dú)特的基因標(biāo)識(shí)符，它和所表達(dá)基因 中關(guān)于片段長(zhǎng)度或片段部位的信息相聯(lián)系。樣品中表達(dá)基因的相關(guān)表達(dá)然后可以在所有可 能的片段庫(kù)中根據(jù)和那個(gè)基因相關(guān)聯(lián)片段的相關(guān)表達(dá)來(lái)估計(jì)。開(kāi)展DD的方法和組合物在 文中是熟知的，見(jiàn)例如U. S. 5，776，683 ；和U. S. 5，807，680?；蛘?，在樣品中基因表達(dá)中應(yīng)用雜交分析，它是以核苷酸相互作用的特異性為基 礎(chǔ)。寡核苷酸或cDNA可以用來(lái)選擇性的識(shí)別或俘獲特異性序列組合物的DNA或RNA，對(duì)和 已知俘 的序列雜交的RNA或cDNA的量進(jìn)行定性或定量的測(cè)定，以提供關(guān)于樣品中的細(xì)胞 信息庫(kù)中特定信息相關(guān)表達(dá)的信息?？稍O(shè)計(jì)雜交分析使得同時(shí)篩選成百至上千基因的相關(guān) 表達(dá)，通過(guò)應(yīng)用，例如，有高密度形式的陣列-基礎(chǔ)技術(shù)，包括過(guò)濾器、顯微鏡載物片或微芯 片或應(yīng)用光譜分析的液體-基礎(chǔ)技術(shù)(例如質(zhì)譜分析)。下面詳細(xì)敘述了在所述發(fā)明診斷 方法中應(yīng)用陣列的例子。
可以實(shí)施和陣列雜交，其中所述陣列可根據(jù)文中所知的任何合適的方法制造。例 如，U. S. 5，134，854中描述的制造大寡核苷酸陣列的方法，以及U. S. 5，455，934中描述的應(yīng) 用光-控合成技術(shù)。應(yīng)用計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)，單體異質(zhì)陣列通過(guò)同時(shí)在大量反應(yīng)位點(diǎn)連接轉(zhuǎn) 換為聚合物異質(zhì)陣列。或者，微陣列通過(guò)將合成前的寡核苷酸沉積在固體底物上而產(chǎn)生，例 如PCT出版的申請(qǐng)?zhí)朩O 95/35505中描述的。收集來(lái)自帶有陣列的樣品的雜交數(shù)據(jù)的方法在文中也是熟知的。例如應(yīng)用一種檢 測(cè)熒光標(biāo)記物創(chuàng)造細(xì)胞樣品的多聚核苷酸，通過(guò)掃描微陣列檢測(cè)可察覺(jué)的標(biāo)記物的存在 來(lái)檢測(cè)樣品中多聚核苷酸的雜交。用來(lái)檢測(cè)裝置上熒光標(biāo)記目標(biāo)的方法和裝置在文中是已 知的。通常，這樣的檢測(cè)裝置包括顯微鏡和用來(lái)將光對(duì)準(zhǔn)底物的光源。光子計(jì)數(shù)器檢測(cè)來(lái) 自底物的熒光，然而χ-y轉(zhuǎn)化步驟變化了底物的位置。一種可以應(yīng)用于所試方法的共焦檢 測(cè)裝置描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，631，734。一種掃描激光顯微鏡描述于Shalon等，Genome Res. (1996)6 :639。應(yīng)用合適的激發(fā)線，對(duì)每個(gè)應(yīng)用的熒光團(tuán)進(jìn)行掃描。然后為了接下來(lái)的分析 結(jié)合來(lái)自掃描的數(shù)字圖象。對(duì)于任何特定的陣列成分，將來(lái)自一個(gè)樣品的熒光信號(hào)的比例 和來(lái)自另外一個(gè)樣品的熒光信號(hào)作比較，并測(cè)定相關(guān)的信號(hào)密度。分析從和陣列雜交收集數(shù)據(jù)的方法在文中也是熟知的。例如，當(dāng)雜交檢測(cè)包括熒 光標(biāo)記物時(shí)，數(shù)據(jù)分析可包括從所收集的數(shù)據(jù)測(cè)定熒光密度的步驟，熒光密度是底物位置 的函數(shù)，去除無(wú)關(guān)項(xiàng)，即背離預(yù)先確定的統(tǒng)計(jì)分布的數(shù)據(jù)，并可從剩余數(shù)據(jù)計(jì)算靶物的相對(duì) 結(jié)合力。所得的數(shù)據(jù)可以顯示為一張每個(gè)區(qū)域密度根據(jù)靶物和探針之間結(jié)合力而變化的 圖。模式匹配可以手工實(shí)施，或應(yīng)用計(jì)算機(jī)程序?qū)嵤?。配制底物矩?例如陣列)的 方法，設(shè)計(jì)寡核苷酸應(yīng)用于這樣的矩陣，探針的標(biāo)記、雜交條件、雜交矩陣的掃描以及產(chǎn)生 模式的分析，包括對(duì)比分析，例如描述于U. S. 5，800，992。在另外一種篩選方法中，所述試驗(yàn)樣品在蛋白質(zhì)水平分析?？梢詰?yīng)用任何方法測(cè) 定試驗(yàn)樣品中分化表達(dá)的多肽的缺失或存在或改變的量來(lái)完成診斷。例如，檢測(cè)可以利用 帶有標(biāo)記抗體的細(xì)胞或組織切片染色(例如來(lái)自活組織切片檢查)，依照傳統(tǒng)的方法實(shí)施。 細(xì)胞可以被滲透而沾染胞質(zhì)分子。通常，將特異結(jié)合所述發(fā)明分化表達(dá)多肽的抗體加入樣 品中，保溫一段時(shí)間而足以使得結(jié)合抗原決定簇，通常至少大約10分鐘。所述抗體可以為 了直接檢測(cè)而標(biāo)記(例如應(yīng)用放射性同位素、酶、熒光素、化學(xué)熒光物等)，或可以和第二抗 體或試劑聯(lián)合應(yīng)用來(lái)檢測(cè)結(jié)合(例如生物素和辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的親和素，和熒光化合 物結(jié)合的第二抗體，例如熒光素、羅丹明、得克薩斯紅等等)?？梢酝ㄟ^(guò)許多方法測(cè)定是否存 在抗體結(jié)合，包括游離細(xì)胞的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法、顯微鏡方法、放射攝影術(shù)、閃爍計(jì)數(shù)等等?？?以應(yīng)用任何合適的可供選擇的定量或定性測(cè)試分化表達(dá)多肽水平或量的方法，例如ELISA、 western印跡、免疫沉淀反應(yīng)、放射性免疫測(cè)定等等。篩選試驗(yàn)所述受試細(xì)胞對(duì)于體外試驗(yàn)和篩分是有用的，可以檢測(cè)到作用于肝移植細(xì)胞和 由所述肝移植細(xì)胞產(chǎn)生的肝細(xì)胞的試劑。很多的試驗(yàn)可以用于這個(gè)目的，包括毒理學(xué)試驗(yàn)、 蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫測(cè)定；細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和功能活性的測(cè)定；激素的制造；等等。在生物活性試劑、病毒等的篩選試驗(yàn)中，所述受試細(xì)胞，通常是包含受試細(xì)胞的培 養(yǎng)物，和重要的試劑接觸，并通過(guò)監(jiān)測(cè)輸出參數(shù)估計(jì)試劑的效果，例如標(biāo)記物的表達(dá)、細(xì)胞生存能力等等。所述細(xì)胞可以是如上述的新近分離、培養(yǎng)和遺傳改變的等。所述細(xì)胞可以 環(huán)境誘導(dǎo)克隆培養(yǎng)物的變異體例如分離為獨(dú)立的培養(yǎng)物并在不同的條件下生長(zhǎng)，例如和 或不和病毒一起；存在或不存在其他細(xì)胞活素及它們的化合物。細(xì)胞對(duì)于試劑，特別是藥物 試劑反應(yīng)的方式，包括反應(yīng)的時(shí)間是對(duì)于所述細(xì)胞生理狀態(tài)的重要反應(yīng)。參數(shù)是細(xì)胞可計(jì)量的成分，尤其是可以精確測(cè)定的成分，理想的用高通量系統(tǒng)。一 種參數(shù)可以是任何細(xì)胞成分或細(xì)胞產(chǎn)物，包括細(xì)胞表面決定簇、受體、蛋白質(zhì)或構(gòu)象或遺傳 翻譯后的修飾，脂類(lèi)、糖類(lèi)、有機(jī)或無(wú)機(jī)分子、核酸例如mRNA、DNA等，或來(lái)自這樣的細(xì)胞成 分或它們的化合物的一部分。雖然大多數(shù)參數(shù)將提供定量的讀出，但在一些例子中，半-定 量或定性的結(jié)果是可以接受的。讀出的信息可包括單個(gè)確定的值，或可包括平均值、中位數(shù) 或方差等。特征性的，對(duì)于每個(gè)由于相同試驗(yàn)的多樣性產(chǎn)生的參數(shù)將獲得一個(gè)參數(shù)讀出值 范圍。變異性是期望的，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法加用以提供單一值的普通統(tǒng)計(jì)方法將獲得每組 試驗(yàn)參數(shù)值的范圍。篩選用的重要試劑包括已知或不知的化合物，包括許多化學(xué)種類(lèi)，主要是有機(jī)分 子，包括有機(jī)金屬分子、無(wú)機(jī)分子、基因序列等等。所述發(fā)明的一個(gè)重要方面就是評(píng)價(jià)候選 藥物，包括毒性試驗(yàn)來(lái)測(cè)試肝炎病毒的作用，例如肝炎A、B、C、D、E病毒；抗病毒藥物；等等。除了復(fù)雜的生物試劑外，例如病毒，候選試劑包括包含對(duì)于結(jié)構(gòu)相互作用，特別是 氫鍵結(jié)合，必需的功能基團(tuán)的無(wú)機(jī)分子，典型的包括至少一種胺、羰基、羥基或羧基，常常至 少兩個(gè)功能性化學(xué)基團(tuán)。候選試劑常常包括環(huán)碳或被以上一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代的雜環(huán)結(jié)構(gòu) 和/或芳香或聚芳香結(jié)構(gòu)。候選試劑也見(jiàn)于生物分子，包括肽、多聚核苷酸、糖、脂肪酸、類(lèi) 固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或它們的化合物。藥物活性的藥物、遺傳活性的分子等包括在內(nèi)。重要的化合物包括化療藥物、激 素或激素拮抗劑等等。適合這項(xiàng)發(fā)明的示例藥物試劑是那些在“療法的藥理學(xué)基礎(chǔ)”(The Pharmacological Basis of Therapeutics)中描述的，Goodman 禾口 GiIman, McGraw-Hi 11, 紐約(1996)，第九版，選自以下章節(jié)水、鹽和離子(Water, Salts andlons)；影響腎臟功能 禾口電角軍質(zhì)代 的藥物(Drugs Affecting Renal Function andElectrolyte Metabolism)； 影響胃腸道功能的藥物(Drugs AffectingGastrointestinal Function))；微生物疾病的 化學(xué)療法(Chemotherapy ofMicrobial Diseases)；腫瘤疾病的化學(xué)療法(Chemotherapy of NeoplasticDiseases)胃白勺胃· (Drugs Acting on Blood-Forming organs)；激素和激素拮抗劑(Hormones and Hormone Antagonists)；維生素，皮膚病學(xué) (Vitamins, Dermatology)和毒理學(xué)(Toxicology)，這里都包含進(jìn)來(lái)作參考。還包括毒素 和生物及化學(xué)競(jìng)爭(zhēng)試劑，例如見(jiàn)Somani，S. Μ.(編)，“化學(xué)競(jìng)爭(zhēng)試劑”(ChemicalWarf are Agents)，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1992)。試驗(yàn)化合物包括上面描述的所有種類(lèi)的分子，還進(jìn)一步包括未知內(nèi)容的樣品。來(lái) 自天然資源如植物的自然出現(xiàn)化合物的混合物是有重要意義的。雖然許多樣品包含溶液化 合物，可以溶解在合適溶劑中的固體樣品也可以被測(cè)定。有意義的樣品包括環(huán)境樣品，例如 地面水、海水、礦廢物等等；生物樣品，例如由農(nóng)作物配制的溶解產(chǎn)物，組織樣品等等；人造 樣品，例如在藥物配制過(guò)程中的時(shí)間進(jìn)程；以及配制作分析之用化合物庫(kù)等等。有意義的樣 品包括評(píng)定潛在治療值的化合物，例如藥物候選物。
0111]術(shù)語(yǔ)“樣品”也包括上面所述的液體，并在其中加入如了附加的成分，例如影響離子強(qiáng)度、PH、總蛋白濃度等的成分。此外，所述樣品也通過(guò)處理而完成至少部分化學(xué)分離或 濃縮?？梢詫⑸飿悠繁４?，如果照看它而減少化合物的降解，例如在氮下、冷凍或它們的 聯(lián)合。應(yīng)用的樣品體積要足夠而使得測(cè)量可以察覺(jué)，通常是大約0. 1 μ I-Iml的生物樣品就 足夠了。包括候選試劑的化合物從許多來(lái)源獲得，包括合成或天然化合物庫(kù)。例如，可利用 許多方法任意和有指導(dǎo)的合成多種有機(jī)化合物，包括生物分子，包括任意寡核苷酸和寡肽 的表達(dá)?；蛘?，自然化合物文庫(kù)，以細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物浸出物的形式是可利用或容易制 造的。此外，天然或合成制造的文庫(kù)和化合物通過(guò)傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生化方法很容易被修 飾，并可以用來(lái)制造組合文庫(kù)。已知的藥物試劑可接受指導(dǎo)的或任意的化學(xué)修飾，例如酰 化、烴化、酯化、酰胺化等等，來(lái)制造結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。通過(guò)將所述試劑加入到至少一種，通常大量細(xì)胞樣品，通常和缺少試劑的細(xì)胞聯(lián) 合，對(duì)生物活性進(jìn)行篩選。測(cè)定對(duì)所述試劑反應(yīng)的參數(shù)變化，通過(guò)和參考培養(yǎng)物的比較評(píng) 價(jià)結(jié)果，例如存在和不存在所述試劑，用其他試劑獲得等等。所述試劑可方便的以溶液的形式或容易的以可溶解的形式加入培養(yǎng)物中的細(xì)胞 培養(yǎng)基。所述試劑可以流通系統(tǒng)加入，為流注，間歇或連續(xù)的，或者將化合物藥丸(bolus) 逐一或遞增的加入至其他靜止的溶液，并且其他的溶液和加入的試驗(yàn)化合物是相同的。第 一液體流通過(guò)所述細(xì)胞，接著是第二。在單一溶液方法中，將試驗(yàn)化合物藥丸加入至細(xì)胞周 圍的培養(yǎng)基體積中。所述培養(yǎng)基的成分總濃度不應(yīng)該在加入藥丸后明顯變化，或處于流通 方法中兩種溶液之間。優(yōu)選的試劑制劑不包括附加成分，例如防腐劑，它可能對(duì)制劑總體有明顯的影響。 因此優(yōu)選的制劑基本上包括生物活性化合物和生理上可接受的載體，例如水、乙醇、DMSO等 等。然而，如果化合物是沒(méi)有溶劑的液體，所述制劑本質(zhì)上包括所述化合物本身。大量的試驗(yàn)可以根據(jù)不同的試劑濃度而同時(shí)實(shí)施，來(lái)獲得對(duì)于不同濃度的不同反 應(yīng)。正如文中所知的，測(cè)定試劑的有效濃度典型的應(yīng)用濃度范圍是1 10，或其他粗材測(cè) 定，稀釋液。所述濃度如果需要，可進(jìn)一步用第二組稀釋液限定。典型的，這些濃度之一充 當(dāng)陰性對(duì)照，例如零濃度或低于所述試劑發(fā)現(xiàn)的水平或處于或低于不產(chǎn)生表型可察覺(jué)變化 的試劑濃度?？梢岳酶鞣N方法定量測(cè)試所選擇標(biāo)記物的存在。為了測(cè)定存在的分子的量， 一種便利的方法就是用可檢測(cè)的部分標(biāo)記分子，可以是熒光的、發(fā)光的、放射性的、酶活性 的等等，特別是一種對(duì)于高親合結(jié)合參數(shù)有特性的分子。熒光部分事實(shí)上容易用來(lái)標(biāo)記 任何生物分子、結(jié)構(gòu)或細(xì)胞類(lèi)型。免疫熒光部分可以指導(dǎo)結(jié)合的不光是特異的蛋白質(zhì)，也 可以是特異的結(jié)構(gòu)、分裂產(chǎn)物或位點(diǎn)修飾，如磷酸化。單個(gè)肽和蛋白質(zhì)可以設(shè)計(jì)為自發(fā) 熒光，例如通過(guò)表達(dá)它們?yōu)榧?xì)胞內(nèi)部綠色熒光的蛋白質(zhì)嵌合體(回顧見(jiàn)Jones等(1999) Trends Biotechnol. 17(12) :477_81)。因此，抗體可以被基因修飾而提供熒光染劑作為它 們結(jié)構(gòu)的一部分。依賴(lài)所選的標(biāo)記物，可以應(yīng)用除熒光標(biāo)記物的方法測(cè)定參數(shù)，應(yīng)用例如 免疫測(cè)定技術(shù)，如放射免疫測(cè)定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，同種酶免疫測(cè)定和 相關(guān)非-酶技術(shù)。核酸的數(shù)量，尤其是信使RNAs，也是有意義的參數(shù)。這些可以通過(guò)依賴(lài) 核酸核苷酸序列的雜交技術(shù)測(cè)定。所述技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)，基因陣列技術(shù)。見(jiàn)分子生 物學(xué)的現(xiàn)代議定書(shū)，Ausubel 等編，John Wiley&Sons，紐約，NY, 2000 ；Freeman 等(1999)Biotechnigues26(l) 112-225 ；Kawamoto ^ (1999)Genome Res 9(12) 1305—12 ；禾口 Chen 等(1998) Genomics 51(3) :313_24。
實(shí)施例下面實(shí)施例的給出是為了向文中那些普通的技術(shù)人員提供如何進(jìn)行和應(yīng)用所試 發(fā)明的完整揭示和描述，不是為了限制所述發(fā)明所認(rèn)定的范圍。已經(jīng)做了努力來(lái)保證所應(yīng) 用數(shù)字的精確性(例如數(shù)量、溫度、濃度等等)但一些實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤和偏差是允許的。除非另外 表明，部分是重量區(qū)分的，分子量是平均分子量，溫度是攝氏溫度；壓力是處于或接近大氣 壓。在這個(gè)說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)這里包含進(jìn)來(lái)做參考，好象每個(gè)單 獨(dú)出版物或?qū)＠暾?qǐng)是特殊和單獨(dú)表明包含做參考。任何出版物的引用是為了在填寫(xiě)日期 前揭示它，不應(yīng)該認(rèn)為承認(rèn)所述發(fā)明沒(méi)有利用先前發(fā)明早于這樣出版物的權(quán)利。已經(jīng)明白這項(xiàng)發(fā)明不限于所述的特定方法、協(xié)定、細(xì)胞系、動(dòng)物種或類(lèi)，這些都是 可以變化的。同樣明白了這里應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述特定的實(shí)施方案，而不是為了限 制所述發(fā)明的范圍，它的范圍只有被附屬的權(quán)利要求所限制。如這里所應(yīng)用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“這種”包括復(fù)數(shù)對(duì)象除非上下文另 外明確規(guī)定。因此，例如提及“一個(gè)細(xì)胞”就包括大量這樣的細(xì)胞，提及“蛋白質(zhì)”就包括一 種或多種蛋白質(zhì)以及為文中的技術(shù)員所知的等價(jià)物，等等。這里所應(yīng)用的所有技術(shù)和科學(xué) 術(shù)語(yǔ)與所述發(fā)明的文中一個(gè)普通技術(shù)員通常明白的有相同意義，除非另外明確規(guī)定。實(shí)施例1人類(lèi)肝細(xì)胞流式細(xì)胞分選雙重激光流式細(xì)胞分析以及將人類(lèi)肝細(xì)胞從胎兒和成年組織中分選出來(lái)在 Becton Dickinson FACSVantage SE上實(shí)施。一種氬離子激光和氦氖激光應(yīng)用為主要和次 要刺激源分別在488nm波長(zhǎng)發(fā)射150mW，633nm波長(zhǎng)發(fā)射30mW。前向光散射和直角被線形 放大，并通過(guò)48nm帶通過(guò)濾器測(cè)定，在前向掃描檢測(cè)器前運(yùn)用0. 60D中性密度過(guò)濾器，為了 衰減來(lái)自較大細(xì)胞群體的高水平前向角度散射信號(hào)。在這種裝置中，前向掃描軸上有足夠 的動(dòng)力范圍來(lái)捕獲和測(cè)量來(lái)自肝組織中發(fā)現(xiàn)的多種大小范圍細(xì)胞的前向角度散射信號(hào)，在 單個(gè)線性十倍程中。典型的前向掃描放大器放大設(shè)置的范圍是8-16。FITC、PE和PI熒光 色素在488nm處都被激發(fā)，分別應(yīng)用530/30、585/42、610/20nm帶通過(guò)濾器測(cè)定熒光發(fā)射。 APC和APCCy7熒光素在633nm處被激發(fā)，并分別應(yīng)用660/20帶通和750長(zhǎng)通過(guò)濾器測(cè)定 熒光發(fā)射。所有的免疫熒光測(cè)定都用對(duì)數(shù)放大。每個(gè)熒光通道的電壓設(shè)置應(yīng)用Spherotech RFP 30_5參考粒子校準(zhǔn)。校準(zhǔn)后，應(yīng) 用單色對(duì)照經(jīng)驗(yàn)性的產(chǎn)生補(bǔ)償設(shè)置。流式細(xì)胞儀上的流體學(xué)裝置的結(jié)構(gòu)為了肝衍生組織中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞獨(dú)特大小的分 布和特征而最優(yōu)化。應(yīng)用一種傳統(tǒng)制造的口徑為130μπι的油嘴以及一種IOpsi的鞘壓裝 置。所述鞘儲(chǔ)器、樣品存放器和接受管架都通過(guò)冷卻回流器保持在4°C。肝衍生細(xì)胞的培養(yǎng)亞群可以通過(guò)在細(xì)胞懸浮液中加入PI而確認(rèn)，對(duì)所述細(xì)胞進(jìn) 行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，并分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)是前向掃描與PI熒光的繪圖?？筛鶕?jù)以下的特征溶解 三種不同群體；表現(xiàn)為低前向掃描、低水平熒光(Rl)的小細(xì)胞簇；表現(xiàn)為高前向掃描和中度熒光(R2)的大細(xì)胞簇，以及包含第三種不同簇的死亡細(xì)胞，這種簇帶有連續(xù)的低至中等 水平的前向掃描信號(hào)和非常高水平的熒光。結(jié)果在圖1中顯示。所述R2亞群通過(guò)進(jìn)行如 上所述的缺乏PI的分析證明了是自發(fā)熒光的?？筛鶕?jù)以下的特征溶解兩種不同群體；表現(xiàn) 為低前向掃描、低水平熒光的小細(xì)胞簇；表現(xiàn)為高前向掃描和中度熒光的大細(xì)胞簇。聚集物的區(qū)別是應(yīng)用脈沖處理，通過(guò)描繪前向掃描峰的高度對(duì)寬度，后者形成了 第三區(qū)域的基礎(chǔ)。一種分選的門(mén)定義為這三個(gè)區(qū)域交叉點(diǎn)。所述靶群體的初步富集在第一 輪分選中完成。所述富集產(chǎn)物然后再被分選為相關(guān)純度。產(chǎn)物的純度總是通過(guò)再分析而校 驗(yàn)。實(shí)施例2肝祖細(xì)胞的分離先前冷凍的肝細(xì)胞或新近分離的肝細(xì)胞用5E12染色。所述細(xì)胞通過(guò)應(yīng)用5E12Ab 的MACS柱富集5E12，然后分選5E12+的細(xì)胞?；蛘?，5E12+的細(xì)胞在染色后直接分選。為 了分選，細(xì)胞在Rl和R2門(mén)之間分離。R2/5E12+細(xì)胞代表了體外或活體試驗(yàn)中的大多數(shù)肝 移植細(xì)胞。所述細(xì)胞的特征被描述為在相同的細(xì)胞中表達(dá)ckl9和白蛋白(如圖2A和2B 顯示)。除了 5E12外，對(duì)于較低水平I型HLA表達(dá)的選擇為肝移植富集，應(yīng)用和人類(lèi)I型 HLA A、B、C起反應(yīng)的抗體(W6-32抗體)。當(dāng)門(mén)控R2細(xì)胞時(shí)，三種不同簇亞群的細(xì)胞可以通 過(guò)分析5E12對(duì)比I型HLA的熒光，如二維密度或等值線圖而溶解(圖1)。一種亞群表現(xiàn)為 5E12 禾口 HLA-I型HLA都是陰性染色(5E12-HLA-)；第二種亞群表現(xiàn)為較低相關(guān)水平的5E12熒 光和較高水平的I型HLA熒光(5E12—HLA+)；以及一種第三亞群表現(xiàn)為較高水平的5E12熒 光和較低水平的I型HLA熒光(5E12+HLA )。然而單染色分析，例如一種顏色，不必然提供明顯的群體差別，圖中明顯的是，在 兩種顏色的圖中細(xì)胞分為不同的亞群。MM提供一種方法來(lái)富集肝祖代群落，通過(guò)分選細(xì)胞表面的抗原表達(dá)。從分選的人類(lèi) 胎兒肝細(xì)胞促克隆形成試驗(yàn)所得的結(jié)果通過(guò)生存能力(PI)、大小(FS)和自身熒光分選細(xì) 胞，然后進(jìn)一步通過(guò)表面抗體分離，并用FFS或BMS-6平皿培養(yǎng)。在分選(ckl9/白蛋白或 僅僅ckl9)后產(chǎn)生的所述肝群落的繁殖能力2周后在培養(yǎng)物中比較。只有R2門(mén)控的細(xì)胞 (FS+PIffi)產(chǎn)生群落。所述5E12抗體富集人類(lèi)胎兒和成年肝祖細(xì)胞。圖1舉例說(shuō)明了用5E12單克聾抗 體對(duì)人類(lèi)胎兒肝細(xì)胞(16g.w.)染色。包括在R2門(mén)中的細(xì)胞用5E12或同型匹配的對(duì)照mAb 染色。表1和表2顯示了分選的5E12肝細(xì)胞限制性稀釋分析的結(jié)果。人類(lèi)胎兒肝細(xì)胞應(yīng) 用MACS柱富集為5E12陽(yáng)性細(xì)胞。LR2、5E12陽(yáng)性細(xì)胞在BMS-6基質(zhì)上的96孔培養(yǎng)皿中分 選，每孔1-500細(xì)胞。通過(guò)ELISA監(jiān)測(cè)人類(lèi)白蛋白的表達(dá)，為了檢測(cè)培養(yǎng)孔中祖細(xì)胞集落。表 1分選的5E12陽(yáng)性細(xì)胞的限制性分析應(yīng)用ACDU分選的5E12+肝細(xì)胞和8種稀釋點(diǎn)(1、5、10、25、50、125、250、500細(xì)胞)
進(jìn)行分析。在第7天、第14天、第21天和第28天通過(guò)ELISA檢測(cè)到了白蛋白陽(yáng)性的孔。
權(quán)利要求
一種從肝組織分離的哺乳動(dòng)物肝移植細(xì)胞的組合物，其特征在于，所述組合物中至少80％的細(xì)胞特征為R2，且選自5E12；Ep Cam；CD49f；和E 鈣粘著蛋白以及HLA低的標(biāo)記呈陽(yáng)性；所述組合物包含能夠生長(zhǎng)為成熟肝細(xì)胞的細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的肝移植細(xì)胞組合物，其特征在于，所述細(xì)胞是CD117和CD14陰 性的。
3.如權(quán)利要求1所述的肝移植細(xì)胞組合物，其特征在于，所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的肝移植細(xì)胞組合物，其特征在于，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾而包含 外源DNA載體。
5.一種富集哺乳動(dòng)物肝移植細(xì)胞組合物的方法，其中，所述組合物中至少80%的細(xì)胞 特征為R2，且選自5E12 ；Ep-Cam ；⑶49f ；和E-鈣粘著蛋白以及HLA 的標(biāo)記呈陽(yáng)性，其特征 在于，所述方法包括將特異性識(shí)別5E12、Ep-Cam、⑶49f和E-鈣粘著蛋白的試劑和特異性識(shí)別I型HLA抗 原的試劑及肝細(xì)胞樣品結(jié)合；選擇R2群體；選擇那些選自5E12 ；Ep-Cam ；⑶49f和E-鈣粘著蛋白的標(biāo)記呈陽(yáng)性的細(xì)胞，選擇那些低陰性表達(dá)I型HLA抗原的細(xì)胞；以提供有肝移植活性的細(xì)胞富集群體。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括選擇陰性表達(dá)⑶117和 CD14的細(xì)胞的步驟。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。
8.一種為宿主動(dòng)物提供功能性肝細(xì)胞和/或膽囊細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法 包括將包含完全純凈的哺乳動(dòng)物肝移植細(xì)胞組合物的細(xì)胞群體導(dǎo)入所述宿主動(dòng)物，其中， 所述組合物中至少80%的細(xì)胞特征為R2，且選自5E12 ；Ep-Cam ；⑶49f ；和E-鈣粘著蛋白以 及HLA 的標(biāo)記呈陽(yáng)性。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞陰性表達(dá)CD117和CD14。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述功能性肝細(xì)胞分泌白蛋白或a-1-抗 胰蛋白酶。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述功能性肝細(xì)胞分泌a-1-抗胰蛋白酶。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述功能性肝細(xì)胞分泌白蛋白。
14.如權(quán)利要求1所述的肝移植細(xì)胞組合物，其特征在于，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾而包含 外源DNA載體。
15.一種體外細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述培養(yǎng)物包含哺乳動(dòng)物肝移植細(xì)胞，所述細(xì) 胞特征為R2，且選自5E12 ；Ep-Cam ；⑶49f ；和E-鈣粘著蛋白以及HLA 的標(biāo)記呈陽(yáng)性，所述 培養(yǎng)物帶有或不帶有飼養(yǎng)細(xì)胞層。
16.如權(quán)利要求15所述的體外培養(yǎng)物，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物肝移植細(xì)胞是人類(lèi) 細(xì)胞。
17.一種嵌合型免疫缺陷小鼠，F(xiàn)AH+小鼠或FAH-/-免疫缺陷小鼠，其特征在于，所述 小鼠包括從完全純凈的哺乳動(dòng)物肝移植細(xì)胞組合物產(chǎn)生的功能再生肝細(xì)胞和/或膽囊細(xì)胞，其 中，所述組合物中至少80%的細(xì)胞特征為R2，且選自5E12 ；Ep-Cam ；⑶49f ；和E-鈣粘著蛋 白以及HLA 的標(biāo)記呈陽(yáng)性。
18.如權(quán)利要求17所述的嵌合小鼠，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物的肝移植細(xì)胞是人類(lèi) 細(xì)胞。
19.一種篩選在哺乳動(dòng)物肝移植細(xì)胞中特異性表達(dá)的遺傳序列的方法，其特征在于，所 述方法包括從權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群體、權(quán)利要求15所述的體外細(xì)胞培養(yǎng)物或權(quán)利要求17所 述的嵌合小鼠中分離出RNA， 從所述RNA制造探針， 篩選與所述探針雜交的核酸群體。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在所述肝移植細(xì)胞和第 二種不同細(xì)胞群體間比較所得雜交結(jié)果。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述核酸群體以陣列表現(xiàn)。
22.—種篩選影響哺乳動(dòng)物肝移植細(xì)胞生存能力、生長(zhǎng)、代謝功能或分化的方法，其特 征在于，所述方法包括接觸如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群體，如權(quán)利要求15所述的體外細(xì)胞培養(yǎng)物或如權(quán)利要 求17所述的嵌合小鼠，并測(cè)定所述試劑對(duì)所述肝移植細(xì)胞生存能力、生長(zhǎng)、代謝功能或分 化的影響。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述試劑是懷疑對(duì)人肝細(xì)胞有毒性的藥物。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述試劑是人類(lèi)肝炎病毒。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述試劑是人類(lèi)肝炎病毒疫苗。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述試劑是抗病毒試劑。
全文摘要
提供了充分濃縮的哺乳動(dòng)物肝移植細(xì)胞群體。提供了分離和培養(yǎng)這種肝移植細(xì)胞的方法。從許多的來(lái)源獲得祖細(xì)胞，包括胎兒和成人組織。所述細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)移植中有用，并可作為譜系和細(xì)胞特異性產(chǎn)物的來(lái)源，包括對(duì)于確認(rèn)這些細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因有用的mRNA種型，以及作為發(fā)現(xiàn)可影響它們的因子或分子的目標(biāo)。
文檔編號(hào)A61P33/02GK101974480SQ201010165448
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2002年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日
發(fā)明者E·拉加西, T·奧斯丁 申請(qǐng)人:干細(xì)胞股份有限公司